Diagnostic des maladies

1 300 cochons, moutons, bovins et chiens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation d'un dispositif vasculaire, parfois précédée d'une seconde intervention destinée à lui créer la lésion à traiter, par section d'un nerf, découpe de tissu ou ligature d'un vaisseau. Ces opérations peuvent durer plusieurs heures et s'accompagnent d'une mise à jeun de douze à seize heures, de prélèvements de sang hebdomadaires et d'une douleur postopératoire que le porteur annonce sur plusieurs jours. La mise à mort finale sert à ouvrir les corps pour évaluer la tolérance et la durabilité des implants, dans un cadre que le porteur présente comme une "obligation règlementaire" pour la mise sur le marché de dispositifs médicaux.

Objectifs

Le système vasculaire comprend les réseaux artériels et veineux qui, reliés à la pompe cardiaque, permettent de faire circuler le sang dans l'ensemble de l'organisme et d'assurer la perfusion de tous les organes. La circulation veineuse est connectée avec le réseau des vaisseaux lymphatiques qui vient s'y déverser avant le coeur. Les pathologies vasculaires telles que les thromboses, les sténoses, les anévrismes, les traumatismes, etc... avec leurs conséquences telles que les accidents vasculaires cérébraux ou l'infarctus du myocarde représentent un enjeu majeur pour la santé publique et constituent une préoccupation croissante avec l’augmentation des populations à risque liée au vieillissement de la population, à la sédentarité et aux nouveaux modes de vie. L’implantation ou la mise en oeuvre de techniques et dispositifs médicaux vasculaires (endoprothèses, filtres, stents, delivery systems, cathéters, ballons et guides ou encore dispositifs pour embolisation ou pour thrombectomie par exemple) sont des approches thérapeutiques indispensables pour soigner ces maladies mais aussi pour permettre un accès régulier au compartiment vasculaire (exemple des chambres implantables pour dialyses ou chimiothérapies). Avec le développement de nouvelles technologies, les limites des actes chirurgicaux sont sans cesse repoussées avec le souci permanent de réduire le traumatisme chirurgical et les complications, de raccourcir les temps opératoires et les phases de récupération. La chirurgie mini-invasive, la chirurgie assistée par la robotique, la chirurgie transluminale, la chirurgie endovasculaire, la chirurgie vasculaire sous coelioscopie sont autant d’exemples qui illustrent ces avancées et la transformation de la pratique de la chirurgie vasculaire. Ce projet de recherche a pour objectif le développement et l'évaluation de nouveaux dispositifs et techniques pour le traitement des affections vasculaires au niveau des coronaires, des vaisseaux périphériques et des vaisseaux cérébraux."

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes. - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Des procédures chirurgicales d'implantation de dispositif vasculaire avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'implantation de dispositif vasculaire associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal dont une mini-invasive pour la création de modèle lésionnel. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins/bovins, 12 heures pour les chiens) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type lésion nerveuse, création d'un defect tissulaire, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des examens d'imagerie, scanners, IRM par exemple), par l'interrogation des dispositifs, et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux : recours systématique à l’anesthésie générale avec prise en charge de la douleur durant les interventions d’imagerie, pendant et après les procédures chirurgicales, utilisation de tapis chauffants et suivi du réveil. La réalisation des examens d’imagerie sur le site même des animaleries permet de réduire au maximum le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués. Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés à cette fin. - Le système vasculaire du mouton, du porc et du chien reproduisent fidèlement les réactions vasculaires humaines et le processus de cicatrisation des vaisseaux est similaire à celui observé chez l'homme. - La taille relative de ces modèles animaux permet une visualisation à l'aide d'équipements angiographiques et échographiques standards. - Chez l'ovin, la taille des veines iliaques externes est comparable à celle des humains. - Le modèle porcin est pertinent pour l'évaluation de la thrombogénicité des dispositifs. - Les débits et les volumes dans la veine cave inférieure ou les veines jugulaires du canidé peuvent être similaires à ceux des veines fémorales humaines, la structure hémodynamique des veines est similaire à celle des veines fémorales humaines. - Le modèle veau est pertinent pour les endoprothèses aortiques complexes. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

Les images produites doivent illustrer un brevet en cours de rédaction et servir de base à la création d'une startup. 66 souris jeunes adultes vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe trois séances d'IRM sous anesthésie, dont une de trois heures avec injection d'un agent de contraste au fer, puis deux séances d'une heure à trois et sept jours pour vérifier son élimination. Le porteur retient trois animaux par agent testé, "le nombre minimal permettant de conclure qualitativement", et prévoit de les maintenir en vie pour les réutiliser dans un autre projet.

Objectifs

Les agents de contraste IRM sont des molécules destinées à améliorer la qualité des images en réhaussant le signal là où elles sont présentes (hypersignal). Cela permet, lors d’un examen par IRM, de mettre en évidence certaines régions difficiles à visualiser. Les agents de contraste utilisés en IRM sont majoritairement à base de gadolinium. Certains, dits « linéaires », sont instables et peuvent relarguer du gadolinium dans l’organisme, avec accumulation dans divers organes (reins, os, cerveau). Ce phénomène est lié à des complications telles que la fibrose systémique néphrogénique, notamment chez les patients en insuffisance rénale sévère. En 2017, l’Agence européenne des médicaments a recommandé de restreindre l’usage de certains agents linéaires et de suspendre de nouvelles autorisations. Depuis, plusieurs produits ont été retirés du marché, et les radiologues appliquent une vigilance renforcée. Les agents restants, bien que plus stables, restent contre-indiqués chez des populations à risque : femmes enceintes, enfants en bas âge, personnes âgées, patients transplantés ou insuffisants rénaux, et ceux nécessitant des examens fréquents. Face à ces limites, l’équipe porteuse du projet développe depuis plus de 15 ans des agents de contraste à base de fer, un élément naturellement présent dans l’organisme, doté de écanismes de régulation et d’élimination. Ces nouveaux agents sont prometteurs pour réduire le risque chez les patients sensibles, tout en offrant une efficacité diagnostique équivalente, voire supérieure. Les études in vitro ayant montré une bonne biocompatibilité, le projet entre en phase préclinique. Cette étape vise à évaluer leur comportement en IRM, leur pharmacocinétique et leur tolérance, en vue d’un futur transfert clinique.

