Diagnostic des maladies

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

212 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une instillation de plutonium dans la trachée sous anesthésie, provoquant une irradiation pulmonaire chronique, puis des traitements par inhalation, injection ou gavage et des séjours en cage métabolique, pour tester des associations destinées à éliminer le radioélément. Le porteur indique que des signes précurseurs de fibrose devraient apparaître et que les animaux sont tués après six semaines ou trois mois pour prélever leurs organes. Il justifie le recours à un "organisme entier" par la biocinétique complexe du plutonium, difficile à reproduire in vitro.

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est d’améliorer la prise en charge thérapeutique suite à une contamination interne avec du plutonium (Pu). Ces situations peuvent se rencontrer dans les domaines civil et militaire (travailleur du nucléaire, accident, acte de malveillance etc.). Les traitements utilisés actuellement consistent à favoriser l’élimination du radioélément (décorporation) avec une molécule capable de le piéger (chélateur), tel que l’acide diéthylène triamine penta acétique (DTPA) dans le cas du plutonium. Cependant, ce traitement a une efficacité limitée sur les formes peu solubles de plutonium et son effet sur les conséquences biologiques induites à long terme par la contamination n’a pas été étudié à ce jour. Notre approche innovante consistera donc à combiner ce traitement de référence avec des molécules possédant des mécanismes d’action complémentaires afin de favoriser l’élimination du plutonium et de limiter ses effets biologiques. Deux molécules candidates ont été retenues pour ce projet : un anti-inflammatoire, qui devrait permettre de limiter l’inflammation résultant de la contamination et les pathologies associées (fibrose pulmonaire notamment) et un mucolytique, qui devrait favoriser l’élimination du plutonium en fluidifiant les sécrétions bronchiques qui seront éliminées par la toux. L’association de ces molécules avec le DTPA permettra, en cas de libération de Pu à partir des lésions inflammatoires par exemple, de favoriser son élimination sous forme de complexe Pu-DTPA et d’empêcher sa fixation à d’autres organes. Des expériences préliminaires prometteuses avec ces associations thérapeutiques ont été réalisées sur des modèles cellulaires in vitro. Dans ce projet, nous étudierons l’influence de ces associations thérapeutiques sur la biodistribution du plutonium dans l’organisme et sur les effets biologiques induits, tels que l’apparition de fibroses pulmonaires dans le cas de contaminations pulmonaires.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu suite à ce projet porte sur l’amélioration de la prise en charge thérapeutique en cas de contamination pulmonaire par du plutonium. Cette nouvelle stratégie thérapeutique aura pour objectif de limiter les conséquences biologiques de la contamination à moyen et long terme, au premier rang desquelles l’apparition de fibroses pulmonaires. Les résultats obtenus pourront, à terme, contribuer à l’élaboration de nouvelles recommandations thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront contaminés, sous anesthésie, par une instillation intra-trachéale unique (durée maximale 5 secondes). Les traitements seront délivrés par inhalation (bi-hebdomadaire, durée 15 minutes) et/ou injection (hebdomadaire, durée maximale 5 secondes) et/ou gavage gastrique (administration unique après la contamination, durée maximale 10 secondes) après induction d’une anesthésie générale puis per os (dans l’eau de boisson) durant 6 semaines ou 3 mois.

Impact sur les animaux

Les séjours en cage à métabolisme, d’une durée de 1 à 5 jours maximum, génèreront du stress et de l’inconfort pour les animaux. Les cages à métabolisme sont des hébergements individuels permettant le recueil des excrétas (urines et selles) des animaux en vue d’analyses futures (mesures de la radioactivité par exemple). Les animaux sont placés sur des grilles sous lesquelles un système de séparation et de collecte des excrétas est installé. Ces effets indésirables seront temporaires et disparaitront lors du retour des animaux en hébergement classique. Le plutonium possède une toxicité radiologique, mais pas de toxicité chimique. Il induira une irradiation pulmonaire chronique durant 3 mois au maximum. Ce délai est trop court pour donner lieu à l’apparition de pathologies cancéreuses ou des fibroses pulmonaires déclarées. Des signes biologiques précurseurs devraient néanmoins être observés (lésions préfibrotiques, sécrétion de certaines cytokines, accumulation de collagène, etc.).

Devenir

Tous les animaux utilisés pour ce projet seront euthanasiés 6 semaines ou 3 mois après la contamination afin de prélever différents organes et tissus. Ces prélèvements seront nécessaires pour étudier la biodistribution du plutonium dans l’organisme et l’apparition de phénomènes inflammatoires ou fibrotiques en présence des différents traitements.

