Toxicologie (hors obligations réglementaires)

Gavés deux fois par jour pendant cinq jours avec un candidat médicament déjà reconnu cardiotoxique, 8 chiens beagles sont tués à l'issue pour l'examen de leur cœur, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit quatorze prises de sang, une surveillance télémétrique continue et des interventions de nuit, le porteur annonçant une accélération du rythme cardiaque, une prostration possible, des vomissements et une hypersalivation. La cardiotoxicité avait déjà été observée chez le chien lors d'une étude précédente, ce projet servant à la confirmer et à tester un agent censé l'atténuer. Le porteur indique que les résultats décideront de la poursuite du développement du candidat médicament.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets sur le cœur d’une dose d'un candidat médicament ayant montré dans une précédente étude une cardiotoxicité, et en parallèle d’investiguer un possible mécanisme d’action et de mitigation pour le futur développement du candidat médicament. Pour cela, 2 groupes d’animaux recevront la même dose de candidat médicament avec ou sans un traitement préalable avec un agent mitigateur. Les résultats de ce projet permettront de décider la poursuite du développement du candidat médicament et le cas échéant les modalités de ce développement.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera de permettre de confirmer ou non la cardiotoxicité d’un candidat médicament et, dans le cas de cardiotoxicité, de potentiellement identifier un mécanisme d’action avec un moyen pharmacologique de mitigation, afin d'en poursuivre le développement. A plus long terme, le bénéfice pour la santé humaine serait le possible développement d’un candidat médicament. Il est à noter qu'il est attendu que ce futur produit (antibiotique) combatte un problème infectieux et de santé publique mondial pour lequel aucun médicament actuellement disponible n'est efficace sans générer de résistance.

Procédures

Pour chaque animal inclus dans le projet, une administration biquotidienne par voie orale (environ 30 secondes par administration) sera réalisée sur animal vigile pendant 5 jours consécutifs pour le candidat médicament avec une administration quotidienne par voie orale pour l’agent mitigateur ou son contrôle négatif. Également chaque animal subira des prélèvements de sang vigile (quelques secondes par prélèvement) tout au long du projet (14 prélèvements au total répartis sur 5 journées). Enfin chaque animal sera anesthésié une fois avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les effets ou effets indésirables prévus sur les animaux sont : - Stress, inconfort ou douleur brève, lors des procédures d’administration par voie orale (gavage), de prélèvement de sang - stress, inconfort lors d’intervention ponctuelle pendant la phase nuit pour surveillance des animaux, administration et/ou prélèvements sanguins - effets indésirables potentiellement attendus et liés à l’administration candidat médicament (liste non exhaustive) : inconfort liée à l’augmentation de la fréquence cardiaque, activité diminuée à prostration/abattement, vomissements et/ou hypersalivation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de permettre l’évaluation histopathologique du tissu cardiaque.

Remplacement

Le projet visant à évaluer une possible cardiotoxicité chez le chien après administration répétée sur 5 jours consécutifs par voie orale et d’investiguer un possible mécanisme d’action pour la cardiotoxicité par l’ajout d’un possible agent mitigateur, il ne peut pas être réalisé in vitro ou ex vivo car les interactions complexes et la régulation du système cardiovasculaire ne peuvent s’exprimer que chez un animal vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé comme étant le minimum nécessaire (4 par groupe ; total de 8) pour obtenir une puissance statistique satisfaisante et une pertinence biologique des résultats en limitant l’effet des variations individuelles afin de permettre de conclure sur la cardiotoxicité de manière fiable.

Raffinement

Pour améliorer leur bien-être, les animaux seront hébergés dans des conditions environnementales adaptés à l’espèce (groupes sociaux, jouets, période d’exercice quotidienne, …). Pour les actes contraignants pour l’animal (administration par voie orale, prélèvements de sang) une habituation des animaux à la manipulation est mise en place avec distribution de récompense. En relation avec les signes cliniques potentiellement attendus et liés à l’administration candidat médicament, un suivi clinique continu (observations cliniques, suivi en temps réel de la fréquence cardiaque) avec un monitoring vidéo pendant toute la durée de la période de traitement sera mis en place afin d’identifier au plus tôt l’apparition des signes cliniques liés à la cardiotoxicité. Ce suivi permettra de prévenir le vétérinaire au plus tôt. De plus des points limites spécifiques sont définis pour décider de l’euthanasie des animaux afin de réduire au minimum les nuisances sur leur bien-être.

Choix des espèces

Le chien beagle a été choisi pour ce projet car c’est une des espèces acceptées par les instances réglementaires pour l’évaluation préclinique des médicaments. De plus le candidat médicament a été associé à des lésions histologiques au niveau du myocarde et des vaisseaux sanguins dans une étude précédente réalisée sur le chien. Cette étude est à l’origine de la conduite du projet. Jeunes adultes afin de reproduire les conditions de l’étude précédente dans laquelle la cardiotoxicité a été observée

700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes puis allaitantes reçoivent des nanoparticules directement dans la trachée, une fois par semaine pendant six semaines, et leur descendance subit des mesures de fonction pulmonaire d'une heure à plusieurs stades de sa vie. Le porteur reconnaît que ces expositions répétées pourraient perturber le comportement maternel et provoquer des anomalies de développement chez les souriceaux. Il affirme dans le même temps que les femelles "tolèrent" l'exposition sans nuisance particulière, et présente le projet comme une contribution à l'évaluation des risques pour les femmes enceintes et allaitantes.

