Diagnostic des maladies

3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection sous la peau du crâne par semaine pendant quatre semaines, passe des tests cognitifs, puis subit une ponction du liquide céphalo-rachidien avant d'être tué par exsanguination. Une partie du protocole porte sur des souriceaux de sept jours, que la manipulation expose au rejet par leur mère, à la mort par hypothermie ou au cannibalisme, effets que le porteur qualifie de rares et sporadiques. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne capture la complexité d'un "organisme entier" et écarte la drosophile, C. elegans et le poisson zèbre, dont la barrière cérébrale diffère trop de celle des mammifères.

Objectifs

Récemment, certaines zones barrières du cerveau, ont été identifiées comme des interfaces de communication active entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières. De plus, des découvertes récentes ont identifié des canaux ouverts dans l'os du crâne, les cellules immunitaires présentes dans la moelle osseuse peuvent accéder au cerveau en cas de maladie ou d'infection, tandis qu'en bonne santé elles atteignent le cerveau et de là libèrent des facteurs solubles qui peuvent façonner le cerveau à distance. Les troubles du spectre autistique et la schizophrénie sont considérés comme neurodéveloppementaux. La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative mortelle associée au vieillissement, qui touche 30 à 50 % des personnes de plus de 85 ans. Pour les maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives, certains traitements existent, mais leur efficacité est limitée et de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires de toute urgence. Des recherches récentes suggèrent unanimement que la dérégulation du système immunitaire est au centre de la pathologie. Les signaux inflammatoires dans le cerveau atteint de la maladie d’Alzheimer devraient donc influencer l’activité de la moelle osseuse. En effet, des travaux antérieurs et préliminaires ont montré que le processus de production de cellules immunitaires et d’autres propriétés du tissu de la moelle osseuse sont altérés dans la maladie d’Alzheimer, mais il n’est pas certain que cela soit vrai pour la moelle osseuse crânienne. De plus, nous savons que les signaux immunitaires dérivés de la moelle osseuse via le cerveau peuvent influencer l’activité cérébrale chez les adultes, mais on comprend moins bien si ces signaux contribuent au développement du cerveau. Notre objectif est d’étudier comment la moelle osseuse crânienne est altérée dans la maladie d’Alzheimer et au cours du développement, et si des changements dans dans la moelle osseuse pourraient modifier le développement cérébral ou la progression de la trajectoire de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra d’identifier des facteurs produits par la moelle osseuse du crâne et potentiellement impliqués dans la modulation du développement et du fonctionnement du cerveau dans les cerveaux sains et atteints de la Maladie d’Alzheimer (MA). À court terme, cette étude fournira des connaissances fondamentales sur un nouveau canal de communication cerveau-immunité. Explorer les frontières cérébrales dans cette direction est très important car l’accès des médicaments courants au cerveau est souvent altéré, car de nombreux médicaments ne traversent pas la barrière hémato-encéphalique. Ces dernières années, nous avons observé d’énormes progrès dans le développement de médicaments pour les maladies cardiovasculaires, les maladies immunologiques et le cancer, mais peu de progrès ont été réalisés en neurologie, en partie à cause de cet obstacle. Par conséquent, la compréhension des voies alternatives vers le cerveau est un défi majeur en neurologie. Plus précisément, à long terme, ces recherches pourraient conduire au développement de nouvelles approches pharmacologiques qui réguleraient cette voie de communication cerveau-immunité pour lutter contre la Maladie d’Alzheimer (MA) ou prévenir le risque d’autisme.

Procédures

Dans la procédure 1, les souris seront soumises à une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne sous anesthésie gazeuse, une fois par semaine pendant 4 semaines. Ensuite, les souris seront testées pour leur capacité cognitive (sans stress ni douleur) pendant une semaine. Enfin, les souris recevront une injection intrapéritonéale 16h plus tard, une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien et seront mises à mort par exsanguination (élimination du sang). Dans la procédure 2, des souris âgées de 7 jours seront soumises à une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne sous anesthésie gazeuse. Suite à l’injection, les souris âgées de 15 ou 21 jours recevront une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien. Les souris adultes après une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne seront testées pour leur comportement (pas de stress ni de douleur) dans un délai de deux semaines. Apres, les souris recevront une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien.

Impact sur les animaux

Les injections et l'anesthésie peuvent provoquer une légère douleur et un stress temporaire. Nous ne prévoyons pas d'effets négatifs supplémentaires résultant de ces manipulations ou de la nature des substances injectées. Dans de rares cas, les souriceaux après manipulation sont rejetés par la mère et ils peuvent mourir d'hypothermie. Dans des cas sporadiques, une séparation temporaire peut provoquer un stress chez la mère entraînant un cannibalisme chez les souriceaux. De plus, la manipulation des animaux pendant les tests comportementaux peut provoquer un léger stress et un inconfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour la dissection des tissus afin de répondre aux questions scientifiques posées dans cette proposition.

Remplacement

Notre objectif est d'étudier comment les cellules situées dans la moelle crânienne agissent sur le cerveau, dans le développement et dans un modèle de maladie d’alzheimer (MA). La niche de la moelle crânienne est un organe complexe composé de vaisseaux sanguins, de nerfs et de tissu stromal englobant différents types de fibroblastes, d'adipocytes et de cellules immunitaires de l'ensemble de l'arbre hématopoïétique. Notre question est de savoir comment ces cellules et leurs produits atteignent le cerveau et modulent sa fonction. Il n'existe pas de modèle in vitro ou ex vivo qui capture la complexité d'un organisme ou d'un tissu avec ses composants endothéliaux, stromaux, immunitaires et neuronaux. Des animaux plus simples tels que la drosophile, C. elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie de la barrière cérébrale de ces animaux est très différente de celle des mammifères. De plus, l'indicateur le plus fiable de la gravité de la maladie dans les modèles de MA (et les patients) est la mesure de leur capacité cognitive, et pour les modèles de troubles du spectre autistique (TSA) - comportement social, les paramètres ne peuvent pas être testés dans des modèles non animaux.