Remplacement

La contamination interne par des radioéléments résulte principalement d’une exposition accidentelle par inhalation ou via une blessure. Cette contamination interne implique un passage à travers plusieurs barrières physiologiques indicatives d’un système complexe et intégré. Les approches de décorporation doivent agir à la fois localement (au niveau du site d’entrée) et de façon globale dans l’organisme afin de diminuer la rétention des radioéléments dans les organes cibles (foie et os notamment), et de faciliter leur élimination par les voies naturelles. En raison de la biocinétique complexe des radioéléments dans l’organisme, l’évaluation de l’efficacité des traitements ne peut se limiter à étudier leurs effets sur un type cellulaire particulier ou sur un modèle in vitro non intégré. De même, les anti-inflammatoires sont des molécules agissant sur plusieurs cibles et les mucolytiques fluidifient les sécrétions bronchiques qui seront éliminées par la toux, phénomène qui ne peut être obtenu sur des modèles in vitro. Ce projet nécessite donc de travailler sur un organisme entier (in vivo). Des expériences préliminaires à ce projet ont par ailleurs été menées in vitro afin de confirmer la pertinence des traitements envisagés en amont du recours à l’expérimentation animale.

Réduction

La stratégie adoptée s’appuie sur les données du laboratoire. L’expérience suggère que des groupes de 5 à 7 animaux sont suffisants pour démontrer une efficacité thérapeutique du DTPA ou d’autres traitements par voie veineuse, par voie pulmonaire ou par voie orale chez le rat après analyse statistique. Un effectif de 6 animaux par groupe a donc été retenu pour la conduite de notre projet. Pour des raisons réglementaires inhérentes au travail en installation nucléaire il n’est pas possible de réaliser une campagne de contamination sur plus de 30 animaux simultanément. Ces contraintes justifient la conduite de plusieurs campagnes de contamination. Par ailleurs, en raison de la variabilité inhérente à la préparation des solutions de plutonium et à la contamination, chaque campagne devra inclure un groupe contrôle contaminé non traité ainsi que les traitements simples avec une seule molécule (6 animaux par groupe). L’analyse statistique comparera chaque groupe traité au groupe non traité et au groupe traité avec une seule molécule (dans le cas des associations de traitements) au sein d’une même campagne.

Raffinement

Après contamination les animaux sont hébergés individuellement dans des cages à métabolisme (5 jours maximum) en plastique transparent à travers desquelles les rats peuvent se voir les uns les autres, s’entendre et se sentir. Un enrichissement de type jouet à ronger est ajouté dans les cages à métabolisme. Par la suite, les animaux sont hébergés en groupe (3 animaux par cage) avec des enrichissements matériels et nutritionnels (tunnel ou boule en plastique, bâtonnets en bois, papier, grosse croquette etc..). La contamination et le gavage des animaux seront réalisés après induction d’une anesthésie générale afin de limiter le stress et l’inconfort lié à ces actes. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 fois par semaine minimum (ou plus si besoin pour expérimentation ou surveillance accrue). Mise en place de points limites identifiés pour ce projet et l’utilisation d’analgésique pour soulager l’animal en cas de souffrance. Une vigilance particulière sera également portée à l’apparition de potentiels symptômes respiratoires (dyspnées, essoufflements, éternuements et toux), une réponse inflammatoire pulmonaire pouvant faire suite à la contamination.

Choix des espèces

Le rat est l'espèce animale retenue pour nos études du fait de la richesse des données issues de la littérature sur la contamination par les radioéléments de la même famille que le plutonium, d'un point de vue de la biocinétique et des tests de traitements de décorporation des radioéléments. En effet, le rat est un modèle pertinent pour la contamination interne pulmonaire : sa taille, supérieure à celle de la souris, permet de réaliser des prélèvements biologiques suffisamment conséquents pour obtenir des niveaux de radioactivité mesurables et des informations exploitables sur un certain nombre de paramètres biologiques. De plus, de nombreuses données historiques obtenues sur cette espèce sont disponibles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront âgés de 4 à 6 semaines au moment de la réception car les risques de contamination interne avec des radioéléments concernent principalement les travailleurs jeunes adultes et adultes). Les rats présenteront initialement des poids allant de 150 à 200 g, de façon à faciliter leur hébergement en groupe et leur assurer un meilleur confort lors du séjour en cage à métabolisme.