Objectifs

Les nanotechnologies sont en plein essor depuis le début du XXIème siècle. Les propriétés exceptionnelles des nanoparticules, acquises par leur taille nanométrique, les rendent intéressantes dans de nombreux secteurs industriels (agroalimentaire, cosmétique, pharmaceutique etc.). Cependant, leur utilisation exponentielle suscite des inquiétudes quant à leurs potentiels effets sur la sante de l’Homme et sur l’environnement. En effet, en raison de leur présence dans de nombreux produits du quotidien (produits cosmétiques, alimentation, produits d’entretien, expositions professionnelles etc.), nous y sommes régulièrement exposés, que ce soit par voie cutanée, orale ou pulmonaire. Des analyses toxicologiques sont donc nécessaires pour connaitre les risques liés à leur utilisation, notamment dans le cadre d’expositions pendant la période périnatale, lorsque l’organisme en développement est particulièrement sensible aux agressions environnementales. Des études récentes réalisées chez la souris ont montré que des nanoparticules administrées à des femelles gestantes ou lactantes peuvent atteindre le fœtus, traversant la barrière placentaire via la circulation sanguine, ou le souriceau après passage dans le lait maternel. Les conséquences de ces expositions périnatales jusqu’à l’âge adulte sont encore peu étudiées, il apparait cependant qu’elles peuvent provoquer des défauts dans divers organes (reins, foie, organes sexuels) chez la descendance. Une étude a montré qu’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la gestation (voie pulmonaire) provoque des anomalies de développement pulmonaire chez la descendance. Ce présent projet s’inscrit dans leur continuité. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer les conséquences d’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la période de lactation sur le développement et la fonction pulmonaires de la descendance et d’évaluer les potentiels effets combinés d’une exposition pendant la gestation et la lactation, à l’aide d’approches in vivo et in vitro complémentaires. Dans un premier temps, nous effectuerons des tests qui nous permettront de mettre au point un protocole d'exposition optimal, permettant une exposition post natale la plus précoce possible, avec un minimum de dommages pour la descendance. Les résultats obtenus permettront de contribuer à l’évaluation des risques liés à ce type d’exposition chez les femmes enceintes, allaitantes et leurs enfants.

Bénéfices attendus

Bien que l’impact d’une exposition directe aux nanoparticules sur le site d’exposition (poumons, système digestif) ait été bien décrit ces dernières années, les conséquences d’expositions maternelles aux nanoparticules sont relativement peu étudiées et se concentrent sur le développement prénatal de la descendance. Les analyses des conséquences à l’âge adulte d’expositions périnatales à ces nanoparticules sont rares, notamment dans le cas particulier du développement pulmonaire. Ce projet nous permettra donc d’en apprendre davantage sur la toxicité des nanoparticules chez la souris, dans un modèle in vivo permettant d’étudier la transmission de ces particules de la mère à la descendance (circulation sanguine, lait maternel) et ses conséquences sur le développement pulmonaire des souriceaux dans des conditions physiologiques. Ce projet aura pour bénéfice de contribuer à l’évaluation des risques liés à des expositions périnatales aux nanoparticules pour les femmes enceintes, allaitantes ainsi que leurs enfants.

Procédures

Les femelles gestantes et lactantes seront soumises à des expositions pulmonaires nanoparticules (administration par voie pulmonaire via la trachée) aux sous anesthésie de manière hebdomadaire pendant 6 semaines (geste technique réalisé en quelques minutes, réveil et récupération rapides pour l’animal). La descendance sera soumise à des mesures longitudinales non invasive de fonction pulmonaire sur animaux vigiles durant 1h à plusieurs stades de leurs vies.

Impact sur les animaux

Les souris femelles tolèrent l’exposition aux nanoparticules pendant la gestation sans nuisance particulière. Leur descendance ne présente pas de létalité excessive ou d’anomalies évidentes de développement, les souriceaux grandissent normalement jusqu’à l’âge adulte. La mesure de la fonction pulmonaire, non invasive, n’induit pas d’effets indésirables. Dans le cadre de ce projet, les expositions comprendront la période de gestation ainsi que celle de lactation. L’exposition des femelles chaque semaine pendant la gestation puis la lactation pourrait induire un stress conduisant à des troubles du comportement maternel. Des anomalies de développement pourraient apparaitre chez la descendance, une attention particulière sera portée à leur croissance dès les premiers jours de vie afin de détecter des troubles éventuels.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier les effets de l'exposition aux nanoparticules (prélèvement d'organes).

Remplacement

Notre étude porte sur l’impact d’une exposition maternelle aux nanoparticules sur le développement pulmonaire de la descendance. Ces nanoparticules peuvent passer des poumons de la mère à son système sanguin, s’accumuler dans ses organes et enfin atteindre la descendance, en traversant le placenta ou en passant dans le lait maternel ingéré par les nouveau-nés. Cette transmission résulte d'une complexité impossible à modéliser de manière bio-informatique ou par technique de culture cellulaire. Nous souhaitons ensuite mesurer les conséquences de cette exposition périnatale sur la physiologie et la fonction pulmonaires de la descendance jusqu’à l’âge adulte, que nous ne sommes pas en mesure de modéliser par des méthodes alternatives à l’heure actuelle. Notre étude sur modèle murin nous permettra justement de modéliser des expositions maternelles humaines bien plus complexes, pour lesquelles nous avons encore peu de données.

Réduction

Nous avons optimisé les protocoles afin d’étudier le phénotype pulmonaire à la fois des mâles et des femelles. Nous réalisons un maximum d’analyses sur le même animal afin d’utiliser tous les animaux générés dans nos procédures et d’en minimiser le nombre, tout en gardant la puissance statistique nécessaire pour mettre en évidence des variations biologiques Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous n’effectuerons que les seules expériences indispensables, et nous efforcerons de réutiliser les animaux lorsque cela est possible, notamment le contingent de mâles d’accouplement nécessaires pour générer des femelles gestantes.

Raffinement

Pour les besoins de notre étude, nous travaillerons avec les femelles gestantes et lactantes particulièrement sensibles au stress. Au cours de nos travaux antérieurs portant sur les femelles gestantes, nous avons mis au point un protocole permettant de minimiser ce stress, notamment en rangeant ces cages aux endroits de plus faible passage dans le box d’hébergement, et en les enrichissant fortement par l'ajout de refuges en carton, de carrés de cellulose et de lanière de papier. Après le sevrage, les souris de la descendance bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement, pour réduire leur stress et favoriser leur bien-être. Au cours de l’expérimentation, toutes les étapes de la procédure seront réalisées en limitant au maximum la souffrance et l’angoisse animale. Les animaux seront sous observation quotidienne pendant toute la durée du protocole, et l’évaluation permanente de l’état général des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise à mort rapide à l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi dans notre projet car la souris est le modèle le plus utilisé en toxicologie, la littérature à son sujet est donc abondante. Par ailleurs, le projet nécessite un modèle mammifère permettant la transmission des nanoparticules de la mère à la descendance par la circulation sanguine et le lait maternel. Or, les quelques études décrivant cette transmission ont été réalisées dans le modèle murin. Le but du projet est de caractériser les effets d’une exposition périnatale aux nanoparticules sur le développement et la fonction pulmonaire jusqu’à l’âge adulte, les poumons se développant chez la souris en pré et post-natal. Le phénotype pulmonaire de la descendance sera analysé à 2 stades : 1) au stade juvénile (jeune non sevré) afin de visualiser les effets d’une exposition post-natale pendant la période de lactation et 2) à l’âge adulte afin d’en évaluer les conséquences à long terme.

