Diagnostic des maladies
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
EVALUATION DE DEUX NOUVEAUX CAPTEURS MINIATURISES DE BIO-AEROSOLS POUR LA CARACTERISATION DE L’INFECTION PAR QUATRE AGENTS PATHOGENES IMPLIQUES DANS LE COMPLEXE RESPIRATOIRE PORCIN
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
40 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, pour comparer des capteurs d'air à des prélèvements sur animaux vivants. Ils sont inoculés avec quatre agents pathogènes respiratoires, puis subissent pendant trois à six semaines des prélèvements répétés de mucus trachéal, des écouvillonnages, des prises de sang et des collectes d'air. Le porteur indique que l'infection par Actinobacillus pleuropneumoniae peut provoquer une forte fièvre et la mort dans les 48 heures chez dix porcs, les autres agents ne devant pas entraîner de symptômes sévères. Tous les porcs sont mis à mort par saignée sous anesthésie pour obtenir des prélèvements de qualité.
Objectifs
Le complexe respiratoire porcin (CRP) constitue l’une des maladies les plus fréquentes affectant les porcs élevés dans de grandes collectivités en bâtiment. Il est responsable de pertes économiques importantes pour la filière porcine. L’origine du CRP est multifactorielle. Au niveau des facteurs infectieux, le CRP résulte de la combinaison d’infections par plusieurs agents pathogènes. Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp), les virus influenza A porcins (swIAV) et le virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (SDRPV) représentent les principaux agents pathogènes impliqués et Actinobacillus pleuropneumoniae (App) dans une moindre mesure. Différents travaux ont montré que ces agents infectieux peuvent être détectés dans l’air mais la viabilité dans l’air de ces agents infectieux est actuellement mal documentée. Le projet propose d’évaluer les capacités de nouveaux capteurs de bioaérosols (utilisant une collecte à sec par voie cyclonique ou par voie électrostatique) à détecter et quantifier quatre agents pathogènes impliqués dans le CRP et excrétés dans l’air par des porcs infectés, à savoir Mhp, App, les swIAV et le SDRPV. Ces capacités de détection seront comparées à celles des prélèvements sur animaux vivants, lesquels sont considérés comme étant la référence pour mettre en évidence l’excrétion de ces agents. Les prélèvements de référence sur animaux sont le prélèvement de mucus trachéal pour Mhp, l’écouvilllonnage amygdalien pour App et l’écouvillonnage nasal pour les swIAV et le SDRPV. Des prélèvements sanguins seront en outre effectués pour suivre la virémie SDRPV et la séroconversion vis-à-vis des pathogènes afin de confirmer les infections. Le projet vise également à évaluer la viabilité des bactéries et des particules virales contenues dans les aérosols collectés à partir de ces équipements. Le projet poursuit aussi l’objectif de décrire la composition de l’air exhalé par des porcs infectés.
Bénéfices attendus
La disponibilité de techniques de prise d’air pratiques et faciles à mettre en œuvre, alliées à des techniques de laboratoire performantes ouvrirait la voie à l’utilisation des prélèvements d’air comme nouvelle méthode pour le diagnostic des infections respiratoires. Sous réserve que l’échantillonnage d’air associé à des techniques de laboratoire ad hoc soit aussi performant que les prélèvements sur animaux vivants pour la détection et la quantification d’agents infectieux, le prélèvement d’air constituerait une alternative plus respectueuse du bien-être des animaux. Les techniques considérées comme « référence » pour la mise en évidence des infections respiratoires varient selon les agents pathogènes. Une prise d’air permettrait la recherche de multiples agents infectieux et simplifierait les modalités pratiques de collecte des échantillons diagnostic pour les gestionnaires de la santé du porc. Ce type d’outil permettrait de plus de suivre les cinétiques d’excrétion et de transmission des pathogènes dans des conditions expérimentales et de terrain. Au final, l’échantillonnage d’air et la qualification de ceux-ci vis-à-vis des agents pathogènes du CRP permettrait d’améliorer les connaissances sur les voies de transmission aéroportée et de mettre en œuvre des mesures de gestion appropriées pour réduire les probabilités de survenue de ces évènements.
Procédures
Des prélèvements seront réalisés sur chacun des porcs avant inoculation. Après inoculation, les animaux seront prélevés 3 fois par semaine pendant 6 semaines pour 3 expérimentations (lots infectés par Mhp, App ou SDRPV ; 18 interventions post-inoculation (pi)/porc) et 3 fois par semaine pendant 3 semaines pour l’expérimentation impliquant un swIAV (9 interventions pi/porc). La cadence de prélèvements des lots témoins sera plus faible que celle prévue pour les lots infectés, l’objectif étant de s’assurer de la conservation de leur statut négatif et de la spécificité des techniques sans générer un nombre excessif de prélèvements. Les lots témoins seront prélevés 1 fois par semaine (6 interventions pour les lots associés aux lots infectés par Mhp, App ou SDRPV et 3 interventions pour le lot associé au lot infecté par un swIAV). Selon l’agent pathogène inoculé, une partie des prélèvements sur animal vigile va différer afin de correspondre au prélèvement servant de référence pour suivre la durée d’excrétion. Du mucus trachéal sera prélevé sur chacun des porcs du lot inoculé par Mhp et son lot témoin (
Impact sur les animaux
Hormis une hyperthermie et une baisse d’appétit temporaires et des troubles respiratoires (toux, dyspnée), il n’est pas attendu de symptomatologie sévère suite à l’inoculation par Mhp, un swIAV ou le SDRPV (n=18 animaux). Toutefois, l’infection par App peut entrainer une hyperthermie transitoire et de la mortalité dans les 48 h post inoculation (n=10 porcs). En cas d’atteinte de points limites préalablement définis, les porcs seront mis à mort afin qu’ils ne souffrent pas.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par une méthode permettant la récolte de prélèvements de bonne qualité. Ils seront tout d’abord anesthésiés avec un agent pharmacologique puis la mise à mort se fera par saignée. Il est nécessaire de saigner correctement les porcs afin d'obtenir des prélèvements de bonne qualité impactant directement les résultats des analyses.
Remplacement
Une alternative non animale disponible tiendrait à l’aérosolisation de chaque agent infectieux avec un générateur d’aérosols. Toutefois, cette technique physique ne reproduit pas totalement le processus naturel d’excrétion et d’aérosolisation qui se produit au niveau de l’organisme de l’animal. En effet, cette technique pourrait impacter négativement la viabilité des particules infectieuses générées artificiellement. Le projet ayant pour objectifs d’étudier la capacité de deux capteurs de particules à détecter des particules infectieuses viables dans l’air exhalé par des animaux lors d’un épisode infectieux et de quantifier la charge microbiologique des aérosols infectieux, l’utilisation d’une technique produisant des aérosols de manière artificielle et pouvant réduire la viabilité même des agents infectieux dans ces aérosols n’est pas envisageable. L’expérimentation consistant en la génération naturelle d’aérosols par les animaux, il n’y a aucune possibilité de remplacement du modèle animal par une étude in vitro ou in silico.
Réduction
Ce projet impliquera 40 porcs. Ce nombre d’animaux utilisés sera le plus faible possible tout en permettant l’estimation précise des performances de détection des capteurs de particules.
Raffinement
Les porcs seront élevés en groupe stable, bénéficieront d’un enrichissement social et auront à leur disposition des objets manipulables (mordilles, boules plastiques, tourniquets et tubes à relever et abaisser). Ils seront nourris et abreuvés à volonté. Du premier au dernier jour de l'essai, les animaux seront examinés quotidiennement. En cas d’atteinte de points limites préalablement définis, les porcs seront euthanasiés afin qu’ils ne souffrent pas. La cadence de prélèvements du lot témoin sera plus faible que celle prévue pour les lots infectés, les objectifs étant ici de s’assurer de la conservation de leur statut négatif et d’estimer les capacités des capteurs à réveler l’absence d’infection sans générer un nombre excessif de prélèvements. Un système de récompense sera proposé aux porcs une fois l’ensemble des prélèvements réalisé afin d’associer un moment positif aux manipulations opérées pour les besoins du projet.
Choix des espèces
Le porc est l’espèce cible de Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, des virus influenza porcins et du virus du SDRP. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions des procédures expérimentales. Les animaux impliqués dans ces expérimentations auront entre 5 et 6 semaines de vie au début de l’étude. Les modèles expérimentaux ont été précédemment validés à ces stades physiologiques ce qui permettra de s’affranchir d’une étape de validation de chaque modèle expérimental.
Etude comparative de la physiopathologie de l’infection induite par le virus Marburg, souche Popp ou Musoke, chez le macaque cynomolgus et validation d’outil diagnostic associé.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
12 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont infectés par le virus Marburg, proche d'Ebola, et devraient développer fièvre, perte de poids, chutes de tonus et symptômes hémorragiques avant leur mise à mort, avec prélèvements de liquide céphalo-rachidien et de moelle osseuse. Le porteur prévoit une mise à mort dès l'atteinte d'un score clinique qu'il qualifie de "limite éthique" et décrit l'étude comme une étape pilote sans test statistique. Il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas une maladie dans un organisme "entier" et que le primate est le seul modèle reproduisant l'infection humaine.