Réduction

Nous souhaitons étudier les interactions entre le crâne, la moelle osseuse et le cerveau dans les maladies neurodégénératives et le développement. Les quantités d'animaux utilisées pour réaliser notre projet sont établies en tenant compte de notre expérience antérieure et de tests statistiques. Seuls 10 microlitres du liquide à analyser ( liquide cephalo rachidien (LCR)) peuvent être collectés dans le cerveau d'une souris, ce qui ne permet qu'un seul type d'analyse. Un seul échantillon de crâne et des méninges uniques ne peuvent être utilisés que pour une seule analyse à la fois, mais le cerveau peut être conservé (de plusieurs façons) et utilisé pour plusieurs tests. Nous prévoyons pour chaque groupe, 14 animaux à analyser ; le sexe des animaux peut influencer les phénotypes observés, des mâles et des femelles seront inclus (7 mâles et 7 femelles). Des expériences seront réalisées en triples pour obtenir des résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 4 groupes comparés (sains vs. alzheimer et traités vs. contrôle) : les effectifs proposés (7 individus par groupe) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.

Raffinement

Les procédures décrites sont conçues pour minimiser l'inconfort des animaux. Le suivi des animaux, selon une liste de signes cliniques et des points limites spécifiques et précoces. Dès l’apparition d’un signe clinique, nous multiplierons l’enrichissement (plus de coton, un igloo) et, le cas échéant, nous chaufferons les cages avec des chaufferettes si l’animal montre des signes d’hypothermie. Des aides alimentaires (type gel hydrique) et une réhydratation sous-cutanée avec de la solution saline seront mises en place au besoin. Si un animal atteint le score limite, il sera mis à mort. Des injections sous-cutanées (sous la peau) sur le dessus du crâne seront effectuées sous anesthésie générale et sur un tapis chauffant sur lequel les animaux seront maintenus pendant la procédure et jusqu'à leur réveil pour minimiser l'inconfort.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives. De nombreux anticorps dirigés contre des épitopes murins et permettant l’analyse par imagerie et/ou la déplétion de certains types cellulaires sont également disponibles. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 2 à 9 mois. Au cours du développement typique de la maladie de type Alzheimer chez les souris, les premiers signes de pathologie sont la formation de plaques bêta-amyloïdes dans le cerveau, clairement visibles au microscope, qui se développent à 3 mois, ainsi que des différences comportementales dans les capacités d'apprentissage et de mémoire, que nous mesurons dans des tests comportementaux. Cet âge peut varier légèrement en fonction de l'animal et du sexe (les femelles développent généralement la maladie plus lentement que les mâles dans ce modèle). Pour capturer ces fenêtres de progression de la pathologie, des injections sous-cutanées pour manipuler le crâne seront administrées aux animaux à l'âge de 3 à 6 ou de 6 à 9 mois et des échantillons seront prélevés à 4, 6 ou 9 mois. Nous injecterons aussi des souris le 7e jour postnatal (P.7) pour pouvoir capturer la fenêtre de développement de la croissance et du recâblage intenses du cerveau, qui se produit vers entre le 10eme et le 20eme jour postnatal. Nous analyserons les cerveaux aux âges entre le 15eme et le 21eme jour postnatal pour capturer tous les changements que la manipulation aurait pu imposer au cerveau et analyserons le comportement des souris adultes après la manipulation pour voir si cela a eu des effets à long terme.

6 176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, jusqu'à deux injections dans le sinus rétro-orbitaire, quatre injections intrapéritonéales, trois gavages hormonaux, deux prélèvements sanguins et une irradiation de six minutes et cinquante-quatre secondes. Le porteur décrit des tumeurs pouvant entraîner des difficultés respiratoires, des ulcérations, des nécroses, des automutilations et l'isolement des animaux, celles dont le système immunitaire est absent y étant plus exposées. Les retombées annoncées, mieux choisir les traitements et repérer les patients qui répondent aux immunothérapies, sont renvoyées au long terme, tandis que le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'évolution d'un "organisme entier" au cours du développement des cancers.

Objectifs

Les points de contrôle immunitaires sont des protéines qui interagissent avec les cellules du système immunitaire, appelées lymphocytes T, pour réguler leur activité une fois qu'une infection est éliminée. Cependant, dans le cas d’un cancer, les cellules tumorales utilisent ces protéines pour bloquer l’action des lymphocytes T, ce qui leur permet d’échapper au système immunitaire. Pour contrer cela, des médicaments appelés « inhibiteurs de points de contrôle immunitaires » ont été développés. Ils réactivent les lymphocytes T pour qu'ils attaquent les cellules cancéreuses. Ces traitements ont révolutionné le traitement de certains cancers, comme le mélanome avancé. Cependant, beaucoup de patients ne répondent pas à ces traitements ou rechutent dans les cinq ans. Il est donc crucial de mieux comprendre comment les voies cellulaires et moléculaires sont mises en place lors de traitements et de trouver des moyens de prédire qui va y répondre. La protéine Eomes, présente dans les lymphocytes T, joue un rôle important dans la lutte contre les tumeurs, mais on ne sait pas encore clairement comment elle influence la réponse à ces traitements. Les premières recherches montrent que plus il y a d'Eomes, meilleure est la réponse contre le cancer. Ce projet vise à comprendre comment Eomes agit sur l'efficacité des traitements contre le cancer, en utilisant des modèles de cancer chez la souris. Cela permettra de savoir si les lymphocytes T possédant Eomes sont les cibles principales des inhibiteurs des points de contrôle immunitaires.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en place lors du traitement par les inhibiteurs des points de contrôle immunitaires permettra d’améliorer la compréhension des réponses immunitaires impliquées dans la réponse antitumorale et ainsi de comprendre pourquoi certains patients sont réfractaires aux thérapies actuellement utilisées. À terme, cette étude aura donc pour but de mieux sélectionner les traitements, d’augmenter l’efficacité des traitements déjà existants, et potentiellement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Tous les gestes invasifs seront réalisés sous inhalation d'isoflurane (2% + mélange air/oxygène). Une attention particulière sera portée au suivi par des personnes formées et compétentes. Les injections en sous cutanée ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau de la veine caudale durent 5 minutes et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau du sinus retro-orbital durent 1 minute et sont réalisées 2 fois avec un jour d’intervalle entre les deux injections. Les prélèvements de sang en sous-mandibulaire durent 1 minute par souris et sont réalisées 2 fois avec 3 semaines d’intervalle entre les deux prélèvements. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées 4 fois avec 2 jours d’intervalle entre chaque injection. L’administration par gavage d’un traitement hormonal a une durée de 2 minutes par souris et sera réalisée 3 fois par souris. L’irradiation a une durée de 6 minutes et 54 secondes et est réalisé une seule fois.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux murins induits dans ce projet vont engendrer le développement de tumeurs pouvant entraîner des difficultés de déplacements. Un défaut d’alimentation et/ou de boisson et une perte de poids de l’animal peuvent apparaître. De plus, les tumeurs pourraient éventuellement induire des troubles fonctionnels chez l'animal comme des difficultés respiratoires ou une augmentation du rythme respiratoire ainsi qu’une altération de la température corporelle. Des troubles comportementaux pourraient survenir tels que des auto-mutilations,des défauts de toilettage et de nidification ainsi que l’isolement. L’état général des souris pourrait être altéré. Les tumeurs peuvent également présenter des ulcérations ou des infections. Lors de la régression tumorale favorisée par l’action des combinaisons d’immunothérapies, des nécroses peuvent être visibles sans saignements ni rougeurs. L’absence de système immunitaire chez certaines souris du projet les rendent plus sensibles au développement et à la progression tumorale ainsi qu’aux ulcérations, infections et invaginations de la tumeur.