200 mulets-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pêchés dans des eaux saumâtres puis acclimatés à l'eau douce, jusqu'à 96 d'entre eux sont privés de nuit pendant un mois par un éclairage continu, jusqu'à 96 reçoivent une alimentation contaminée par un biocide, et 33 à 48 cumulent les deux. Le porteur reconnaît que les effets du biocide sont difficiles à anticiper faute de littérature, et envisage dans le pire des cas des lésions internes, un arrêt de la prise alimentaire ou une mortalité. 36 poissons sont isolés une heure dans une chambre de choix, ce que le porteur décrit lui-même comme potentiellement très stressant pour une espèce grégaire.

Objectifs

L’objectif général du projet est d’acquérir des connaissances concernant les effets de stress urbains sur le fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Plus précisément, il s’agira d’évaluer les impacts de la pollution lumineuse nocturne et d’une pollution par un produit chimique sur le mulet-porc Chelon ramada, un poisson très commun dans les eaux côtières et saumâtres urbanisées européennes (ex : les ports, le long des quais). Le produit chimique, un biocide largement utilisé dans les détergents et produits ménagers en Europe, a été choisi car il est fréquent d’en retrouver dans l’eau. Les poissons que nous allons impliquer seront exposés soit à la pollution lumineuse, soit à la contamination de leur alimentation, soit aux deux, pendant un mois. A l’issue de cette période, nous mesurerons les effets de ces pollutions sur 1) leur niveau de stress via l’hormone « cortisol » que l’on pourra retrouver dans l’eau de leur bac et dans leur sang et via la présence de lipides spéciaux qui témoignent de la dégradation des cellules de l’animal ; 2) l’accumulation du polluant dans les organes des poissons ; 3) la façon dont les poissons se nourrissent et s’ils continuent à acquérir des acides gras qui leur sont essentiels ; 4) quelle(s) zone(s) en fonction de leur luminosité les poissons favorisent. Les résultats obtenus auront une portée internationale, les facteurs de pollution étudiés étant largement répandus.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de l’étude sont, à court terme, de compléter les connaissances en matière de réaction, par le mulet-porc, à un stress lumineux d’une durée d’un mois. A moyen terme, les résultats obtenus permettront d’appréhender les effets singuliers et combinés de deux facteurs de stress urbains sur cette espèce largement répandue dans le monde. A long terme, cette démarche expérimentale qui intègre des analyses sur plusieurs éléments biologiques (biofilms, poissons), permettra d’apporter des éléments de connaissance scientifique robustes sur les effets de la lumière artificielle nocturne et d’une pollution chimique émergente provoquée par le polluant testé et leurs éventuelles interactions, sur le fonctionnement des écosystèmes aquatiques urbains. Ces connaissances permettront de proposer des solutions pour optimiser la gestion des espaces publics en ville, en facilitant notamment l’arbitrage entre suppression, réduction ou mitigation des éléments susceptibles d’avoir des répercussions sur l’environnement.

Procédures

Les mulets-porcs seront pêchés dans des eaux saumâtres impactées par l’urbanisation. Des filets seront maintenus face au courant pendant 5 mn permettant de limiter le risque de les blesser. Ils seront transportés en moins de 2 h dans des sacs adaptés, dans un véhicule agréé, jusqu’au lieu de l’expérimentation où ils recevront un traitement antibiotique contre les pathologies. Les mulets-porcs étant une espèce capable de s’adapter à des changements de salinité, c’est-à-dire pouvant vivre aussi bien en eau douce qu’en eau salée, il faut qu’ils s’acclimatent à l’eau de rivière qui alimentera les dispositifs expérimentaux et qui est d’une salinité inférieure à celle du milieu de capture. Pour cela, des seuils d’acclimatation progressifs seront réalisés, accompagnés d’observations comportementales continues. Les poissons seront nourris avec un aliment commercial dont l’appétence en captivité a été éprouvée lors d’une étude préalablen. Un mois après, les poissons seront répartis en 12 lots de 11 à 16/17 individus (selon la survie des surnuméraires), exposés à des cycles d’éclairage différents (c’est-à-dire à une photopériode normale avec un cycle journalier comprenant des successions jour/nuit et une photopériode altérée avec un éclairage en continu) et à une alimentation saine ou contaminée à une concentration retrouvée dans le milieu naturel (comme dit dans le point 5.5.1). 36 poissons seront ensuite soumis à des tests comportementaux d’une durée d’1 h : une fois placés individuellement dans un dispositif appelé « chambre de choix », ils pourront se déplacer dans des zones plus ou moins éclairées. Ceci permettra d’évaluer l’effet de leur conditionnement précédent (exposition à une photopériode altérée ou normale, alimentation saine ou contaminée), sur leur comportement en matière de choix d’ambiance lumineuse. Tous les poissons seront anesthésiés à diverses étapes pour la réalisation d’une prise de sang par individu, nécessaire à l’évaluation de leur niveau de stress via le dosage du cortisol suite à leur exposition. Ils seront ensuite tous euthanasiés aux diverses étapes du projet (pêche, tests d’éclairage et d’alimentation et des chambres de choix).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à d’éventuelles blessures (écaillage, lésions externes) et à un stress lors de leur capture, puis lors du transport et de la phase d’acclimatation à l’eau de rivière. Une mortalité, faible selon une précédente étude, est possible au cours de ces étapes. Duant le projet, 66 à 96 individus (selon la survie des surnuméraires) seront exposés à une absence totale de nuit pendant un mois. C’est l’effet de ce stress, mimant une exposition à la pollution lumineuse nocturne en milieu urbain, qui sera quantifié par l’expérimentation. Les effets attendus sont d’ordres comportemental (mobilité accrue, frénésie alimentaire) et physiologique (accumulation du cortisol dans le sang et excrétion de cortisol dans l’eau). Dans un deuxième temps, 66 à 96 individus selon la survie des surnuméraires seront exposés, pendant un mois, à une alimentation contaminée par le biocide à des doses similaires à celles que l’on retrouve dans la nature. Des effets physiologiques ou comportementaux pouvant potentiellement affecter l’état de santé des animaux sont là aussi possibles, mais ils sont difficiles à anticiper en raison du faible nombre, voire de l’absence, d’articles scientifiques à leur sujet. On peut toutefois, dans le pire des cas, s’attendre à des lésions internes, une modification du comportement des animaux (arrêt de la prise alimentaire, mobilité accrue ou au contraire comportement de prostration) voire une mortalité (bien que peu probable de par les faibles concentrations de polluant utilisées). Ce sont ces effets qui seront analysés. Enfin, 33 à 48 animaux selon la survie des surnuméraires seront soumis à ces deux facteurs de stress réunis : la pollution lumineuse et la pollution chimique dans l’alimentation. Les effets attendus sont identiques à ceux décrits précédemment, avec une intensité éventuelle plus importante liée au cumul des stress. Enfin, 36 poissons seront transférés individuellement dans les chambres de choix décrites dans le point 5.6.1 où ils seront isolés durant une heure, ce qui peut générer un stress important. Les effets attendus sont dans ce cas d’ordre comportemental (agitation ou prostration) et physiologiques (excrétion et accumulation de cortisol).

