Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Offre de prestation d’étude de pharmacocinétique et de tolérance chez le rongeur (rat, souris) et le cobaye.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 7200
Cochons d'Inde : 7200
Jusqu'à deux prises de sang par semaine pendant un mois, dont deux au plus au sinus avec une pommade anesthésique sur l'œil, et une injection dans le liquide céphalorachidien sous anesthésie : 21 600 rongeurs, 7 200 souris, 7 200 rats et 7 200 cochons d'Inde, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour prélever sang, tissus et organes. Le projet est une offre de prestation : mesurer comment des candidats médicaments se répartissent dans l'organisme et s'ils sont tolérés, afin de fixer les doses des études d'efficacité et des premiers essais cliniques. Les composés passent par la bouche, le nez, les veines, les muscles, l'abdomen ou sous la peau, et certaines voies exigent un abord chirurgical, source de douleur et d'inflammation. Aucune ligne ne justifie l'emploi des cochons d'Inde, et le porteur rapporte l'effectif de 21 600 à la seule "variabilité des modèles et des techniques de dosage".
Objectifs
Quelle que soit la voie d'administration, un médicament doit atteindre son organe cible pour être actif, à une concentration suffisante sans être toxique. L'obtention de la bonne concentration du produit au niveau de son organe cible dépend de son profil pharmacocinétique, obtenu par une voie d'administration et selon une fréquence d'administrations spécifiques, dans une formule donnée. C'est dans ce contexte que s'inscrit ce projet qui a pour objectif de réaliser des études de pharmacocinétique de candidats médicaments chez les rongeurs pour traiter différentes pathologies, pour définir le devenir du produit dans l'organisme, déterminer l'exposition des animaux au produit, au niveau plasmatique et de certains organes, de définir les doses pouvant être administrées pour les études d'efficacité et lors des premières études cliniques et de sélectionner les formulations optimales. Les différentes voies d'administration pouvant être réalisées chez le rongeur sont : la voie orale, intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale, intranasale, directement dans le liquide céphalorachidien par injection intrathécale. Pour certaines pathologies, l'utilisation de voies locales permet d'obtenir une meilleure efficacité en réduisant les effets systémiques non désirables. L'utilisation de formulations innovantes et/ou à libération prolongée, permet d'améliorer la biodistribution du produit et/ou d'augmenter la durée de l'efficacité des traitements, pour diminuer le nombre des administrations parfois invasives et/ou obtenir une concentration active stable dans le temps. Des prélèvements sanguins pourront-être réalisés soit à des temps spécifiques post-administration soit en fin d'étude pour effectuer les dosages du principe actif ou de ses métabolites, ou le dosage de biomarqueurs. Des prélèvements d'organes et de tissus pourront-être réalisés post-mortem pour les dosages du principe actif ou de ses métabolites, ou le dosage de biomarqueurs. La tolérance de ces candidats médicaments pourra aussi être évaluée in vivo par observation de signes cliniques (poids, comportement, douleur), au niveau local par observation du site d'injection de modifications macroscopiques comme la présence de signes d'inflammation, et post-mortem par des analyses des tissus soit globales (ELISA, PCR, etc...), soit histologiques. Ce projet a donc pour objectif de tester la tolérance et l'atteinte des organes cibles de thérapies innovantes dans diverses pathologies.
Bénéfices attendus
Ces études de pharmacocinétique et de tolérance constituent un prérequis dans le développement de candidats médicaments, quelle que soit l’indication. Nous espérons grâce à ce projet permettre la poursuite du développement des composés et formulations ayant démontré une bonne tolérance et une bio distribution pertinente pour le traitement de différentes pathologies. Ces études pharmacocinétiques et de tolérance permettront de sélectionner les composés les plus pertinents en fonction de leurs propriétés de biodistribution et de leur innocuité, de déterminer la formulation permettant une délivrance optimale et la concentration à utiliser pour atteindre la concentration thérapeutique dans le tissu / fluide/ organe cible.
Procédures
Administration de composés à tester ou de produit de référence : -L’administration de médicaments vétérinaires (anesthésiques/antalgiques) suivant les bonnes pratiques vétérinaires qui pourront être quotidiennes pendant 7 jours au maximum. Durée de l’intervention entre 5 minutes (Isoflurane) et 1h 00 (MMF). -Une administration intrathécale unique sous anesthésie générale, administration systémique ou intranasale sur l’animal éveillé en contention. Durée de l’intervention entre 5 minutes (administration systémique) et 1h 00 (administration intratéchale). -Des prélèvements sanguins pourront être réalisés : 1 à 2 par semaine (dans la limite des contraintes liées à la récupération des animaux et aux spécificités du site de ponction), jusqu’à la fin de l’étude.( 1 mois maximum après l'injection du principe actif). Durée de l’intervention maximum 5 minutes. Pour les prélèvements sanguins nous pouvons prélever au maximum: -Pour une ponction unique jusqu’à 10% du volume sanguin total suivi d’une période de récupération de 3 semaines. -Pour des prélèvements répétés dans la limite de 20% du volume sanguin total sur une période de 14 jours. En fonction de la fréquence et du volume minimum nécessaire aux analyses nous adapterons le site de ponction et éventuellement la réalisation des prélèvements sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus dans des études de pharmacocinétique ou de tolérance sont : (1) la douleur ou le stress possiblement induit lors de l’administration du candidat médicament par voir systémique ou locale. Un stress peut être présent associé à la contention et une légère douleur liée à l’introduction d’une aiguille. (2) des contraintes modérées associées au prélèvement sanguin au niveau du sinus. (3) des douleurs ou des processus inflammatoires induits par les voies d’administration nécessitant un abord chirurgical.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car le sang, certains tissus et organes sont prélevés afin de réaliser des analyses.
Remplacement
Le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthodes alternatives validées pour mesurer la biodisponibilité et la tolérance de molécules dans les organes cibles après administration systémique ou locale. La pharmacocinétique de nouveaux traitements ne peut pas être étudiée via la culture cellulaire ou les modèles informatiques. Néanmoins nous réalisons une veille bibliographique active afin de suivre les modèles de remplacement qui sont susceptibles d’être développés à l’avenir.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été estimé, en tenant compte de la variabilité des modèles et des techniques de dosage de pharmacocinétique. Ce nombre d’animaux nous permettra d’avoir des résultats fiables sans utiliser plus d’animaux que nécessaire.
Raffinement
Ce projet fait l’objet d’une démarche spécifique dans la réalisation des études par du personnel formé aux méthodes, compétent et habilité dans le respect des principes éthiques : Le contenu de ces études intègre les impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée, mais aussi la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal. Si nécessaire, de l’aliment sera mis sur le sol des cages la veille et deux jours après l’administration du composé afin de faciliter l’accès à la nourriture. De même si nécessaire, afin de faciliter l’accès à l’eau des biberons adaptés (tige longue pour souris) et/ou de l’hydrogel seront mis à disposition des animaux. Lors des procédures d’anesthésie de plus de 15 minutes, les animaux sont placés sur des tapis chauffants et un gel oculaire est appliqué. Une hydratation par administration de sérum physiologique est mise en place après les anesthésies qui vont avoir une durée supérieure à 30 minutes. Des protocoles d’analgésie adaptés sont mis en place lorsque cela est nécessaire, notamment pour les procédures impliquant des chirurgies. Afin de limiter et pallier cet effet indésirable, une administration d’anesthésiques et/ou antalgiques par voie systémique, suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires (introduction d’une aiguille), sera réalisée. Selon le cas, une habituation à la manipulation pourra aussi être effectuée afin de limiter le niveau de stress de l’animal. Les contraintes modérées associées aux modalités d’administration, aux prélèvements sanguins et au niveau du sinus (2 prélèvements au maximum pour diminuer le risque de lésion et en appliquant une pommade ophtalmique anesthésique locale) sont réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs en limitant le plus possible la contention de l’animal. L’état clinique des animaux est surveillé au moins quotidiennement, des pesées ou des mesures sont réalisées comme la prise de température, les examens sanguins…afin d’anticiper au maximum l’apparition de toute douleur et de mettre en place des mesures spécifiques (arrêt anticipé de l’étude, mise en place de soins…) par le responsable de l’étude en concertation avec le vétérinaire clinicien en application des points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des adultes pour lesquels les différents organes sont complètements formés et fonctionnels. En amont une évaluation est faite sur le choix des modèles les plus pertinents selon le type de pathologie à traiter, et le mode d’administration préféré : l’utilisation de voies locales permet d’obtenir une meilleure efficacité en réduisant les effets systémiques non désirables. L’utilisation de formulations innovantes et/ou à libération prolongée, permet d’améliorer la biodistribution du produit et/ou d’augmenter la durée de l’efficacité des traitements, pour diminuer le nombre des administrations parfois invasives et/ou obtenir une concentration active stable dans le temps. Le mécanisme d’action de la thérapie à tester permettra également de sélectionner le meilleur modèle de rongeur pour réaliser les études d’efficacité et donc de pharmacocinétique.
Etudes de toxicologie de la reproduction avec observations post-natales longues chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 59624
74 464 rongeurs, 59 624 rats et 14 840 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent un produit par voie orale chaque jour, les femelles subissent des lavages vaginaux avant accouplement, et les petits nés dans les études sont soumis à des tests de développement physique, sexuel et neurologique, à des examens ophtalmologiques, à des mesures du tibia et de la distance ano-génitale ainsi qu'à des prélèvements de sang et d'urine. Les effets attendus portent sur toutes les étapes de la reproduction : accouplement, nidation, gestation, mise bas, lactation, comportement maternel et développement des descendants. Le porteur présente ces essais comme "indispensables" dans un dossier de mise sur le marché et "nécessaires règlementairement", et note qu'aucun modèle in vitro ne couvre l'ensemble de la fonction de reproduction.