Objectifs
L’étude des maladies infectieuses émergentes (MIE) ou ré émergentes occupe un intérêt majeur en santé publique et dans la recherche scientifique ; et cet intérêt a augmenté depuis l’apparition du SARS-CoV-2. Ainsi, l’état français a décidé de renforcer les capacités de la France à répondre aux épidémies, en mettant l’accent sur le développement d’outils de diagnostic/détection des MIE, mais également en appuyant la recherche, le développement et l’innovation dans la mise au point de traitements contre ces maladies. Notre étude cible le virus Marburg (MARV), de la même famille que le virus Ebola (Filoviridae). Identifié en 1967, il provoque chez l’homme une fièvre hémorragique, dont les symptômes s’apparentent à ceux de la grippe, puis dégénère en une forme plus sévère provoquant saignements, forte fièvre, troubles vasculaires, neurologiques, pulmonaires, douleurs musculaires, et dont l’issue est fatale dans 80% de cas. Ce projet expérimental s'articule autour de deux volets : 1) la caractérisation de la physiopathologie induite par deux souches différentes de MARV (Popp et Musoke), à travers une étude préliminaire réalisée chez le macaque cynomolgus. La description de l'infection de ce modèle animal, par ces deux souches de virus, est une première étape clé pour la mise au point et la validation de nouveaux vaccins ou molécules antivirales. Les souches Musoke et Popp étant disponibles au laboratoire, ce projet portera donc sur la caractérisation de la pathogénicité de la souche Popp en comparaison à la souche Musoke, cette dernière étant déjà décrite. Les animaux seront suivi périodiquement afin de pouvoir étudier l’apparition des symptômes au regard de modifications des constantes biologiques de l’animal. La physiopathologie induite par les deux souches sera également confrontée à l’apparition de la virémie infectieuse et moléculaire mise en évidence à partir de prélèvements sanguins. Pour pouvoir détecter rapidement et efficacement la présence du virus dans le sang d’animaux, il est nécessaire de développer des systèmes de détection moléculaires sensibles et sécurisés. 2) la validation d'un outil de diagnostic dit "au lit du patient". Cette technologie, repose sur l’utilisation d’un système clos de cartouche dans laquelle l’échantillon biologique sera aussitôt traité pour en détecter la présence du virus MARV par PCR en temps réel.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra la mise en place d’un outil de diagnostic robuste, offrant un avantage considérable en termes de sécurité biologique. De plus, la caractérisation de l’infection chez le primate non-humain, ici le macaque cynomolgus, par voie intramusculaire par MARV (en particulier la souche Popp), posera les bases d’un nouveau système pour l’évaluation in vivo de nouvelles cibles thérapeutiques ou de vaccins ciblant ces pathogènes. 1) Avantages de la caractérisation l’infection de MARV chez le macaque cynomolgus : à court terme, cela permettra de poser les bases d’un modèle détaillé pour l’infection par la souche Popp encore très peu décrite. La comparaison avec la souche Musoke permettra de confirmer et compléter les données de la littérature. Cette étude, première expérimentation du virus MARV chez le primate non-humain (PNH) dans notre laboratoire, nous permettra de développer une table de scoring plus adaptée qui sera appliquée lors de nouvelles expérimentations. Les données obtenues seront partagées au sein de la communauté scientifique. A moyen/long terme, il s'agit de proposer un modèle bien établi ciblant la famille des filovirus (modèle décrit pour Ebola) pour la validation et l’évaluation d’outils thérapeutiques et prophylactiques, étant un enjeu de majeur depuis l’apparition de la Covid-19. 2) Les objectifs de la détection du virus MARV par les cartouches sont de permettre une mise sur le marché d’un outil de diagnostic rapide et sécurisé et à plus long terme, un déploiement en zone épidémique pour détecter suffisamment tôt une infection et en limiter ainsi sa propagation. Cet outil a déjà été mis à disposition en Afrique de l’ouest (détection du virus Ebola, épidémie 2014-2016). De nombreux automates ont été envoyés afin d’augmenter la capacité locale de diagnostic. La mise sur le marché de ces cartouches (détection MARV), viendra renforcer cette capacité à l’aide d’un système rapide (durée réduite du prélèvement au résultat), simple (peu de gestes techniques, limités au dépôt d’échantillon en cartouche), sécurisé (inactivation de l’échantillon en système fermé), et en une seule étape (lyse, extraction d’acides nucléiques et réaction PCR). Le développement de nouvelles cartouches ciblant d’autres agents responsables de fièvres hémorragiques virales, de groupe de risque 4, se poursuivra dans les prochaines années.
Procédures
La procédure expérimentale soumettra les animaux à des anesthésies (au nombre de 12 prévues dans la procédure expérimentale et d'une durée de 1h à 2h selon les individus) et à des prélèvements lacrymaux, salivaires, vaginaux et sanguins sur animaux anesthésiés (11 sessions de prélèvements prévues dans cette procédure expérimentale). Lors de l'atteinte de point limite ou de la fin du protocole, les animaux seront anesthésiés, puis les prélèvements de LCR (liquide céphalo-rachidien) et de moelle osseuse seront réalisés avant de procéder à la mise à mort.
Impact sur les animaux
La procédure concernée dans ce projet sera de classe sévère et concernera 12 animaux. Les animaux, suite à l'infection par l'une ou l'autre des souches de MARV, devraient présenter des signes cliniques caractéristiques d'une infection par un filovirus et plus particulièrement par MARV, tels qu'une dérégulation de la température corporelle, une perte de poids, une diminution de l'alimentation et de l'hydratation, une perte de tonus et des symptômes hémorragiques. Les animaux présentant des points limite ou un score clinique de 15 (selon notre matrice de score), représentant la limite précoce d'un état de la maladie devenant une limite éthique en termes de douleur/détresse de l'animal, seront anesthésiés puis mis à mort. Une autopsie avec collecte d'échantillons sera alors réalisée.
Devenir
L'étude comparative de la physiopathologie induite par les deux souches virales d'intérêt implique que les organes et les tissus puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux de l'étude (n=12), ceux-ci étant répartis en deux groupes infectés différemment (n=6) et composés chacun d'un égal nombre de mâles et de femelles (n=3 et n=3, respectivement). Par conséquent, seule la mise à mort des 12 animaux de l'étude permettra d'obtenir des données statistiquement robustes.
Remplacement
Il existe désormais plusieurs méthodes alternatives in vitro, dérivées de la culture cellulaire classiquement utilisée depuis des décennies. Ces nouvelles technologies tendent à recréer artificiellement les interactions inter cellulaires que nous pouvons retrouver dans l'organisme. Citons par exemple le développement de la culture cellulaire en trois dimensions, ou encore la culture d'organoïdes, sphéroïdes ou d'organes sur puce. Dans tous les cas, il s'agit de reconstituer la structure organisationnelle de systèmes cellulaires complexes ex vivo, afin de mimer les conditions observées in vivo. Ces avancées récentes ont déjà permis d'étudier des questions complexes et multidimensionnelles telles que l'apparition de la maladie, la régénération tissulaire ou bien les interactions entre organes. Bien que très prometteuses, ces techniques restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées, tout en étant multi factorielles. Dans le cadre de notre étude, elles ne permettent pas, pour l'instant, de répondre à des questions globales telles que l'apparition d'une maladie dans un système vivant "entier", le développement symptomatologique ou la mise en place des réactions immunitaires dans leur ensemble. Lors du développement d'un outil de diagnostic (PCR par exemple), les preuves d'efficacité incluent, généralement en première intention, des tests réalisés sur des échantillons mimant les conditions retrouvées sur le terrain. Ainsi, du virus mélangé dans des matrices complexes telles que le plasma, le sang total, la salive, etc. permettent de récréer des prélèvements "naturels" et ainsi valident le test. Cependant, l'outil n'est définitivement validé qu’après avoir été éprouvé à partir de "vrais" prélèvements issus de patients. La complexité de la matrice et les variabilités inhérentes aux individus peuvent induire des résultats imprévisibles et bien différents de ceux observés artificiellement in vitro (présence d'inhibiteurs, changement de composition de la matrice ...). Afin de répondre à nos questions et pour toutes les raisons citées précédemment, il est impossible de remplacer l'utilisation d'un organisme vivant complexe. Le modèle primate non-humain (PNH) est, pour l'étude de l'infection du virus MARV, le seul organisme pouvant reproduire ce qui se passe chez l'homme.
Réduction
Il s’agit dans ce projet de réaliser une étude pilote portant sur la description de la physiopathologie induite par deux souches d’un même virus, MARV. Pour permettre cette caractérisation tout en intégrant la variabilité inter-individuelle, les groupes seront constitués de 3 animaux de chaque genre. Ce nombre de 12 animaux a été réduit au maximum afin d’obtenir des résultats interprétables et robustes tout en restant en accord avec les capacités d’hébergement de l’animalerie : 6 animaux seront challengés avec la souche Musoke, 6 animaux seront challengés avec la souche Popp. S’agissant d’une étude pilote, aucun test statistique n’a été réalisé. Cette étude nous permettra à terme, de pouvoir réaliser des tests statistiques (et de puissance) afin d’établir les groupes d’animaux adéquats lors d’une future étude, portant sur ce modèle animal, infecté dans les mêmes conditions.
Raffinement
Afin d’assurer au mieux le bien-être des animaux, ils seront hébergés en volière par groupes de 3, dans un environnement enrichi avec des dispositifs favorisant l’adoption d’un comportement naturel (perchoir, hamac, jeu, diversification alimentaire…). Les animaux seront implantés par télémétrie, nous permettant de surveiller et d’enregistrer en temps réel, l’activité et la température corporelle des animaux. Un système de vidéosurveillance permettra également de visualiser le comportement des animaux pendant les périodes où ils ne seront pas stimulés par la présence des techniciens. La surveillance via ce système est réalisée quotidiennement en fin de journée, et plus régulièrement pendant la période critique. L'accès aux enregistrements est également possible. En cas de doute sur l’état d’un ou plusieurs animaux, une entrée en laboratoire sera programmée immédiatement pour procéder à une observation en zone et à une possible décision. Une matrice de score, établie pour l’étude de la physiopathologie induite par les filovirus, nous permettra de réaliser un scoring quotidien (éprouvé sur d’autres protocoles utilisant des primates non-humains) qui sera mis en place dès le jour du challenge et des points limites seront définis à l’avance (hypothermie, pyrexie, perte de poids, durée des symptômes, coma post anesthésie, durée de symptômes persistants, …). L’observation d’un point limite ou l’atteinte d’un score supérieur ou égal à 15 points (représentant la limite précoce d'un état de la maladie devenant une limite éthique en termes de douleur/détresse de l'animal) permettra de mettre fin à la procédure expérimentale pour l’animal concerné.
Choix des espèces
Le modèle PNH, étant phylogénétiquement et physiologiquement proche de l'Homme, est un modèle sensible à l'infection par les filovirus. Comme le révèlent les observations de terrain, les PNH développent des syndromes hémorragiques comparables à ceux décrits chez l'Homme, ce qui en fait un modèle de choix pour l'évaluation de stratégies vaccinales, diagnostiques et thérapeutiques. Certains modèles rongeurs (souris, cobaye, hamster), modèles expérimentaux présentant souvent un système immunitaire déficient, sont sensibles à l'infection par le MARV mais présentent des symptômes et pathologies peu comparables à ceux chez l'humain. La littérature décrit quelques études portant sur l'infection par MARV (selon les souches étudiées) chez le macaque, le marmoset et le babouin. Les animaux concernés par ce protocole seront âgés de 2,5 à 3 ans afin de pouvoir caractériser l'infection par le virus Marburg chez des individus bénéficiant d'un système immunitaire mature. Le système d'hébergement PNH du laboratoire ne permet pas l'hébergement et donc l'étude, d'animaux de plus de 3 ans.
Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines virales en utilisant des souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque paire de souris reçoit deux injections d'antigène dans la patte, à douze jours d'intervalle, puis est tuée par dislocation cervicale deux jours plus tard pour prélever les ganglions poplités et en extraire les lymphocytes. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour obtenir des anticorps monoclonaux de souris et que les méthodes de prédiction informatique ne sont pas prouvées pour des antigènes complexes. Il retient la souris plutôt que le rat ou le lapin au motif d'un coût plus faible.
Objectifs
Le but des travaux est d’obtenir des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre des protéines virales de polyomavirus et coronavirus. Ces travaux permettent d’obtenir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus et potentiellement de développer des immunothérapie. Après une semaine d’acclimatation, les souris (2 souris/ antigène) seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution contenant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées). Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration sera réalisée. Les souris seront mises à mort 2 jours après la seconde injection et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes. Les souris seront utilisées par paires en fonction des besoins, une paire de souris permettant de réaliser des anticorps monoclonaux pour un antigène. Ainsi, nous prevoyons un total de 40 souris pour 20 antigènes sur la periode de validité de la saisine (5 ans).
Bénéfices attendus
Le projet vise à produire des anticorps monoclonaux dans le but d'avoir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus. De plus, dans le cas ou ces anticorps sont neutralisants, ils pourront par la suite servir au développement de nouvelles immunothérapies dans des pathologies liées aux Polyomavirus et aux coronavirus.
Procédures
Après une semaine d'acclimatation, les souris seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution comportant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (Adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées) Cette intervention dure environ 1 minute. Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration et la même durée d'intervention sera réalisée. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale 2 jours après la seconde injection (duré d'intervention inférieur à 1 minute) et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes.
Impact sur les animaux
La seule douleur qui sera ressentie sera celle des inoculations par voie intrapodale (aiguilles 26G). L’adjuvant utilisé n’induit qu’une inflammation légère et le volume injecté n'est que de 50 μl/patte. Au vu de la durée de l'expérimentation et de sa nature, génération d'une réponse immunitaire, les animaux n'ont aucune raison rationnelle de developper un syndrome algique suite à l'injection, il n'existe donc pas de point limite strict liée à l'immunisation . Néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux (prostration, pelage hérissé) conduira à leur euthanasie au CO2.
Devenir
Les 40 souris (2/antigène) à J14 seront euthanasiées par dislocation cervicale et prélèvement des ganglions poplités.
Remplacement
Aucune méthode de remplacement n’existe pour l’obtention d’anticorps monoclonaux de souris, l’induction d’une réponse immunitaire in vivo est nécessaire pour l’obtention de ces réactifs. Les methodes informatiques par prédiction n'ont pas encore fait l'objet de preuve de concept pour des antigènes complexes comme des particules virales.
Réduction
Le nombre de souris utilisé (N=2/ antigène) est le nombre minimum de souris requis pour l’obtention d’anticorps monoclonaux, nombre suffisant de lymphocytes.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement physique des cages d'hébergement systématique (abris en plastique rouge transparent et papier absorbant) ainsi qu'un enrichissement social (2/cage)
Choix des espèces
La souris est actuellement l’espèce de référence pour la génération d’anticorps monoclonaux. Les autres espèces utilisables, rat et lapin, sont d’un coût plus élevé. 7 semaines (incluant semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance
Fourniture de primates non-humains équipés en vue de raffiner la réalisation d’études extérieures
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
Macaques à longue queue : 150
Macaques rhésus : 50
Singes vervets : 50
300 primates non-humains, ouistitis, macaques et singes vervets, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, puis transférés vivants vers d'autres laboratoires. Chez un fournisseur, chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie générale, jusqu'à deux heures, pour implanter des cathéters ou des dispositifs de télémétrie, avec douleur et inflammation à l'abdomen et aux membres et une mobilité réduite pendant sept jours. Le porteur présente cette préparation chirurgicale comme un "raffinement" bénéfique pour l'animal et le client, destiné à limiter les ponctions lors des études ultérieures. Les usages finaux, détaillés dans d'autres autorisations, ne figurent pas dans ce résumé.
Objectifs
La préparation des animaux chez le fournisseur en vue de l’utilisation chez les utilisateurs est une étape bénéfique pour l’animal et pour le client. Elle inclut l’équipement des animaux avec des dispositifs permettant de raffiner les études des utlisateurs. En effet, les dispositifs concernés permettront le suivi des paramètres physiologiques de manière non invasive ainsi que la réalisation d’administrations et/ou de prélèvements sanguins répétés en réduisant la douleur liée aux ponctions répétées.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de certaines études, le suivi des paramètres physiologiques (température, activité, ECG, pression artérielle…) est primordial non seulement en tant que variable de mesure mais également dans le cadre de l’application des points limites. L’implant de télémétrie permet de réaliser ce suivi de manière continue et non invasive sur un animal éveillé et libre de ses mouvements et représente ainsi un raffinement de l’étude. De la même manière, certaines études notament pharmacocinétiques peuvent nécessiter de nombreuses administrations ou prélèvements sanguins. L’implantation de cathéters à demeure avec chambre sous-cutanée permet de réaliser ces actes sur animal éveillé sans provoquer de douleur liée aux ponctions répétées. Ainsi, la fourniture de primates équipés permet de raffiner la réalisation d’études extérieures.
Procédures
Tous les animaux impliqués dans ce projet subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale pour l’implantation de matériel d’administration/prélèvement (durée maximum de la chirurgie: 2h) ou de monitoring des paramètres physiologiques (durée maxmimum de la chirugie 1h).
Impact sur les animaux
Stress dû à la contention et la capture, douleur et inflammation locale au niveau de l’abdomen liées à l’implantation du dispositif permettant de suivre les paramètres physiologiques de l’animal et douleur et inflammation locale au niveau des jambes liées à l’implantation des cathéters de prélèvement et d’injection. Durant 7 jours, l’animal peut présenter une réduction de la mobilité.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie après avis favorable d’un vétérinaire pour vérifier leur état de santé et autoriser le transfert des animaux chez le client réalisant l’étude.
Remplacement
Le primate est un modèle de choix pour l’étude de nombreuses pathologies, comme par exemple les fièvres hémorragiques ou encore le SIDA, mais également dans le cadre des études réglementaires de mise sur le marché de nouveaux candidats médicaments. Tous les projets des équipes partenaires dans lesquels les animaux issus du présent projet sont utilisés font l’objet d’une autre autorisation de projet où sont détaillées les raisons pour lesquelles l’utilisation des animaux et donc des primates non-humains ne peut pas être évitée.
Réduction
Le nombre d’animaux déclarés dans ce projet est seulement une estimation à la hausse mais dépendra de la demande. Notre expertise et nos compétences dans le domaine nous permettent de limiter les complications opératoires et donc le nombre d’animaux nécessaires. D'autre part, nous réutilisons des animaux issus de projets antérieurs.
Raffinement
Chaque chirurgie d’implantation est réalisée sous anesthésie générale et couverture antalgique appropriée et est supervisée par l’un des 3 vétérinaires du site. Ce projet ne nécessite pas l’isolement d’animaux, ils seront donc hébergés au minimum par paire. Un temps de récupération post-chirurgie de minimum 7 jours est laissé aux animaux avant tout transfert pendant lequel une surveillance accrue est mise en place pour vérifier l’absence de signes d’infection et de comportements anormaux évocateurs de douleur. Toutes nos animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires…), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises…). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal du site.
Choix des espèces
A ce jour, le primate est le modèle de choix pour de nombreuses études notament dans le domaine infectieux par exemple mais également dans le cadre des études réglementaires de mise sur le marché de nouveaux candidats médicaments. Le choix de l’espèce utilisée par les équipes partenaires dépend de leurs recherches et est dûment justifiée dans chaque autorisation de projet dont elles font l’objet. Animaux jeunes sevrés et adultes (soit entre 8 mois et 30 ans), dépendant des besoins des utilisateurs. Le choix du stade de développement des animaux utilisés par les équipes partenaires dépend de leurs recherches et est dûment justifié dans chaque autorisation de projet dont elles font l’objet. Nous apportons conseil et expertise au client pour un choix pertinent face à la question scientifique posée.
Rôle du gène BAHCC1 dans la croissance in vivo de mélanome
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur de mélanome mesurée deux fois par semaine jusqu'à un centimètre cube, suivie avec ses métastases par bioluminescence sous anesthésie gazeuse, pour caractériser le rôle du gène BAHCC1. Le porteur reconnaît un inconfort lié à la tumeur et aux métastases, avec perte de poids et d'appétit, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la nature agressive du mélanome. Il décrit les objectifs et les bénéfices du projet en une seule phrase quasi identique, centrée sur la caractérisation de la croissance tumorale.
Objectifs
Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 in vivo.
Bénéfices attendus
Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 dans un contexte plus physiologique comparé aux conditions in vitro.
Procédures
Tous les animaux vivants seront suivis pour évaluer deux paramètres : 1- taille de la tumeur primitive au moins 2 fois par semaine pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : les animaux seront éveillés et la taille de la tumeur sera évaluée au pied à coulisse. Durée de intervention 5 minutes pour souris. 2- taille de la tumeur primaire et des lésions secondaires 2 fois par semaine par bioluminescence pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : durant cette procédure les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse (2% d'isoflurane). Durée de intervention 15 minutes pour souris.
Impact sur les animaux
Inconfort généré par la présence de la tumeur primitive et des métastases pouvant entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés par la métastase tumorale.
Devenir
Lot A : 20 animaux subiront les procédures 1 et 2 pour caractériser la cinétique tumorale des 4 lignées cellulaires utilisées pour cette étude (5 souris pour la lignée cellulaire pour générer une étude statistique de base). Lot B : 120 animaux subiront les procédures 1 et 2 qui sont combinées pour analyser la croissance et la cinétique métastatique des tumeurs en présence ou en l'absence de BAHCC1. En raison de la nature agressive du mélanome, toutes les souris seront sacrifiées afin d'éviter tout type de souffrance et de douleur (par inhalation de CO2 ou dislocation cervicale).