Devenir

Les animaux qui ont développé des tumeurs seront mis à mort afin de réaliser des analyses sur les cellules purifiées à partir des organes prélevés (moelle osseuse ou tumeurs, ganglions drainants la tumeur et rate). Ceci nous permettra d’évaluer l’efficacité des immunothérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n'est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne sont pas capables de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers. Ces études in vitro ne reproduisent pas l'ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l'obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro capable de prendre en compte toute la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers.

Réduction

L’ensemble des expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux grâce à des études préliminaires qui nous ont permis de maîtriser ces modèles murins. Les résultats actuels ont permis de valider que des lots de 10 souris par génotype selon les paramètres à évaluer permettent d'acquérir des données fiables. La stratégie d’expérimentation sera une étude longitudinale. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle. Un test statistique sera utilisé pour les expériences du projet. Dans ce projet, nous utilisons un modèle de mélanome murin dans lequel les cellules cancéreuses émettent de la lumière. Par imagerie, nous sommes capables de visualiser la progression tumorale et les métastases au cours du temps et ce de manière non invasive en ré-utilisant les mêmes animaux. Par ailleurs, dans ce projet, nous injecterons simultanément des cellules immunitaires (Lymphocytes T) compétentes et déficientes pour une protéine d’intérêt dans une seule et même souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisé.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux dès l’initiation des modèles de cancers. Ainsi, l’expérimentateur impliqué dans le projet observera le comportement et mesurera le poids des animaux tous les deux jours à compter de l'initiation des modèles de cancers jusqu'à la fin de l'expérimentation. Toutes modifications de la prise de nourriture/boisson, de la posture, des déplacements, de la sociabilité et de la nidification seront observées. En cas de déshydratation et de perte de poids inférieur au seuil défini dans les points limites, de la nourriture et de l’eau sous forme de gel seront ajoutés. Les comportements d’agressivité seront également surveillés et du coton sera ajouté. Suite à l’induction des modèles tumoraux, des nécroses inflammatoires avec apparition d'une invagination au centre de la tumeur, de petits saignements et de rougeurs sur le pourtour de la tumeur peuvent se développer et seront nettoyées avec de la Vétédine. Pour diminuer la souffrance et la douleur liée aux procédures expérimentales et au développement de cancers, un traitement analgésique en locale (lidocaïne) sera administré aux souris au niveau de ces nécroses inflammatoires. Par ailleurs, des grilles d’expressions faciales des souris mises à disposition dans l’animalerie sont consultées pour détecter la douleur, la détresse ou la souffrance des animaux. De manière concomitante, des points limites ont été définis en concertation avec les zootechniciens pour détecter une dégradation trop importante de la santé et du bien-être des animaux et arrêter l’expérimentation. Pour éviter la mort à cause d’une éventuelle infection des souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, ces souris seront hébergées en portoir ventilé, manipulées sous hotte avec port de gants, masque, combinaison, surchaussures et charlotte. Certains actes seront réalisés sous anesthésie générale et/ou sous anesthésie locale suivies d’un réveil des animaux sur tapis chauffant. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes sociaux harmonieux dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux.

Choix des espèces

Les modèles de l’espèce animale Mus musculus sont à la base de la compréhension des mécanismes de reconnaissance par le système immunitaire et ont permis ces dernières années d’importantes avancées thérapeutiques dans ce domaine. En effet, ces modèles sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et chez la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules tumorales aux traitements. Par exemple, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour les molécules d’intérêt Eomes (délétion dans les lymphocytes T). Aucune autre espèce animale avec ces caractéristiques génotypiques pour ces protéines n’est disponible. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. L’ensemble des expériences du projet sera réalisé sur des jeunes adultes soit des animaux âgés d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise tumorale.

Quarante brebis sont saillies, vingt-cinq gestantes reçoivent huit injections intramusculaires de testostérone sur dix-huit semaines, puis leurs quarante agneaux subissent quatorze prises de sang au cou de la naissance à six mois. À la puberté, seize femelles nées de mères androgénisées passent une anesthésie générale et une IRM, la pose d'un cathéter jugulaire, puis 64 prélèvements de sang et six injections. 80 moutons vont ainsi être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour tester un anticorps contre l'hormone anti-müllérienne comme traitement possible du syndrome des ovaires polykystiques chez la femme, le porteur affirmant que cet anticorps ne peut être testé que sur un "organisme entier". Dix-neuf retournent à l'élevage, les autres sont tués après l'agnelage ou après la puberté pour prélever leurs tissus reproducteurs.