Objectifs
Ce projet permet l'évaluation de la toxicité d'un produit chez le rongeur (rat ou souris) sur les fonctions de reproduction et/ou le développement de la descendance ou d'animaux juvéniles, conformément aux lignes directrices : - ICH M3(R2), S5(R2): Pre- and Post-Natal Development (PPND) - OCDE 416 (Two-Generation Reproduction Toxicity Study) et OCDE 443 (Extended One-Generation Reproduction Toxicity Study) - FDA- CDER Guidance for Industry, Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products. Les procédures peuvent être indispensables dans un dossier de mise sur le marché d’un médicament ou d'enregistrement d'un produit chimique et permettre aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition (informations sur les effets toxiques majeurs : détermination d'une dose sans effet adverse afin de déterminer une marge de sécurité pour l'utilisation/l’exposition humaine).
Bénéfices attendus
A ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais aucun ne permet d’intégrer globalement l’impact sur la fonction de reproduction. Ce projet correspond aux tests nécessaires et reconnus règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce) de différents produits.
Procédures
Les animaux sont traités, le plus souvent par voie orale de façon journalière, avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux. Les petits issus des portées pourront être soumis à des tests non invasifs de suivi de développement physique, sexuel ou de maturité sexuelle et neurologiques/comportementaux, ainsi qu’à des observations ophtalmologiques. Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur et pourront faire l’objet d’une mise à jeun préalable .
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets pharmacologiques du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. De l’inconfort et du stress liés aux procédures elles-mêmes (contention, administration, sédation/anesthésie, l’hébergement individuel (quand nécessaire), observations et mesures (lavages vaginaux, examens ophtalmologiques, mesure de la taille du tibia ou de la distance ano-génitale, tests de suivi de développement ou de maturité sexuel(le), évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques) et/ou prélèvements) et des effets systémiques liés au produit administré (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.
Devenir
La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
En raison de la complexité des organismes vivants et des processus de développement, de conception et des échanges dynamiques entre mère et descendance, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’intégrer l’impact global sur la fonction de reproduction. Les tests in vivo de ce projet ne sont actuellement pas remplaçables et restent nécessaires règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle ou l’impact global sur la fonction de reproduction de différents produits (ex : médicaments, produits chimiques).
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les actes pouvant engendrer du stress, de l’inconfort ou des douleurs seront réduits au minimum nécessaire et seront réalisés sous sédation ou anesthésie générale. Dans le cas où l’anesthésie est jugée plus traumatisante pour l’animal et/ou si l’anesthésie est incompatible avec les prélèvements prévus, les prélèvements seront réalisés sur l’animal vigile, notamment les prélèvements sanguins et le recueil d’urine, par exemple. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites de façon à éviter tout inconfort ou souffrance prolongé(e) : poids corporel, évaluation de la consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée, revue par un vétérinaire (le cas échéant) et si un ou plusieurs points limites sont atteints, que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Les rongeurs sont hébergés en groupe la plupart du temps à l’exception de certaines situations expérimentales ou sanitaires exigeant l’hébergement individuel.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont des espèces de choix, le rat étant celle qui est la plus fréquemment utilisée. En effet: - elles sont recommandées par les lignes directrices, - elles présentent une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de petits issus des portées, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rongeur, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - elles font l’objet de données historiques robustes. Le produit sera administré à des animaux adultes car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements, pour évaluer l’effet du produit sur l’appareil reproducteur. Les petits qui naissent dans le cadre des études ne sont pas traités avec les produits mais sont suivis pendant la lactation ou jusqu'à l’âge adulte (selon les lignes directrices ; observation de la survie et du développement de la descendance). Dans d’autres études, le produit pourra également être administré aux juvéniles pour évaluer l’effet sur le développement ou dans le cadre de produits pharmaceutiques à visée pédiatrique. Ces âges sont requis par les lignes directrices et/ou correspondent aux âges d'utilisation chez l'humain. Le produit sera administré à des animaux adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement et selon les lignes directrices/recommandations règlementaires) car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements, pour évaluer l’effet du produit sur l’appareil reproducteur. Dans certaines études, le produit pourra également être administré aux juvéniles pour évaluer l’effet sur le développement ou dans le cadre de produits pharmaceutiques à visée pédiatrique. Ces âges sont requis par les lignes directrices et/ou correspondent aux âges d'utilisation chez l'humain. Sauf dans les cas ci-dessus, les petits qui naissent dans le cadre des études ne sont pas traités avec les produits mais sont suivis pendant la lactation ou jusqu'à l’âge adulte (selon les lignes directrices ; observation de la survie et du développement de la descendance).
Validation, par une molécule de référence, de la procédure d’enregistrement de l’électrocardiogramme par télémétrie implantée chez le miniporc, chien et primate non humain, dans le cadre de l’évolution des lignes directrices internationales
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Cochons : 4
Macaques à longue queue : 4
Porteurs d'un capteur de télémétrie implanté chirurgicalement, 4 chiens beagle, 4 miniporcs Göttingen et 4 macaques à longue queue appartiennent au "stock d'animaux télémétrés" de l'établissement, où ils sont replacés à la fin de la procédure. Les 12 animaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, faites de contentions répétées, d'administrations par sonde gastrique et de prises de sang veineux répétées. La molécule administrée provoque, aux doses élevées, des vomissements et des fèces liquides que le porteur décrit comme rétrocédant en vingt-quatre à quarante-huit heures. L'objet réel est de démontrer que la procédure d'enregistrement de l'électrocardiogramme du site détecte bien un allongement de l'intervalle QT, une validation exigée par l'évolution des lignes directrices internationales et qui permettra aux laboratoires clients de demander une exemption d'essai clinique chez le volontaire sain.
Objectifs
L’objectif du projet est de démontrer que la procédure d’enregistrement de l’électrocardiogramme (ECG) de l’Etablissement est apte à détecter une augmentation de la durée de l'intervalle spécifique mesuré sur un tracé ECG à l'aide d'un capteur de télémétrie implanté chirurgicalement. Cet intervalle est celui entre l'onde Q et l'onde T d'un complexe ECG, appelé intervalle QT. La prolongation de l'intervalle QT (appelé ci-après "risque QT") sera évaluée après administration d'un produit de référence chez le miniporc Göttingen, le chien Beagle et le macaque Cynomolgus. Cette évaluation sera conduite dans les mêmes conditions expérimentales que celles adoptées pour évaluer le risque QT chez l'animal (risque QT préclinique) d'un candidat-médicament (CM). En effet, la prolongation de l'intervalle QT peut prédisposer un individu sain ou malade à une arythmie cardiaque mortelle. On doit donc s'assurer, avant de tester un CM chez l'Homme, que celui-ci n'a préalablement pas démontré de risque QT chez l'animal (risque QT préclinique négatif). Afin de renforcer la prédictivité de ces données de risque QT de l'animal à l'Homme, les lignes directrices ICH E14 (évaluant le risque QT chez l'Homme dans des essais cliniques dédiés) et ICH S7B (évaluant le risque QT préclinique chez les miniporc, chien et macaque) ont récemment évolué. Ainsi, les Autorités de Santé ont édicté des bonnes pratiques de conduite des études et exigent un renforcement de la prédictivité de l'évaluation du risque QT préclinique. Ce nouveau contexte législatif a été entériné par l'Industrie Pharmaceutique et les sociétés de sous-traitance préclinique, dont l'Etablissement. Ce renforcement de la prédictivité repose sur une plus grande robustesse statistique des données ECG précliniques. En particulier, la sensibilité des études précliniques est à démontrer, c’est-à-dire leur capacité à mettre en évidence le risque QT préclinique dans les mêmes conditions expérimentales que celles utilisées pour évaluer le risque QT clinique. Ceci est effectué par administration d'une molécule de référence. Ainsi, si un CM démontre un risque QT préclinique négatif (= absence de prolongation de l'intervalle QT) dans les mêmes conditions expérimentales que celles utilisées pour démontrer le risque QT préclinique positif de la molécule de référence, alors ce risque QT préclinique négatif sera considéré comme réel et non pas comme traduisant une incapacité de l'étude préclinique à démontrer ce risque QT.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont les suivants: La démonstration de la sensibilité de la procédure d’enregistrement de l’ECG par télémétrie implantée à l'aide d'une molécule de référence permettra, à terme, de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les études préclinique d’évaluation du risque QT d'un CM en développement. En effet, l’inclusion d’un groupe d’animaux traités par cette molécule de référence ne sera pas nécessaire. L'amélioration de la prédictivité du risque QT clinique sur la base du risque QT préclinique permettra au laboratoire développant un CM de demander une exemption de conduite de l'essai clinique TQT chez le volontaire sain; cette disposition permettra ainsi de mettre plus rapidement sur le marché des molécules thérapeutiques offrant un service médical rendu prometteur.
Procédures
4 chiens Beagle, 4 macaques Cynomolgus et 4 miniporcs Göttingen seront inclus dans ce projet. Quelle que soit l'espèce, les nuisances seront similaires et consisteront en: - Plusieurs occasions de contention des animaux, durant de quelques secondes à quelques minutes, pour les traitements et les prises de sang veineux, - Plusieurs occasions d'administrations - par intubation gastrique à l'aide d'une sonde adaptée - de formulations liquides de traitement, durant quelques secondes, - Des prises de sang veineux répétées, durant quelques secondes, à l'aide d'une aiguille et d'un dispositif de collecte adapté.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont connus, communs aux 3 espèces, et généralement observés aux doses élevées de la molécule de référence: épisodes occasionnels de vomissements et/ou de fèces liquides, sans atteinte de l'état général. Ces signes rétrocèdent généralement spontanément dans les 24 à 48 heures après traitement.