Bénéfices attendus

Les acquisitions d’images réalisées illustreront et exemplifieront le brevet en cours de rédaction, qui constitue la base de la propriété intellectuelle nécessaire pour développer le projet et créer une startup. Ces études précliniques représentent une étape cruciale, en démontrant l’intérêt médical et la faisabilité pratique de la technologie. La preuve de concept ainsi apportée est essentielle pour obtenir les financements nécessaires au développement d’un agent de contraste destiné à l’humain, qui représente un investissement important. Par ailleurs, les images recueillies valideront pré-cliniquement la structure des molécules testées, permettant ainsi de sélectionner la molécule candidate pour la suite des démarches réglementaires et des essais en conditions de bonnes pratiques de laboratoire (Good Laboratory Practice GLP) En définitive, ces résultats favoriseront l’avancement du projet vers la phase clinique et, ultérieurement, sa commercialisation en tant que nouvel agent de contraste pour l’IRM.

Procédures

Les animaux subiront trois séances d'imagerie IRM sous anesthésie générale à l’isoflurane et une injection unique de produit de contraste lors de la première séance (3 heures); deux séances supplémentaires (1 heure) sont prévues trois et sept jours plus tard afin de vérifier l'élimination complète du produit. Cette injection sera réalisée de manière systémique 15 minutes après la procédure d’anesthésie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus, bien que rares, sont de même nature que pour une injection de produit de contraste commercial : hypersensibilité, réaction anaphylactique, allergie cutanée, vasodilatation, malaise, fièvre, nécrose tissulaire, phlébite au point d’injection. La concentration sera identique à celle que l'on injecte classiquement chez l'humain et sera strictement inférieure à la dose létale médiane mesurée sur cellules vivantes. La déshydratation de l’animal suite à la première session d’imagerie qui durera trois heures, ainsi qu’une dessication des yeux sont prévus et pris en charge par la procédure expérimentale.

Devenir

Les interventions effectuées sur les animaux sont compatibles avec un maintien en vie des animaux et ceux-ci pourront être réutilisés dans un autre projet.

Remplacement

Ce projet, à la frontière entre la recherche fondamentale (de par la totale nouveauté des concepts moléculaires développés) et la recherche appliquée (valorisée par un futur brevet), a permis la réalisation d’une preuve de concept in vitro. Dans une optique de développement du concept moléculaire vers un agent d’imagerie à destination de l’humain, effectuer des tests de biocompatibilité, de performance et de pharmacocinétique in vivo de molécules sur petit animal est une étape indispensable avant le passage chez l’Homme (essais cliniques réglementaires). Dans ce but, aucune autre procédure ne peut remplacer cette étude.

Réduction

Le nombre total estimé d'animaux nécessaire est basé sur le nombre maximum d'agents de contraste à tester avec aux plus trois animaux par agent, trois étant le nombre minimal permettant de conclure qualitativement sur l'intérêt pour l'imagerie IRM d'un agent de contraste donné. C’est la raison pour laquelle le projet n’utilisera pas d’animaux de réforme, afin de garantir une comparaison fiable des données avec le nombre limité d’animaux utilisés. Les animaux seront imagés deux fois supplémentaire pour vérifier la présence ou non d’hypersignal dans certains tissus. L’IRM étant une technique d’imagerie non-invasive, elle permet de réduire par trois le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée selon la dernière directive en vigueur. Nous placerons des boîtes percées dans les cages en guise de raffinement de l’habitat. Le transport des animaux sera effectué sur une distance d’une cinquantaine de mètres via un chariot sur roues pneumatiques atténuant toutes vibrations pour être imagés. Les animaux subiront une procédure avec un temps d’anesthésie inférieur à trois heures. Les rongeurs seront conditionnés dans un lit dédié à l’exploration anatomique, chauffé par thermorégulation par système de circulation d’eau chaude avec monitoring de la respiration et suivi de température. On injectera aux animaux une solution de sérum glucosé chauffée à température corporel : 0.5mL seront injectés après le début de l’anesthésie, puis 1mL juste avant leur réveil afin de les réhydrater. On instillera une goutte d’Ocrygel dans chaque oeil de l’animal pour prévenir de la dessication oculaire. Notre attention sera portée sur les procédures expérimentales pouvant causer un stress ou une douleur telle que l’injection intraveineuse d’agents de contraste. Les animaux replacés à l’animalerie seront suivis quotidiennement. .

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus adaptée pour évaluer pré-cliniquement les agents de contraste sur l’instrument d’IRM préclinique à disposition. Le faible volume corporel de la souris permet une imagerie précise et résolue du corps entier. En effet, l’instrument est adapté à l’imagerie de petits rongeurs en disposant d’une cavité adaptée et d’un lit adapté. De plus, le faible volume sanguin de la souris implique un faible volume d’injection et donc la production d’une quantité d’agent de contraste acceptable pour le laboratoire de chimie qui produit les AC. Les souris utilisées seront au stade de développement « jeune-adulte ». Elles seront commandées à l’âge de 5 semaines

Neuf porcs seront tués en pleine phase aiguë de la maladie d'Aujeszky pour constituer un stock d'organes infectés utile au laboratoire. 21 porcs de 13 semaines vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Inoculés par voie oro-nasale, ils subissent trois fois par semaine deux écouvillonnages nasaux, deux écouvillonnages oro-pharyngés, un brossage des amygdales et une ponction de 13 ml de sang, auxquels s'ajoutent chaque jour ouvré un recueil de salive et un essuyage du groin, avec une fièvre pouvant durer plus d'une semaine, de l'anorexie et de la prostration. Une friandise au sirop de grenadine leur est distribuée après chaque acte. L'effectif de neuf animaux consacré à la collecte d'organes se fonde sur une estimation des "besoins" du laboratoire pour ses dix prochaines années.