Objectifs

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la cause la plus fréquente d'infertilité féminine (8 à 13 % des femmes en âge de procréer dans le monde). Les critères du diagnostic du SOPK sont basés sur au moins deux des trois caractéristiques suivantes : 1/ irrégularité ou absence des règles, 2/ un taux élevé d’hormones masculines dans le sang, et 3/ ovaires renfermant de nombreux kystes folliculaires de 2 à 6 mm. La plupart des patientes atteintes de SOPK présentent également des taux d'hormone AMH (anti-müllérienne) et LH (hormone lutéinisante) élevés. De plus, ce trouble est généralement associé à une résistance à l'insuline, de l’obésité, des taux de cholestérol élevés et une hypertension artérielle. Il est important de noter que la plupart des caractéristiques du SOPK sont transmises aux filles des femmes atteintes de ce syndrome, puisque 60 à 70 % de leurs filles développent ce syndrome. Malgré le nombre de femmes touchées par ce trouble, les causes du SOPK restent incomprises. Parmi les facteurs impliqués dans le SOPK, les androgènes, et l'AMH ont été reconnus comme jouant un rôle central. L'hypothèse actuelle est que l’excès d'androgènes ou d'hormones sexuelles masculines durant la grossesse pourrait entraîner des modifications au niveau de l’activité ovarienne et la sécrétion de certaines, ce qui entraînerait le développement du SOPK à l'âge adulte. Notre projet qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2) a pour objectif de tester si un anticorps dirigé contre l’AMH peut supprimer les défauts d'ovulation observés dans un modèle de brebis ayant reçu un excès d'androgènes mimant le SOPK chez la femme. En effet, la brebis est une espèce proche de la femme en terme de développement ovarien. Nous étudierons également chez la mère et chez ses descendants mâles les conséquences d’un taux élevé d’hormones masculines au niveau des tissus périphériques et reproducteurs.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de constituer un corpus de données visant à évaluer si un anticorps anti-AMH est un bon candidat pour des essais ultérieurs chez l'humain, en l'occurence chez la femme développant un syndrome des ovaires polykystiques. Elle permettra aussi de mieux comprendre les effets moléculaires de la testostérone chez la femme et les conséquences chez la descendance mâle.

Procédures

Pour les 40 brebis adultes : 1 prise de sang (PS) intra-veineuse (IV) (jugulaire) sera réalisé à 18 jours après la saillie. Pour les 25 brebis gestantes sélectionnées : 8 Injections intra musculaire (IM) sur 18 semaines. 4 PS IV (jugulaire) pendant la gestation. Pour tous les descendants mâles (n=20) : 14 Prises de sang par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Pour tous les descendants femelles (n=20) : 14 PS par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Autour de la puberté, 6 PS par IV (jugulaire) sur 3 semaines. 1 anesthésie générale pour 1 passage à l’IRM à la puberté. Pose de cathéter à la puberté sous anesthésie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Pour les femelles pubères issues des mères androgénisées (n=16) : 18 Prises de sang sur 9 semaines. 4 injections intra veineuse (jugulaire). 1 anesthesie genérale pour un passage à l’IRM après l’injection de l’anticorps. 1 pose de cathéter après le passage à l’IRM sous anesthesie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Dans l'EU1 seront effectuées toutes les expérimentations sauf l'anesthésie générale et le passage à l'IRM qui seront réalisés dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Les différentes prises de sang peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les differentes injections peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose des cathéters jugulaires peut entraîner des douleurs au point d'injection. Pour les animaux traités, il existe un risque d’apparition de kystes et d’anomalies de la vessie (observés par IRM). Il peut arriver mais trés rarement des signes extérieurs associés à une douleur comme une dérivation urinaire entre les cuisses qui peut entrainer des brûlures. Les nuisances en lien avec l’anesthésie de l’IRM sont une irritation des voies respiratoires lors de l’intubation et l’extubation, un possible hématome lors l’intraveineuse et un potentiel stress lors des manipulations.

Devenir

Pour la procédure 1: sur les 40 brebis saillies, 25 seront utilisées, les 15 brebis non selectionnées retourneront à l'élevage. Les 25 brebis sont nécessaires afin d'obtenir suffisamment de descendants femelles pour tester l'effet de l'injection d'anticorps . Une fois l'agnelage effectué, les 20 brebis androgénisées et les 5 témoins seront euthanisées afin de récupérer les tissus périphériques et reproducteurs pour une analyse moléculaire. Pour la procédure 2: sur les 40 descendants, 4 descendants femelles issues des mères témoin pourront retourner sur l'élevage. Ainsi, seront euthanasiés 12 descendants mâles issus des mères androgénisées et 4 descendants mâles issus des mères témoin mais aussi 16 descendants femelles injectés soit avec l'anticorps (n=8) ou avec une solution témoin (n=8) afin de pouvoir mener une étude moléculaire sur les tissus périphériques et reproducteurs.

Remplacement

Nous ne pouvons tester les anticorps que sur un organisme entier. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. D'autre part, il a été démontré dans la littérature que la brebis androgénisée est un bon modèle syndrome d'ovaires polykystiques chez la femme.

Réduction

Nous allons utiliser 25 brebis gestantes, 20 (16+4) agneaux mâles et 20 (16+4) agneaux femelles jusqu’à la puberté. Ce nombre a été estimé en utilisant un test de comparaison de deux moyennes (nombre de follicules antraux) dans chaque groupe. Avec des lots de 8 descendants femelles issues de mères androgénisées cela donne une puissance tout à fait satisfaisante. Afin d’avoir 16 brebis issues de mères androgènisées, il faut partir d’au moins 20 brebis au départ. Afin de vérifier que le traitement de testostérone fonctionne, nous suivrons également 5 brebis qui seront non traitées, et leurs descendants.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupes sociaux stables tout au long de l’expérimentation. Pour limiter les tress lié à la manipulation, Ils seront visités tous les jours avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l'expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Nous récompenserons les animaux après chaque session de prises de sang en distribuant du concentré à l’auge. Lors de la pose des cathéters, le comportement et l'apparence des brebis (notamment au niveau de l’implantation du cathéter) sera suivi avec attention. Les animaux seront maintenus en cage individuelle le temps des prélèvements, mais auront tout de même un contact visuel et olfactif avec leurs congénéères. Avant toute injection intramusculaire ou intraveineuse, une application de gel antalgique sera réalisée. Les deux veines jugulaires seront utilisées en alternance pour limiter le risque d’hématome. Les animaux seront mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie pour le passage à l’IRM, afin de limiter tout risque de régurgitation. Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Le transport des animaux de l'EU1 vers l'EU2 avant l'opération et leur retour de l'EU2 vers l'EU1 sera réalisé par un technicien formé et expérimenté dans une bétaillère agréée pour le transport d'animaux vivants. Le trajet est très court (moins de 5 minutes) et la bétaillère sera abondamment remplie de paille.