Devenir
Au terme de la procédure, les animaux seront replacés dans le stock d'animaux télémétrés de l'Etablissement.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas de modèle in vitro ou modélisables par ordinateur (modélisation "in silico") permettant de reproduire la procédure d’enregistrement de l'ECG par télémétrie sur des animaux implantés avec un capteur et traités préalablement avec une molécule de référence dans les conditions environnementales de l’Etablissement. En effet, cette procédure vise à détecter un changement de l'activité électrique cardiaque d'un animal en réponse à l'activité pharmacologique d'une molécule de référence administrée dans certaines conditions environnementales. Ce changement est capté par un système complexe d'électrodes ECG, reliées à un implant préalablement positionné chirurgicalement et un système Bluetooth de transmission du signal vers un ordinateur. L'ensemble des paramètres, leur interaction et la réaction pharmacologique de l'animal ne peuvent pas être reproduits in vitro ou in silico
Réduction
Le traitement des animaux télémétrés selon un carré latin est le design d'étude permettant la plus grande réduction du nombre d'animaux testés car il fournit la puissance statistique la plus élevée par rapport à d'autres designs d'études (traitement par groupes parallèles ou selon des doses croissantes). Ceci est dû au fait que chaque animal reçoit le placebo et plusieurs doses de la molécule de référence, et est donc son propre contrôle. Ce design permet de diminuer la variabilité interindividuelle et d'augmenter ainsi la sensibilité de la réponse de l'intervalle QT à la molécule de référence (c’est-à-dire que la probabilité de détecter un risque QT préclinique positif est augmentée). Sur la base de données statistiques pour les designs d'études de télémétrie en carré latin, 4 animaux seront inclus dans chaque procédure.
Raffinement
Compte-tenu des nuisances induites par les contraintes environnementales et techniques liées aux études de télémétrie et les effets indésirables (et anticipés) liés à l'administration de la molécule de référence, les mesures suivantes seront prises: - Zootechniques: hébergement des animaux en groupes sociaux, programme d'enrichissement adapté à chaque espèce, distribution de récompenses alimentaires après interventions contraignantes, habituation à la contention et à la procédure d’administration à plusieurs occasions, séances dédiées et régulières de regroupement des chiens ("courettes") avec interactions chien-techniciens animaliers. - Cliniques: évaluation quotidienne de l'état général des animaux, examen physique ou détaillé, vidéomonitorage des animaux dans les salles d’hébergement, observations cliniques en direct et rapprochée des animaux après traitement, suivi vétérinaire. - Médicales: mise en vigueur de soins médicamenteux et/ou sanitaires en cas de troubles gastro-intestinaux si ceux-ci ne régressent pas spontanément et tout soin adapté en cas d'altération notable de l'état général des animaux.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce incluse dans les études évaluant de risque QT préclinique avec un CM est dicté par la capacité de ce modèle animal à prédire ce risque chez l'Homme. Cette prédiction repose sur des caractéristiques telles que la pharmacocinétique, le métabolisme et la cible pharmacologique du CM. Un autre critère de choix plus récent est lié à la grande diversité de structure chimique des CM testés, de la nouvelle entité chimique à la molécule biologique tels que les anticorps monoclonaux. L'ensemble de ces critères de choix converge pour indiquer qu'une seule espèce ne peut prétendre, à elle seule, prédire le risque QT chez l'Homme. Par ailleurs, les lignes directrices E14 et S7B récemment actualisées dans le cadre de l'évaluation du risque QT préclinique et clinique recommandent de choisir l'espèce animale la plus appropriée, sur la base des effets pharmacodynamiques du CM, et de la relation entre ces effets et l'exposition plasmatique à un CM; il est également attendu à ce que cette espèce soit la même que celle incluse dans les études de toxicologie précliniques réglementaires conduites avec ce même CM. L’étude de télémétrie implantée destinée à évaluer le risque QT préclinique d'un CM peut donc être réalisée sur le miniporc, le chien et le primate non humain. Par conséquent, dans le cadre de ce projet, la validation du risque QT par la molécule de référence sera effectuée chez ces trois espèces. Les animaux seront de jeunes adultes ou des adultes afin que leurs fonctions vitales (dont l'électrocardiogramme) soient matures.
Etudes mécanistiques pour caractériser, chez le rongeur, les changements physiopathologiques induits par des substances actives sur le métabolisme des sphingolipides
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 70
140 rongeurs mâles, 70 souris et 70 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacun reçoit une injection intrapéritonéale par jour pendant sept jours et peut être saigné une fois par jour à la queue, à la saphène ou sous la langue, puis est tué pour l'autopsie de ses organes. Le composé testé a déjà tué ou conduit à mettre à mort des animaux à partir du soixantième jour lors d'une étude antérieure de quatre-vingt-dix jours, et la durée est ici limitée à moins de trente-cinq jours pour "garantir l'absence d'effets indésirables". Les animaux écartés après randomisation peuvent être gardés vivants et replacés, ou utilisés pour entraîner le personnel aux gestes techniques. Sur le remplacement, le porteur affirme que seule une mesure dans un "organisme entier" permet d'établir une dose sans effet.
Objectifs
Le projet consiste en des études mécanistiques pour étudier chez le rongeur des changements physiopathologiques lié au métabolisme des lipides (notamment en sphingolipides et céramides) potentiellement induites par un composé en développement. Dans cette série d’étude, on cherche à confirmer in vivo la modulation lipidique observée sur des modèles in vitro et à établir éventuellement une relation dose-réponse. Ce projet s’inscrit dans une investigation globale des effets du composé d’intérêt pour comprendre les effets cliniques toxiques observés après dosage répété dans des études chez l’animal et prévenir le risque chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ces études sont de confirmer, in vivo, une modulation des lipides suite à un traitement puis d’établir pour le composé d’intérêt une dose sans effet sur le métabolisme lipidique, ainsi que l'établissement d’une relation dose-réponse tissulaire et éventuellement plasmatique. Ainsi les études menées pourront répondre à la question suivante : quelle méthode et quels marqueurs moléculaires peuvent être utilisés pour prédire un effet clinique néfaste chez les animaux pour établir une dose sans effet ? Ces études mécanistiques apporteront des informations sur la méthodologie à utiliser pour prédire l’origine d’effets toxiques liés à des modulations lipidiques pour des molécules de la même famille ou avec le mode d’action biologique. Au final, ces études courtes avec un nombre réduit d’animaux permettront de décider si la molécule peut être développée dans un contexte de risque chez l’homme avec une forte probabilité de réussite. En cas de réponse négative, les études longues avec un plus grand nombre d’animaux ne seront pas réalisées.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à une injection péritonéale quotidienne sur 7 jours, l'injection ne dure que quelques secondes et la manipulation des animaux moins de 2 minutes. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements sanguins en accord avec les recommendations éthiques (effectué 1 fois par jour au maximum via la veine caudale ou la veine saphène, ou bien la sublinguale sous anésthesie, en moins de 3 minutes). Tous les autres prélèvements seront réalisés post-mortem.
Impact sur les animaux
Aucun effet toxique majeur n’est attendu sur ce projet, la sélection des doses étant fondée sur les résultats des études précédentes notamment de l’étude de 90 jours chez le rat. Une attention particulière sera portée à l’apparition d’effets toxiques potentiellement liés à la diminution de l’efficacité de l’alimentation et aux points limites observés dans l’étude 90 jours ayant mené à la mort ou au sacrifice des animaux à partir du soixantième jour. La forte dose choisie ne doit pas excéder la dose maximale tolérée chez l’animal (et définie au préalable). La forte dose choisie est fondée sur les résultats des études 28 jours et 90 jours. A cette dose, pendant 35 jours, aucun signe clinique n’a été constaté ce qui n’avait pas été le cas au-delà (diminution de l’efficacité alimentaire, puis signes clinique pouvant conduire à des points limites et à la mort. Pour les études de ce projet, le choix des doses et la durée limitée des études (moins de 35 jours) doit garantir l’absence d’effets indésirables. Les injections intrapéritonéales prévues pour l’étude 1 et l’éventuelle étude 4 peuvent induire une douleur légère et de petits hématomes qui disparaissent rapidement. En cours d’étude, un prélèvement de sang pourra être effectué 1 fois par jour au maximum via la veine caudale ou la veine saphène, ou bien la sublinguale sous anésthesie. Ces derniers peuvent induire une douleur légère et de petits hématomes qui disparaissent rapidement.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin d’étude pour évaluer l’effet des subtances chimiques sur les organes lors de l'autopsie. Les animaux excédentaires exclus de l'étude après randomisation peuvent être gardés en vie et être replacés ou seront intégrés dans le processus de formation du personnel aux gestes techniques.
Remplacement
Des essais in vitro et in vivo ont été réalisés pour déterminer le profil toxicocinétique et le profil toxico-dynamique de la molécule d’intérêt et de certains métabolites mais ces essais ne permettent pas de répondre à l’établissement d’une dose réponse fondée sur les changements lipidiques dans un organisme entier. Les résultats des essais mécanistiques in vivo seront analysés en regard des résultats des essais in vivo exploratoires et réglementaires.