Remplacement
Nous avons effectué l'inactivation de BAHCC1 dans des lignées cellulaires humaines in vitro, démontrant son importance pour la prolifération des mélanomes. Cependant, ce modèle a des limites et ne prend en compte ni la croissance dans des conditions tridimensionnelles, ni le rôle du microenvironnement tumoral. Ces caractéristiques ne peuvent être récapitulées que dans un modèle in vivo tel qu'une souris immunodéficiente, facile à manipuler et capable d'héberger des cellules humaines. De plus, notre xénogreffe de souris sera comparée à d'autres modèles de mélanome de souris utilisés par nos collaborateurs de laboratoire.
Réduction
Le nombre total de souris expérimentales sera de 140. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Par ailleurs, plusieurs expériences sont réalisées sur la même cohorte de souris afin de réduire le nombre total de souris nécessaires. L'analyse statistique sera effectuée avec le software GraphPad (Prism 9) avec unpaired t-test ou avec One-way ANOVA non-parametric.
Raffinement
Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale et confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) pour chaque lignée cellulaire injectée à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 1 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des quatre lignées cellulaires utilisées. Toutes les lignées expriment la luciférase, nous pourrons donc surveiller en parallèle le développement et la taille des métastases en mesurant l'activité de la luciférase avec le système IVIS tous les lundis et vendredis de la semaine. La mesure de l’activité luciférase sera effectuée tout au long de la cinétique tumorale avant d'atteindre la taille limite de la tumeur de 1 cm3. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance liée au phénotype, les animaux seront suivis régulièrement et des critères d'évaluation appliqués si nécessaire.
Choix des espèces
Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance de BAHCC1 dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis. Nous utiliserons des souris adultes de 6 semaines qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc.
Utilisation de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) pour la caracterisation des glioblastomes
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, puis des séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements sanguins hebdomadaires, avant l'euthanasie pour prélever le cerveau. Le porteur indique que l'imagerie n'ajoute pas de douleur mais qu'elle sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liés à la tumeur, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. L'objectif reste de valider l'IRM comme outil de suivi tumoral, les retombées pour les patients étant renvoyées à un stade ultérieur.
Objectifs
Le glioblastome multiforme (GBM) est le type de tumeur cérébrale le plus fréquent et le plus mortel. En principe, les médicaments peuvent atteindre les tumeurs via les vaisseaux, mais l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses joue le rôle d'un antagoniste à toute délivrance efficace de médicaments. Les traitements récents associent la chimiothérapie à des médicaments, qui visent à renormaliser les vaisseaux de la tumeur en réduisant l'angiogenèse, c'est-à-dire la ramification de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux existants. Cependant, il n'existe pas encore de facon de distinguer les différents effets du traitement sur les cellules cancéreuses. Le but de ce projet est d’utiliser l'imagerie par résonance magnétique (IRM) afin d'évaluer chez la souris 1) la taille de la lésion tumorale suite à l’implantation de cellules tumorales dans le cerveau 2) les modifications des propriétés visqueuses et élastiques du cerveau qui permettent d'évaluer l'intégrité des tissus et l'organisation vasculaire, 3) la circulation du sang dans les vaisseaux et leur organisation.
Bénéfices attendus
Disposer d’un marqueur biologique identifiable par imagerie robustes et non-invasifs pour évaluer les composants individuels de la t umeur, c'est-à-dire la composition des tissus et l'organisation du réseau des vaisseaux. Ces approches d'imagerie sont donc le moyen idéal pour évaluer les effets de la thérapie sur les tumeurs et l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses.
Procédures
Tous les animaux seront soumis a: 1) Imagerie par résonance magnétique au temps J7, J14, J28, J40 après implantation des cellules tumorales dans le cerveau (J0) pour une duree de 2h par souris (réalisé sous anesthésie gazeuse ) 2) prélèvement sanguin (qui dure environ 5 sec) afin d’évaluer la lésion tumorale 1 fois par semaine sans anesthesie pendant toute la duree du protocole 3) euthanasie pour prélever le cerveau.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. Néanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises telles que l’administration d’ analgésiants. La procédure IRM, qui n'induit pas de douleur, sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liee à l’implantation des cellules tumorales ou a la croissance de la tumeur. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillée et l'animal est placé sur un lit chauffé.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure a fin de recuperer les cerveaux pour les analyses biologiques.
Remplacement
Dans ce projet, l'expérimentation animale sera mise en place pour étudier une modification locale de l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses, qui serait difficile à étudier par des moyens alternatifs (par culture cellulaires ou en modélisation par logiciel).
Réduction
Les groupes ont été conçus de manière à minimiser le nombre d'animaux utilisés. Un calcul statistique du nombre de sujets nécessaires a été effectué afin d'évaluer le nombre d'animaux à inclure pour obtenir des résultats significatifs tout en minimisant le nombre d'animaux. Ces calculs ont été rendus possibles par les résultats antérieurs obtenus avec ces modèles animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur seront limités pour garantir le bien-être de l'animal et des résultats fiables. Le stress a un impact important sur le comportement biologique de la réponse immunitaire. Par conséquent, la manipulation des animaux sera réduite au minimum. Toutes les manipulations seront effectuées sous anesthésie. Les soins et le suivi des animaux seront effectués par des personnes compétentes et expérimentées. De facon systematique, du coton est ajoute dans les cages pour que les souris fassent leurs nids. Les critères d'évaluation de la douleur ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. La douleur observée peut être due à l’implantation des cellules tumorales. Neanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises. Les points les plus précoces sont les troubles du comportement (repli dans un coin, poil hérissé, etc.), l'altération de l'apparence physique (grattage, poil terne, etc.) puis l'anorexie, perte de poids > 20%. Si les points limites sont atteints, l'animal sera euthanasié et ne sera donc pas soumis à la procédure IRM. La procédure IRM, qui n'induit pas de douleur, sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liee à l’implantation des cellules tumorales ou a la croissance de la tumeur. En effet, si le score comme indiqué ci-dessous indique des signes de douleur et donc la nécessité d'utiliser un analgésiant, celui-ci sera administrée avant de se rendre sur le site de l'IRM. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillee et l'animal est placé sur un lit chauffé.
Choix des espèces
L'utilisation des animaux pour etudier le cancer présente de nombreux avantages par rapport à l'utilisation des cellules in vitro (n’utilisant pas de modèle animal). Plus de 80 % des gènes de la souris sont similaires à ceux de l'homme, ce qui a conduit à l'adoption de la souris comme organisme pour etudier la biologie et la thérapie du cancer du cerveau. Beaucoup d'etudes scientifiques ont démontré que les tumeurs dans les animaux, reproduisent mieux les caractéristiques des vaisseaux et des cellules des tumeurs cérébrales humaines. Dans ce contexte, les souris (âge adulte, agées 9-11 semaines) sont soumises à une transplantation dans le cerveau des cellules tumorales, et puis les souris sont soumises au protocole d’IRM pour étudier les propriétés des tissus et développer de nouvelles stratégies diagnostiques.
Étude des agents de contraste capables de détection du zinc – un biomarqueur de cancer de pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart reçoivent une greffe de tumeur du pancréas par chirurgie, puis des injections d'agents de contraste radiomarqués et un prélèvement de sang intracardiaque suivi de la mise à mort, pour étudier la détection du zinc par imagerie. Le porteur indique un suivi par grille de score, avec mise à mort si la perte de poids dépasse 20 % ou si les signes cliniques s'aggravent. Il affirme que la complexité des tumeurs pancréatiques ne peut se modéliser que sur un "organisme vivant entier".
Objectifs
Le zinc revêt un intérêt particulier car il s'agit d'un micronutriment essentiel requis pour plus de 300 processus cellulaires différents. La teneur en zinc est particulièrement importante dans le pancréas : le zinc est relargué avec l’insuline et est impliqué dans le diabète mais aussi dans le cancer pancréatique. C’est estimé que le cancer du pancréas deviendra la deuxième cause de mortalité liée au cancer au cours de la prochaine décennie, dans les pays occidentaux. Son pronostic actuel est extrêmement mauvais avec un taux de survie global à 5 ans de seulement 3% en raison de l'absence de symptômes spécifiques et de l'absence de diagnostic précoce. Des chercheurs ont développé des agents de contraste détectables en IRM sensibles au zinc. Après complexation avec le zinc présent au niveau du pancréas, il va s’ensuivre une variation du signal sur l’image du pancréas. Des études précédentes, déjà validées par le ministère, ont permis l’obtention de preuve de concept de la détection IRM de Zn2+ in vivo dans le cadre du diabète et dans le cadre de l’adénocarcinome de pancréas. Néanmoins, la technique d'IRM ne permet pas une quantification absolue de l'agent de contraste dans un organe d'intérêt du fait que le signal dépend à la fois de la concentration locale d’agent mais aussi de son environnement. L’utilisation d’un analogue radioactif permet l’accès à la distribution relative de l’agent dans l’organisme (biodistribution) car l’activité qui est retenue par chaque organe dépend exclusivement de la concentration locale en agent. L’objectif de cette saisine est d’étudier la biodistribution in vivo (par tomographie d’émission monophotonique, TEMP) et ex vivo (prélèvement d’organes post-mortem à des temps précis), des agents de contraste développés (et validés en IRM) en souris saines et souris modèle de cancer de pancréas (modèles adénocarcinome et insulinome), à l'aide des analogues marqués à l'111In ou à l'165Er, deux émetteurs gamma possibles de visualiser par TEMP.
Bénéfices attendus
L'objectif de cette demande est donc d'évaluer la possibilité de détecter et quantifier le zinc par TEMP, grâce à des agents de contraste dédiés, développés par le client, dans des souris témoins saines et modèles de cancer du pancréas. Des biodistributions ex vivo de ces agents de contraste sont réalisées. L'objectif à long terme de ce projet sera de fournir un diagnostic précoce aux populations à haut risque afin d'accroître leur taux de survie et d'améliorer le suivi des patients après traitement.