Choix des espèces

Afin de pouvoir mimer le SOPK chez la femme nous souhaitons utiliser des brebis gestantes pour plusieurs raisons : 1. contrairement aux rongeurs, la brebis présente l'avantage d'avoir un développement ovarien similaire à la femme. 2. De plus, ce modèle a déjà été validé dans nos unités. - 40 brebis saillies seront utilisées pour la détection de 25 brebis gestantes qui rentreront dans la procédure. Cet effectif doit permettre d'assurer la production de descendants assez conséquente pour poursuivre nos travaux. - 20 descendants mâles seront étudiés de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 20 descendants femelles seront étudiées de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 16 femelles pubertes sur les 20 entreront dans la 2ème phase de l’expérimentation (de J168 jusqu’à J235).

208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un premier groupe subit une obstruction chirurgicale de l'uretère, un deuxième la même obstruction puis une reconnexion à la vessie deux jours plus tard, un troisième un pinçage de quinze minutes des vaisseaux qui alimentent le rein, avec douleur postopératoire et risque d'infection de la cicatrice. Les deux reins sont prélevés après la mise à mort pour suivre des fibroblastes rendus fluorescents, dans l'espoir de repérer les cellules qui déclenchent la maladie rénale chronique, les outils de diagnostic n'étant évoqués que pour le long terme. Le porteur conclut qu'il est "impossible" de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux, les modèles cellulaires ne rendant pas selon lui la complexité de la maladie.

Objectifs

La maladie rénale chronique est une maladie fréquente (10% de la population mondiale) et grave (elle est estimée devenir la 4ème cause de mortalité d’ici 2040). Les événements précoces dans le développement de la maladie rénale ne sont pas bien connus. Identifier des types de cellules qui participent à l’initiation des phénomènes de dégradation du rein est l’objectif de ce projet. En particulier, nous analyserons des animaux qui présentent des cellules fluorescentes, c'est à dire qui émettront une lumière vive lorsqu'observées avec un microscope particulier, permettant ainsi de les suivre durant le développement de la maladie rénale. Ces cellules sont appelées fibroblastes, et sont impliquées dans la maladie rénale chronique. Ce projet cherchera à évaluer leur rôle de manière très précoce

Bénéfices attendus

La meilleure compréhension de ces phénomènes précoces, et plus particulièrement l’identification d’un type de cellule impliquée dans le développement des lésions permettra, à terme, de développer des outils diagnostics et thérapeutiques de la maladie rénale chronique. En effet, à ce jour, les tests diagnostics identifient la maladie à un stade souvent avancé, et les thérapeutiques permettent d’éviter l’aggravation de la maladie mais ne permettent pas sa régression. Identifier puis traiter à un stade précoce permettrait de lutter contre le développement de cette pathologie

Procédures

Trois types de chirurgie sous anesthésie générale auront lieu. Un premier lot d’animaux subira une obstruction de l’uretère (conduit reliant le rein à la vessie), durée de l’acte 5 minutes. Un 2e lot subira aussi une chirurgie d’obstruction de l’uretère puis 2 jours plus tard, nous le reconnecterons à la vessie afin d’étudier les capacités de réparation du rein – durée de l’acte : 30min. Et enfin sur un 3e lot, on pincera pendant 15 mn les vaisseaux sanguins qui alimentent le rein pour ensuite observer les dommages causés après quelques jours ou semaines

Impact sur les animaux

Les chirurgies risquent d’induire des nuisances, en particulier une douleur post opératoire, une irritation ou une inflammation au niveau de la cicatrice, voire une infection du site opératoire (exceptionnel). Uniquement dans ces cas, une perte de poids et/ou une modification du comportement pourrait survenir.

Devenir

Tous les animaux du projets seront euthanasiés afin de prélever en post-mortem les 2 reins et ainsi étudier les tissus.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la maladie rénale chronique. D’autre part, il est probable que le développement des lésions rénales soit la conséquence de multiples types de cellules présent dans le rein. Il est donc impossible de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Une analyse statistique estime qu’un nombre total de 208 animaux est nécessaire. Ce nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être (contrôle de la température et du taux d'humidité de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement (c'est à dire l'apport de structures permettant d'améliorer le bien-être animal, comme des petites maisons en plastique, du coton...) , change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures sont réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront surveillées quotidiennement par nos soins et ceux du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluation et points limites) sera strictement respecté, et effectué quotidiennement en concertation avec l'équipe de zootechnie. En cas d‘atteinte d’un point limite et selon le signe clinique observé, un antidouleur pourra être administré durant deux jours. Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié

Choix des espèces

La souris est la seule espèce permettant à ce jour de suivre l’évolution des fibroblastes grâce à la présence de cellules fluorescentes, en particulier suite à une intervention permettant de reproduire la maladie observée chez l’homme. Les interventions seront réalisées chez des souris adultes, la maladie rénale chronique chez l'homme concernant principalement des adultes.

Douze ponctions ovariennes par animal, sous anesthésie épidurale et sur bête vigile, avec pose et retrait répétés d'un dispositif vaginal et cinq injections de superovulation à douze heures d'intervalle avant chaque collecte : 12 génisses Prim'Holstein subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et sont gardées en vie à l'issue. L'ensemble sert à produire 400 embryons pour mettre au point la détection des anomalies chromosomiques dès le stade préimplantatoire, afin d'éviter les transferts sans issue et de réformer les animaux porteurs. Le porteur mentionne des hématomes possibles au point d'injection et un stress ponctuel lié aux contentions. Il classe la procédure en gravité modérée du fait de la répétition d'actes légers et, écrit-il, en l'absence de données objectives sur le sujet.