Objectifs

La maladie d’Aujeszky (MA) est une maladie virale touchant les porcs et les sangliers. Elle se caractérise par des troubles nerveux entrainant la mort chez les jeunes et des signes respiratoires et des troubles de la reproduction chez les adultes. De nombreux pays d’Europe ou d’Amérique sont indemnes de MA en élevages de porcs mais le virus est présent dans les populations de sangliers de plusieurs pays ce qui constitue une menace constante pour les porcs domestiques. Par ailleurs, la MA est toujours présente en Europe de l’Est et en Asie. Les protocoles d’échantillonnages à réaliser en cas de doute clinique de MA sont fondés sur des études et méthodes relativement anciennes. Depuis ces vingt dernières années, les méthodes de diagnostic ont évolué de même que les outils disponibles pour la collecte d’échantillons (nouveaux matériaux pour les écouvillons, collecte de fluide oral…). Il est donc nécessaire de mettre à jour les données concernant la détection du virus dans les différents types d’échantillons disponibles en utilisant les méthodes de diagnostic actuelles pour aider à la mise en place des plans d’urgence dans les pays touchés par la MA. Dans l’objectif d’acquérir de nouvelles données, le projet expérimental proposé ici aura pour objectifs de 1) comparer les performances de diagnostic de différentes méthodes de prélèvements (écouvillonnage nasal, écouvillonnage oropharyngé, brossage d’amygdales), de 2) tester des approches alternatives de prélèvements pour le diagnostic (fluide oral, lingette nasale, prélèvement d’air), de 3) collecter des tissus positifs vis-à-vis de la MA utiles pour les activités du laboratoire, et enfin d’ 4) acquérir des données sur une souche isolée récemment et qui est représentative des souches circulant chez le sanglier.

Bénéfices attendus

La comparaison des performances de diagnostic en fonction des différents prélèvements génèrera des données utiles aux autorités qui mettent en place une surveillance clinique de cette maladie dans leurs pays. En outre, les tissus positifs collectés au cours de ce protocole seront utilisés pour les activités du laboratoire. Ils pourront notamment être utilisés pour organiser des essais inter-laboratoires permettant de vérifier l’aptitude des laboratoires à réaliser un diagnostic de la maladie à partir d’organes.

Procédures

Tous les actes prévus sur les animaux se feront sur animaux vigiles. Selon les groupes, les animaux recevront 5ml par voie oro-nasale de virus de la maladie d’Aujeszky (2 souches différentes seront utilisées) ou de milieu de culture (lot contrôle). L’inoculation oronasale prend moins d’1 minute. La moitié des animaux inoculés avec du virus sera mise à mort lors de la phase aigüe de la maladie afin de collecter des organes positifs alors que tous les autres animaux (infectés et témoins) seront suivis pendant 3 semaines post-infection. Tout au long de la procédure expérimentale, les animaux infectés par le virus de la MA seront soumis 3 fois par semaine aux prélèvements suivants : 2 écouvillons nasaux, 2 écouvillons oro-pharyngés, 1 brossage amygdalien et 1 ponction sanguine (total de 13ml). De plus, tous les jours du lundi au vendredi, du fluide oral individuel sera collecté (1ml de salive) ainsi qu’une lingette nasale (gaze de 4cm x 4cm utilisée pour essuyer le groin de l’animal). Un prélèvement d’air quotidien sera effectué à l’échelle de la salle. La cadence de prélèvements du lot contrôle sera plus faible que celle prévue pour les lots infectés, l’objectif étant de s’assurer de la conservation de leur statut négatif et de la spécificité des techniques sans générer un nombre excessif de prélèvements. Ainsi ce lot sera prélevé 1 fois par semaine (mêmes prélèvements que ceux indiqués ci-dessus). Tous ces actes sont réalisés par un personnel très expérimenté et sont effectués le plus rapidement possible (environ 1 minute 30). A l’issu de ces actes, les animaux sont récompensés par la distribution d’une friandise type sirop de grenadine.

Impact sur les animaux

Les signes cliniques induits par une infection des porcs par le virus de la maladie d’Aujeszky sont dépendants de l’âge des animaux et de la souche utilisée. Si l’infection de jeunes animaux provoque des signes neurologiques et une forte mortalité, l’infection de porcs de plus de 3 mois se limite généralement à une forte fièvre, une baisse d’appétit et des troubles respiratoires. Compte tenu de l’âge des animaux (13 semaines) et des souches qui seront utilisées dans ce projet, aucune symptomatologie sévère n’est attendue. Les signes cliniques attendus sont : de la fièvre pouvant durer plus d’une semaine, de l’anorexie, de la prostration, des problèmes respiratoires, de la toux et des éternuements. Un soin particulier sera apporté au suivi clinique quotidien de chaque porc. Un suivi rapproché sera mis en œuvre dès que l’évolution de l’état de santé d’un animal le nécessitera. L’animal concerné sera observé le matin, en début d’après-midi et en fin de journée (y compris le week-end) afin d’évaluer l’évolution de son état de santé et de procéder à sa mise à mort en cas d’atteinte de l’un des points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour pouvoir récolter des prélèvements d’organes et, pour certains d’entre eux, de gros volumes de sang.

Remplacement

Pour répondre aux objectifs de ce projet, il n’y a aucune possibilité de remplacement du modèle animal par une étude in vitro ou in silico.

Réduction

Pour répondre aux objectifs 1 et 2 de l’étude, il est nécessaire d’avoir 6 porcs infectés avec une souche de référence et qui seront suivis jusqu’à la fin de la procédure de façon à avoir des données statistiques fiables. Le nombre de 3 porcs témoins est l’effectif minimal pour permettre de s’assurer de la conservation de leur statut négatif et de la spécificité des techniques de prélèvement. Enfin, le nombre de 3 porcs infectés avec la souche nouvellement isolée est l’effectif minimal pour obtenir des données préliminaires relatives à cette souche, qui seront comparées aux données des 6 animaux précédemment mentionnés (objectif 4). L’effectif de 9 animaux pour la collecte d’organes (objectif 3) se base sur une estimation des besoins du laboratoire pour ses activités des dix prochaines années. Il n’est pas possible d’attendre la fin de la procédure et d’utiliser les 12 porcs mentionnés ci-dessus (pour les objectifs 1, 2 et 4) puiqu’à ce stade de l’infection, le virus de la MA ne sera plus présent dans la plupart des organes. Il est donc nécessaire de collecter ces organes lors de la phase aigüe de la maladie pour avoir des organes positifs.

Raffinement

L’expérimentation sera conduite dans le respect de l’éthique et du bien-être des animaux. Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de la durée du projet. Ils seront répartis dans 4 animaleries contenant chacune un à deux parcs. Du début à la fin de la procédure, chaque parc accueillera 3 animaux. Les porcs seront alimentés et abreuvés à volonté. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets type "mordille", "tourniquet", etc. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine leur sera distribuée. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal pendant toute la durée de la procédure expérimentale. En cas d’atteinte d’un des points limites, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du virus de la maladie d’Aujeszky. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de cette procédure. Les porcs seront sevrés à 4 semaines d’âge. Ils seront inoculés à 13 semaines d’âge (phase d’engraissement). Cet âge a été choisi pour que les animaux survivent à l’infection et ainsi permettre de suivre l’excrétion virale pendant 3 semaines post-inoculation.