Réduction
Ces études se font dans le respect des 3Rs avec un nombre restreint d'animaux. Un minimum de 5 animaux par groupe est prévu d’après l’expérience du laboratoire et de la littérature. Ce nombre pourra être affiné en fonction des résultats. Un total estimé de 140 animaux pourra être utilisé pour ce projet, seulement sur les mâles afin de limiter l'emploie d'animaux (les éventuels effets attendus devraient être plus ou moins similaires entre les deux sexes). De plus, en fonction des résultats obtenus dans ce projet les études de cancérogenèse pourraient ne pas avoir lieu.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages appropriées avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et à leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés tous les jours (week-ends compris). Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance et leur bien-être. Toutes ces observations sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes régulières de maintien des compétences. Des points limites ont été identifiés par le laboratoire, qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal. Une évaluation rétrospective sur le bien-être animal est réalisée par la structure du bien-être animal sur toutes les études. La priorité est de garantir le bien-être des animaux en administrant les produits à des doses appropriées basée sur la littérature ou sur les précédentes études conduites. On retiendra donc des doses inférieures à la dose maximale tolérée chez l’espèce utilisée.
Choix des espèces
Les études sur les animaux décrites dans ce document sont réalisées chez le rongeur mâle pour permettre d’établir une dose sans effet sur le métabolisme des lipides. Le rat et la souris sont les espèces les plus appropriées pour étudier les aspects abordés dans le projet actuel, les autres études de toxicologie étant réalisées sur ces espèces. Toutes les études décrites dans ce projet utilisent en général de jeunes adultes (à partir de 6-7 semaines et jusqu’à 15 semaines) conformément aux recommandations pour les études de toxicité réglementaire.
Etude de la réversibilité de la réponse induite par des perturbateurs endocriniens à l’aide de poissons zèbres génétiquement modifiés
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Une lignée de poissons zèbres génétiquement modifiés, dont la fluorescence suit l'activité d'un gène du métabolisme intestinal, est mise au point pour évaluer les perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire, dans le cadre d'un projet européen. 700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leurs intestins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés à des substances entre 72 et 120 heures après la fécondation, ils passent cinq séances d'imagerie au microscope sans anesthésie, à 5, 7, 10, 15 et 20 jours, et sont suivis jusqu'à trois mois. Le porteur qualifie cette expérience d'"essentielle" à la caractérisation de la lignée et invoque l'"organisme entier" pour écarter les cellules en culture.
Objectifs
Dans le cadre de l’étude des perturbateurs endocriniens en lien avec les pathologies métaboliques telles que l’obésité, le diabète ou la stéatose, nous développons une lignée transgénique de poisson zèbre apte à rendre compte d’effets de substances au niveau du métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme. La quantification de la fluorescence dans cette lignée transgénique permet de suivre l'expression de notre gène d'intérêt et est réalisée après exposition d’embryons issus de cette lignée à des substances pendant 48h, de 72 heures post-fécondation (hpf) à 120hpf. Afin d’étudier la réversibilité de la réponse de ce modèle nous souhaitons poursuivre les mesures de fluorescence au microscope au-delà de 120hpf, jusqu’à 3 mois. Les animaux ne seront donc pas exposés aux substances passé 120hpf. L’utilisation de la lignée transgénique apportera des informations complémentaires sur les mécanismes d’action des substances sans augmenter le nombre de poissons nécessaires à la réalisation des essais pour l’identification des perturbateurs endocriniens. A terme, le modèle que nous développons permettra d’évaluer l’impact de perturbateurs endocriniens en ayant recours à des embryons âgés de moins de 120hpf et les données générées au cours de ce projet permettront le développement/l’amélioration de voies de toxicité impactant le métabolisme qui pourront être utilisées pour une meilleure évaluation des dangers et des risques des perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire.
Bénéfices attendus
L’étude la réversibilité de la réponse après exposition des embryons de poissons zèbres aux substances de 72hpf à 120hpf permettra d’approfondir notre connaissance des mécanismes régulant cette réponse. Nous pourrons ainsi analyser si l’expression de la fluorescence, induite ou inhibée à la suite de l’exposition aux substances, persiste ou au contraire revient à la normale alors que les poissons n’y sont plus exposés. Ainsi, la fluorescence étant relative à l’expression de notre gène d'intérêt, acteur clé du métabolisme intestinal chez le poisson zèbre, cette expérimentation permettra d’étudier les effets au long terme (jusqu’à 3 mois) sur ce métabolisme à la suite d’une exposition courte (48h) aux substances inductrices ou inhibitrices de de ce gène. Dans le cadre du développement d’un modèle de poisson zèbre apte à rendre compte des impacts des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme, l’étude de la réversibilité de la réponse aux substances a toute son importance. Ces données participeront à la caractérisation du modèle et de fait à l’élaboration d’un outil d’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme chez l’Homme, au cœur des objectifs du projet européen dans lequel s’inscrivent ces travaux.
Procédures
Les poissons zèbres seront soumis à des prises d'image en microscopie à fluorescence. Les animaux (5, 7, 10, 15 et 20 jours post fécondation) ne seront pas anesthésiés mais resteront dans de l'eau tout le temps de l'imagerie qui ne durera que 10 secondes environ. Chaque animal sera soumis à 5 imageries au cours de l'expérimentation.
Impact sur les animaux
L’exposition aux substances réalisée en début d’expérimentation (de 72hpf à 120hpf) aura un effet sur l'expression de notre gène d'intérêt (et probablement d'autres qui ne seront pas mesurés) sur le court terme et peut être le long-terme mais aucun effet toxique ou développemental n'est attendu aux concentrations sélectionnées. Les manipulations répétées tout au long de l’expérimentation (la prise d'image au microscope à fluorescence) pourraient entrainer un stress chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les intestins pour réaliser des mesures d'expression du gène d'intérêt à l'aide de techniques de biologie moléculaire.
Remplacement
L’étude de la réversibilité de la réponse dans le modèle poisson zèbre que nous développons ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants. En effet, cette expérimentation est essentielle à la caractérisation de ce modèle biologique, permettant de renseigner de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme à l’échelle de l’organisme entier, une problématique encore peu investiguée. Les modèles cellulaires ne permettent pas cette approche. Quant aux modèles mathématiques, s’agissant d’une problématique émergente, la modélisation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme est encore balbutiante. A terme, l’expérimentation menée ici permettra d’établir un modèle de poisson zèbre pertinent pour l’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme.
Réduction
L'utilisation d'animaux transgéniques pour le suivi des effets dans le temps des substances permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés en réutilisant les mêmes individus à chaque temps d'étude. Les effectifs ont été calculé en tenant compte de la variabilité de l'expression de notre gène d'intérêt et de la mortalité normale au cours du développement afin de pouvoir mettre en évidence des effets des substances de plus de 50% (test statistique).
Raffinement
Les animaux sont conservés dans un environnement controlé connus pour engendrer un minimum de stress (aquariums teintés en bleu si possible avec un fond en décors graviers, paramètres physico-chimiques de l'eau et photopériode contrôlés). Ils sont hébergés en groupe afin de respecter leur comportement grégaire et limiter l’anxiété que pourrait entrainer l’isolement, en gardant des populations faibles afin d’éviter les comportements agressifs. Les poissons sont également nourris en partie avec des artémies vivantes, leur permettant ainsi d’enrichir l’éventail de leurs comportements sociaux, notamment celui de la chasse. Tout au long des expérimentations, les animaux seront suivi avec une grille de bien-être adaptée à chaque stade de développement. L'ensemble de ces procédures est réalisé par des personnes formées et sensibilisées à l'évaluation de la souffrance animale.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est une des espèces recommandées pour la réalisation de tests réglementaires sur les perturbations endocriniennes. Sa petite taille permet des expositions dans de faibles volumes d’eau d’où une faible consommation de substances toxiques et une quantité de déchets générés moindre. Ces dernières années un nombre croissant de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés ont été développées et se sont avérées être des outils pertinents pour la détection des perturbateurs endocriniens tout en réduisant le nombre d'animaux.
Evaluation précoce de la toxicité de produits futurs candidats médicaments
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 1500
Cochons d'Inde : 100
Hamsters dorés : 110
Gerbilles de Mongolie : 110
Trier des candidats médicaments avant les études réglementaires : 6 000 souris, 1 500 rats, 110 hamsters dorés, 110 gerbilles de Mongolie et 100 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent jusqu'à quatre administrations par jour pendant vingt-huit jours, à doses toxiques ou maximales tolérées, avec chirurgie pour certaines voies, perfusions de plus d'une heure et prélèvements de sang répétés. Les effets annoncés vont des diarrhées aux signes neurologiques, avec une perte de poids pouvant atteindre 20 %. Le porteur présente ce tri précoce comme un moyen d'éviter des études réglementaires "coûteuses d'un point de vue éthique et économique", et prévoit environ 75 études par an sur cinq ans.
Objectifs
Le projet a pour objectif : • d’étudier les putatifs mécanismes de toxicité liée à l’administration de la molécule d’intérêt. La détection précoce de toxicité permet d’arrêter le développement d’une molécule avant des études de toxicologie règlementaires couteuses d’un point de vue éthique et économique. Ces effets toxiques pourront être reliés à la concentration circulante du candidat médicament administré grâce à des données de toxicocinétique générées en parallèle. • de déterminer dans le cas de toxicité des biomarqueurs pertinents qui pourront être par la suite étudiés chez l’homme. •de caractériser éventuellement des populations répondeuses ou non à la molécule d’intérêt en associant des méthodes d’analyses ex vivo de génomique, protéomique ou métabolomique
Bénéfices attendus
Le projet vise à détecter très tôt dans le développement les effets de toxicité d'un composés test ce qui obligatoirement implique l'arrêt du développement d’une molécule avant même les études de toxicologie règlementaires coûteuses d’un point de vue éthique, en animaux, et économique. Le projet permet d'apporter des informations aux agences de réglementations pour prendre la décision de commercialiser un médicament chez l'homme ou l'animal. Le projet contribue à mettre sur le marché des médicaments sûrs et sécurisés chez l'homme et chez l'animal pour des maladies dont les besoins thérapeutiques sont non satisfaits à ce jour (domaine du cancer, infectieux et système nerveux). Le projet contribue à comprendre les mécanismes de toxicité d'une famille de composés et sélectionner ainsi des composés d'intérêt et des doses adminsitrées beaucoup plus sûrs.