Procédures
270 souris auront des greffes orthotopiques au niveau du pancréas (procédures 1, 2, 3) Elles seront placées sous paracétamol (analgésique) dans l'eau de boisson la veille de l’intervention (500mg dans un biberon de 200mL) jusqu’à 24h post induction. L'induction sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2% dans l'air). A la fin de l’intervention, une injection de tolfédine 4mg/kg (anti inflammatoire) sera réalisée en sous cutané (50μL) et renouvelée le lendemain de l'intervention. Elles subiront une seule chirugie lors de l'induction tumorale qui durera 20 minutes maximum. 75 souris vigiles (dont 60 avec des tumeurs pancréatiques) recevront 2 fois 150μL d'agent de contraste radiomarquée par voie intraveineuse au niveau de la queue (à un temps précoce J7 et à un temps tardif J21 ou J35) (procédure 2) et 180 souris vigiles (dont 120 avec des tumeurs pancréatiques) recevront 1 fois 150μL d'agent de contraste radiomarquée par voie intraveineuse au niveau de la queue. 180 souris vigiles portant une tumeur du pancréas recevront une IP de 50μL de glucose 40% (modèle insulinome dans les procédures 1, 2 et 3). 180 souris ((dont 120 avec des tumeurs du pancréas) anesthésiées à l'isoflurane (2% dans l'air) subiront un prélevement sanguin de 400μL en intracardiaque qui sera immédiatement suivi par la mise à mort sans réveil intermédiaire. (procédure 3)
Impact sur les animaux
Les dommages attendus lors de ce projet sont dûs au développement tumoral pancréatique. Pour suivre cela, nous mettons en oeuvre une grille de scoring qui permettra de prendre les mesures nécessaires afin d'éviter toute souffrance chez l'animal. En pratique, une perte de poids et une modification du comportement pourront être observés (diminution de la locomotion, prostration, amaigrissement, aspect du pelage).
Devenir
Procédure 1: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever les foies et les pancréas post mortem pour le dosage du Zinc présent. Procédure 2: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les souris ayant des tumeurs pancréatiques et ayant été injectées avec des agents de contraste radiomarquées ne peuvent être réutilisées. Procédure 3: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort, afin de pouvoir prélever différents organes (pancréas, rate, foie, coeur, poumons, reins, cerveau, intestins, muscles) post mortem afin de quantifier précisément des molécules marquées à l'111In ou à l’165Er préalablement administrées.
Remplacement
Le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisqu'à notre connaissance il n'existe pas de modélisation capable de représenter la complexité des tumeurs pancréatiques et la distribution des agents de contraste à tester in vitro ; cette étude ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles.
Raffinement
Les animaux seront suivis par observation individuelle chaque jour de la semaine pour anticiper, le cas échéant, le développement de douleurs ou de souffrances. Les animaux seront également suivis individuellement par pesée 1 fois par semaine. Si une perte de poids est supérieure à 20% du poids initial, cela entraînera la mise à mort de l’animal (points limites). Par ailleurs, l’absence de socialisation des animaux, le changement d’aspect de la peau (reflet de la qualité du toilettage de l’animal) et l’absence de toilettage seront évalués quotidiennement pour anticiper la souffrance des animaux. Les modèles de tumeur pancréatique peuvent se dérouler sur une période maximale de 35 jours postinjection des cellules. De par notre expérience, à J35, les tumeurs auront une taille inférieure ou égale à 100mm3. Si toutefois un animal venait à présenter des signes de souffrance, il serait mis à mort avant. Une grille de scoring sera utilisée pour le suivi clinique des animaux :ASPECT GENERAL, COMPORTEMENT/ LOCOMOTION, PHYSIOLOGIE CLINIQUE Chaque animal sera mis à mort dès que le score d’un paramètre sera égal à 2, ou dès que le total des scores sera strictement supérieur à 3. De plus, l’imagerie TEMP est une approche non invasive pratiquée sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le modèle d’adénocarcinome chez la souris a été décrit et mis en oeuvre par notre équipe depuis plusieurs années. La lignée immunodéprimée Swiss nude est la lignée qui répond le mieux à l’induction de l’adénocarcinome. Les niveaux de zinc changeant avec la lignée et le sexe des souris, cette même lignée sera utilisée comme témoin et pour l’induction des insulinomes. Des souris femelles âgées adultes de 6-8 semaines seront utilisées conformément aux études déjà publiées sur ce modèle.
Étude des défauts hypothalamiques dans des modèles murins de sclérose latérale amyotrophique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations mimant la sclérose latérale amyotrophique et subissent des chirurgies cérébrales, implantation de pompes, pose d'électrodes sous-durales et injection intracérébrale, puis des tests glycémiques, métaboliques et des tests comportementaux non détaillés sur trente-cinq jours. Le porteur indique que les chirurgies provoquent des douleurs atténuées par des analgésiques et prévoit de retirer un animal dont l'état ne s'améliore pas sous 48 heures. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un modèle animal dont l'hypothalamus est bien caractérisé et conclut que la souris ne "saurait être remplacée".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA), la plus fréquente des maladies du système moteur adulte (2 à 3 nouveaux cas pour 100 000 habitants), reste une pathologie incurable et présente un pronostic extrêmement sévère, conduisant au décès, 2 à 5 ans après l’apparition des premiers symptômes. La SLA présente des formes sporadiques (90%) et familiales (10%). Diverses lignées de souris transgéniques ont été mises au point, récapitulant les symptômes de la maladie : une dégénérescence des neurones moteurs cortico-spinaux et des motoneurones spinaux, une dénervation des muscles striés squelettiques accompagnée d’une atrophie musculaire et d’une paralysie progressive se finissant par la mort. Ces lignées transgéniques sont à la base des recherches expérimentales dans le domaine de la SLA. Outre les symptômes moteurs, la SLA est aussi accompagné par une perte de poids très importante (chez l’homme et modèles murins) due à une diminution de la prise alimentaire, associée à un changement de la dépense énergétique. Il a été observé récemment que les modèles transgéniques ont aussi des dysfonctionnements du sommeil et du métabolisme. Ces altérations à l’origine de ces symptômes n'ont pas encore été demontrees. Chez la souris, l’hypothèse expliquant les bases cellulaires de ces dysfonctionnements sont un défaut fonctionnel des neurones hypothalamiques impliquées dans la régulation de la balance énergétique, la prise alimentaire et le sommeil. Ceci suggère l’existence d’un défaut hypothalamique touchant le contrôle de la prise alimentaire et la qualité/quantité de sommeil aussi chez le patient SLA. De plus d'un point de vue moléculaire, il a été montré que l'une des molécules impliquées dans la maladie, est un élément central de l’horloge interne. Ce dernier gène particulièrement contrôle de façon remarquable le rythme de prise alimentaire et le sommeil. Ceci faisant le lien entre la pathologie étudiée et les problèmes de l'horloge interne. Nous investiguerons donc, dans cette etude, le sommeil et le metabolisme de ces lignees transgeniques mimant la SLA.
Bénéfices attendus
Ces expériences nous permettront de déterminer si les défauts fonctionnels de l’hypothalamus peuvent être reversés et ainsi ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour la SLA. Au-delà de la SLA, ce projet est destiné à contribuer à l’effort commun de recherche sur l’étiologie des maladies neurodégénératives du système moteur.
Procédures
Les animaux subiront des procédures chirurgicales (implantation de pompes iPRECIO durée 2h, implantation d’électrodes subdurales durée 3h, injection intracérébrale durée 2h) en plus de test glycémique (durée 2h), comportementaux et métaboliques. Ces expériences dureront maximum 35 jours et prennent en compte le développement de la pathologie dans les 2 lignées transgéniques. Les prélèvements ne seront fait qu’en phase terminale d’une procédure.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à des douleurs causées par les procédures chirurgicales qui seront atténuées par des antalgiques et analgésiques avant, pendant et après la chirurgie ainsi qu’une surveillance quotidienne pendant la période de récupération des souris. Nous préviendrons toutes infections par l’apport d’antibiotique a la fin des procédures chirurgicales. Enfin, nous ne laisserons aucune souris dans la souffrance en nous référant à la feuille en Annexe 1. Il sera pris la décision de sortir une souris de l’étude si les conditions de la souris ne montrent pas d'amélioration sous 48 heures.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort pour des analyses biochimiques et immunologiques, après avoir collecté sang, tissus et organes.
Remplacement
La SLA est une maladie d’origine multifactorielle et multicellulaire. Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré de cette pathologie. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent, en outre, une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux dans ce projet, les animaux destinés aux analyses biochimiques ou histologiques seront au préalable inclus dans les études fonctionnelles. Le nombre de souris incluses dans ce projet a été précisément calculé à partir des observations faites dans le laboratoire lors d’études préliminaires ce qui a permis de calculer la puissance statistique et d’éviter les biais de taille d’effet (nombre suffisant permettant l’exploitation statistique). Le logiciel GPower nous a permis de calculer le nombre minimum nécessaire par groupe à 24. Secondairement lorsque les données seront récoltées nous utiliserons une analyse statistique ANOVA à un facteur avec une analyse post-hoc pour analyser les résultats.
Raffinement
Les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, bénéficieront de conditions d’hébergement conformes à la réglementation en vigueur. L’enrichissement de l’environnement des animaux (coton compressé pour faire des nids, maisons en plastique rouge), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront de s’assurer de leurs bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Des points limites (perte de poids, difficultés métaboliques, etc.) permettant de soustraire l’animal à la souffrance ont été établi. De plus, nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes de pré-anesthésie, d’anesthésie et de prise en charge analgésique en cas de procédure.
Choix des espèces
La souris est un modèle important et pertinent dans l’étude de la SLA. Pour intégrer la complexité de la pathologie, et notamment des implications du dysfonctionnement de hypothalamus, il est indispensable de travailler avec un modèle animal possédant une structure hypothalamique bien caractérisée. De plus, les modèles transgéniques de souris sont des modèles expérimentaux très puissants (génétique connue, commercialisation d’outils moléculaires, etc.). En conséquence, dans le cadre de la question biologique posée, le modèle animal choisi ne saurait être remplacé par un autre. Les animaux seront utilisés à partir de 30 jours, au moment du sevrage, car l’injection de DREADDS nécessite d’être faite sur des souris âgées de 30 jours car le DREADDS est laissé 15 jours avant de pouvoir conduire un quelconque effet. Pour les pompes iPRECIO et l’EEG des animaux de 65 jours seront utilisés pour pouvoir observer les effets au stade présymptomatique.
Développement de radiotraceur pour l’imagerie de la mutations mIDH1 dans le chondrosarcome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
488 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales en sous-cutané ou près du tibia, puis l'injection de traceurs radioactifs pour l'imagerie, avant d'être tuées pour analyser la distribution des molécules. Le porteur reconnaît que la greffe près du tibia peut être douloureuse et gêner le déplacement une fois la tumeur développée. Il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant" pour valider ces traceurs.