Les souris de ce projet sont immunodéficientes et humanisées, la rate qu'on leur retire étant remplacée par des fragments de rate humaine, y compris de rate fœtale. 1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de quarante-cinq minutes, jusqu'à huit prélèvements sanguins répartis sur 112 jours et une échographie de quarante-cinq minutes tous les quatorze jours, leur immunodéficience les exposant par ailleurs aux infections. Le porteur justifie la mise à mort par le fait que ces animaux sont modifiés et greffés de tissu humain, et prévoit de proposer les rates murines retirées à des équipes d'immunologistes du campus comme source de cellules.

Objectifs

Le premier objectif du projet est d’explorer expérimentalement le rôle de filtration de la rate et les différents mécanismes physiques et biologiques à l’origine de la rétention des globules rouges dans la rate, en particulier dans le cadre de maladies héréditaires (drépanocytose, sphérocytose héréditaire, ...) ou acquises (Paludisme,...). Dans ces maladies, la déformabilité des globules rouges est altérée, entraînant une rétention dans la rate à l’origine d’anémie et de complications pouvant être graves. Les mécanismes d’anémie et de congestion de la rate sont complexes et requièrent un modèle expérimental. Les modèles murins conventionnels ne sont pas totalement pertinents pour analyser cette fonction physiologique et les mécanismes physiopathologiques. Des souris greffées par des fragments de rate humaine permettraient en revanche d’aborder ces questions. La filtration des globules rouges est un phénomène dynamique, tridimensionnel et multicellulaire, impossible à répliquer entièrement in vitro dans l’état actuel de la technique. L’étude aura également pour objectif d’étudier la prise de greffe et le développement de fragments de rate fœtale. Cela permettra d’analyser la fonction filtrante et immunologique de ces rates immatures en considérant que leur développement reflète – ou non – en partie la poursuite de leur développement physiologique. En deuxième objectif, nous souhaitons explorer la faisabilité de l’auto-greffe splénique humaine afin de restaurer une fonction déficiente, sur le modèle de la préservation de la fertilité par cryopréservation-réimplantation différée des ovaires en médecine humaine. Chez les patients atteints de drépanocytose, une splénectomie est parfois nécessaire du fait de complications graves. La cryopréservation d’une partie du tissu splénique permettrait sa réimplantation et la restauration d’une fonction splénique normale chez les patients guéris ultérieurement de leur drépanocytose. Démontrer dans le modèle murin la prise de greffe avec des fragments de rate humaine serait une indication forte du succès possible de notre démarche. La probabilité de succès est élevée du fait du phénomène de splénose (repousse de petits fragments spléniques), observé tant chez l’être humain que chez la souris.

Bénéfices attendus

La rate joue un rôle crucial dans le système immunitaire et aide à maintenir une circulation fluide des globules rouges en éliminant ceux qui pourraient obstruer les petits vaisseaux. En cas de certaines maladies des globules rouges, la rate peut devenir hyperactive, entraînant une anémie et d'autres complications. Les mécanismes exacts de ces processus ne sont pas encore bien compris. Un processus spécifique appelé "pitting" permet à la rate d'éjecter des corps rigides ou des parasites morts des globules rouges sans les endommager. Ce processus est difficile à étudier en laboratoire, car il nécessite l'utilisation de rates humaines, qui sont rares et limitées. Pour mieux comprendre ces mécanismes, l’étude propose de greffer des fragments de rate humaines sur des souris afin d'observer directement la filtration des globules rouges et d'évaluer les effets de médicaments sur la déformabilité des globules rouges. Ce modèle pourrait également être utilisé pour des interventions thérapeutiques ou prophylactiques. L’utilisation de rates fœtale permettrait également d’étudier la maturation de ces dernières dans notre modèle. La perte de fonction splénique peut entraîner des complications graves. Après une rupture de rate traumatique, la rate peut se régénérer spontanément, ce qui suggère qu'une réimplantation contrôlée de tissu de la rate pourrait améliorer le pronostic à long terme des patients. Cette étude préclinique est une étape nécessaire avant de solliciter l'agence de la biomédecine pour la mise en œuvre d'une démarche ambitieuse de préservation de la fonction de la rate chez l'être humain, ce qui pourrait avoir de grands bénéfices pour certains patients.

Procédures

Les animaux dans ce projet expérimental seront soumis : Procédure 1 : - 2 à 6 injections (15sec) sur animaux vigiles répétables toutes les 8-12h - 1 à 3 injections (15sec) sur animaux vigiles répétables toute les 8-12h - 1 chirurgie (45 min) sur animaux anesthésiés et analgésiés - 8 prélèvements sanguins sur animaux vigiles (30 sec) répétés tous les 14 jours sur une période totale de 112 jours - 1 échographie tous les 14 jours sur animaux endormis jusqu’à 112 jours (45min) Procédure 2 : - Pour l’ablation de la rate et la greffe, les interventions seront les mêmes que pour la procédure 1 - 1 échographie tous les 14 jours sur animaux anesthésiés jusqu’à un temps déterminé en procédure 1 (45 min) sur animaux anesthésiés - 2 injections (30 sec) espacées de 3 jours si besoin - 1 injection sur animaux endormis (2min) - 5 prélèvements sanguins (30sec) de faible volume répété à 1 min, 30 min, 2h, 24h et 48h - Imagerie sur animaux anesthésiés durant un temps défini ne dépassant pas 4 heures

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sont immunodéficiente ce qui augmente leurs sensibilités aux infections. Les injections et prélèvements de sang peuvent causer une douleur légère et temporaire à chaque site d'injection. La piqure d’aiguille pour l’injection elle-même provoque une douleur légère de courte durée. La chirurgie (exérèse de la rate, greffe) quant à elle, entraîne une douleur et un inconfort modérés.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront mis à mort car étant des organismes génétiquement modifiés et/ou greffés et/ou injectés avec du tissu humain ils ne peuvent pas être réutilisés ou replacés.