Procédures
Les animaux subissent des adminsitrations uniques voire répétées sur 28 jours maximum de composé d'intérêt à des doses élévées afin d'identifier des effets secondaires susceptibles d'être observés chez l'homme. Pour les voies d'administration contraignantes, les animaux sont anesthésiés pour éviter tout inconfort ou souffrance inutile. Des prélèvements de sang sur animaux vigiles ou anesthésié sont également effectués pour mesurer les concentrations du composés d'intérêt dans le sang ou les tissus pour évaluer l'exposition des animaux au composé ou suivre un biomarqueur qui réflète l'évolution de lésions. Le maximum d'administrations quotidienne est de 4 et ceux pendant 28 jours maximum. La durée de ces administrations vont de quelques secondes pour une voie orale à moins d'une heure pour les perfusions longue durée sur animal contraint et à plus d'une heure pour des animaux libre de leurs mouvements. Le maximum de prélèvements de sang est limité au volume totale de sang prélevé sur une semaine qui doit être infèrieur à 10% du volume de sang total. La durée de ces prélèvements n'excèdent pas 2 minutes.
Impact sur les animaux
La manipulations des animaux peuvent entrainer des nuisances : - Pesée : stress de la manipulation, limité par de méthodes de préhension douces des animaux (léger) ; - Administrations de produits: stress de la manipulation et éventuelle douleur au point d’injection (léger). Certaines voies d’administrations lentes nécessitent une contention un peu plus longue. Certaines voies d’administration nécessitent une intervention chirurgicale (modéré) : effet de l’anesthésie, douleur per et post-opératoire, fortement limitée par l’anesthésie et l’analgésie adaptées. - Des prélèvements de sang peuvent être effectués : stress de la manipulation et éventuelle douleur au point de prélèvement(léger). - Hébergement individuel temporaire, soit pour recueil d’urine/fécès, soit en post-opératoire (léger). L'exposition des animaux à des doses toxiques ou de doses maximales tolérées de composés à tester peuvent provoquer des effest indésirables. Ces effets seront très limités dans le temps par la mise en place de critères d'arrêt anticipés et de suivi très rigoureux des animaux. Les animaux peuvent manifester des signes légers ou modérés d’inconfort, de stress :changements de comportements, baisse de la prise alimentaire ou hydrique, dégradation de l’état général , modifications de la fréquence respiratoire, manifestation de signes d’origine neurologique, selles diarrhéiques ou perte de poidsl (
Devenir
Les animaux sont tous mis à mort en fin d'étude. Pour les besoins de l’évaluation de la tolérance des composés testés, les organes doivent être observés et des analyses tissulaires réalisées qui nécessitent la mise à mort des animaux en fin d'étude.
Remplacement
De nombreux test in vitro de toxicité remplacent déjà les animaux. Il s'agit de tests orientés sur un organes. Il n'existe pas de tests englobant l'ensemble des systèmes biologiques
Réduction
Le nombre d’animaux est déterminé pour répondre à la question scientifique de l’étude. Le nombre d’animaux s’appuie sur des recommandations internationales dans le domaine de la toxicologie et des publications scientifiques. Le nombre minimal par cohorte est réduit à 3 pour répondre scientifiquement à l’objectif de l’étude. Les recommandations de l’EMA demandent également à réduire autant que possible le nombre d’animaux, notamment en évitant d’ajouter des groupes contrôles ou véhicule quand cela est possible, notamment lorsqu’il existe des données déjà publiées ou historiques. Le nombre d’études sur les 5 prochaines années pour ce projet a été déterminé à partir des données historiques. Concernant les Hamsters, Cobaye et Gerbille environ 4 études par an peuvent être envisagées. Ces études comportent 4 groupes d’au maximum 4 animaux soit 16 animaux par études. Concernant les souris et rats, les études par composé comportent 4 groupes de 5 animaux en moyenne (minimum n=3, maximum n=8) soit 20 animaux pour un composé. Nous considérons 1 étude par composé et nous envisageons de tester environ 75 composés par an soit 75 études par an, avec un 80% d’études souris et 20% d’études rats. Les données expérimentales sont analysées avec des tests statistiques adaptés. Dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux, lors d’administration de fortes doses, un ou deux animaux de lacohorte est traité afin d’évaluer la tolérance au produit à fortes doses. En cas de signes cliniques majeurs sur cesanimaux, le reste de la cohorte ne sera pas traité aux fortes doses. Par ailleurs, les fortes doses seront administrées lorsque la certitude d’absence d’effets secondaires sera observée sur les doses inférieures autant que possible.
Raffinement
L'ensemble des procédures contraignantes jugées douloureuses pour les animaux sont faites sous anesthésie générale par inhalation ou par injection de composés à propriétés anesthésiantes. Les étapes de contention sont limitées (
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est défini par les lignes directrices internationales (ex. ICH, CHMP, OECD, WHO, FDA, MHLW) et sur des bases scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le(s) véhicule(s) envisagé(s) et les données disponibles de pharmacocinétique, de métabolisme et de toxicologie in vitro. Le stade adulte est celui utilisé afin de disposer d’animaux dont les systèmes biologiques sont matures. Exceptionnellement, des animaux juvéniles pourraient être utilisés si un impact sur le développement de l’animal doit être évalué.
Validation du modèle d’administration intracérébrale chez le primate non-humain
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Déjà utilisés dans d'autres expériences et présents sur le site depuis au moins un an, trois macaques à longue queue vont subir une injection directe dans le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'IRM et l'injection intracérébrale se déroulent en une seule séance d'environ six heures sous anesthésie générale, après intubation, et le réveil peut s'accompagner de désorientation, de perte d'équilibre, de perte de réflexes et d'hypothermie. Convulsions, tremblements, chutes, ulcères cornéens et œdème aux points d'entrée du cadre stéréotaxique figurent parmi les suites possibles. Le porteur affirme qu'il n'existe aucune alternative non animale pour vérifier qu'une injection intracérébrale est bien tolérée, et destine ce modèle validé à des études réglementaires de toxicologie.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de valider le modèle d’administration intracérébrale chez le primate non-humain. Ce modèle sera validé grâce à l’injection d’un produit de référence associé à un agent de contraste et via une évaluation histopathologique complète afin d’évaluer l’impact et qualité de la procédure d’administration intracérébrale nécessaire pour la conduite d’étude de toxicologie générale. Une fois validé, ce modèle sera utilisé sera utilisé dans des études précliniques d'évaluation de la sécurité de candidats médicaments destinés à être administrées par voie intracérébrale chez l'homme.
Bénéfices attendus
La validation du modèle d’administration intracérébrale chez le primate non-humain permettra la réalisation d’études de toxicologie règlementaire qui sont nécessaires pour démontrer la sécurité des produits pharmaceutiques en développement, avant leur mise sur le marché ou les premiers essais cliniques (notamment pour le développement de thérapie innovante telle que la thérapie génique administrée par voie intracérébrale chez l’homme). De plus la validation pourra contribuer à la mise sur le marché de nouvelles thérapies sûres pour les patients atteints de pathologie du système nerveux central (exemples: maladies de Parkinson et Alzheimer).
Procédures
L’imagerie IRM et l’injection intracérébrale (1 occasion, d’une durée d’envion 6 heures) seront réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale). Une évaluation neurocomportementale sera réalisée en post-administration/prélèvement (durée d’environ quelques minutes) afin de déceler toute potentielle atteinte neurologique en lien avec la procédure. Des prélèvements sanguins seront réalisés à raison de 3 temps (prétest, durant la phase d’observation et à la mise à mort). Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux vigile et seront de courte durée (quelques minutes).
Impact sur les animaux
Les procédures d’administration intracérébrale sont pratiquées sur animaux anesthésiés qui seront mis à jeun la veille de la procédure. Des événements anesthésiques peuvent survenir (ex : hypothermie, hypotension…). Lors du réveil anesthésique, une désorientation/perte d’équilibre, perte de certains réflexes neurologiques (palpébral…) ains qu’une hypothermie et baisse d’activité (en raison de la durée de la chirurgie, envion 6 heures) peuvent être observées temporairement. Des signes locaux (oedème) au niveau des points d'entrée des cadres ou des ulcères cornéens pourraient être observés et être associés à de la douleur. Des symptômes neurologiques (risque de pertes d'équilibres ou chutes, tremblement, convulsions,…) peuvent être observé à la suite de la procédure d’administration intracérébrale. Pour les prélèvements sanguins (PS) qui seront réalisés sur animaux vigiles, ceux-ci pourraient être associés à des sensations désagréables de ponction mais seulement pendant une courte durée et des hématomes post-prélèvement. Les signes cliniques suivant pourraient être observés en cas de réaction exagérée au produit pharmaceutique de référence : • Troubles de la coordination des mouvements • Diminution de l’appétit • Somnolence • Vomissement • Diarrhée. Ces signes cliniques devraient être seulement transitoires et seront surveillés par un vétérinaire.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et une évaluation histopathologique et une analyse de biodistribution seront réalisées au niveau du tissu cérébral à la fin de la procédure afin d’évaluer l’impact de la procédure d’administration intracérébrale. Ceci afin de valider le modèle, dans le contexte des études réglementaires de toxicologie.