Objectifs
Les mutations des gènes de l’Isocitrate Déshydrogénase (mIDH) favorisent la progression tumorale. Ces mutations sont fréquemment identifiées dans des cancers comme le gliome ou le chondrosarcome (CHS), tumeurs solides infiltrantes et invasives, limitant une résection complète et provoquant souvent des récidives ainsi qu’une incapacité progressive des patients. De nouveaux inhibiteurs ciblant mIDH pourraient représenter de nouveaux espoirs de thérapie, mais leur succès repose sur une évaluation préalable de l’expression de mIDH dans ces tumeurs. Cependant, contrairement aux alternatives invasives comme la biopsie, les modalités d’imagerie non invasives pour la quantification de l’expression de mIDH n’ont été que peu étudiées pour ces tumeurs. Ce projet consiste en une approche translationnelle et multimodale de développement de méthodes d’imagerie, via des radiotraceurs marqués au fluor-18 pour l’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP). Ces stratégies d’imagerie constitueraient un outil précieux pour une médecine de précision pour ces pathologies cancéreuses.
Bénéfices attendus
Si les résultats de biodistribution sont favorables au transfert et à évaluation clinique de radiotraceurs, la quantification de l’expression de mIDH sera évaluée par autoradiographie sur tissus de tumeurs cérébrales et de CHS issus de patients, afin de conduire pour la première fois à des données quantitatives concernant l’expression de mIDH sur des tumeurs humaines. Si ces résultats sont favorable, cette mutation et son impact métabolique seront également étudiés en clinique par spectroscopies per-opératives de résonance magnétique chez des patients atteints de gliome ou de CHS afin d’évaluer leur intérêt pour estimer plus précisément l’étendue de la résection à réaliser, paramètre impactant fortement le taux de survie. A plus long terme, Ces stratégies d’imagerie constitueraient un outil précieux pour une médecine de précision pour ces pathologies cancéreuses.
Procédures
L’ensemble des animaux recevra une injection sous cutanée ou paratibiale sous anesthésie gazeuse (durée 5min). Pour les animaux des lots 2 à 4, ils recevront également une injection intraveineuse (moins de 1min) en vigile entre 15 jours et 6 semaines après l’injection sous cutanée ou paratibiale.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules en paratibiale pourrait entrainer une douleur poste injection (douleur anticiper par l’administration préventive d’antalgique (Rimadyl, 20mg/kg ou Méloxicam 5 mg/kg) en pré et post implantation. Une gêne au déplacement pourra aussi être observé une fois la tumeur ayant atteint un certain stade de développement.
Devenir
Procédure 1 et 2 : Mise à mort Lot 1 pour l’analyse protéique, génomique et histologique des tumeurs Procédure 3 : Mise à mort Lot 2 détermination de la distribution des radiotraceur dans les organes des animaux à différent temps Mise à mort Lot 3 analyses de spécificité de fixation par prélèvement Mise à mort du lot 4 analyses des métabolites sang et urine et tumeur
Remplacement
Suite aux études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouveaux radiotraceurs requièrent la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Ce nombre a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. De plus, l’étude pilote (étude 1) et les examens d’imagerie (étude 3) permettent également de réduire le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux est de 488 souris maximum sur une période de 5 ans.
Raffinement
Les modèles animaux choisis sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Des méthodes sont utilisées afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques (Rimadyl, 5mg/kg en sous-cutanée, 1 fois par jours pendant 5 jours maximum) avant l'atteinte des points limites définis (perte de poids supérieure à 20%, du poids maximal observé, prostration, hérissement du poil, volume tumoral, aspect du point d’injection…). Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié. De plus, l’étude pilote ainsi que l’étude impliquant des examens d’imagerie permettent de raffiner cette étude en termes de caractérisation du modèle et d’examen non invasif.
Choix des espèces
Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptés pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Des animaux de 5 à 7 semaines sont classiquement utilisés pour ce type de modèle.
Cycle hormonal et déficits de reconnaissance chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées par dislocation ou par perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde, pour que leur cerveau soit prélevé et analysé, 692 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris portent, à la place de leurs propres gènes, deux gènes humains dont l'un présente deux mutations familiales de la maladie d'Alzheimer. Les femelles subissent des frottis vaginaux, les souris passent des tests de reconnaissance d'objet après 24 heures et d'association objet-place, jusqu'à 60 d'entre elles sont isolées quatre jours en cage individuelle, d'autres sont transportées pour des IRM à 2, 4 et 12 mois. Le porteur affirme que l'étude de ces lignées est "encore indispensable", tout en écrivant que "les souris ne développent pas la MA".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est caractérisée par des pertes de mémoire et par la pathologie tau et la pathologie amyloïde qui sont liées respectivement à des formes de la protéine tau et de la protéine amyloïde anormalement aggrégées dans le cerveau. L’APP est la protéine précurseur du peptide amyloïde. Les modèles rongeurs actuels surexpriment des gènes humains de l’APP avec des mutations rares provoquant la MA (formes familiales) et/ou des gènes mutés de tau qui ne sont pas associés à la MA mais qui provoquent une pathologie tau. La présence de pathologies tau et amyloïde chez ces animaux ont permis des progrès dans la compréhension de la MA, mais la surexpression de l’APP et/ou de tau provoque aussi d’autres effets qui ne se retrouvent pas dans la MA. Les souris double knock-in (dKI) AppNL F/MAPT évitent ces effets car elles ont un gène de l’APP humanisé avec deux mutations familiales humaines (Swedish et Iberian : AppNL,F) et le gène humain normal de tau (MAPT) au lieu des mêmes gènes chez la souris. En analysant la mémoire de nos souris dKI de l’âge de 2 à 6 mois, nous avons découvert que les femelles dKI ne parviennent plus à reconnaitre un objet après un délai de 24h (test RO24h) dès l’âge de 2 mois. De plus, elles n’ont pas de bons résultats dans un test de changement de la règle dans un labyrinthe, contrairement aux mâles dKI. Or ces deux tests dépendent du dialogue entre deux structures du cerveau, l’hippocampe (HC) et le cortex préfrontal (CPF). Ces résultats sont cohérents avec une étude montrant une altération de la connectivité HC-CPF plus marquée chez les femmes que chez les hommes en début de MA. Une perturbation des rythmes veille/sommeil, comme celle observée chez le patient, peut perturber le dialogue HC-CPF. A 4 mois, les dKI des deux sexes oublient rapidemment une association objet-place (OiP). Cette forme de mémoire dépend du dialogue HC-cortex entorhinal latéral (CEL). Elle est atteinte chez des personnes âgées des deux sexes et c’est un signe précurseur de la MA. En conclusion, chez les souris dKI de 4 mois, la voie CEL-HC semble affectée chez les deux sexes, tandis que les femelles semblent affectées en plus et plus tôt sur la voie HC-CPF. Les souris dKI sont les premières à montrer une perturbation aussi précoce et aussi proche de celle trouvée en phase préclinique des patientes développant une MA. Le but de ce projet est de comprendre l’origine de cette vulnérabilité féminine dans la pathologie Alzheimer.
Bénéfices attendus
L’objectif du projet est de mieux comprendre l’origine de la vulnérabilité féminine dans les premiers stades de la MA. Il est important d’explorer le rôle des oestrogènes car le développement de la MA a maints fois été attribué à la baisse marquée de production d’œstrogènes privant ainsi le cerveau d’un puissant neuroprotecteur contre les pathologies amyloïde et tau. Ici, nous analyserons chaque étape clé de l’implication des œstrogènes dans les processus de mémoire affectés chez les dKI femelles dès les premiers signes de la pathologie. Si nous découvrons une altération d’une ou plusieurs étapes, cela aidera à la compréhension de cette vulnérabilité féminine et révèlera des cibles intéressantes pour mettre au point des tests de diagnostique précoce et/ou de traitements adaptés à la femme. Cette démarche s’insère dans la statégie actuelle de développement d’une médecine personalisée. Le projet décrit ici ne représente que l’approche fondamentale développée dans un vaste. Ce programme inclue aussi des approches translationnelles en utilisant des techniques applicables à l’Homme : investigations en IRM (IRM fonctionnelle, tractographie, …), en électroencéphalographie à haute densité (EEGhd) et en biologie des rythmes (évaluation comportementale du fonctionnement de l’horloge circadienne). De plus, après adaptation et validation des tests de RO24h et OiP à l’Homme, ils pourront être intégrés dans des évaluations neuropsychologiques pour un dépistage. En conclusion, le programme dans son ensemble aborde certes les cibles neurobiologiques (présente saisine) qui seront utiles à long terme, mais il ouvre également des perspectives à moyen terme pour le développement d’outils de diagnostique par IRM, par EEGhd et par de nouveaux tests neuropsychologiques. Les résultats de notre étude bénéficieront d’abord à l’Homme puisque les souris ne développent pas la MA. Néanmoins, certains animaux de compagnie (chien, octodon) ou sauvages (microcèbe, ours blanc) développent une pathologie rappelant la MA avec pathologie amyloïdes et tau. Au mois deux de ces espèces (octodon ; microcèbe) possèdent un gène de risque génétique majeur pour la MA (APOE4). Chez l’Homme, l’APOE4 peut multiplier par 10 le risque de développer une MA. Il est donc tout à fait envisageable que les progrès réalisés dans le domaine de la MA en termes de dépistage et de traitement pourraient être adaptés à des pathologies proches chez l’animal, puis intégrée dans une approche vétérinaire.
Procédures
Procédure 1 modérée: 4 groupes de souris (de génotype et sexe différents, maximum 60 au total) sont mises dans des cages individuelles placées côte à côte sur une étagère munie de détecteur de mouvement (petites cellules de détection) pour mesurer leur activité locomotrice sur 4 jours. Malgré la proximité de leur congénères, cette séparation transitoire pourrait générer un stress modéré, mais transitoire. Les autres procédures sont légères pour les 632 souris restantes. Elles comportent 1) la réalisation de frottis vaginaux sur les femelles (dépôt d’une goutte à l’entrée du vagin puis réaspiration) par une expérimentatrice maitrisant la technique en douceur, 2) la passation d’un ou deux tests d’exploration d’objet (éventuellement à 2, 4 et 12 mois) basés sur l’exploration spontanée de deux objets disposés dans un environnement rendu familier par une habituation (10 min) préalable avec leur groupe social. Le lendemain chaque souris passera seule deux à trois fois dans l’enceinte en présence de 2 ou 4 objets selon le test (10 min environ de pause entre chaque passage de 8-10 min), sauf pour un test où un seul passage/jour est répété sur deux jours et 3) les manipulations préalables à la mise à mort (dislocation ou perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde). Aucune perte de poids, inactivité/mobilité réduite ou expression d’un comportement anormal n’est connu pour ces trois types de manipulations. Enfin, dans la dernière procédure les souris seront transportées (aller-retour dans la journée) en restant dans leur groupe social (2-3 souris/cage) pour effectuer un scan IRM à 2 mois, 4 mois et 12 mois.