Remplacement

La démarche n'est pas directement applicable chez l'être humain et nécessite une étape préclinique. Les seules données antérieures disponibles sur cette démarche de greffe de rate humaine ont été obtenues chez la souris. Les modèles in vitro et ex vivo préalablement développés présentent des limites dans leur puissance d’exploration (visualisation directe de la filtration des globules rouges, évaluation de l’impact des médicaments in vivo), ne pouvant être franchies que par l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre de souris impliquées est réduit au maximum pour confirmer la faisabilité de la démarche et évaluer les médicaments avant leur utilisation chez l'être humain. Nous souhaitons nous assurer d'une probabilité de prise de greffe fonctionnelle supérieure à 70%. L’utilisation de l’échographie pour évaluer la prise de greffe lors de nos procédures permet un suivi transversal permettant de réduire le nombre d’animaux. Les rates murines enlevées lors de la splénectomie préparatoire seront proposées à des équipes d’immunologistes du campus comme source de cellules. Le nombre d’animaux a été défini avec un biostatisticien et à l’aide d’un outil statistique où nous considérons deux groupes et 3 répétitions. Chaque répétition sera divisée en 4 jours d'expériences, avec 2 animaux par groupe et par jour. Par conséquent, nous considérons un effet aléatoire jour qui inclut à la fois les effets de la répétition et du jour. Un effet lot/jour pourrait représenter 10,00 % de la variabilité totale, ce qui nous amène à multiplier le nombre total d'individus par un facteur adapté par rapport à une situation où aucun effet de lot n'est attendu. Résolution statistique de l'expérience : Nous avons décidé d'utiliser 8 individus par groupe et par répétition, ce qui porte le nombre total d'individus à 48. En tenant compte d'un effet lot/jour de 10,00 %, ces nombres devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des effets importants à très importants.

Raffinement

Le choix du modèle animal participe au raffinement en sélectionnant une espèce et une souche adaptées aux objectifs scientifiques tout en minimisant l’inconfort. Leur immunodéficience impose un hébergement en conditions sanitaires strictes où tout ce qui sera en contact avec les animaux sera stérile pour limiter les risques infectieux. Les interventions chirurgicales et injections seront faites sous anesthésie gazeuse avec une analgésie adaptée afin de limiter la douleur, le stress et d’optimiser la récupération. Des plaques chauffantes préviendront l’hypothermie, une réhydratation post-opératoire sera assurée, et un gel appliqué pour éviter le dessèchement oculaire. Les greffons stériles seront traités afin de garantir une asepsie maximale et prévenir toute infection ou réponse inflammatoire. La greffe sera effectuée là où la rate se régénère naturellement. Cette technique est privilégiée car elle est robuste et évite une nouvelle incision. L’échographie permet un suivi transversal des animaux et déceler des signes précoces de nécrose des greffons. Les animaux seront observés quotidiennement, avec des critères d’évaluation précis basés sur les recommandations de la SBEA. Des points limites spécifiques et précoces, tels qu’une perte de poids, des signes de détresse, des signes inflammatoires ou d’infections sont identifiés et pourrons permettre de traiter l’animal avec l’avis du vétérinaire et le cas échéant, la mise à mort sera réalisée.

Choix des espèces

Notre objectif est de développer des mesures fiables et indépendantes de fonctionnement anormal de la rate. Nous utilisons plusieurs techniques. Les marqueurs actuels, peu adaptés aux contraintes hospitalières, nécessitent une validation plus robuste comme prédicteurs de gravité. Le produit final visé est un test biologique de routine quantifiant la fonction splénique. Pour atteindre cet objectif, un modèle expérimental animal est indispensable. Après avoir testé diverses hypothèses physiopathologiques et agents pharmacologiques in vitro, nous devons désormais confirmer nos résultats in vivo pour proposer de nouvelles solutions thérapeutiques. Un modèle murin est essentiel, car les systèmes moins évolués ne reflètent pas suffisamment le contexte humain. L’humanisation du modèle murin par greffe d’organes humains a déjà permis des avancées significatives dans la compréhension de plusieurs phénomènes physiopathologiques. De jeunes adultes de 8 semaines seront utilisés afin d’être suffisamment âgés pour permettre une chirurgie aisée et suffisamment jeunes pour permettre un suivi prolongé (3 mois). De plus, cet âge correspond à l’âge des souris dans l’article publié sur lequel nous nous basons pour ce projet.

Ce sont des brebis gestantes au dernier tiers de leur gestation qui sont opérées, à 125 jours pour un terme de 145, parce que la cible réelle de l'étude est leur fœtus. 212 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque brebis subit une chirurgie d'environ quatre heures sous anesthésie générale, puis une anesthésie loco-régionale destinée uniquement à prélever le sang du fœtus, à raison de huit prélèvements par journée de manipulation. Une même brebis sert à plusieurs expérimentations, ce que le porteur décrit comme une façon d'"optimiser au maximum l'utilisation de l'animal". À la fin du projet, il annonce la mise à mort d'environ 60 brebis gestantes et de leurs fœtus, et une vingtaine de brebis en adoption possible, celles qui auront perdu leur fœtus ou mis bas prématurément.

Objectifs

La majorité des patientes en salle de naissance bénéficie d’une analgésie devant les douleurs entraînées par les contractions utérines lors du travail. Leur mise en place peut provoquer une instabilité de la fréquence cardiaque et de la tension artérielle maternelle transitoire lors de l’injection des médicaments, et entraîner des anomalies du rythme cardiaque fœtal. L’impact d'une césarienne ou d'une anesthésie générale ou d'une péridurale maternelle sur l’hémodynamique fœtale et le retentissement sur le système nerveux autonome reste peu connu, et sa compréhension est nécessaire afin de diminuer la morbi-mortalité fœtale.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à observer une modification des paramètres fœtaux sanguins et cardiaques plus importante en cas d’analgésie type césarienne par rapport aux autres analgésies. L’impact serait en pratique clinique d’adapter l’analgésie maternelle pour diminuer le risque d’hypoxie foetale et ses complications (lésions cérébrales anoxo-ischémiques). Cette étude permettra également de déterminer l’effet sur le coeur et la tension artérielle des sédations foetales lors d’une réanimation à cordon intact afin d’optimiser la prise en charge des nouveaux-nés vulnérables.

Procédures

Chaque brebis sera soumise à une chirurgie sous anesthésie générale d'une durée d'environ 4 heures, une seconde anesthésie cette fois loco régionale sera réalisée sans objectif d' incision mais uniquement pour les prélèvements sanguins chez le foetus, ces prélèvements serviront pour la vérification des gaz du sang (valeur de pH, quantité d’oxygène et de dioxyde de carbone dans le sang etc), et l’évaluation du retentissement de l’anesthésie effectué. Les quantités prélevées seront de 0,3 ml à raison de 8 prélèvements par journée de manipulation. Chez la brebis ces prélèvements serviront à évaluer le retentissement son état sanguin en comparaison à l'état sanguin de son foetus.