Remplacement
Actuellement, il n’existe pas d’alternative non animale permettant d’évaluer la sécurité et la toxicité, notamment systémique et neurocomportementale des futurs candidats médicaments dans le cadre du développement de thérapies innovantes, telle que la thérapie génique. Il n’existe pas non plus d’alternative non animale pour valider que la technique d’administration intracérébrale aboutit à une exposition de l’animal au produit pharmaceutique de référence et que celle-ci est bien tolérée (analyse histopathologique).
Réduction
Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique (biodistribution du produit réference). De plus, dans les études réglementaires de toxicologie 3 animaux par groupe sont généralement utilisés. Au total, 3 animaux seront utilisés dans ce projet. Des animaux non-naïfs seront utilisés dans le cadre de ce projet afin de réduire l’utilisation d’animaux.
Raffinement
Le produit de référence associé à l’agent de contraste sera injecté à une seule occasion (volume maitrisé de 100 µL par hémisphère, débit maximal 3 µL/min) et à une dose bien tolérée sans effet toxique attendu. Les animaux non-naïfs sont présents sur le site depuis au moins 1 an, et sont acclimatés aux conditions de vie dans le laboratoire. Les animaux auront au moins 5 jours d’acclimatation dans la salle d’étude avant le J1. Un entrainement pour les pesées corporelles et des interactions positives seront mis en place. Pour limiter le stress des animaux, les animaux seront manipulés régulièrement par les personnes en charge des procédures expérimentales (contention, suivi du poids). Des récompenses alimentaires seront distribuées après les actes contraignants. Une protection mécanique préventive des yeux et des soins locaux seront mise en place pré- et post-opératoire afin de réduire le risque d’ulcéres cornéens. L’injection intracérébrale sera réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique. Une analgésie/anti-inflammatoire et antibiothérapie préventive sera mise en place avant (entre 30min et 1h avant l’anesthesie) et après administration (jusqu’à 6h et 7 jours après administration pour l’antibiothérapie et l’analgésie/anti-inflammatoire, respectivement) du produit de contraste et élément d’essai afin d’anticiper toute douleur ou détresse. Des mesures de prévention de l’hypothermie seront appliquées pendant l’anesthésie et au réveil. Une évaluation neurocomportementale sera réalisée duant le pretest et à deux occasions après adminisration (+4h et +24h post-procédure). La mise à mort sera considérée pour les points limites suivants : convulsions ne rétrocédant pas spontanément ou à l'administration d'anti-convulsivants ou convulsions répétées dans la même journée, incapacité prolongée de l'animal à se déplacer ou pertes d'équilibres durables impactant la qualité de vie de l'animal, perte d'appétit ne rétrocédant pas aux mesures de soutien, perte de poids supérieur à 15% et infection des plaies chirurgicales ne rétrocédant pas aux soins. Des soins locaux quotidiens seront appliqués à la suite de l’administration, jusqu’à 7 jours post-administration. Les animaux sont gardés isolés 2h pour limiter le risque de chutes. En cas d’hypothermie, une prise en charge par lampe chauffante (et/ou coussin chauffant) sera mise en place. Les primates seront socialisés.
Choix des espèces
Les études réglementaires de toxicologie doivent se faire chez une espèce pertinente pour l’évaluation de la sécurité des futurs candidats médicaments. La pertinence du primate non humain (PNH) pour la conduite des études de sécurité préclinique est basée sur une homologie phylogénétique, anatomique et transcriptomique importante avec l’Homme. De nombreuses nouvelles stratégies thérapeutiques du système nerveux central (SNC) sont basées sur des produits biologiques ou de thérapie génique qui nécessitent une homologie phylogénétique ou transcriptomique importante avec l’Homme afin d’évaluer les propriétés pharmacodynamiques du produit mais également les potentiels effets toxiques. Par conséquent, l’utilisation d’autres modèles non-rongeur (tel que porc et chien) est inapproprié dans ces études. L’utilisation du primate non humain pour la validation du modèle d’administration intracérébrale est donc justifiée puisque les études précliniques non rongeurs sur ces nouvelles thérapies seront réalisées chez le macaque. La validation du modèle d’administration intracérébrale ne nécessite pas de pré-requis d’âge et se fera sur jeunes adultes/adultes comme pour les études de toxicologie réglementaire. Des animaux d’environ 3 ans seront utilisés pour ce projet.
Evaluation pharmacocinétique et pharmacodynamique de molécules pharmacologiquement actives chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Rats : 1290
Une perte de poids supérieure à 20 % maintenue trois jours déclenche la mise à mort immédiate. 3 180 souris et 1 290 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 4 290 d'entre eux et modéré pour 180. Chaque animal peut recevoir jusqu'à 28 administrations, une par jour pendant 28 jours, et jusqu'à cinq prélèvements sanguins sous anesthésie. Le laboratoire indique ne pas connaître la nature des molécules testées, propriété de ses clients, ce qui rend selon lui les effets indésirables difficiles à anticiper.
Objectifs
Ce projet est nécessaire pour l’évaluation de paramètres essentiels comme la clairance, la biodisponibilité, l'exposition, la demi-vie et le volume de distribution d'une molécule suite à son administration chez l'animal. L'ensemble de ces analyses permettra de déterminer la dose à administrer pour les molécules testées et d'optimiser les modalités de traitement.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ces analyses permettra de déterminer la dose à administrer pour les molécules testées et d'optimiser les modalités de traitement.
Procédures
Une administration unique ou plusieurs administrations (maximum 28 à raison de 1 par jour pendant 28 jours) pourront être réalisées. La durée de chaque administration est inférieure à 1 minute (quelques secondes). Des prélèvements sanguins (de 1 à 5 maximum) seront réalisés sous anesthésie. La durée d'anesthésie pour un prélèvement est d'environ 5 minutes, le prélèvement dure 1 minute.
Impact sur les animaux
La manipulation, les administrations, les anesthésies et prélèvements répétés peuvent provoquer du stress chez les animaux. Des effets indésirables liés à l'administration des molécules thérapeutiques (mauvaise tolérance...) peuvent être observés mais sont difficiles à anticiper car nous ne connaissons pas la nature des molécules de nos clients.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements de sang total seront réalisés. Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront également être réalisés.
Remplacement
Il existe des modèles cellulaires permettant d'évaluer l'absorption des molécules et des hépatocytes peuvent être utilisés pour évaluer leur métabolisme in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules ; cependant, aucun modèle in vitro ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est indispensable de mener ces études dans un modèle animal reflétant l'intégralité des paramètres métaboliques et pharmacocinétiques des molécules testées.
Réduction
Le design de l'étude étant un plan d'expérience contrôlé, le nombre d'animaux est réduit à son minimum pour chaque groupe et calculé en utilisant des tests statistiques. L'évaluation pharmacocinétique d'un composé est faite par analyse du sang, du plasma ou des organes à l'aide de techniques analytiques ou immunodosages. Ces techniques d'analyse nécessitent des volumes d'échantillons définis souvent faibles (
Raffinement
Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des zones ayant reçu le traitement topique...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Les procédures pourront être réalisées sous anesthésie générale, avec utilisation de tapis chauffants. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids supérieure à 20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule. Si l'un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans ce projet (rat, souris) sont recommandées par les agences de réglementation pour les études de métabolisme, de pharmacocinétique et de toxicologie. Ces espèces sont les plus utilisées et il s'agit d'excellents modèles pour ce type d'études. Ainsi, il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives aux études dans ces espèces. Les multiples homologies de séquences entre ces espèces et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Ils sont ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus, ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de noter que les molécules utilisées actuellement en clinique ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Conservation des espèces
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 25000
300 000 rongeurs vont être utilisés, 275 000 souris et 25 000 rats, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour, en plus du tatouage d'identification, et les lignées entretenues peuvent porter un phénotype dommageable dont le porteur admet ne pas toujours connaître l'impact avant caractérisation. À l'issue, les animaux sont soit expédiés, soit tués, le porteur précisant qu'ils "appartiennent au scientifique" et ne peuvent être replacés. L'objet du projet est de fournir des rongeurs génétiquement modifiés à des laboratoires, activité présentée comme un bénéfice en soi puisqu'elle améliore la "qualité génétique, sanitaire et zootechnique" des animaux livrés.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la caractérisation et/ou l’élevage de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des traits physiologiques spécifiques, et parfois pathologiques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes ou encore la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent, ou de queue) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée transgénique, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie de taille réduite peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Enfin, certaines lignées transgéniques sont induites par une hormone. Pour induire cette mutation d’intérêt, une injection de l’hormone pourra également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 300 000 animaux (ajout de 10% en prévision de la hausse d’activité) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux transgéniques (avec un statut génétique et sanitaire connu) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production et de la qualité génétique, sanitaire et zootechnique des animaux génétiquement altérés à fournir aux scientifiques pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute, à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Expression d’un phénotype dommageable et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques ou stress exprimé pendant l’évaluation Bien Etre Animal. Douleur et stress associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum, oreille ou queue) en plus d’une identification. Douleur et stress associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress et perte de poids dûs aux contentions. Douleur, stress et perte de poids dûs à l'injection du ligand.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet (par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction), ou d’éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels).