Impact sur les animaux
Le suivi de lignée jusqu’à l’âge de 12 mois indique que le phénotype des souris dKI n’est pas dommageable : le succès reproducteur, le poids et l’occurrence d’anomalies comportementales ou physiologiques restent identiques entre les WT et les dKI. Leur fonds génétique C57BL/6J est entretenu par backcross pour éviter une dérive génétique. Par ailleurs, il faut préciser que ces souris ont été caractérisées dans des tests de mémoire et d’anxiété classiques et dans des tests hypersensibles à la pathologie Alzheimer. Les mâles et femelles dKI de 2 à 6 mois réussissent comme leurs témoins les tests classiques (test spatial en labyrinthe de Barnes, tests de reconnaissance d’objet et de place jusqu’à un délai de 3h). Même à 12 mois, il n’y a toujours pas de déficit dans ces tests. Entre 2 et 6 mois, le problème n’apparait que dans des tests hypersensibles : une performance moindre au premier jour du changement de règle dans un labyrinthe, un déficit marqué dans les tests d’association objet-place (test OiP), de mémoire du détail et pour un long délai de rappel (RO24h). En conclusion, les souris dKI présentent des problèmes légers de mémoire qui sont présents chez des personnes âgées déclarées cognitivement normales. Ces déficits ne sont donc pas de nature à affecter le bien-être des souris dKI par rapport à leurs témoins WT. Seules deux procédures pourraient induire un stress transitoire : la procédure 1 pour l’isolement en cage permettant de mesurer l’activité locomotrice individuelle sur 4 jours et la procédure 8 où les souris seront transportées (aller-retour dans la journée) en restant dans leur groupe social (2-3 souris/cage) pour un scan IRM à 2 mois, 4 mois et 12 mois. Les autres procédures sont légères. Elles comportent 1) la réalisation de frottis vaginaux sur les femelles (dépôt d’une goutte à l’entrée du vagin puis réaspiration) par une expérimentatrice maitrisant la technique, 2) la passation de deux tests de reconnaissance d’objet (RO24h et OiP à 2, 4 et 12 mois) basés sur l’exploration spontanée de deux objets disposés dans un environnement rendu familier par une habituation préalable avec leur groupe social et 3) les manipulations préalables à la mise à mort (dislocation ou perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde). Aucune perte de poids, inactivité/mobilité réduite ou expression d’un comportement anormal n’est connu pour ces trois types de manipulations.
Devenir
Le but du projet est de découvrir les altérations neuropathologiques impliquées dans le dimorphisme sexuel face à l’émergence d’une pathologie Alzheimer afin de mieux comprendre les causes de la vulnérabilité du cerveau des souris dKI femelles par rapport aux mâles. Les cerveaux seront systématiquement recueillis et analysés afin de déterminer ces causes.
Remplacement
L'étude des animaux modèles de la MA est encore indispensable pour progresser dans la compréhension de cette pathologie. Il n'est pas encore possible actuellement de modéliser les processus cognitifs de façon fiable et complète dans un modèle in silico ou en culture cellulaire. Il est donc encore nécessaire de recourir à des modèles animaux dont on analyse la relation entre la neuropathologie et les performances cognitives.
Réduction
Pour étudier le lien entre les performances comportementales (mémoire et rythme circadien de l’activité locomotrice) et les données neuropathologiques obtenues par des approches histologiques ou biochimiques (P1 à P6), le nombre d’animaux sera au maximum de 15 animaux par groupe pour assurer l’efficacité des statistiques dans les tests comportementaux. Cet effectif est nécessaire en particulier dans notre modèle car nous testons des souris avec une pathologie débutante et des déficits subtils qui pourraient passer inaperçus si les groupes sont trop petits. La dernière procédure est une étude longitudinale d’animaux destinés à des analyses en IRM. Elle permet donc le suivi d'un même animal à trois âges pour étudier l’émergence et l’évolution de la pathologie ce qui permet une réduction du nombre d'animaux/groupes à inclure. Le nombre de souris sera au maximum de 35 animaux par groupes (4 groupes mâles et femelles des génotypes dKI et témoins WT) afin d’assurer l’efficacité des tests statistiques et donner des résultats statistiquement fiables pour les données IRM et pour des analyses corrélatives avec les données comportementales et histopathologiques obtenues sur les mêmes animaux au sein de notre laboratoire. L’ensemble du projet requiert 692 souris.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’éléments d’enrichissement dans leur cage (matériel de construction du nid, un tube refuge et des boulettes de nourriture à manipuler), ainsi qu’un suivi quotidien de leur état général. Elles seront maintenues en groupe sociaux sauf pendant deux périodes de 10 minutes/jours pour chacun des tests de mémoire. Tous ces tests sont basés sur le comportement d’exploration spontanée de la souris dans un milieu adapté à l’espèce (lumière faible de 20 lux maximum et ambiance sonore atténuée à 45 dB). Un suivi spécifique à chaque procédure avec des points limites adaptés est mis en place pour éviter toute souffrance éventuelle. Trois nouvelles techniques de raffinement sont à mettre/mise en place au cours du projet. Elles concernent la manipulation/transport des souris, l’habituation à l’enceinte des tests de mémoire et une méthode non invasive de prélèvement pour le génotypage. Les souris sont d’ores et déjà transportées de la cage à l’enceinte de tests (et vice versa) grâce au tube refuge présent dans leur cage. L’habituation à l’enceinte des tests se fait depuis plus de 6 mois avec l’ensemble du groupe social de chaque cage. Le bien-être qui en résulte se reflète par une plus grande régularité dans la durée d’exploration des objets présents dans l’enceinte au cours des tests de mémoire réalisés ensuite en individuel. Enfin, une nouvelle méthode de prélèvement non invasive pour le génotypage à partir d’une pincée de poils (au lieu du punch d’oreille de 2 mm) est en cours de mise au point pour s’assurer de sa faisabilité/reproductibilité avec les primers utilisés pour les souris dKI et WT.
Choix des espèces
A ce jour, les modèles animaux de la MA ont essentiellement été créés chez la souris, même s'il existe des modèles chez la drosophile et d'autres espèces. Nous avons un modèle de souris qui est en rupture par rapport aux modèles précédents, car il n’a pas les effets secondaires dûs à la surexpression des protéines clé. Il présente une différence entre les deux sexes dans l'apparition des premiers troubles de la mémoire qui ressemble à celle trouvée au stade préclinique de la MA, c'est-à-dire 5 à 10 ans avant le premier diagnostic. Toutes les souris seront sur un fonds génétique C57BL/6J. Dans toutes les procédures sauf une, les souris seront utilisées entre 1 et 4 mois (jeunes adultes) car c’est l’âge où apparaissent les premiers déficits de mémoire dans ce modèle de maladie d’Alzheimer. Dans la dernière procédure les souris atteindront l'âge de 12 mois pour analyser leur neuropathologie lorsqu’elle devient manifeste (plaques amyloïdes notamment).
Etude de la cryoconservation des spermatozoïdes aviaires pour la gestion de la biodiversité
- Conservation des espèces
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Autres oiseaux : 138
346 oiseaux, 208 poules et 138 cailles, vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Les interventions se limitent à des collectes de semence et des inséminations, mais les mâles sont maintenus en cage individuelle en raison de leur agressivité, pour une étude sur la cryoconservation du sperme aviaire au service de la filière volaille et de la biodiversité. Le porteur indique que les animaux sont gardés vivants puis proposés à d'autres expérimentations à la fin du projet. Il affirme qu'aucune alternative in vitro n'existe pour produire des spermatozoïdes fécondants chez ces espèces.
Objectifs
A l’échelle mondiale, le maintien de la diversité génétique des espèces animales est un enjeu majeur, notamment pour les espèces de rente comme les volailles représentant la première source de protéines animales pour l’alimentation humaine. Actuellement, la sélection des races basées sur des critères de croissance s’accompagne d’une réduction majeure de la diversité génétique. La conservation des ressources génétiques est donc cruciale pour protéger la biodiversité, restaurer des espèces ou races menacées et contrer les épidémies ou les accidents de reproduction. De nos jours, la cryoconservation des spermatozoïdes est l'approche la plus répandue car elle se base sur la collecte de grandes quantités de cellules, le respect du bien-être animal (prélèvement non-invasif) et la possibilité d’un stockage long. Cependant chez les espèces aviaires, ces protocoles sont longs et fastidieux, dépendants de la fertilité des animaux, ainsi que des espèces et races considérées. De plus, les taux de fertilité après décongélation sont plus faibles que ceux obtenus avec de la semence fraiche. Des optimisations sont donc encore nécessaires afin de tendre vers un protocole applicable à toutes les espèces et races aviaires, notamment celles présentant une faible fertilité des mâles. L’amélioration de ces protocoles passe nécessairement par la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les capacités fécondantes des spermazotoïdes. Ces mécanismes connus, il est alors possible d’identifier des leviers d’amélioration de la conservation de la semence aviaire. Ainsi, les objectifs de ce projet sont multiples. Tout d’abord, nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la fécondance d’un spermatozoïde, dans deux espèces aviaires d’interêts agronomique et scientifique, la caille et la poule, en comparant de façon individuelle la qualité des spermatozoïdes d'animaux de haute fertilité à ceux d'animaux de basse fertilité. Ces données nous permettrons dans un second temps d'améliorer les protocoles déjà existants de cryoconservation de la semence pour les espèces et races domestiques françaises. Ce projet, finance par le CRB anim (ANR-11-INBS-0003), a débuté en 2016 et se finit fin juin 2022, sous la DAP APAFIS#4026-2016021015509521 qui se termine en février 2022. La présente DAP a pour objet de poursuivre les expérimentations déjà débutées (animaux déjà présents) sur la période de février à juin 2022.