Devenir

Les 200 poissons impliqués seront tous euthanasiés pour des analyses de leurs tissus et organes.

Remplacement

L’expression du stress et les réponses comportementales complexes attendues par cette expérimentation ne peuvent pas être abordées par l’usage d’un modèle de remplacement simplifié (par exemple, des cultures cellulaires) en l’état actuel des connaissances. De plus, le choix d’une espèce sauvage très répandue dans les écosystèmes aquatiques urbanisés d’Europe, plutôt que d’un modèle biologique expérimental plus standardisé (poissons zèbres ou medaka par exemple) permettra d’optimiser les résultats du projet à large échelle et dans un contexte appliqué et adapté aux objectifs du projet de recherche.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisé correspond au strict minimum requis pour l’obtention de résultats fiables et interprétables vis-à-vis de la question de recherche abordée. Ce nombre a été contraint pour respecter le principe de réduction en se limitant à tester l’interaction entre absence ou présence d’un à deux facteurs de stress. Les nombres impliqués permettront néanmoins d’obtenir des conclusions statistiques robustes. Chaque lot de poissons impliqués est constitué d’un nombre minimum d’animaux suffisant dont un total de 63 mulets-porcs surnuméraires pour pallier une mortalité éventuelle au cours des étapes de l’expérimentation.

Raffinement

Les animaux ne seront manipulés à l’aide d’épuisettes à mailles fines que lorsque ce sera strictement nécessaire (étapes de capture/transport puis répartition dans les bacs d’accueil). Tous les transferts opérés sur le lieu de l’expérimentation se feront à l’aide d’un pichet avec couvercle, grâce auquel seront évités les émersions et les risques de blessure. Les pêches seront réalisées selon des protocoles utilisés en routine par notre établissement ce qui permettra d’en optimiser l’efficacité. Les poissons seront capturés avec des haveneaux de surface positionnés face au courant (pas de tractage actif) pendant 5 min seulement afin de limiter les dommages causés par le filet. La sélection d’individus immatures juvéniles limitera l’impact des pêches sur les ressources naturelles. Un traitement antibiotique post-pêche sera appliqué pour limiter l’incidence de pathologies pouvant affaiblir les poissons. Une surveillance quotidienne de leur état sanitaire et général sera garantie. Les poissons seront nourris à satiété avec un aliment dont l’appétence a été éprouvée au cours d’une précédente étude. Des mesures continues de température, salinité et oxygène dissous et hebdomadaires des produits azotés garantiront la qualité de l’eau. Les bassins offriront un espace de mobilité confortable aux animaux : en fonction des étapes du projet, la quantité de poissons par bac sera faible et donc garante de leur bien-être. Les poissons seront tout le temps conservés en groupe, ce qui correspond à leur mode de vie habituel, à l’exception d’une durée d’une heure pendant laquelle 36 poissons seront placés dans des chambres de choix comme évoqué précédemment. A l’exception de cette dernière étape, un couvercle transparent sera posé sur chaque bac pour éviter tout échappement (saut) tout en permettant la diffusion de la lumière et le contrôle des poissons par les animaliers sans les perturber. Les bacs seront nus car un abri serait de peu d’intérêt pour le mulet-porc qui est une espèce mobile grégaire se déplaçant dans la colonne d’eau en dehors des activités alimentaires sur le fond. Les bacs seront en matériau opaque de couleur sombre, ce qui permettra de les distinguer visuellement les uns des autres et de produire une ambiance proche de celle du milieu d’origine des poissons.

Choix des espèces

Le mulet-porc Chelon ramada est présent dans la majorité des masses d’eaux saumâtres urbanisées de climat tempéré, ce qui en fait un modèle d’étude pertinent pour aborder l’impact des stress urbains sur les écosystèmes aquatiques. Son statut de conservation est non-préoccupant et c’est l’espèce dominante dans la zone de pêche ciblée si bien que l’impact de sa capture sur les ressources naturelles sera minimisé. Les animaux seront des juvéniles de 10 ± 3 cm de longueur totale, un stade de développement où ils consomment exclusivement du biofilm. Les jeunes mulets constituent ainsi un vecteur essentiel des transferts d’énergie entre compartiments benthique (fond) et pélagique (colonne d’eau) des réseaux alimentaires. Cette caractéristique permet d’appréhender l’effet des stress urbains non seulement sur l’espèce cible mais plus largement sur le fonctionnement des écosystèmes aquatiques urbains où l’espèce est représentée. La sélection d’individus juvéniles limitera également les effets potentiels des captures sur les ressources naturelles. Leur forte capacité d’adaptation à l’eau salée et à l’eau douce permettra de faciliter leur acclimatation à l'eau douce au sein des dispositifs expérimentaux. Enfin, le savoir-faire scientifique et technique de notre équipe, ainsi que ses connaissances de l’espèce cible, permettront d’optimiser l’ensemble des interventions durant le projet.