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu serait la douleur modérée pendant et suite à la chirurgie de la brebis gestante, dont la prise en charge de la douleur est optimisée pendant les manipulations et par un protocole anti douleur après les manipulations durant 3 jours par Buprénorphine.

Devenir

Après une évaluation de l’état général des brebis à l’issue de la chirurgie par l’expérimentateur (sensibilisé au bien-être animal) et les zootechniciens, les animaux ne seront pas euthanasiés à la fin de la 1ere procédure. Ils seront hébergés dans une animalerie conventionnelle et agréée. A la fin des procédures et du projet, ou en cas de point limite atteint, les animaux seront euthanasiés, soit environ 60 brebis gestantes et leur fœtus. En cas de perte fœtale inopinée (mises bas prématurées ou perte fœtale due à l'anesthésie), nous comptons environ 20 brebis en possible adoption.

Remplacement

L’étude du fœtus humain n’est possible qu’en cas d’expérimentation non invasive et après validation des hypothèses au préalable chez l’animal. En effet d’un point de vue éthique, il n’est pas justifié de réaliser une expérimentation qui comporte un risque de perte fœtale (la réalisation de prélèvements sanguins ou la mesure de façon invasive de la pression artérielle moyenne sur le fœtus par abord cordonal est techniquement possible mais avec un risque de perte fœtale de 3 à 10%). Aucun modèle non animal ne pourrait permettre de réaliser ce projet.

Réduction

Plusieurs procédures expérimentales sont incluses dans ce projet. Les fœtus d’agneau seront leur propre témoin ce qui limitera le nombre d’animaux nécessaires pour le protocole. L’étude consistera à comparer l’état de base des paramètres de fréquence cardiaque et pression artérielle des foetus, de leur signal cérébral et des paramètres sanguins à la réponse obtenue lors d’une analgésie et sédation maternelle et fœtale. Le nombre d'animaux déterminé par une approche statistique est d'environ 8 à 12 animaux par groupe expérimental.

Raffinement

Chaque brebis arrive 10 jours au moins avant la date de la chirurgie afin de s'acclimater à son nouvel environnement. Les brebis sont livrées au minimum par 2 afin de réduire le stress du transport. Les brebis sont hébergées à plusieurs en permanence dans les box et aucune brebis ne sera seule hébergée afin de réduire le stress lié à la solitude. La manipulation sera effectuée sous anesthésie générale avec un protocole spécifique d'anesthésie, d'anti douleur et d'antibiotique préventif. Les expérimentations seront débutées 4 jours après la chirurgie et une même brebis sera utilisée pour plusieurs expérimentations afin d’optimiser au maximum l’utilisation de l’animal. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale : Après une pose de Voie veineuse centrale en jugulaire, un remplissage de 1L de Ringer Lactates, ainsi qu’une pré-oxygénation au masque, la sédation se fera par une injection de Kétamine IV 0.5mg/kg suivi de propofol IV 2 à 3mg/kg (titration jusqu’à perte de conscience), et un maintien à l’isoflurane (AErane®) enfin une injection per opératoire IV continue de kétamine à 0.1-0.25mg/kg/h. Les animaux bénéficieront de protocoles antalgiques adaptés (Buprénorphine BUPAQ® (0,04 à 0,06 mL/kg en intramusculaire) lors de la période pré et post-opératoire.

Choix des espèces

Le modèle animal doit avoir des caractéristiques morphologiques et physiologiques proches du modèle humain. C’est le cas de la brebis, qui est un mammifère avec une gestation de singleton ou de jumeaux, dépendante du placenta et de la circulation foeto-placentaire. Le poids et la circulation du fœtus d’agneau sont proches de ceux du fœtus humain. Sa taille est suffisante pour permettre la pose de cathéters vasculaire, en limitant le risque de perte fœtale liée à la chirurgie. Des études sur plusieurs jours sont possibles chez le fœtus d’agneau instrumenté ce qui permet de limiter le nombre d’animaux par projet. Ce modèle est reconnu par la communauté scientifique comme le modèle animal le plus proche pour étudier la physiologie fœtale, ce qui justifie la pertinence de notre choix. Notre protocole de recherche est sur le foetus. Il est donc nécessaire d’utiliser des brebis gestantes. Notre expéri-mentation aura lieu lors du dernier tiers de la gestation (intervention à 125 jours pour un terme de 145 jours). Cet âge gestationnel est nécessaire pour que le fœtus soit suffisamment gros pour la chirurgie, pour la pose de cathé-ters vasculaires (2500 à 3000 g) et pour limiter les risques de perte fœtale per opératoire.

Deux heures d'IRM sous anesthésie, la tête maintenue par des barres d'oreilles : 240 souris et 40 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour confronter les images aux analyses histologiques. Avant cela, chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique de 45 minutes pour recevoir dans le cerveau un vecteur viral ou une protéine pathologique, avec douleur et perte de poids possibles pendant un à trois jours. Une lignée de souris présente en outre un risque de crises d'épilepsie vers l'âge de deux mois. Le porteur défend le choix des rongeurs en concédant que ces modèles des maladies d'Alzheimer et de Parkinson sont "imparfaits", tout en les qualifiant d'"indispensables".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer, la maladie de Huntington ou la maladie de Parkinson appartiennent à une classe de maladies neurodégénératives (les protéinopathies) causées par des protéines mal repliées ou mal dégradées qui s’agrègent dans le cerveau. Outre leur perte de fonction initiale due au mauvais repliement, ces protéines solubles acquièrent des fonctions toxiques, notamment en s’agrégeant et se propageant dans le cerveau. De plus, il existe actuellement un débat scientifique sur la nature des agrégats de ces protéines qui présentent des degrés variables de toxicité et des caractéristiques de propagation conduisant à différentes formes de maladies. De plus en plus de personnes âgées souffrent de protéinopathies, et en particulier de la maladie d’Alzheimer et de la maladie de Parkinson. Il est d’un intérêt considérable de pouvoir distinguer les formes solubles et agrégées des protéines impliquées dans les maladies d’Alzheimer et de Parkinson, de quantifier leur agrégation précocement et de surveiller leur propagation de manière non invasive. Cela permettra de mieux comprendre la physiopathologie de ces maladies neurodégénératives en recherche fondamentale et préclinique, et à terme, de disposer d’un outil de diagnostic et de suivi. Une modalité d'IRM relativement récente appelée CEST (Chemical Exchange Saturation Transfer) a été proposée pour imager les protéines avec une excellente résolution spatiale. Elle pourrait notamment permettre de distinguer les protéines solubles des agrégats de protéines. Ainsi, l'objectif principal de notre projet est d'établir un outil de surveillance et de diagnostic des maladies d’Alzheimer et de Parkinson reposant sur l'imagerie non invasive d'agrégats protéiques spécifiques impliqués dans ces maladies neurodégénératives. Notre deuxième objectif est de mieux comprendre les voies pathologiques (agrégation, propagation à travers les structures cérébrales) de chaque type de protéines, et comment celles-ci, selon leurs propres caractéristiques, peuvent provoquer des formes de maladies différentes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de faire de l’IRM-CEST une nouvelle modalité diagnostique pour les maladies neurodégénératives. Cette approche offrirait des avantages significatifs à la recherche fondamentale et préclinique pour une meilleure compréhension des processus pathologiques impliqués dans ces maladies et en fournissant des biomarqueurs pertinents pour l’évaluation des traitements futurs. Elle profiterait également à la recherche clinique, puisque toutes les méthodes développées sont transférables sur des scanners cliniques.