Bénéfices attendus
Les protocoles de cryoconservation de la semence aviaire actuellement disponibles présentent certaines failles. En effet, seuls les individus ayant une bonne fertilité au départ présentent une bonne capacité de cryoconservation avec une bonne fertilité observable après décongélation. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la fécondance du spermatozoïde aviaire, en comparant des animaux présentant un haut et un faible taux de fertilité, pour identifier des leviers d'amélioration de la cryoconservation de la semence aviaire. De plus, le protocole actuellement le plus répandu utilise comme cryoprotectant (agent de protection des cellules contre les dommages de la congélation), le glycérol. Or cette substance est associée à une forte réduction de la fertilité des animaux lorsqu'elle subsiste dans les échantillons de semence inséminés. Aujourd’hui, il est donc nécessaire de supprimer le glycérol par des moyens longs et complexes. Nous avons pour objetif de développer de nouvelles approches pour retirer cette substance, reposant notamment sur un gel colloïdal. Enfin, sur la base de nos données obtenues chez la poule, nous travaillons également à l’élaboration d’un protocole de cryoconservation de la semence de caille, procédure jusqu’à présent non décrite.
Procédures
Les seules interventions prévues sont la collecte de semence chez les mâles et les inséminations des femelles. Ces deux interventions sont non invasives et couramment menées en élevage. La seule procédure est l'hébergement des mâles en cage individuelle (entre 30 et 60 semaines d'âge) car les mâles sexuellement matures sont agressifs les uns envers les autres et il est impossible de les mettre avec les femelles pour éviter les inséminations non contrôlées. L’hergement en cage individuelle est donc la seule solution pour éviter les accidents d’élevage (agressivité) et certifier la justesse des données (insémination des femelles non contrôlées).
Impact sur les animaux
Le prélèvement de semence est un acte non invasif chez les espèces caille et poule. Cependant, afin de limiter le stress lié à la manipulation, seuls trois prélèvements seront effectués par semaine. Les inséminations artificielles sont des procédures classiquement développées en élevage sans stress pour les animaux. Nous limitons cependant le nombre d’insémination à cinq par mois afin de limiter tout stress lié à la manipulation excessive des individus. L’hébergement des mâles en cage individuelle (nécessaire car les mâles sexuellement matures sont agressifs les uns envers les autres) mais également la présence de différents individus dans les cages des femelles (mise en place de hiérarchie) peuvent être source d’inconfort et de stress. En cas d’arrêt de ponte, d’un mâle ne donnant plus de semence, de diarrhée, de prostration, de l’absence de chant ou de caquètement, ou de tout autre signe de maladie même bénigne, l’intervention d’un vétérinaire est prévue. Après traitement, la décision que l’animal réintègre ou non l’expérimentation se fera en fonction de son état de santé.
Devenir
Les animaux sont maintenus en vie tout au long du projet. Les animaux seront proposés pour d'autres expérimentations à la fin du projet auprès de l'unité expérimentale.
Remplacement
Ce projet concerne la reproduction d’espèces aviaires. A l’heure actuelle, aucune alternative in vitro n’existe pour la production de spermatozïdes fécondants ou de fécondation in vitro chez ces espèces.
Réduction
Nous travaillons actuellement sur 48 coqs et 66 cailles mâles. D’après notre expérience, ces chiffres nous permettent de constituer des groupes de mâles de faible fertilité entre 5 et 10 individus, permettant des analyses statistiques concluantes sur les taux de fertilité (évalués sur les nombres d’œufs fertilisés par chi2). Pour déterminer précisement la fertilité d’un mâle, l’insémination de 8 ou de 4 femelles par mâle pour respectivement les espèces poule et caille est généralement préconisée. Afin de limiter le nombre d’animaux, nous n’étudions pas la fertilité de tous les mâles en même temps. En effet, nous effectuons plusieurs campagnes d'analyse de la fertilité (4 pour les cailles et 3 pour les poules) durant lesquelles la fertilité individuelle de maximum 18 mâles cailles et 20 coqs est étudiée sur respectivement 72 et de 160 femelles. La fertilité des individus se maintenant généralement dans le temps, les groupes ainsi identifiés de bons et mauvais reproducteurs peuvent ainsi être constitués pour l’ensemble du protocole. Ainsi, ce projet concerne 48 coqs et 160 poules (soit 208 poules) mais également 66 cailles mâles et 72 cailles femelles (soit 138 cailles), soit 346 animaux au total. L'analyse de la fertilité des mâles actuellement en expérimentation (APAFIS#4026-2016021015509521 ) est aujourd'hui en cours.
Raffinement
Aucune douleur particulière n'est attentue avec ce protocole. De plus, les mâles sont entrainés au moins deux fois par semaine au prélèvement de semence par massage dorsal depuis l’âge de 30 semaines afin de limiter tout stress lié à la manipulation. Cependant, tout signe de stress accru notamment lié aux manipulations répétitives est fortement surveillé. En cas d’arrêt de ponte, d’un mâle ne donnant plus de semence, de diarrhée, de prostration, de l’absence de chant ou de caquètement, ou de tout autre signe de maladie même bénigne, l’intervention d’un vétérinaire est prévue. Après traitement, la décision que l’animal réintègre ou non l’expérimentation se fera en fonction de son état de santé.
Choix des espèces
La caille et la poule sont deux espèces à fort interêt agronomique mais également des espèces modèles pour les autres espèces aviaires. En effet, la cryoconservation de la semence de ces deux espèces est un enjeu important pour la filière volaille (maintien des lignées/races à fort potentiel) mais les protocoles développés pour ces deux espèces serviront également de base pour la cryoconservation de la semence d'autres espèces aviaires. Les animaux doivent être matures sexuellement afin d’étudier leur reproduction, soit entre 30 et 60 semaines d’âge.
Evaluation de l’utilisation des micro-robots magnétiques pour le traitement de pathologies neurovasculaires
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
14 cochons vont être utilisés, opérés sous anesthésie puis tués avant tout réveil. Chaque animal est maintenu anesthésié quatre heures pendant qu'un micro-robot magnétique est guidé dans ses vaisseaux cérébraux, pour tester le traitement d'anévrismes et d'accidents vasculaires cérébraux, avant d'être euthanasié pour l'examen des lésions vasculaires. Le porteur annonce vouloir "révolutionner" le traitement de ces pathologies, retombée qui reste suspendue à une faisabilité encore à démontrer. Il indique avoir testé la navigation sur des modèles vasculaires imprimés en 3D mais juge "nécessaire" de passer à l'animal vivant, le cochon étant retenu pour un réseau neurovasculaire proche de celui de l'humain.
Objectifs
La neuroradiologie interventionnelle est une discipline chirurgicale minimalement invasive qui permet le traitement local de pathologies cérébrales, avec peu ou pas d’incision (en passant par les voies vasculaires). Les outils aujourd’hui à la disposition des neuroradiologues interventionnels présentent de fortes limites étant donné la complexité et la fragilité de l’arbre vasculaire cérébral, tortueux et étroit. Pour améliorer le traitement de pathologies comme l’anévrisme cérébral ou l’Accident Vasculaire Cérébrale (AVC) ischémique, seconde cause de mortalité et première cause de handicap en France et dans le monde, il est urgent de mettre au point de nouvelles solutions. Le but de ce projet est de révolutionner le traitement de pathologies neuro-vasculaires à l’aide de micro-robots thérapeutiques contrôlés par une plateforme de guidage magnétique.
Bénéfices attendus
L’objectif est donc de proposer de nouveaux outils thérapeutiques plus efficaces et plus sûrs permettant (1) la navigation magnétique d’un micro-robot et son automatisation, (2) la possibilité d’utiliser ces micro-robots pour atteindre des zones-cible dans le cerveau, et (3) la faisabilité du traitement des anévrismes et/ou des thrombus au niveau du cerveau.
Procédures
L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. Un animal sera utilisé en phase préliminaire pour valider la faisabilité de l'étude et 12 autres pour le projet à proprement parlé. L'ensemble des animaux seront sous anesthésie générale pendant la durée de la procédure (4 heures) avant d'être euthanasiés. Trois animaux seront utilisés pour valider la navigation du µ-robot magnétique par guidage automatisé. Trois animaux seront utilisés pour valider la neuro-navigation du µ-robot magnétique par guidage automatisé. Trois animaux seront utilisés pour valider l'utilisation du µ-robot thérapeutique dans le traitement des anévrismes cérébraux. Trois animaux seront utilisés pour valider l'utilisation du µ-robot thérapeutique dans le traitement des Accidents Vasculaires Cérébraux.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés afin de pouvoir réaliser l'étude anatomopatholgique des éventuelles lésions vasculaires liées à la navigation par le µ-robot guide ou les µ-robots thérapeutiques.
Remplacement
A ce jour la navigation de premiers modèles de micro-robots ont été téstés dans des modèles anatomiques imprimés en 3D sur des bancs expérimentaux, répliquant au mieux les conditions physiologiques : analogue de sang, flux, pulsatilité, etc. Les modélisations numériques complexes réalisées ainsi que les tests in vitro sur le banc expérimental démontrent la faisabilité de l’approche, et il est maintenant nécessaire de démontrer la faisabilité de la navigation in vivo.
Réduction
Avant chaque procédure animale prévue, une procédure in vitro correspondante sera réalisée sur la base d’un fantôme obtenu de l’animal (modèle 3D imprimé), afin de maximiser les chances de succès de la procédure (et le nombre d’animaux à traiter pour avoir une procédure réussie).
Raffinement
Avant chaque procédure animale prévue, une procédure in vitro correspondante sera réalisée sur la base d’un fantôme obtenu de l’animal (modèle 3D imprimé), afin de maximiser les chances de succès de la procédure (et le nombre d’animaux à traiter pour avoir une procédure réussie).
Choix des espèces
Nous avons choisi un modèle porcin pour différentes raisons: -Les modèles ‘petits animaux’ ne permettent pas d’avoir une vasculature suffisamment semblable à la vasculature humaine (vaisseaux trop petits principalement), et nous ne pouvons pas de façon réaliste réduire toute la taille du système afin de l’adapter à de petits animaux -Le porc possède un réseau neurovasculaire similaire à l’homme, à l’exception de la présence du rete mirabile, qui n’empêchera pas de tester des navigation dans certains vaisseaux crâniens. -Le porc est un modèle de référence pour les procédure neuro-endovasculaires, bien documenté et principalement utilisé au cours des études à visée réglementaire pour de tels dispositifs