40 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres études après une période de repos. Sous anesthésie générale, chaque animal peut subir jusqu'à cinq fois sur deux ans des prélèvements de moelle osseuse, de liquide cérébrospinal, des lavages broncho-alvéolaires ou des prises de sang. L'objectif est de fournir du matériel biologique de primate pour mettre au point des techniques d'analyse. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, la proximité des primates avec l'humain étant présentée comme sans équivalent.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre à disposition de la communauté scientifique du matériel biologique de primate (liquide cérébrospinal, échantillons pulmonaires ou de moelle osseuse, accompagnés ou non de prélèvement sanguin), qui ne peut être collecté que sous anesthésie générale des animaux. Ces prélèvements sont nécessaires à la mise au point de techniques d'analyses sur ces échantillons, à la sélection d'animaux sur certains critères physiologiques, ou encore à la réalisation de test in vitro afin d’appréhender la toxicité ou l'efficacité d’un produit, au lieu de ou avant de le tester chez l’animal. Ce projet vise donc à pouvoir prélever certains échantillons biologiques de primate sous anesthésie, dans le but de réaliser des tests préliminaires ou en remplacement d'études in vivo sur cette espèce.

Bénéfices attendus

Tout test de matériel biologique obtenu lors de protocoles expérimentaux utilisant l'animal nécessite au préalable d'être mis au point, affiné, voir validé selon un certain cadre réglementaire. Ces mises au point nécessitent elles-mêmes l'utilisation de matériel biologique, qui doit être obtenu sur la même espèce. Beaucoup de tests sont basés sur des produits sanguins, mais certains nécessitent d'autres matrices biologiques plus difficile d'accès, comme la moelle osseuse, le liquide cérébrospinal ou les lavages pulmonaires. La moelle osseuse pourrait par exemple être utilisée dans le cadre de la mise au point d'un test visant à caractériser les cellules progénitrices du sang, pour le développement d'une thérapie contre des maladies héréditaires. Le liquide cérébrospinal pourrait être utilisé pour mettre au point une méthode de mesure d'un produit injecté dans le sang d'un patient, pour évaluer sa capacité à passer dans le cerveau. Cela peut avoir des implications pour évaluer la potentielle neurotoxicité d'un produit, ou au contraire sa capacité à atteindre le cerveau pour lutter contre des maladies neurodégénératives. Finalement, les lavages pulmonaires permettent d'avoir accès à du liquide et à des cellules de poumons, sans pour autant sacrifier l'animal : cela permettrait d'étudier le microbiote pulmonaire d'animaux, ou encore d'utiliser ces échantillons pour mettre au point des méthodes d'investigation de virus pulmonaires comme le SARS-CoV-2 (ex: PCR). Ces prélèvements sous anesthésie de matrices biologiques spécifiques pourront potentiellement être accompagnés de prélèvements sanguins dans la limite des recommandations de volume et fréquence pour l'espèce. Ces prélèvements de sang pourront être réalisés seulement s'il est jugé scientifiquement ou éthiquement pertinent de les faire sur le même animal plutôt que sur une cohorte différente. Dans certains cas, ces échantillons pourraient être utilisés pour réaliser des tests in vitro remplaçant l'utilisation de l'animal, comme par exemple dans le cadre de tests de toxicité d'un produit sur les cellules progénitrices de la moelle. Dans ce contexte, les différents prélèvements réalisés sont nécessaires pour mettre au point ou améliorer des méthodes d'analyses existantes. Ce projet contribuera donc à réduire le nombre d’animaux utilisés en étude, en permettant le développement de méthodes d'analyses plus fines ou de test in vitro remplaçant l'animal lors de phases expérimentales précoces.

Procédures

Les animaux seront manipulés afin de réaliser une injection d’anesthésique. Les procédures se déroulent entièrement sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à une parmi les 4 procédures différentes, chacune nécessitant entre moins d’une minute et trois minutes . Les prélèvements possibles seront : prélèvement de moelle osseuse, prélèvement de liquide cérébrospinal, lavage broncho-alvéolaire et prélèvements sanguins. Le temps entre l’induction de l’anesthésie de l’animal et son réveil est d’environ 1h.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de liquide cérébro-spinal est réalisé sous anesthésie. Une légère gêne au lieu de ponction peut être ressentie au réveil par l’animal. Le lavage broncho-alvéolaire peut provoquer une gêne chez l'animal suite à l'administration de liquide dans les poumons. De plus, dans le cadre de ce protocole, les prélèvements seront par définition ponctuels et donc non répétés dans le temps. Le prélèvement de moelle osseuse peut quant à lui provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement. ire un hématome sur la zone de prélèvement.

Devenir

Après une période de repos adéquate, les animaux seront disponibles pour intégrer d'autres études, sur avis vétérinaire.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'animal dans le cadre de ce projet. L'utilisation de celui-ci est indispensable afin d'obtenir le matériel biologique nécessaire à la mise au point, la calibration et la validation de méthodes d'analyses biologiques. Ces méthodes visent en effet directement les cellules de l'espèce animale concernée (cytométrie en flux, tests de stimulation de cellules immunitaires, caractérisation de l'expression de certains gènes…), ou peuvent être fortement influencées par le milieu biologique dans lequel elles sont réalisées (mesure de la quantité d'un anticorps ou d'une protéine exogène par ELISA ou spectroscopie de masse). Le raffinement de ces méthodes d'analyses sert d'une part à transférer des protocoles d'analyses d'une espèce à l'autre, et à améliorer leurs sensibilité et spécificité, réduisant ainsi potentiellement le nombre d'animaux nécessaires lors d'études subséquentes. De plus, la disponibilité de matériel biologique permet de la réalisation d'étude d'efficacité ou de toxicité in vivo, qui pourront potentiellement permettre de remplacer ou réduire le besoin d'études in vivo.