Raffinement
Les observations par le personnel technique permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en faisant appel aux techniciens qualifiés et compétents et au vétérinaire. Si un point d’intervention est atteint, le technicien met en place un enrichissement adapté, un isolement et/ou si besoin la mise à mort de l’animal. En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Les lignées connues pour pouvoir présenter un phénotype dommageable peuvent être observées et vérifiées de manière plus fréquente et plus spécifique avec des points limites et des raffinements précis. Ceci est évalué lors de la caractérisation du phénotype de la lignée ou en lien avec le scientifique en charge de cette lignée et le vétérinaire lorsque le phénotype attendu est connu. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal , l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype dommageable, une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement, avec accord du scientifique, ce traitement est mis en place. Les animaux déclarant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final afin qu’il puisse gérer selon les normes éthiques et de bien-être animal leur réception et utilisation. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la « Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l’animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5j après la fécondation.
Impact des perturbateurs endocriniens sur le cycle de vie de l’épinoche
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
15 750 épinoches à trois épines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 14 100 tuées, les 1 650 témoins et leur descendance retournant en salle d'élevage. Les géniteurs sont anesthésiés puis tués pour récupérer spermatozoïdes et oeufs, et les deux générations suivantes sont exposées à des perturbateurs endocriniens de l'oeuf au stade adulte avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur attend une perte de qualité des gamètes, des anomalies du développement, une féminisation du sex-ratio, une baisse des défenses immunitaires, une obésité et des effets négatifs sur la croissance et la survie, tout en indiquant que la nature exacte et la durée de ces effets restent inconnues. Les polluants retenus et les doses ne sont pas encore choisis et le seront "en fonction des données de la littérature et de l'avancement du projet".
Objectifs
L'objectif du projet est de mieux appréhender l'impact d'une exposition aux perturbateurs endocriniens tout au long du cycle de vie de l'épinoche. L'intérêt du projet est de faire le lien entre les capacités de défense, le métabolisme énergétique et la reproduction et la capacité de maintien de l'organisme. Au cours du projet les perturbateurs endocriniens retenus ainsi que les doses environnementales proposées seront à définir en fonction des données de la littérature et de l'avancement du projet.
Bénéfices attendus
L'intérêt du projet est de faire le lien entre les capacités de défense, le métabolisme énergétique et la reproduction et la capacité de maintien de l'organisme et de la population dans son ensemble suite à une exposition à des perturbateurs endocriniens. Les impacts sur la croissance et la survie sont également recherchés.
Procédures
Pour les géniteurs, lors des fécondations in vitro, les mâles sont anesthésiés (moins de 10 min) et mis à mort (quelques secondes) avant de récupérer les spermatozoïdes. Les femelles sont anesthésiées (moins de 10 min) puis leurs oeufs sont prélevés (moins de 2 min) avant d’être mises à mort (quelques secondes). Concernant la première et la seconde génération, les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation (moins de 1 min) et différents organes sont prélevés. Les poissons adultes exposés sont anesthésiés (moins de 10 min) et mis à mort avant de prélever les organes (quelques secondes).
Impact sur les animaux
Est envisagé un effet sur : 1. la reproduction : perte de la qualité des gamètes, anomalies du développement, modification de la distribution mâles /femelles en faveur des femelles ; 2. diminution de la défense immunitaire ; 3. augmentation des réserves de gras (obésité) ; 4. effets négatifs sur la croissance et la survie. La durée et la nature exacte des effets n'est pas encore connue actuellement, les nuisances et effets éventuels seront suivis à l'aide d'une grille d'évaluation des points limites.
Devenir
Les individus de la première génération exposés aux perturbateurs endocriniens et leur descendance seront tous sacrifiés en fin d'expérimentation (=13350), les individus témoins de la première génération et leur descendance (=1650) seront remis en salle d'élevage. Les poissons issus de l'exposition au stade adulte seront tous sacrifiés en fin d'expérimentation pour les analyses multi-biomarqueurs (=750).
Remplacement
Il n'existe pas d'alternative à l'utilisation animale pour valider l'importance des perturbateurs endocriniens sur les stades de vie précoces (stade oeuf) et sur la physiologie générale des poissons et leurs capacités de reproduction tout au long de leur cycle de vie.
Réduction
Les premières fécondations in vitro, sont réalisées à partir d'animaux d'élevage. Pour chaque procédure, suite aux expérimentations, des tests statistiques seront effectués. Les 2250 oeufs produits seront exposés (150 organismes par aquarium en triplicats = 450 organismes par condition à raison de 4 doses et 1 témoin) et maintenus jusqu'au stade adulte (1 à 1,5 ans). Les 150 organismes par aquarium et par triplicat sont nécessaires, d'après la littérature pour pouvoir différencier les effets entre les différentes conditions. Aux différents temps de prélèvement, 10 individus par condition de l'oeuf aux juvéniles et 10 individu par condition et par sexe chez les adultes sont suffisants pour atteindre une bonne puissance statistique pour les analyses multibiomarqueurs. Ces organismes seront prélevés sur les 150 organismes par aquarium. Lors de la création de la seconde génération, 750 oeufs seront maintenu jusqu'à 1 mois post fécondation des oeufs. Ce chiffre se base sur les données de la littérature afin de pouvoir différencier les effets entre les différentes conditions. Concernant le suivi des organismes pour les marqueurs phénotypiques (croissance, mortalité) de la première (100 individus par condition) et seconde génération (50 individus par condition) et les traits d'histoire de vie chez les adultes (15 individus par condition et par sexe), nous avons évalué l'effectif nécessaire en se basant sur des données de la littérature. Pour l'exposition des adultes (indépendante de la première procédure), nous utiliserons : 150 individus = 15 mâles et 15 femelles par condition à raison de 4 doses et 1 témoin : suffisants pour atteindre une bonne puissance statistique dans l'analyse des traits d'histoire de vie.
Raffinement
Afin de veiller au bien-être animal, les géniteurs, les juvéniles et les individus adultes bénéficieront d’enrichissements (tubes et plantes artificielles). Les poissons seront maintenus dans un environnement optimale dont les paramètres seront vérifiés a minima une fois par semaine. Les animaux seront nourris tous les jours avec une alimentation diversifiée et appropriée à leur stade de développement (3% du poids/jour). Au niveau expérimental, lors du sacrifice des animaux, les poissons sont placés dans un bain anesthésiant pour réduire le stress puis rapidement mis à mort. Tout au long du projet, les animaux adultes sont observés. Afin de limiter la souffrance animale, la mise à mort par balnéation est effectuée par surdose d’anesthésique. Cette étude servira également de base pour mieux définir des points limites applicables aux autres stades de développement (notamment juvéniles) et pourront être proposés à notre Structure chargée du Bien Etre Animal.
Choix des espèces
L’épinoche à trois-épines est une espèce de poisson largement utilisée pour les études écotoxicologiques et présente des intérêts pour l’étude des contaminations environnementales. D'autre part, l'épinoche est une espèce qui s'adapte à tout type de milieu (eau douce, salée et saumâtre). Dans une optique d'étudier de façon spécifique la gamétogenèse, des expositions au stade embryonnaire semblent pertinentes puisque cette fonction physiologique est mise en place dès le stade embryon. De même pour mieux percevoir les relations avec les traits d'histoire de vie, se baser sur les individus adultes et les stades embryonnaires est pertinente. L'exposition de la première génération sera effectuée uniquement du stade oeuf à 40 jours post éclosion afin d'encadrer les stades précoces de développement et la mise en pace des réponses physiologiques précoces. L'exposition suivante sera effectuée sur les individus adultes pour mieux comprendre le lien entre les modifications physiologiques et les réponses sur les traits d'histoire de vie. Les animaux adultes et juvéniles seront tous maintenus en condition d'élevage classique après l'exposition.
Etudes de toxicologie rongeur
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 20000
40 000 animaux non-humains, 20 000 souris et 20 000 rats, vont être utilisés et tous tués pour analyse histopathologique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un candidat médicament, un vaccin ou un produit chimique par voie orale ou par injection, chaque jour ou chaque semaine, sur des études pouvant durer un, trois ou douze mois, avec jusqu'à une vingtaine d'interventions par animal et par semaine, des prises de sang en tube de contention sur animal vigile, une mise à jeun et jusqu'à seize heures en cage à diurèse. Le porteur retient comme effets attendus l'inconfort, le stress, la douleur transitoire et la perte de poids, et parle de "sacrifices" pour désigner les mises à mort intermédiaires. Il indique que ces essais répondent à une exigence réglementaire et affirme qu'il n'existe pas encore de méthode in vitro pour certains effets, en raison de la complexité des organismes vivants.
Objectifs
L’objectif de ce projet est l’évaluation des caractéristiques toxiques chez le rongeur d’un candidat médicament, d’un vaccin ou d’un produit chimique, conformément aux lignes directrices du médicament ou de l'OCDE. Ces études interviennent lors de plusieurs phases du développement (précocément pour les études préliminaires, en prérequis avant tout essai clinique chez l’Homme pour les études subchroniques, ou dans les dernières étapes du développement d’un médicament avant sa mise sur le marché pour les études chroniques). Ces études permettent l’évaluation du risque pour l’Homme ou l’animal, en fournissant des informations sur les organes cibles et sur les effets toxiques majeurs, en déterminant notamment une dose sans effet adverse intégrée dans les critères de marge de sécurité pour l’utilisation ou l’exposition humaine ou pour un usage vétérinaire.