160 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un régime carencé en vitamine A censé induire une neurodégénérescence, avec déclin cognitif et altérations motrices, avant d'être tués pour analyse post-mortem du cerveau, la moitié alimentant une biobanque. Le porteur signale que ces déficits ne sont visibles qu'au moyen de tests comportementaux "poussés" qu'il ne détaille pas. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative adaptée pour ce projet de physiologie intégrée.

Objectifs

Cette étude s'inscrit dans le cadre d'un Grand Projet de Recherche (GPR) financé par l'Etat français. L'objectif scientifique du projet est d'étudier en parallèle et de manière harmonisée 3 maladies neurodégénératives pour identifier des biomarqueurs communs et ainsi développer de nouvelles stratégies thérapeutiques de prévention et de traitement pour ces pathologies. Ces trois maladies sont la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amiotrophique. Le modèle de carence en vitamine A chez le rat présente des aspects de déclin cérébral global : déclin cognitif et altérations motrices principalement. J'étudie ce modèle depuis plusieurs années en rapport avec la neurodégénéresence spécifique à la maladie de Parkinson. Je m'associe au projet GPR afin d'étudier tous les aspects de la neurodégénérescence dans ce modèle, en rapport avec les 3 maladies neurodégénératives citées plus haut. Ainsi, les animaux utilisés vont permettre d'étudier l'impact de la carence en vitamine A sur la neurodégénérescence d'un point de vue biochimique et sub-cellulaire dans les différents types de neurones spécifiquement altérés dans ces pathologies. Par ailleurs, la moitié des animaux utilisés servira à constituer une biobanque qui a vocation à recueillir les échantillons biologiques des différents modèles des pathologies citées, pour des investigations harmonisées sur ces 3 pathologies.

Bénéfices attendus

L'utilisation de ces animaux permettra de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques communs qui sous-tendent la neurodégénérescence dans les maladies d'Alzheimer, de Parkinson et la sclérose en plaque amiotrophique.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime sub-carencé en vitamine A. C'est la seule intervention qui sera réalisée dans cette étude.

Impact sur les animaux

Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux suite au régime sub-carencé en vitamine A sont d'une classe de sévérité modérée. Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont attendus chez les animaux. Hormis la neurodégénérescence qui est attendue, ce qui peut induire un déclin cognitif et des altérations motrices modérées, nous n'avons pas observé d'effet sévère sur les animaux à cause du régime. Pour la vie quotidienne des animaux, les conséquences de la sub-carence ne sont pas observables, il faut réaliser des tests comportementaux poussés pour voir des déficits au niveau des capacités de mémorisation et d’apprentissage moteur.

Devenir

Les animaux doivent être euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale car une grande partie du projet repose sur l'analyse post-mortem de plusieurs structures cérébrales pour étudier les mécanismes de la neurodégénérescence à l'échelle sub-cellulaire.

Remplacement

Ce projet est fondamentalement un projet de physiologie intégrée étudiant l'impact de la nutrition sur la physiologie du cerveau dans son ensemble, il n'existe donc pas de méthode alternative ou substitutive adaptée aujourd'hui. Les cellules en culture ne forment pas de réseaux de neurones représentatifs de la réalité biologique et nous n'avons pas encore suffisamment de données pour utiliser des modèles informatiques. De plus, les approches expérimentales réalisées dans ce projet ne sont pas envisageables chez l'Homme.

Réduction

Un nombre de 10 animaux par groupe a été déterminé comme étant le minimum requis pour atteindre une puissance statistique suffisante. Nous aurons 2 études en parallèle dans ce projet, avec 2 régimes différents et 2 temps de prélèvements post-mortem, et ces études seront réalisés chez des rats mâles et femelles. Ceci représente un total de 160 rats.

Raffinement

Les rats seront hébergés par paire avec un congénère et ils bénéficieront d'un enrichissement comportemental dans leur cage. Leur état de santé sera vérifié quotidiennement et ils seront pesés 1 fois par semaine. Malgré toutes les précautions prises, si un animal présente des points limites à un moment de l'étude, comme une diminution du poids de plus de 20% en 1 semaine, il sera euthanasié pour éviter toute souffrance. Cette étude de recherche fondamentale apportera des connaissances importantes sur les mécanismes de la neurodégénérescence et pourra ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter les maladies étudiées et/ou en ralentir la progression.