Réduction

Afin de ne pas surestimer le nombre d'animaux utilisés, le nombre d’animaux pour ce projet a été défini par une analyse rétrospective des prélèvements de liquide cérébrospinal et de prélèvements pulmonaires fait au sein de l’entreprise au cours des dernières années, modulée par la trajectoire de croissance de notre activité . Afin d’assurer un nombre minimum d’animaux, les animaux pourront être prélevé un maximum de 5 fois sur une période de 2 ans dans le cadre de cette DAP.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager. Des jouets sont mis à leur disposition (rotation des jouets une fois par semaine). Des friandises sont distribuées quotidiennement aux animaux (après les manipulations et fin de journée) dans la litière et dans des dispositifs à friandises (tube, jouets...). Les fruits et légumes frais qui leurs seront fournis seront variés d'un jour à l'autre, tout comme la façon de les préparer, afin de stimuler les animaux. Un fond musical sera diffusé dans l'animalerie tout au long de la journée afin d'habitue les animaux à la voix humaine et de masquer les sons liés à l'utilisation quotidienne de l'animalerie. Toutes les procédures décrites dans ce protocole auront lieux sous anesthésie, accompagnées de mesures de soutien en fonction de la procédure en question. Par exemple, les prélèvements de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal seront précédés d'injection d'analgésique, les prélèvements pulmonaires seront accompagnés de monitoring dédié et de supplémentation en oxygène. Les animaux seront gardés sur coussin chauffant durant la procédure afin de ne pas occasionner d'hypothermie. Les volumes maximum de matrice biologique à prélever sont basés sur une analyse de la littérature disponible, ou sur les pratiques utilisées en clinique humaine le cas échéant. L'animal sera suivi par le personnel d’étude tout au long de l'anesthésie et surveillé au moment de son réveil ainsi que durant les heures suivantes. Un suivi clinique quotidien ainsi que la mise en place de points limites spécifique à chaque procédure permet d’évaluer quotidiennement le bien-être de l’animal. En fonction de la procédure réalisée, un score neurologique pourra aussi être réalisé, si nécessaire, les jours suivant les prélèvements afin d’assurer qu’il n’y ait pas de dommage neurologique.

Choix des espèces

Par leur origine phylogénétique, les primates non humains présentent une forte proximité avec les humains en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Cette proximité permet de les utiliser dans le cadre de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et/ou prophylactiques. Cette espèce est donc particulièrement utilisée pour tester l'efficacité ou la toxicité de drogues visant des processus biologiques spécifiques à l'homme ou aux espèces proches. Ces études peuvent couvrir les thérapies géniques ou cellulaires visant à corriger l'expression de gènes défectueux, les études infectieuses sur des virus n'infectant que l'homme ou certains primates, ou encore les thérapies visant le système nerveux central (la barrière hémato-encéphalique de l'humain étant très proche de celle du singe). Ce type d'étude nécessites la mise au point de méthodes d'analyses dédiées, pour lesquelles l'accès au matériel biologique de l'espèce cible est nécessaire. Ainsi, des études visant des maladies génétiques ou des leucémies auront besoin d'analyser la moelle osseuse des animaux, les études infectieuses de virus respiratoire (le singe étant le modèle de référence pour l'infection au SARS-CoV-2) auront besoin d'échantillons pulmonaires, et les études visant le système nerveux auront besoin d'échantillons de liquide cérébrospinal pour mettre au point leur méthode de dosage. Les mises au point et/ou test préliminaires de ce projet concerneront des candidats médicaments humains. Les animaux pourront être des juvéniles à mature, en fonction des besoins de l’étude. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou des matures en fonction des objectifs des études. Par exemple, des prélèvements de moelle osseuse peuvent chercher certaines populations de cellules précurseurs plus fréquentes chez le juvénile que chez l'animal mature.

330 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des sensibilisants chimiques par application cutanée et par voie respiratoire, cette dernière réalisée en tube de contention, ce qui peut provoquer une irritation de la peau, des voies aériennes et des signes d'asthme. Les ganglions lymphatiques sont prélevés après mise à mort à des temps successifs. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire n'est validé pour ce travail et présente le projet lui-même comme une étape vers un tel modèle alternatif.

Objectifs

L’allergie est classée au 4ème rang des affections chroniques les plus fréquentes par l’Organisation Mondiale de la Santé. Les symptômes allergiques peuvent prendre des formes cutanées ou respiratoires et font suite à l'exposition répétée des sujets à une substance dite sensibilisante. Jusqu'à 25% des cas d'asthme déclarés sont d'origine professionnelle et font suite à une exposition répétée, par voie respiratoire ou cutanée, à des substances sensibilisantes chimiques. A ce jour, aucune méthode n'a été validée par les instances règlementaires européennes pour identifier les substances chimiques avec un potentiel sensibilisant respiratoire. Or, ces substances présentent un danger pour les individus exposés. La différenciation des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques locaux est une étape déterminante dans le développement de la maladie allergique. L’objectif de ce projet est d’identifier des gènes régulant la différenciation des lymphocytes T au cours du processus de sensibilisation respiratoire chez la souris. Afin d’atteindre cet objectif, deux voies d’exposition seront utilisées sur un modèle murin de sensibilisation qui sera combiné à des outils d’analyse de l’expression des gènes afin d’identifier les gènes cibles exprimés par les cellules immunitaires d’intérêt activées par des sensibilisants respiratoires et des sensibilisants cutanés. L’objectif final est de développer un modèle de culture cellulaire, alternatif au modèle animal, qui permettra d’identifier spécifiquement les substances chimiques ayant le potentiel de déclencher une maladie allergique respiratoire, grâce aux biomarqueurs qui auront été identifiés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes immunologiques mis en jeu au cours de la sensibilisation respiratoire. Ces connaissances sont nécessaires pour améliorer la description des évènements clés menant au développement de l’allergie respiratoire. En outre, de nouveaux biomarqueurs seront identifiés au cours de ce projet, ils permettront de développer un modèle de culture cellulaire alternatif au modèle in vivo permettant de prédire le potentiel sensibilisant respiratoire des substances chimiques. De telles méthodes sont nécessaires, pour identifier le risque associé à l'exposition aux substances sensibilisantes, afin de prévenir le développement de maladies allergiques. Aucun modèle de culture cellulaire n’est validé à ce jour par les instances européennes pour identifier les substances chimiques avec des propriétés sensibilisantes respiratoires.