Procédures

- Tous les animaux (280) seront scannés à l’IRM sous anesthésie (durée : 2h00). - L’injection d’un vecteur viral (qui permet d’introduire dans les cellules cérébrales un gène codant pour la protéine pathologique) sous anesthésie profonde (durée de la chirurgie : 45 min) sera réalisée sur 40 animaux et sous conditions stériles. - L’injection de la protéine d’intérêt ou d’un liquide contrôle sous anesthésie profonde (durée de la chirurgie : 45 min) sera réalisée sur 240 animaux et sous conditions stériles. L’analgésie est toujours utilisée avec l’anesthésie lors des chirurgies.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à ce que certaines chirurgies puissent causer de la douleur, du stress ou une perte de poids temporaire. Des effets indésirables (stress ou douleur) peuvent durer pour un temps variable d’une journée à 3 jours après l’opération. Un risque de stress cardio-respiratoire est aussi présent lors de l’anesthésie. Cetrtaines souris peuvent présenter un risque de crise d’épilepsie vers l’âge de 2 mois.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de confronter les mesures in vivo aux résultats histologiques.

Remplacement

Ce projet fait appel à deux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer ainsi qu’un modèle rat de la Maladie de Parkinson déjà caractérisés. A l’heure actuelle, ce projet ne peut pas être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des techniques informatiques. En effet, les symptômes neurologiques cognitifs de la maladie ne peuvent être répliqués que chez l’animal. Par ailleurs, les régulations hormonales ou les réactions inflammatoires liées aux maladies d’Alzheimer et de Parkinson ne peuvent pas être reproduites dans des modèles cellulaires 2D ou des organoïdes. Enfin, l’étude de la diffusion des protéines Tau dans le cerveau requiert toute la complexité des réseaux neuronaux qui se mettent en place au cours de la maturation et du vieillissement du cerveau. Il est donc nécessaire de réaliser ce projet sur des espèces modèles mammifères comme la souris et le rat, présentant le plus possible de similitudes avec la physiologie humaine, c’est-à-dire possédant un cerveau complexe permettant d’exprimer des comportements sophistiqués.

Réduction

Le nombre maximal d’animaux utilisés pour ce projet (280 animaux dont 240 souris et 40 rats) a été défini au plus juste pour atteindre les objectifs scientifiques et être statistiquement pertinent compte-tenu de nos connaissances au début du projet. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation d’un logiciel in vivo, approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis. Par ailleurs, les techniques de neuro-imagerie développées dans ce projet permettent un suivi des animaux au cours du temps. Ceci permet d’augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre l’objectif scientifique.

Raffinement

- Examens IRM (sous anesthesie) : la douleur liée à l’utilisation de barres d’oreilles pour stabiliser l’animal est minimisée par application locale d'analgesie 5 minutes avant. - Stéréotaxies (sous anesthésie) : Un analgésique est administré 30 min avant la chirurgie ainsi qu’en post-opératoire. Une analgésie locale est mise en place 5 minutes avant l’incision chirurgicale et la douleur liée à l’utilisation de barres d’oreilles pour stabiliser l’animal est minimisée par application locale d'analgésie 5 minutes avant. Les animaux sont thermorégulés durant toute l’anesthésie jusqu’au réveil complet après réversion de l’anesthésie. - Points limites établis pour réduire la souffrance et le stress des animaux. En cas de perte de poids des animaux, une administration d’eau gélifiée enrichie en vitamines et glucose sera mise en place. - Des points limites spécifiques sont également prévus pour couvrir le risque de crise convulsive d'une lignée souris . Une surveillance quotidienne sera également mise en place pour minimiser les risques de crises d’épilepsie non détectées. - Les animaux sont hébergés en groupe, dans environnement à température contrôlée, avec un cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Les animaux sont examinés quotidiennement par les donneurs de soin, sous supervision permanente du vétérinaire du centre, également en charge du bien-être animal. L’environnement est enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire.

Choix des espèces

Les modèles rongeurs sont pertinents car ils peuvent être observés in vivo par des scanners IRM à haute performance et ce, malgré la petite taille de leur cerveau. Par ailleurs, le projet de recherche est basé sur des modèles reconnus de la maladie d’Alzheimer et de la maladie de Parkinson. Bien qu'imparfaits, les modèles rongeurs de ces maladies neurodégénératives permettent d'étudier certains aspects de la pathologie et sont indispensables pour progresser dans la compréhension des mécanismes qui lui sont associés. Les animaux seront adultes afin de se placer dans des conditions expérimentales qui permettent de reproduire l’évolution de la maladie qui touche des adultes.

Une tumeur devenue trop grosse ou une perte de poids déclenchent la mise à mort immédiate de la souris. 70 souris de huit à dix semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Des cellules de cancer du poumon leur sont injectées sous la peau, la tumeur est mesurée deux fois par semaine, et un mois plus tard commencent des séances d'imagerie magnétique sous anesthésie réparties sur trois semaines. Le porteur qualifie l'inoculation de la tumeur de "souffrance ou angoisse légère de longue durée", et annonce comme finalité d'augmenter la survie des patients traités par radiothérapie et de conduire à une "rémission totale", quand l'objet immédiat se limite à suivre où vont des nanoparticules d'oxyde de fer.