Choix des espèces

L'utilisation du modèle rat représente le meilleur compromis pour tester nos hypothèses afin de comprendre la neurodégénérescence induite par la carence en vitamine A. D'une part, le modèle de carence en vitamine A est très maitrisé depuis de nombreuses années chez le rat. Ainsi, cette étude pourra s'appuyer sur toutes les données déjà publiées et ne nécessitera pas de validation supplémentaire. D'autre part, la carence chez le rat est bien mieux maitrisée que chez la souris, car la carence chez la souris est beaucoup plus longue, ou bien doit être commencée pendant la phase développementale, ce qui n'est pas réalisable vis à vis de nos hypothèses de travail. Les animaux seront utilisés à partir du sevrage (21 jours) et les régimes dureront 1 ou 4 mois.

18 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés avec le parasite Trypanosoma lewisi puis subissent des prélèvements sanguins quotidiens pendant six semaines et un prélèvement terminal, pour produire des parasites et des sérums de référence destinés à un test de dépistage. Le porteur indique que ce parasite, commensal du rat, présente une faible virulence. Il affirme que le recours au rat est "incontournable" pour produire les parasites en quantité.

Objectifs

Trypanosoma lewisi (T.lewisi), parasite hébergé par le rat, est transmis par une puce qui, via ses fécès, peut infecter le rat ou l’homme, surtout les enfants (par grattage au point de piqûre ou par ingestion de boisson contaminée). Souvent sans autre symptôme que la fièvre, cette infection peut être bénigne, nécessiter un traitement, ou être mortelle. A ce jour, l’Inde est le pays où le plus grand nombre d’infections à T. lewisi a été observé et confirmé, le dernier datant de décembre 2021. Les conditions sanitaires dans des pays à très fortes démographies facilitent le contact rat/homme dans les habitations précaires. Cette pathologie est très peu connue et sa prévalence de fait certainement sous-estimée. Compte-tenu du très grand nombre d’individus exposés, il est indispensable de disposer d’un test de dépistage sensible, spécifique et surtout utilisable sur le terrain. Sachant qu’un individu infecté par T. lewisi va produire des anticorps circulants dirigés contre le parasite, la présence de ces anticorps peut être détectée dans le sang ou le sérum humain par un test d’agglutination sur carte avec des trypanosomes préalablement colorés. Ce type de test, appelé CATT (Card Agglutination Trypanosomiasis Test), a fait ses preuves pour le dépistage sérologique de terrain de la maladie du sommeil ou Trypanosomiase humaine africaine. Le test CATT est facile d’utilisation et le résultat est obtenu en 5 minutes. Ce nouveau test CATT/T. lewisi consistera en un dépôt sur une carte d’une goutte de sang ou de plasma/sérum dilué, à laquelle sera mélangée une goutte d’antigènes de T. lewisi (trypanosomes colorés). S'il y a présence d'anticorps chez l’hôte, ces derniers agglutineront les parasites, ce qui sera visible à l’œil nu. En cas de résultat positif, la détection directe des parasites dans le sang de l’hôte, qui nécessite d’autres types de tests beaucoup plus lourds et longs à réaliser, sera effectuée comme diagnostic de confirmation. L’objectif in fine du présent projet est le développement d’un test CATT/T. lewisi qui nécessite 1/ la production d’antigènes du parasite T. lewisi pour la détection des anticorps ; cette étape consiste en la production de trypanosomes en quantité sur rongeurs de laboratoire, 2/ la production de sérums de référence positifs et négatifs pour l’étape de validation du test CATT/T. lewisi ; ces sérums seront obtenus à partir de rats infectés et non infectés.

Bénéfices attendus

La mise à disposition d’un test de dépistage sérologique rapide et utilisable sur le terrain va faciliter le travail des équipes médicales, compte-tenu du grand nombre de personnes à tester (exemple de l’Inde). Seules les personnes séropositives feront par la suite l’objet de tests supplémentaires pour mettre en évidence la présence du parasite T. lewisi. Après son évaluation ce test sera mis à disposition de toutes les équipes médicales des pays concernés par les infections humaines à T. lewisi (en Afrique ou en Asie). Cela permettra d’évaluer, pour la première fois, l’importance réelle de cette infection que de nombreux scientifiques pensent sous-estimée, et très certainement de sauver des vies, en particulier chez les catégories d’individus jeunes et/ou immunodéprimés, souvent atteints d’autres pathologies.