Procédures

Un lot de 52 souris vigiles sera exposé par application cutanée à 2 sensibilisants allergiques et au solvant approprié. La veille de la première application, les flancs des animaux seront tondus sous anesthésie gazeuse. Les produits seront appliqués sur les flancs des souris à J0 et J5, puis derrière les oreilles à J10, J11 et J12. Les animaux seront mis à mort J0, J3, J7, J10 et J13 après sédation suivie d’une anesthésie profonde (comme pour tous les animaux mis à mort dans ce projet) et les ganglions lymphatiques locaux seront prélevés pour être analysés en cytométrie en flux (analyse des protéines d’intérêt par marquage fluorescent). Ensuite, trois lots de 28 souris et un lot de 20 souris vigiles seront exposées par application cutanée à 7 substances et au solvant approprié. Les animaux seront mis à mort à J0 et deux autres temps déterminés par les analyses en cytométrie en flux. Les ganglions lymphatiques locaux seront prélevés pour les analyses d’expression génétique. Un lot de 10 souris sera exposé par voie respiratoire à un mélange d’acétone et d’huile d’olive dans un but de formation. Ces animaux, ainsi que tous ceux qui seront exposés par voie respiratoire au cours du projet, bénéficieront d’une anesthésie légère précédée d’une sédation. Leur réveil sera ensuite induit par injection médicamenteuse après l’instillation. L’exposition respiratoire sera faite à J0, J5, J10, J11 et J12 dans cette procédure. Les animaux seront mis à mort à J13. Un lot de 68 souris sera exposé à un sensibilisant respiratoire et au solvant approprié comme suit : trente-deux de ces animaux seront exposés de façon vigile par voie cutanée à J0 et J5 et 32 autres animaux seront exposés par voie respiratoire à J0 et J5. Tous les animaux seront ensuite exposés à J10, J11 et J12 par voie respiratoire. Les animaux seront mis à mort à J0, J3, J7, J10 et J13. Un lot de 36 animaux sera utilisé pour tester un sensibilisant cutané selon la méthode définie à l’issue du 1er lot de 68 souris. Ensuite, trois lots de 28 souris et 1 lot de 20 souris seront exposés aux mêmes 7 substances que pour l’exposition cutanée par voie respiratoire. Les animaux seront mis à mort à J0 et deux autres temps pour les analyses d’expression génétique.

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux seront principalement dues aux voies d’administration des substances chimiques. Malgré le plus grand soin apporté pour limiter l’inconfort des animaux, la procédure de sensibilisation par application cutanée pourra induire de l’irritation cutanée. L’exposition des animaux par voie respiratoire pourra induire de l’irritation des voies aériennes. L’exposition par inhalation, qui sera faite par voie oro-nasale, pourra induire du stress chez les animaux qui seront mis en tubes de contention. Avec les deux procédures, des signes d’asthme pourront également apparaitre. Dans tous les cas, dès l’apparition de signes de souffrance non réversibles, les animaux seront mis à mort.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort dans le but de prélever les différents tissus nécessaires aux analyses prévues dans ce projet.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux à des fins expérimentales car le modèle animal permettra d’étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la différenciation des lymphocytes T lors du processus de sensibilisation in vivo. Aucun modèle de culture cellulaire n’est à ce jour établi et validé pour étudier ces mécanismes. C’est d’ailleurs l’objectif au terme de ce projet : le développement d’un modèle de culture cellulaire à partir des données issues de ce projet afin de proposer un modèle alternatif pour l’évaluation du potentiel sensibilisant respiratoire.

Réduction

Nous avons réduit au minimum le nombre d’animaux utilisés afin de pouvoir effectuer des analyses statistiques valables entre les groupes expérimentaux. En accord avec la littérature, nous avons porté à 4 le nombre de souris par groupe. En outre, nous allons collecter le maximum de tissus afin de pouvoir effectuer les analyses post-mortem nécessaires à ce projet en utilisant un nombre minimal de souris. L’analyse sur cellule unique permet de diminuer la variabilité entre les individus, car environ 2000 cellules seront analysées dans chaque échantillon, ce type d’analyse permet donc de réduire le nombre d’animaux à inclure par groupe expérimental.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué chaque jour lors des soins quotidiens apportés par les zootechniciens et lors des contrôles quotidiens effectués par les autres membres participant à ce projet (techniciens de recherche et chercheurs). Les souris seront manipulées par préhension dans le creux des mains. Toutes les personnes intervenant dans ce projet sont formées initialement et de façon continue à l’expérimentation animale et en particulier au bien-être animal. Les gestes réalisés seront maitrisés afin de garantir le confort maximum des animaux lors des traitements. Les animaux seront hébergés par groupe dans des cages répondant aux exigences de la réglementation en terme de dimensions. Un enrichissement varié (maisonnette et éléments de nidification) leur sera apporté. Une observation renforcée après les expositions aux substances chimiques permettra la prise en charge rapide des animaux en cas de souffrance ou d’atteinte de point limite.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est justifiée pour plusieurs raisons : -la souris est l’espèce couramment utilisée pour les études de toxicologie, elle est notamment l’espèce sélectionnée dans la ligne directrice 429 de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economiques) portant sur le modèle Local Lymph Node Assay qui permet d’identifier les substances chimiques allergéniques; -la composition et le fonctionnement du système immunitaire de la souris sont semblables à celui de l’Homme et les résultats issus des expériences pourront donc être extrapolés raisonnablement aux effets attendus chez l’Homme ; -la souche BALB/c est choisie car son système immunitaire est adapté aux études de sensibilisation allergique. Cette souche, bien qu’orientée Th2, permet d’étudier la différenciation des lymphocytes T en ses différents sous-types et plusieurs études ont montré qu’elle permet le développement d’une réaction allergique respiratoire aux substances chimiques. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8-10 semaines, stade de développement auquel la souris atteint l’âge adulte. Nous souhaitons étudier la réponse allergique sur des animaux ayant un système immunitaire mature.

13 530 animaux non-humains vont être utilisés, en très grande majorité tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : 6 400 souris, 4 800 rats, 1 250 macaques à longue queue, 540 chiens et 540 cochons. Ils reçoivent des administrations répétées de candidats médicaments, des prélèvements de sang, de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal et, pour les non-rongeurs, la pose chirurgicale d'implants de télémétrie, dans des études de toxicité réglementaire. Le porteur indique qu'une analyse terminale des organes est le plus souvent nécessaire, seuls 10 à 15 % des non-rongeurs pouvant être réutilisés et certains proposés à l'adoption. Il justifie l'emploi de deux espèces, dont un non-rongeur, par les lignes directrices internationales et l'extrapolation à l'humain, aucune méthode ne remplaçant selon lui l'"organisme entier".