Bénéfices attendus
Le nombre minimal d’animaux par groupe et ou/sexe suit les recommandations des lignes directrices dans le but de garantir suffisamment d’animaux pour permettre la détection des signes de toxicité au début des premiers essais chez l’Homme ou l’animal). Ces effectifs minimums sont aussi recommandés pour garantir le succès des tests statistiques [tests de normalité variance , comparaison de moyennes par exemple] afin d'interpréter les résultats. L'ensemble des études du projet vise à identifier la tolérance locale des produits, une toxicité d'organe, un potentiel clastogène et aneugène d'une substance, un profil métabolique et pharmacocinétique, et/ou des seuils de toxicité (dose maximale tolérée, dose sans effet...) permettant le calcul de marge de sécurité chez l'Homme en gardant à l'esprit en permanence le ratio bénéfice/risque du produit concerné pour la santé humaine (industrie pharmaceutique), la sécurité d’utilisateurs (industrie chimique) ou le bénéfice pour l’animal (industrie vétérinaire).
Procédures
Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi injection intramusculaire, sous- cutanée ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire avec le produit d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études peut être courte (un jour) ou longue [en général de 1, 3, ou 12 mois pour les études règlementaires]. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (en cas d’agressivité ou de soins individuels par exemple).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés.
Devenir
Les études de toxicologie incluent souvent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus ; à ce titre les animaux seront euthanasiés en fin d’étude.
Remplacement
L’évaluation de la toxicité de candidats médicaments/produits chimiques selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n’existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité des organismes vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses de toxico-/pharmacocinétique ou pharmacodynamie, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, nombre de doses testées, criblage de plusieurs produits, etc. Pour les études à objectif règlementaire, le nombre d’animaux est précisé dans les lignes directrices correspondantes. En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.
Raffinement
L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés...), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène...) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme par exemple les administrations intramusculaire et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout isolement d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.
Choix des espèces
Au-delà des aspects pratiques (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent cité car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou connue pour plus de sensibilité à certaines molécules) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’Homme (exemple paramètres immunologiques), le Hamster pour son métabolisme, le cobaye pour la voie dermale ou pour paramètres immunologiques. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique. Les animaux ont 5 à 6 semaines d’âge en début de traitement car ils sont en âge de croissance. Dans certains modes d'administration, il est possible d'augmenter légèrement l'âge (voie dermale, souris) pour des contraintes techniques ou pour des raisons scientifiques (maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux. Les animaux ont 5 à 6 semaines d’âge en début de traitement car ils sont en âge de croissance. Dans certains modes d'administration, il est possible d'augmenter légèrement l'âge (voie dermale, souris) pour des contraintes techniques ou pour des raisons scientifiques (maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.
Etude systémique entre les os et les reins, par analyses morphologiques et fonctionnelles, après une exposition chronique à faible dose d’uranium chez des souris C57BL/6J
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent de l'uranium dans leur eau de boisson pendant six mois, passent jusqu'à seize heures seules en cage à métabolisme pour le recueil des urines et des fèces, et subissent des échographies doppler de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie avant d'être tuées pour prélever le sang, les reins et les os. Le projet dispose déjà de sphéroïdes, d'organoïdes rénaux et de modèles osseux biomimétiques, et le porteur indique que les souris servent d'abord à évaluer la robustesse de ces modèles sans animaux, puis à observer la relation entre os et rein qu'il juge irréalisable in vitro. Il présente la mutualisation des prélèvements entre partenaires du projet comme sa mesure de réduction.
Objectifs
L’uranium est un métal lourd radioactif naturellement présent dans l’environnement. Du fait de cette présence naturelle mais également de ses propriétés de radioéléments il est utilisé par l’Homme pour diverses applications civiles et militaires. La population générale peut y être exposée par ingestion d’eau de boisson et/ou d’aliments contaminés. Diverses études épidémiologiques et expérimentales ont auparavant montré qu’une exposition environnementale, ou professionnelle à l’uranium peut induire des effets délétères sur les reins et les os connues comme étant les organes cibles de la toxicité aiguë de ce radioélément. Cependant d’importantes lacunes subsistent sur la compréhension des mécanismes à l’origine de cette toxicité ; de plus l’impact de cette toxicité sur la relation qui existe entre ces deux organes est très peu documenté - notamment dans le cadre d’une exposition chronique à faible dose qui correspond au risque d’exposition professionnelle ou de la population générale. Le présent projet permettra de comprendre les réponses biologiques et biochimiques existantes après une exposition chronique à de faible dose d’uranium au niveau des reins et des os ainsi qu’entre ces deux organes qui possèdent une relation physiologique importante. Le projet s’appuiera sur un modèle in vivo de souris non modifiées génétiquement qui a déjà prouvé être un modèle pertinent lors de précédentes études de toxicologie rénale. De plus, afin de limiter l’utilisation d’organismes vivants, le projet s’appuiera également sur différents modèles cellulaires 3D innovants (osseux et rénaux). Ils permettront d’évaluer en amont les mécanismes toxicologiques mis en jeu au cours d’une exposition chronique à faibles doses d’uranium. Les mécanismes et les voies cellulaires altérées au cours des études de toxicologie cellulaire seront par la suite analysés plus finement à l’aide du modèle in vivo dont il est fait mention. L’étude de ces réponses et de ces interactions physiologiques sera effectuée en collaboration avec des spécialistes du tissu osseux ainsi que des spécialistes des interactions protéines-ligands.
Bénéfices attendus
A court terme ce projet a pour objectif de mieux comprendre le comportement et le devenir de l’uranium (séparation en différence espèce chimique, interaction, distribution spatiale) dans les compartiments intra et extra-cellulaires des différents modèles osseux et rénaux chez l’animal, d’identifier les voies de signalisations cellulaires impactées, et différents biomarqueurs au sein et entre ces deux organes après une exposition chronique à faible dose. A plus long terme, ce projet a pour objectif de permettre une meilleure compréhension et une meilleure prise en charge des risques pour les populations et la santé humaine à la suite d’une contamination interne aux radionucléides.
Procédures
L’exposition par eau de boisson sera faite avec une surveillance du poids des biberons et du poids des animaux ; il n’est pas attendu de nuisance importante par rapport à l’exposition en cohérence avec les précédentes études publiées ; l’exposition interne à l’uranium doit conduire à une irradiation dans le domaine des faibles doses. Les animaux seront hébergés pendant un maximum de 16 heures individuellement en cage à métabolisme à 2 mois et/ou, 4 mois et/ou 6 mois selon la procédure expérimentale. Les analyses échographiques sont non-invasives et effectuées sous anesthésie : l’échographie aura lieu sous anesthésie légère pendant 30 à 45 minutes sous monitoring cardiaque et respiratoire. Elles seront réalisées avant l’exposition et à 2 mois et/ou 4 mois et/ou 6 mois selon la procédure expérimentale. Un prélèvement de sang est réalisé sur animal anesthésié juste avant son euthanasie de l’animal (2 min).
Impact sur les animaux
L’étude est susceptible de provoquer un léger stress chez les animaux qui seront amenés à être manipulé notamment lors du passage en cage spécifique pour la collecte d’urines et de fèces ; ainsi que pour le suivi par échographie doppler qui nécessitera une anesthésie préalable.
Devenir
Les animaux seront anesthésiés avant d’être mis à mort à la fin de l’exposition pour prélèvement terminaux (sang, reins, os) qui seront par la suite utilisés à des fins histologiques (marquages des tissus pour localisation de biomarqueurs cibles au sein des tissus), ainsi qu’en biochimie et biologie moléculaire (expression de gènes cibles, quantification de protéines et de marqueurs d’atteintes toxicologiques/pathologiques).
Remplacement
Le projet comprend l’utilisation de modèles cellulaires innovants dont des sphéroïdes et organoïdes rénaux ainsi que des modèles osseux biomimétiques qui permettront d’évaluer une réponse toxicologique et de mettre en avant des voies de signalisation propres à l’organe d’intérêt du modèle utilisé (reins ou os). L’utilisation d’animaux au sein de ce projet permettra dans un premier temps d’évaluer la robustesse du développement de nos nouveaux modèles 3D (application des principes de remplacement) ; mais également d’analyser les réponses biologiques et biochimiques à l’uranium au niveau systémique et donc d’intégrer les relations hormonales existantes entre les os et le rein ce qui n’est pas réalisable à l’heure actuelle avec des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé à l’aide de calcul statistique afin d’aboutir à un effectif minimal qui permettra un traitement des données statistiques à la suite de la procédure expérimentale. Les souris euthanasiées permettront de fournir des échantillons biologiques de façon mutualisées (os, reins, fluides biologiques etc) pour tous les partenaires impliqués dans le projet et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés si les études in vivo avaient été divisés entre les partenaires du projet.
Raffinement
Pendant toute la durée de l’étude, les animaux seront hébergés en groupe maximum de 5, avec un enrichissement supplémentaire (ouates, maisons…) comme mesure de raffinement. L’isolement pourra être fait uniquement en cas d’agression entre congénères. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé. Les points d’arrêt définis dans le projet seront appliqués à tous les animaux de l’étude présentant des signes comportementaux ou cliniques d’atteinte et conduiront à la mise à mort anticipée de l’animal (application du principe de raffinement).
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J est un modèle bien décrit dans la littérature. De plus les précédentes études sur la physiopathologie rénale effectuées au laboratoire après exposition interne à l’uranium ont permis à l’équipe porteuse des procédures d’expérimentation animale d’acquérir une expertise sur ce modèle de souris. Les animaux seront des adultes de 6-8 semaines au moment du début de l’exposition chronique. A cet âge, la physiologie rénale et osseuse est mature. Les animaux seront hébergés et mis en groupe à l’âge de 5 semaines afin de limiter les agressions entre congénères.