Procédures

Prélèvement (durée: 1 minute) sous anesthésie de 1ml de sang à T0 puis 1 fois par semaine durant 3 semaines sur 18 rats. Inoculation (durée: 30 secondes) sous anesthésie de parasites T. lewisi sur 18 rats puis collecte (durée: 30 secondes) sous anesthésie d’1 goutte de sang à la queue quotidiennement durant 6 semaines maximum et un prélèvement sanguin terminal (durée: 2 minutes) sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. Prélèvement (durée: 1 minute) sous anesthésie de 1ml de sang 1 fois par semaine durant 6 semaines maximum sur 9 rats.

Impact sur les animaux

L’infection à Trypanosoma lewisi chez le rat peut induire des effets indésirables (augmentation ou perte de poids, une légère perte de mobilité, le poil hérissé) qui ne sont pas systématiques. Néanmoins cette souche de parasite ne présente pas une virulence élevée, puisque T. lewisi est considéré comme un commensal du rat (portage sain).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour récolter leur sang qui contient les parasites en vue de leur purification, et de la collecte des sérums de référence.

Remplacement

Pour produire un très grand nombre de trypanosomes et obtenir des sérums de référence positifs et négatifs, le recours au rat est incontournable. En cas de succès de la mise au point de ce test CATT/T. lewisi et dans le cadre d’une production de ces parasites à plus grande échelle, nous envisageons une adaptation de ces parasites à la culture in vitro.

Réduction

Le nombre de rats est limité à 6 par essai de mise au point car nous avons calculé que les quantités de parasites et de sérums négatifs et positifs récoltés seront suffisants pour la mise au point du test. Ces mêmes 6 rats permettront de produire les sérums de référence négatifs avant l’inoculation des parasites, puis les parasites et les sérums de référence positifs ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Une fois infectés, les animaux feront l’objet d’une observation quotidienne afin d’évaluer un changement de comportement anormal. Si les animaux présentent un changement d’apparence physique tel que le poil hérissé pendant plus de 3 jours, avec un aspect général moribond, un état de prostration, ou s’ils ne s’alimentent plus ou si la perte de poids excède 15%., seront euthanasiés sans délai. Le poids de l’animal est relevé à chaque estimation de la parasitémie. Enfin, les animaux seront maintenus en groupe de 2 ou 3 et des mesures d’enrichissement du milieu destinées à améliorer les conditions de vie et à réduire le stress des rongeurs seront mises en place : utilisation de tunnels et/ou carrés de cellulose. Un tapis chauffant est utilisé lors des anesthésies afin de compenser la chute de température interne des animaux.

Choix des espèces

Les rats étant très susceptibles à l’infection par T. lewisi (parasite commensal), ils permettent d’obtenir de fortes parasitémies sous un volume sanguin important. Leur utilisation permet d’obtenir des trypanosomes en quantité suffisante pour la fabrication du test CATT/ T. lewisi. Les rats sont utilisés au stade adulte (300g) afin de permettre de collecter de plus grands volumes de sang pour constitution des sérums de référence et au prélèvement sanguin terminal.

2 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit des injections répétées d'antigènes, parfois avec l'adjuvant complet de Freund, et subit un ou plusieurs prélèvements sanguins à la veine sous-mandibulaire, pour produire des anticorps destinés à des tests de diagnostic et à des médicaments. Le porteur décrit comme nuisances les injections, les prélèvements et l'euthanasie au CO2 en fin d'étude. Sur le remplacement et la réduction, il renvoie à un engagement écrit du client, qui atteste sous-traiter seulement ce qui ne peut être réalisé in vitro et n'utiliser que le nombre d'animaux "nécessaire".

Objectifs

Ces études d’immunisation sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications de ces études peuvent être diverses comme : -Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine -Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques) -Applications diverses en recherche et développement

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisations sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Les applications de ces études peuvent être diverses – comme : -Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine -Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine. Les bénéfices sont donc : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine -Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques) -Applications diverses en recherche et développement.