Objectifs

La radiothérapie (RT) fait aujourd’hui partie intégrante de la lutte contre le cancer. Toutefois, et en dépit des nombreux progrès récents, la principale limitation de la RT réside dans son manque de sélectivité spatiale lors de l’irradiation de la zone cancéreuse. De récentes études ont mis en évidence des propriétés radiosensibilisantes pour les nanoparticules d’oxyde de fer (IONPs). Dans ce projet nous testerons ce type d’IONPs dans un modèle de cancer du poumon. Plus précisément, nous étudierons les profils de biodistribution des IONPs après leur administration en utilisant un imageur (appelé imageur par particule magnétique ; MPI) qui permet de détecter le signal magnétique des IONPs. Nous comparerons des IONPs non fonctionnalisées et des IONPs fonctionnalisées avec un peptide spécifique des tumeurs pulmonaires. L’utilisation de ces modèles murins nous permettrait d’étudier le potentiel de nos IONPs de façon bien plus pertinente qu’un modèle in vitro eu égard des contraintes de biodistribution. Ce projet vise à améliorer l’efficacité de nanomatériaux à caractère théranostique, c’est à dire qui permette à a fois le diagnostic des tumeurs tout en améliorant l’effet thérapeutique de la radiothérapie ; théranostique = thérapeutique + diagnostique. Elles pourraient permettre le suivi de la progression du cancer en imagerie à particule magnétique tout en améliorant son traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre du test de l’efficacité de nouveaux nanomatériaux à caractère théranostique (= thérapeutique + diagnostique) dans le cadre de la lutte contre le cancer. Il est attendu que ceux-ci auront un effet thérapeutique en augmentant l’efficacité des traitements par radiothérapie, tout en permettant le suivi du développement ou de la régression des tumeurs. Cet aspect nous semble particulièrement important au vu de la haute prévalence des traitements par RT en cancérologie moderne et de ses principales limitations (dont le manque de sélectivité spatiale lors de l’irradiation de la zone tumorale). À long terme, nous pouvons donc dire que la finalité de cette étude est donc d’augmenter la survie des patients traités par radiothérapie et de conduire à une rémission totale.

Procédures

Une inoculation de cellules tumorales sera réalisée par injection sous cutanée. Cette injection se fait sous anesthésie n’excédant pas 30 minutes. Au cours des semaines suivant cette injection, un suivi de la taille de la masse tumorale est réalisé 2 fois par semaine. Cette mesure rapide ne nécessite ni mesures de contention ni anesthésie. Une fois la tumeur développée, un mois après l’inoculation, les souris seront étudiées en imagerie par particule magnétique MPI. Pour cela les souris seront anesthésiées, un agent de contraste sera administré et les souris seront placé dans l’imageur sous anesthésie, en suivant la profondeur de l’anesthésie via la vitesse de respiration et le scan d’imagerie sera effectué. Dans la mesure où cette procédure est suivie d’une imagerie, l’animal sera anesthésié pendant l’injection (cette anesthésie a une durée estimée de moins d’une heure). Des examens d'imagerie des particules magnétique auront lieu périodiquement pendant un maximum de 3 semaines.

Impact sur les animaux

L’inoculation en sous-cutané des cellules tumorales peut entrainer une souffrance ou une angoisse légère de longue durée et avoir une incidence légère sur le bien-être ou l'état général de l’animal, nous surveillons pour cela que la taille de la tumeur et la présence de signe de souffrance. L’administration des particules d’oxyde de fer (IONPs) n’est pas associée à d’effets secondaires susceptibles de porter atteinte au bien-être de l’animal. L’évolution de la masse tumorale et de la biodistribution des IONPs seront évalués par des techniques d’imagerie non ionisante et non invasive. Par conséquent, l’inconfort généré lors de cette manipulation sera limité à l’anesthésie de l’animal. Il en découle que les animaux sont susceptibles d’éprouver un inconfort et une angoisse transitoire et de faible intensité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier précisément ex vivo la localisation des particules d'oxyde de fer au sein de la tumeur.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisé sur les particules d’oxyde de fer afin de sélectionner en amont la meilleure synthèse de ces particules. A ce stade, nous devont étudier le dévenir des particules d’oxyde de fer après leur administration dans un organisme, leur intéraction avec un tissu tumoral et la capture par le système immunitaire qui impact la biodistribution. Il est impossible d’étudier ces aspects complexes d’interaction avec la biologie des particules d’oxyde de fer sans utiliser de modèle animal.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux utilisés passe par l’utilisation d’un protocole d’induction et de suivi de la masse tumorale déjà mis en place et optimisé par l’équipe des chercheurs travaillant sur ce projet. Le caractère non-invasif et non-ionisant des méthodes d’imagerie in vivo employées permet de suivre le même animal au cours du temps, plutôt que de mettre un animal à mort à différent temps pos-injection. Le nombre total de souris nécessaire pour le projet a été calculé avec un test de puissance statistiques et en estimant la perte de certains animaux. Nous avons donc réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir les informations nécessaires à l’étude de la biodistribution de nos particules d’oxyde de fer, et leur interaction avec un tissu tumoral.

Raffinement

Pendant les procédure d'inoculation des cellules tumorales en sous-cutanée, les souris seront maintenus sous anesthésie. Un analgésique est également administré 20 min avant le début de la procédure. La température de la souris est maintenue avec un tapis chauffant autorégulé à 37°C et un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux. L’application d’analgésique local est également utilisé. Après la procédure, les animaux sont suivis régulièrement et une attention particulière est porté sur la présence de signe de souffrance ou de mal être de l’animal. Si des signes clairs de souffrance sont observés en terme de perte de poids, apparence ou comportement révélateur de mal être et taille de la tumeur trop importante, l’animal est mis à mort immédiatement afin de limiter au maximum la souffrance.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée dans le cadre de ce projet est la souris âgée de 8 à 10 semaines, correspondant au stade de jeune adulte. Ce choix est justifié par des considérations scientifiques, physiologiques et éthiques. La souris possède un système immunitaire et vasculaire relativement proche de l’homme et nous savons que les phénomènes de biodistribution et d’intéraction avec le système immunitaire observés seront très similaires chez l’homme. Le stade de souris jeune adulte permet une meilleure standardisation du modèle tumoral, en assurant une réponse homogène à l'inoculation tumorale et en limitant la variabilité interindividuelle. De plus, cet âge est le plus approprié pour tolérer l'anesthésie, la croissance tumorale contrôlée et les procédures répétées (manipulations, imagerie, etc.), sans entraîner de détérioration prématurée de l’état général.