Objectifs

Depuis 2009, la sélection génomique s’est développée dans la filière bovine avec près de 300 000 analyses annuelles du génome réparties désormais dans une quinzaine de races, dont 80% pour une gestion du renouvellement en élevage. La lecture du génome peut également être effectuée plus précocement, dès le stade embryonnaire préimplantatoire après analyse de l’ADN préamplifié issu d’une biopsie de quelques cellules d‘un embryon (utilisation dans le cadre des schémas de sélection). Ces données génomiques sont principalement utilisées aujourd’hui pour prédire les performances futures de chaque individu mais ne sont pas valorisées pour détecter des problèmes d‘aneuploïdie (nombre anormal de chromosomes) qui peuvent survenir à chaque génération. Ces anomalies chromosomiques entrainent souvent l’arrêt du développement voire des problèmes d’infertilité ou de stérilité sur l’individu né. Le projet présenté vise à développer des approches méthodologiques permettant valoriser les données de génotypage pour détecter les anomalies chromosomiques (monosomie, trisomie) le plus précocement possible chez l’embryon et chez le veau afin de les prévenir et les gérer. Le projet justifiant cette demande d’autorisation porte uniquement sur la détection des anomalies chromosomiques chez les embryons, les approches chez les veaux nécessitant uniquement l’exploitation de données de génotypages déjà disponibles dans les bases de données nationales.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de développer et valider des méthodologies de détection des problèmes de ploïdie (monosomie, trisomie) dès le stade embryonnaire préimplantatoire chez les bovins. Ces indicateurs permettront à la fois d’éviter de transférer les embryons aneuploïdes (probabilité de gestation et naissance quasi-nulle alors même que l’aspect morphologique semble bon) mais également de mieux diagnostiquer des problèmes de fertilité chez des animaux aneuploïdes et ainsi les réformer pour éviter la dissémination de ces tares génétiques.

Procédures

La production des embryons nécessitera la répétition, pour chaque génisse du projet, de 12 collectes d'ovocytes (1 collecte d'ovocytes tous les 15 jours par animal) réparties en deux séries entrecoupées d’une période de repos de plusieurs semaines. Au début de chacune des deux séries de collecte d'ovocytes, un traitement de synchronisation des chaleurs sera effectué comprenant la pose et le retrait d'un dispositif vaginal ainsi qu'une injection intramusculaire (chaque intervention durant moins d'une minute à chaque fois). Chacune des collectes d'ovocytes nécessite une succession d'interventions sur les animaux : ponction ovarienne (15 minutes) et pose d'un dispositif vaginal (moins d'une minute) suivi 2 jours plus tard d'un traitement de superovulation (5 injections intramusculaires à 12 heures d'intervalle; chaque injection durant moins d'une minute à chaque fois) et enfin ponction ovarienne multiple sous contrôle échographique (30 minutes) avec changement de dispositif vaginal (moins d'une minute). Les ponctions ovariennes seront systèmatiquement effectuées sur animaux vigiles anesthésiés.

Impact sur les animaux

Du fait des injections intramusculaires liées aux traitements de superovulation, un hématome peut apparaitre au niveau du site d’injection. Afin de limiter ces risques, les injections seront réalisés alternativement de chaque côté de l'encolure. De plus, les différentes interventions et contentions prévues dans le projet peuvent engendrer un stress ponctuel chez les animaux. Néanmoins, du fait de la répétition d'actes induisant des nuisances légères et en l'absence de données objectives sur le sujet, la procédure expérimentale est considérée en degré de sévérité modérée dans ce projet.

Devenir

Toutes les génisses seront gardées en vie à la fin de cette procédure sauf avis contraire du responsable scientifique et du vétérinaire sanitaire.

Remplacement

Avant de passer à l’utilisation de l’animal, les méthodes de détection de l’aneuploïdie ont d’abord été développées et validées sur embryons produits in vitro à partir d’ovaires prélevés post-mortem en abattoir. Néanmoins, compte-tenu des différences de qualité ovocytaire avec le modèle de prélèvement sur animaux vigiles et de la volonté d’étudier l’impact de la répétition des sessions de production sur le taux d’aneuploïdies des embryons, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo. De plus, la production d’embryons in vitro après ponction folliculaire sur animaux vigiles représente le protocole principalement utilisé par les professionnels de la filière. Le développement méthodologique effectué doit donc nécessairement être validé en conditions de production réelles avant d’être mis en œuvre en routine.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été déterminé en fonction du nombre d’embryons à produire pour étudier le taux d’aneuploïdie (nombre anormal de chromosomes) des embryons selon les facteurs étudiés (protocole de production des embryons, taureau utilisé pour la fécondation, rang de collecte des ovocytes) et en tenant compte des impératifs pratiques imposés par le protocole de production (nombre de femelles traitées par jour et intervalle de temps entre les sessions). Ainsi, l’utilisation de 12 génisses permet de limiter le nombre d’intervention sur chaque animal avec 12 ponctions ovocytaires par individu permettant la production de 400 embryons sur l'ensemble du projet. Ces effectifs sont à priori nécessaires pour mettre en évidence, s'ils existent, les effets du taureau (présumés faibles), du protocole de production d’embryons (présumés importants) et du rang d’OPU (inconnus; aucune donnée bibliographique n'étant disponible sur le sujet) avec les exigences statistiques fixées (risque de 5% de conclure que l'effet existe alors qu'il n'existe pas; risque de 20% de conclure que l'effet n'existe pas alors qu'il existe).

Raffinement

L’étude est mise en place sur 12 génisses qui seront hébergées dans une stabulation libre avec aire paillée intégrale. Les génisses donneuses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales, enrichissement de milieux avec différents objets,...). Afin de limiter les risques d’hématomes, au niveau du site d’injection IM du traitement de superovulation, nous alternerons le lieu et le coté des injections. De plus, une anesthésie épidurale sera réalisée préalablement aux ponctions ovocytaires. Enfin, dans un objectif de renforcement positif, une récompense alimentaire (concentrés) sera donnée aux femelles après chaque passage dans la cage de contention, lors de la phase d’acclimatation ainsi que pour les collectes d'ovocytes.

Choix des espèces

Compte tenu de l’objectif même de l’étude, aucune autre espèce animale ne peut être choisie. La race Prim’Holstein choisie est la 1ère race laitière française en effectif, et est particulièrement concernée par les biotechnologies de l’embryon sur le terrain. Afin de produire les embryons du projet, il est nécessaire d'utiliser des génisses, toutes pubères et âgées de 14 à 18 mois. Le modèle génisse est représentatif de la population de donneuses d’embryons en France et à l’étranger. De plus, il a l’avantage, par rapport à un modèle vache, de ne pas présenter de biais expérimentaux liés à l’historique des femelles (conditions de mise bas, interactions avec la production laitière….).