Procédures

Injections auxquelles les animaux vigiles pourraient être soumis (voies et volumes) : Sous cutanée : volume maximum sans adjuvant : 0,5ml, 4 sites max volume maximum avec adjuvant, injection primaire : 0,1ml/site, 4 sites max volume maximum avec adjuvant, injection subséquente (*) : 0,5ml/site, 4 sites max (*) : le nombre d’injection subséquentes peut varier en fonction du projet (durée du projet, demande du scientifique et type de produit). Par expérience, la nécessité de pratiquer plus de 4 injections subséquentes est très peu fréquente. Intra musculaire (*) : volume maximum sans adjuvant : 0,05ml/site, 2 sites max volume maximum avec adjuvant, injection primaire : 0,05ml/site, 2 sites max volume maximum avec adjuvant, injection subséquente (**): 0,05ml/site, 2 sites max (*) Si utilisation de l’adjuvant complet de Freund (CFA), le scientifique devra justifier par écrit avant le début de la procédure. (**) : le nombre d’injection subséquentes peut varier en fonction du projet (durée du projet, demande du scientifique et type de produit). Par expérience, la nécessité de pratiquer plus de 2 injections subséquentes est très peu fréquente. Intra péritonéale : volume maximum sans adjuvant : 1ml Intra veineuse : volume maximum sans adjuvant : 0,2 ml Voie de prélèvements possible sur animaux vigiles : Veine sub-mandibulaire. Un ou plusieurs prélèvements sanguins pourront être réalisés en cours de protocole, en respectant les règles suivantes : Prélèvement unique par jour : % du sang total circulant prélevé / Durée approximative de récupération 0.75 % / 24 heures 7,5 % / 1 semaine 10 % / 2 semaines 15 – 20 % / 4 semaines. Prélèvements multiples par jour : % du sang total circulant prélevé en 24 h / Durée approximative de récupération 0.75 % / 24 heures 7,5 % / 1 semaine 10-15 % / 2 semaines 20 % / 3 semaines

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : Les injections des antigènes +/- d’un adjuvant, Les prélèvements sanguins pour permettre l’obtention de sang, de plasma ou de sérum, L’euthanasie des animaux en fin d'étude.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés par inhalation d’une concentration progressive de CO2 en fin d'étude ou en cas d'atteinte de points limites.

Remplacement

Le scientifique s’engage par écrit avant chaque étude à nous sous-traiter que les études d’immunisation ne pouvant être réalisées in vitro dans l’état de l’art.

Réduction

Le scientifique s’engage par écrit avant chaque étude à utiliser le nombre d’animaux nécessaire et suffisant à la quantité d’anticorps désirée.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux, avec du matériel de nidification comme enrichissement. Elles sont observées chaque jour par du personnel formé et compétent et des points limites sont mis en place. Avant les injections intra-veineuses les souris sont positionnées dans une enceinte chauffante à 38°C pendant 10 minutes pour faciliter l’injection intra-veineuse.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus adaptée pour les études d'immunisation et en quantité suffisante pour répondre aux demandes spécifiques du scientifique.

20 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit une injection de la bactérie de la syphilis directement dans les testicules sous anesthésie générale, puis des prises de sang à l'oreille deux fois par semaine pendant six semaines, jusqu'au développement d'une orchite. Les animaux sont ensuite tués pour prélever les tréponèmes présents dans le tissu testiculaire. Le porteur présente le lapin comme le seul modèle connu et affirme qu'une fois la culture en milieu axénique maîtrisée, il s'abstiendra du recours à l'expérimentation animale.

Objectifs

Notre projet a pour but l'obtention de suffisamment de matière infectieuse prélevée sur des lésions de syphilis primaire induites chez le lapin au niveau des testicules inoculé à partir de souche établit ou de prélèvements cliniques. Ce broyat testiculaire de lapin sera mis en culture dans les différents milieux mis au point par notre équipe. L’infectiosité sera suivie au cours du temps par PCR mais aussi par inoculation à d’autres lapins. Nous cherchons à montrer qu’un protocole de culture axénique est valable. Ainsi nous nous abstiendrons du recourt à l’expérimentation animale quand cette technique sera maîtrisée.

Bénéfices attendus

Nous cherchons à montrer qu’un protocole de culture axénique est valable pour l'isolement de nouvelles souches cliniques ainsi que pour leur production. L'étape d'injection des testicules de lapin est primordiale pour la mise au point de milieu de culture optimum afin de s'abstenir à terme de l'utlisation d'animaux ou d'en réduire au maximum son utilisation.

Procédures

Inoculation par injection intra testiculaire sous anesthésie générale pour une durée prévue entre 15 à 20 minutes maximum. Le prélèvement sanguin auriculaire sera effectué sur des animaux vigiles après application de crème anesthésiante locale de type EMLA 5%. Les animaux sont placés dans des boites de contention le temps du prélèvement pour une durée prévue entre 10 à 15 minutes, 2 fois par semaine pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

Le suivi des lapins se fera pendant les six semaines qui suivront l’inoculation. Le développement d’une orchite est attendu. D’après la littérature, les lapins sont sacrifiés dès l'apparition de l'orchite afin de prélever les treponema présents dans le tissus testiculaire. Des prises de sang auront lieu 1 fois par semaine (suivi PCR et sérologie). A l’issu, ils seront euthanasiés et prélevés.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure. En effet, les individus infectés ne peuvent pas être utilisés dans une nouvelle procédure ni proposé à l'adoption.