Objectifs

Un médicament n’est mis sur le marché pour les patients qu’après plusieurs années de Recherche et Développement. Les études précliniques, en amont des essais chez l’Homme, sont indispensables à l’évaluation de l’innocuité et de l’efficacité d’un candidat médicament. Celles visant à qualifier la sécurité du candidat médicament sont réalisées en accord avec la réglementation qui impose cette évaluation sur deux espèces mammifères, un rongeur (rats ou souris) et un non rongeur (chiens, mini-porcs ou primates non humains) (sauf cas particulier, par exemple pour les anticorps si une seule espèce est pertinente). L’objectif de ce projet est de réaliser des études de sécurité préclinique afin d’évaluer les potentiels effets indésirables des candidats médicaments. Pour cela, les procédures mises en œuvre concernent le suivi clinique et biologique des animaux suite à l’administration unique ou répétée du candidat testé, par des voies, la plupart du temps, identiques à celles prévues chez l’Homme, avec des prélèvements de fluides biologiques (par exemple : sang, urines) permettant de mieux caractériser les effets observés. Cela permettra d’avoir des informations essentielles (choix de dose et index thérapeutique) avant la première administration chez l’Homme ou bien de stopper le développement d’un candidat ayant un profil non satisfaisant en termes de sécurité. Ce projet fait partie des prérequis indispensables à la mise sur le marché de nouveaux médicaments et de nouvelles stratégies thérapeutiques pour l’Homme, efficaces, plus sûrs et mieux tolérés et participe aux progrès scientifiques et biomédicaux.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’apporter les éléments d’information nécessaires aux prérequis toxicologiques en évaluant la sécurité et les effets indésirables des candidats médicaments chez l’animal vivant. Les avantages attendus sont la protection de l’Homme, d’une part en stoppant le développement de composés pour lesquels la toxicité est rédhibitoire et/ou innocuité insuffisante et d’autre part en fournissant les informations essentielles avant les administrations en clinique (par exemple calcul des index thérapeutiques, caractérisations des effets secondaires attendus, biomarqueurs).

Procédures

Les animaux vigiles seront concernés par l’administration unique ou répétée (quotidienne ou hebdomadaire) du candidat médicament, possibles par différentes voies (le plus souvent intra-veineuse ou orale), au cours de l’étude sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements de sang ou autres fluides biologiques, associés à une contrainte légère de quelques minutes, seront nécessaires pour évaluer différents paramètres (par exemple hématologie, biochimie, immunologie) ; leur fréquence et leur volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie (entre 15 et 30 minutes) quand ils sont invasifs (par exemple moëlle osseuse, liquide cérébrospinal). Des mesures comme par exemple, la température corporelle (avec puce électronique), le poids (2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. Plus rarement, une procédure chirurgicale pourra être pratiquée chez les non-rongeurs afin de mettre en place un implant vasculaire ou de télémétrie pour mesurer par exemple les ECG et la pression artérielle (durée d’intervention sous anesthésie générale-analgésie d’environ 2 heures).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables seront limités à une contrainte modérée. L’administration du composé lui-même peut provoquer une baisse d’activité, une perte de poids, des modifications de la température corporelle par exemple. Les nuisances liées à la procédure (contention, administration, prélèvements de fluides ou tissus biologiques, etc.) se traduisent par un stress, une douleur de courte durée. La mise en place d’implants vasculaires par chirurgie provoquera une contrainte de courte durée (douleur légère, baisse d’appétit par exemple).

Devenir

Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse que certains animaux non-rongeurs pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 10-15%. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.

Remplacement

Le projet est réalisé sur animal vivant car il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro mimant la complexité des interactions d’un organisme entier et les effets possibles d’un candidat médicament sur celui-ci. Il n’existe pas de méthode substitutive pour remplacer l’ensemble des études menées pour l’évaluation des risques en sécurité préclinique. Cependant, l’utilisation de méthodes in silico (modélisation informatique) et in vitro (par exemple organ-on-chip) mimant la structure et la fonction d’un organe (par exemple : foie, cœur, rein) permet un premier criblage des futurs candidats ou de mieux caractériser l’atteinte de telle ou telle fonction.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (données bibliographiques et historiques, lignes directrices internationales et internes), et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les éventuels effets adverses. Les tests statistiques utilisables sont dépendants des paramètres étudiés, et peuvent être par exemple, une analyse de variance, un test de tendance. La mise en place d’études combinant l’acquisition et l’analyse de paramètres de sécurité, pharmacodynamie et pharmacocinétique permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, l’utilisation d’animaux contrôles n’est pas systématique et est soumis à réflexion en fonction des objectifs de l’étude. Enfin, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le Vétérinaire clinicien, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. Pour certains gestes techniques, une phase de désensibilisation/habituation est faite en amont de l’étude pour diminuer le stress de l’animal. L’administration est associée à une récompense physique (caresses, félicitations avec la voix) et/ou alimentaire. Les interventions chirurgicales sont réalisées en condition maximale d’asepsie et avec l’utilisation d’une analgésie multimodale. Le suivi clinique, au moins quotidien des animaux, permet la détection précoce de toute douleur, inconfort ou détresse et la mise en application de critères d’arrêt anticipés supervisée par le Directeur d’étude, le Vétérinaire clinicien et la Structure en charge du Bien-Etre Animal, afin que les animaux ne subissent pas plus qu’une contrainte modérée.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est défini par : -les lignes directrices internationales (ICH) définissant que les études de Toxicologie Générale doivent être conduites à la fois chez le rongeur (rat, souris, génétiquement modifiés ou non) et chez le non rongeur (chien, mini-porc ou primate non humain) -les données scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le véhicule envisagé et les données disponibles (pharmacocinétique, métabolisme et de toxicologie). L’espèce utilisée doit être pertinente et est essentiellement fonction de la similitude du profil métabolique et des effets biologiques attendus chez l’Homme, afin de permettre l’extrapolation des données acquises à l’espèce humaine. Le choix de l’espèce non rongeur peut dépendre également de la modalité thérapeutique (par exemple, les primates non humains pour les biologiques). Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes, pour répondre aux exigences de la réglementation internationale et aux spécificités découlant des différents programmes de recherche.