40 brebis sont saillies, 25 gestantes entrent dans le protocole et les 15 autres retournent à l'élevage, où pourront aussi retourner plus tard 4 agnelles nées de mères témoins. 80 moutons, brebis et agneaux, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les 25 brebis gestantes, dont 20 androgénisées et 5 témoins, reçoivent 8 injections intramusculaires en 18 semaines, et leurs 40 agneaux subissent chacun 14 prises de sang de la naissance à 24 semaines. Autour de la puberté, les agnelles passent une IRM sous anesthésie générale, puis la pose d'un cathéter jugulaire suivie de séries de 36, 12 et 16 prélèvements, et les 16 nées de mères androgénisées recommencent après des injections d'anticorps anti-AMH ou de solution témoin. Les 25 mères sont tuées après l'agnelage, ainsi que 16 agneaux et ces 16 agnelles, pour analyser leurs tissus. Le texte ne dit rien du sort des 4 autres agneaux mâles, nés de mères androgénisées.

Objectifs

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la cause la plus fréquente d'infertilité féminine (8 à 13 % des femmes en âge de procréer dans le monde). Les critères du diagnostic du SOPK sont basés sur au moins deux des trois caractéristiques suivantes : 1/ irrégularité ou absence des règles, 2/ un taux élevé d’hormones masculines dans le sang, et 3/ ovaires renfermant de nombreux kystes folliculaires de 2 à 6 mm. La plupart des patientes atteintes de SOPK présentent également des taux d'hormone AMH (anti-müllérienne) et LH (hormone lutéinisante) élevés. De plus, ce trouble est généralement associé à une résistance à l'insuline, de l’obésité, des taux de cholestérol élevés et une hypertension artérielle. Il est important de noter que la plupart des caractéristiques du SOPK sont transmises aux filles des femmes atteintes de ce syndrome, puisque 60 à 70 % de leurs filles développent ce syndrome. Malgré le nombre de femmes touchées par ce trouble, les causes du SOPK restent incomprises. Parmi les facteurs impliqués dans le SOPK, les androgènes, et l'AMH ont été reconnus comme jouant un rôle central. L'hypothèse actuelle est que l’excès d'androgènes ou d'hormones sexuelles masculines durant la grossesse pourrait entraîner des modifications au niveau de l’activité ovarienne et la sécrétion de certaines, ce qui entraînerait le développement du SOPK à l'âge adulte. Notre projet qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2) a pour objectif de tester si un anticorps dirigé contre l’AMH peut supprimer les défauts d'ovulation observés dans un modèle de brebis ayant reçu un excès d'androgènes mimant le SOPK chez la femme. En effet, la brebis est une espèce proche de la femme en terme de développement ovarien. Nous étudierons également chez la mère et chez ses descendants mâles les conséquences d’un taux élevé d’hormones masculines au niveau des tissus périphériques et reproducteurs.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de constituer un corpus de données visant à évaluer si un anticorps anti-AMH est un bon candidat pour des essais ultérieurs chez l'humain, en l'occurence chez la femme développant un syndrome des ovaires polykystiques. Elle permettra aussi de mieux comprendre les effets moléculaires de la testostérone chez la femme et les conséquences chez la descendance mâle.

Procédures

Pour les 40 brebis adultes : 1 prise de sang (PS) intra-veineuse (IV) (jugulaire) sera réalisé à 18 jours après la saillie. Pour les 25 brebis gestantes sélectionnées : 8 Injections intra musculaire (IM) sur 18 semaines. 4 PS IV (jugulaire) pendant la gestation. Pour tous les descendants mâles (n=20) : 14 Prises de sang par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Pour tous les descendants femelles (n=20) : 14 PS par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Autour de la puberté, 6 PS par IV (jugulaire) sur 3 semaines. 1 anesthésie générale pour 1 passage à l’IRM à la puberté. Pose de cathéter à la puberté sous anesthésie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Pour les femelles pubères issues des mères androgénisées (n=16) : 18 Prises de sang sur 9 semaines. 4 injections intra veineuse (jugulaire). 1 anesthesie genérale pour un passage à l’IRM après l’injection de l’anticorps. 1 pose de cathéter après le passage à l’IRM sous anesthesie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Dans l'EU1 seront effectuées toutes les expérimentations sauf l'anesthésie générale et le passage à l'IRM qui seront réalisés dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Les différentes prises de sang peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les differentes injections peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose des cathéters jugulaires peut entraîner des douleurs au point d'injection. Pour les animaux traités, il existe un risque d’apparition de kystes et d’anomalies de la vessie (observés par IRM). Il peut arriver mais trés rarement des signes extérieurs associés à une douleur comme une dérivation urinaire entre les cuisses qui peut entrainer des brûlures. Les nuisances en lien avec l’anesthésie de l’IRM sont une irritation des voies respiratoires lors de l’intubation et l’extubation, un possible hématome lors l’intraveineuse et un potentiel stress lors des manipulations.

Devenir

Pour la procédure 1: sur les 40 brebis saillies, 25 seront utilisées, les 15 brebis non selectionnées retourneront à l'élevage. Les 25 brebis sont nécessaires afin d'obtenir suffisamment de descendants femelles pour tester l'effet de l'injection d'anticorps . Une fois l'agnelage effectué, les 20 brebis androgénisées et les 5 témoins seront euthanisées afin de récupérer les tissus périphériques et reproducteurs pour une analyse moléculaire. Pour la procédure 2: sur les 40 descendants, 4 descendants femelles issues des mères témoin pourront retourner sur l'élevage. Ainsi, seront euthanasiés 12 descendants mâles issus des mères androgénisées et 4 descendants mâles issus des mères témoin mais aussi 16 descendants femelles injectés soit avec l'anticorps (n=8) ou avec une solution témoin (n=8) afin de pouvoir mener une étude moléculaire sur les tissus périphériques et reproducteurs.

Remplacement

Nous ne pouvons tester les anticorps que sur un organisme entier. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. D'autre part, il a été démontré dans la littérature que la brebis androgénisée est un bon modèle syndrome d'ovaires polykystiques chez la femme.