Remplacement

La syphilis est due à Treponema pallidium, bactérie spirochète, observée au microscope au début du siècle dernier, mais qui n’a jamais été mise en culture axénique. Depuis un an, notre équipe tente la culture ultrapure de l’agent de la syphilis (T. pallidium) dans un milieu axénique (en absence de tout autre organisme, dans un milieu stérile, exempt de tout autre agent biologique). Les résultats obtenus, s’ils montrent que des cultures restent positives au test moléculaire (détection de l’ADN) de réaction de polymérisation en chaîne (PCR), ne peuvent pas objectiver la viabilité des éventuelles bactéries cultivées. Le passage à l’essai in vivo chez le lapin (seul connu pour être un bon modèle) devient une étape obligatoire d’une recherche scientifique, qui une fois que la culture axénique de T. pallidum sera maîtrisée, s’abstiendra d’avoir recours à l’expérimentation animale. Des animaux destinés à la recherche seront donc utilisés, de manière ponctuelle, dans ce projet.

Réduction

Afin d'estimer au mieux le nombre d'animaux pour l’isolement de souche clinique et leur production, nous avons utilisé le concept de l'effet de taille (effect size). On s'attend à ce que plus l'effet soit fort (donc la différence est grande), plus la taille de l’échantillon nécessaire sera petite. Pour se faire, deux moyennes ont été comparées, une moyenne théorique (mt) de 25% a été choisie en se référant aux données bibliographiques, et la comparaison a été faite pour un effet fort (80%), qui représente ici le taux d’infections réussies avec une puissance de 0,9 et un risque (alpha) de 0,05. Le nombre de lapins nécessaires pour la production est fixé à 2 lapins pour chaque inoculum bactérien, si 10 souches par an, nous aurons besoin de 20 lapins par an, soit 100 lapins sur 5 ans. En ce qui concerne l’isolement d’une souche clinique, la faible quantité et concentration de départ nous oblige à ne prévoir qu’un seul lapin par souche, ce qui correspond à 10 lapins par souche clinique par an, soit sur 5 ans: 50 lapins. Au total, sur 5 ans, nous pensons avoir recours à 150 lapins.

Raffinement

Par ailleurs, les animaux bénéficient d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin de leur assurer un bien-être optimal tout au long des études. Ce suivie est réalisé par du personnel habilité. Des éléments à ronger, de la paille à ronger et d'autres enrichissement seront fournis aux lapins afin qu’ils puissent se divertir. Les lapins seront hébergés dans des cages individuelles munies d’une plateforme non métallique répondant aux normes. Les manifestations de la douleur seront suivies rigoureusement grâce à une grille d’évaluation (voir annexe) (adaptée de celle de Morton et Griffiths 1985) et tout signe de douleur sera tout de même soulagé par une pommade anti-inflammatoire (Betneval® 0,1 %). De plus, une anesthésie profonde est préconisée avant l’euthanasie des lapins de laboratoire afin de réduire le plus possible la douleur et la détresse de l’animal. Cela est préconisé dans la directive du Parlement Européen et du Conseil relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques : (https://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=COM:2008:0135:FIN:FR:PDF ). La voie IM est la voie préconisée pour l’administration de la combinaison kétamine/xylazine chez le lapin, car elle est non douloureuse. Cela a été décrit par Lipman et al. (Lab Anim Sci. 1990, 40(4):395-8).

Choix des espèces

Le choix du lapin est basé sur les informations bibliographiques dans le domaine de laproduction et isolement d'agent de la syphilis. Le modèle lapin a déjà été prouvé et validé pour l'infection par Treponema pallidum. Nous allons utiliser des sujets adultes dont le volume des organes cibles de cette infection (testicule de lapin) est suffisant et capable de contenir l’infection sans induire de choc infectieux(septicémie) fatal.