Réduction

Nous allons utiliser 25 brebis gestantes, 20 (16+4) agneaux mâles et 20 (16+4) agneaux femelles jusqu’à la puberté. Ce nombre a été estimé en utilisant un test de comparaison de deux moyennes (nombre de follicules antraux) dans chaque groupe. Avec des lots de 8 descendants femelles issues de mères androgénisées cela donne une puissance tout à fait satisfaisante. Afin d’avoir 16 brebis issues de mères androgènisées, il faut partir d’au moins 20 brebis au départ. Afin de vérifier que le traitement de testostérone fonctionne, nous suivrons également 5 brebis qui seront non traitées, et leurs descendants.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupes sociaux stables tout au long de l’expérimentation. Pour limiter les tress lié à la manipulation, Ils seront visités tous les jours avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l'expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Nous récompenserons les animaux après chaque session de prises de sang en distribuant du concentré à l’auge. Lors de la pose des cathéters, le comportement et l'apparence des brebis (notamment au niveau de l’implantation du cathéter) sera suivi avec attention. Les animaux seront maintenus en cage individuelle le temps des prélèvements, mais auront tout de même un contact visuel et olfactif avec leurs congénéères. Avant toute injection intramusculaire ou intraveineuse, une application de gel antalgique sera réalisée. Les deux veines jugulaires seront utilisées en alternance pour limiter le risque d’hématome. Les animaux seront mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie pour le passage à l’IRM, afin de limiter tout risque de régurgitation. Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Le transport des animaux de l'EU1 vers l'EU2 avant l'opération et leur retour de l'EU2 vers l'EU1 sera réalisé par un technicien formé et expérimenté dans une bétaillère agréée pour le transport d'animaux vivants. Le trajet est très court (moins de 5 minutes) et la bétaillère sera abondamment remplie de paille.

Choix des espèces

Afin de pouvoir mimer le SOPK chez la femme nous souhaitons utiliser des brebis gestantes pour plusieurs raisons : 1. contrairement aux rongeurs, la brebis présente l'avantage d'avoir un développement ovarien similaire à la femme. 2. De plus, ce modèle a déjà été validé dans nos unités. - 40 brebis saillies seront utilisées pour la détection de 25 brebis gestantes qui rentreront dans la procédure. Cet effectif doit permettre d'assurer la production de descendants assez conséquente pour poursuivre nos travaux. - 20 descendants mâles seront étudiés de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 20 descendants femelles seront étudiées de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 16 femelles pubertes sur les 20 entreront dans la 2ème phase de l’expérimentation (de J168 jusqu’à J235).

Soumises à une chirurgie d'une heure au maximum pour déclencher la formation d'un caillot dans une artère, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent jusqu'à six injections sous la peau et une injection derrière l'œil sous anesthésie, le porteur indiquant que des saignements oculaires peuvent apparaître après l'administration des antiplaquettaires et que le caillot peut migrer et provoquer un accident vasculaire cérébral chez la souris. L'objet du projet est de suivre l'évolution d'un caillot occlusif sur un jour puis sur une semaine et de tester des molécules ciblant les plaquettes. Les retombées annoncées pour les patients sont renvoyées au long terme, quand la carotide et le cerveau de chaque souris sont prélevés après sa mise à mort.

Objectifs

L’hémostase est le processus biologique assurant l’arrêt des saignements. Elle implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion du vaisseau, vont former un agrégat, appelé clou plaquettaire, qui limite le saignement. Un processus similaire intervient lors de la thrombose artérielle qui survient dans une artère malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à la rupture de cette plaque, les plaquettes forment un agrégat pouvant entrainer des pathologies graves comme un accident vasculaire cérébral (AVC). Dans certains cas, l’agrégat peut boucher le vaisseau ce qui stoppe totalement la circulation sanguine. Le but de ce projet est de mieux comprendre l’évolution d’un agrégat occlusif au cours du temps, sa sensibilité à des traitements contre les plaquettes ainsi que sa potentielle évolution vers un AVC.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre l’évolution d’une thrombose occlusive ainsi que d’étudier l’impact du ciblage de différents récepteurs plaquettaires sur celle-ci. A long terme, cela nous permettra d’améliorer la prise en charge des patients présentant une thrombose artérielle occlusive et de réduire les séquelles à long terme de cette pathologie, comme l’AVC ischémique.

Procédures

Le modèle nécessite une procédure chirurgicale pour induire la thrombose, celle-ci sera de maximum 60 min. Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées (maximum 6) et rétro-orbitales (maximum 1) (animal anesthésié).

Impact sur les animaux

Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Des saignements pourraient apparaitre au site d’incision ou site chirurgical. Des signes de douleur peuvent également apparaitre après l’intervention chirurgicale, notamment au niveau du site chirurgical. On pourrait observer des saignements au niveau de l’œil suite à l’administration des traitements antiplaquettaires. De plus, le thrombus pourrait emboliser et entraîner un accident vasculaire cérébral (AVC) chez la souris.

Devenir

Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure afin de récupérer la carotide et le cerveau pour réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier l’évolution d’une thrombose occlusive au cours du temps ainsi que le rôle de différents récepteurs plaquettaires. La pathologie étudiée, la thrombose artérielle, étant un processus particulièrement complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, globules blancs) ainsi que les conditions hémodynamiques (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus. De plus, nous ne disposons pas à l’heure actuelle de modèle de thrombose occlusive in vitro. Nous souhaitons également évaluer l’évolution du thrombus sur de longue période (1j et 1 semaine), ce qui est impossible in vitro du fait que le sang doit être utilisé dans les 4h suivant son prélèvement.

Réduction

Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 10 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs sont calculés par des tests statistiques adaptés, le critère recherché est la comparaison de moyennes.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Aucun geste n’est réalisé sur animal vigile, nous n’avons donc pas prévu d’habituation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une habituation au gel nutritif 3 jours avant l’opération • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin de lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie ainsi que son réveil en boite thermostatée à 37°C • Par l’injection d’analgésique et d’anesthésique local avant chaque procédure en sous-cutanée et également appliqué sur l’œil après injection intraveineuse. • Par application de gel ophtalmique sur les yeux lors de l’anesthésie afin de les protéger, et par injection d’1 mL de sérum physiologique à la fin de la procédure chirurgicale pour assurer l’hydratation de l’animal en plusieurs points d’injection (au moins 2). Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles de thrombose artérielle. De plus, les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant certains récepteurs plaquettaires humains, permettant ainsi de tester de nouveaux traitements de la thrombose artérielle. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Une exception sera faite pour un type de souris car leur carotide est plus grosse à âge égal, elles seront utilisé à 1 mois afin de générer une thrombose suffisante.