39 600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit l'injection d'un produit pharmaceutique et sa température est suivie, pour détecter d'éventuelles substances provoquant de la fièvre, environ un lapin sur cinq servant à un second test avant sa mise à mort. Le porteur reconnaît qu'un test sans animaux, décrit dans la Pharmacopée européenne, peut être une "vraie alternative", mais maintient l'essai sur lapins parce qu'il reste inscrit comme obligatoire dans les dossiers d'autorisation. Il présente le nombre et l'espèce comme fixés par les Pharmacopées.

Objectifs

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées internationales, qui sont les référentiels pharmaceutiques pour la réalisation des tests de contrôle qualité. L’objectif de ce test est de détecter la présence de molécules pyrogènes, c’est-à-dire pouvant provoquer une augmentation de la température, à l’intérieur de produits pharmaceutiques, médicaments expérimentaux ou de dispositifs médicaux. Pour cette détection, le produit à tester est injecté à un groupe de lapins, et la température de ces animaux est mesurée afin de déterminer la hausse de température éventuelle.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments ou des dispositifs médicaux à des patients. Ce test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire comme test libératoire de produits pharmaceutiques.

Procédures

Injection de NaCl 0.9% en intraveineuse (10mL /kg) -Injection de l’échantillon à tester en intraveineux (IV) à la dose maximum de 10 ml/kg ou en intra-musculaire (IM) à 1 ml/lapin maximum -Contention de l’animal durant l’essai.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour l’animal sont : -L’administration des produits pharmaceutiques, -L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole, - La contention de l’animal durant le test.

Devenir

Tous les animaux entrant en test pyrogène sont mis à mort : -soit en cas de détection d’un signe clinique -soit à la fin de la réalisation des tests pyrogènes -soit s’il ne réussit pas le prétest 2 fois consécutives, et n’est donc pas éligible pour un test pyrogène A noter néanmoins qu’environ 20% des lapins effectuent un deuxième test pyrogène (réutilisation) avant d’être euthanasiés.

Remplacement

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM de clients. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques. Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : -Le test des endotoxines bactériennes, qui peut être utilisé comme variante au test pyrogène, ne détectera que les molécules type endotoxines, alors que le test sur lapins pourra détecter tout type de molécules pyrogènes. -Il existe maintenant le test MAT qui est décrit dans la Pharmacopée européenne, et peut être une vraie alternative au test pyrogène. En revanche ce test peut ne pas être validable pour certains produits pour cause d'interférences. -Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM (autorisation de mise sur le marché) du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est défini par les Pharmacopées (entre 3 et 5 lapins selon les Pharmacopées – note : 3 lapins sont usuellement utilisés) ou le cas échéant dans les dossiers d’AMM des scientifiques. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, une réutilisation des lapins est possible dans un même projet dans la mesure où un lapin ne reçoive pas deux produits immunisants (exemple : antibiotique).

Raffinement

Hébergement : Les Pharmacopées demandent que les lapins utilisés en test pyrogène soient hébergés individuellement or la directive européenne exige un hébergement en groupe sociaux. Afin de respecter la pharmacopée tout en préservant au mieux le besoin d'hébergement social les lapins sont stabulés 2 par cage de 4329 cm². Présence d’une séparation avec ouverture, permettant aux 2 animaux de se déplacer librement sur toute la surface de la cage. La veille du prétest ou test, l’ouverture est condamnée, et chaque lapin est donc stabulé individuellement dans une demi-cage. Quand l’hébergement par groupe de 2 n’est pas possible (ex : incompatibilité sociale) : Stabulation d’un seul lapin dans une cage de 4329 cm² tout en gardant le contact visuel et olfactif avec ses congénères. Enrichissement : Des enrichissements sont fournis aux animaux (e.g. balles de foins, balles en plastique). Surveillance : Pendant la procédure, la présence permanente d'un technicien est planifiée et l’état clinique général des animaux est vérifié toutes les heures après l’injection jusqu’à la fin de l’essai, et la durée d’enregistrement des températures après l’injection est limitée à 5h30 maximum. Les animaux sont ensuite replacés dans leurs cages de stabulation pour qu’ils aient un accès à l’eau et l’aliment. Autre : Lorsque cela correspond à un raffinement de la méthode, l’administration d’un produit approuvé au préalable par le service vétérinaire peut être utilisé dans le cadre d’un test pyrogène (exemple : injection de glucose 5% lors d’un essai de test pyrogène d’une insuline).

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce requise par les Pharmacopées pour la réalisation de ce test. Le poids des lapins minimum pour la réalisation de ce test est de 1.5kg (lapins adultes) en accord avec les exigences des pharmacopées.