Alimentation animale

720 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 tuées pour des prélèvements et 600 remises dans un circuit d'élevage. Après douze semaines de nutrition, ces alevins subissent un stress de confinement de dix minutes destiné à mesurer leur réponse physiologique, pour définir le ratio d'acides gras essentiels de leur aliment. Le porteur indique que le confinement fait monter le cortisol et la consommation d'oxygène, et affirme que le retour à de bonnes conditions limite les nuisances. Il conclut que l'étude porte sur le métabolisme et la résistance au stress et ne peut être menée ni sur lignée cellulaire ni par modélisation, l'objectif affiché étant de remplacer la farine et l'huile de poisson dans les aliments d'aquaculture.

Objectifs

La composition optimale des acides gras alimentaires est une condition préalable à la réussite de l'élevage des alevins de poissons. Un apport adéquat d'acides gras essentiels au cours des premiers stades de développement des alevins de poisson est essentiel pour la progression normale de la neurogenèse (formation de neurones fonctionnels) et ainsi le développement du cerveau. Pour les alevins de poisson, la substitution de l'huile de poisson par des huiles végétales peut potentiellement entraîner des déficiences ou des déséquilibres en acides gras essentiels chez les alevins de poissons, qui ont été impliquées dans une variété de troubles, telles qu'une réponse retardée et accrue au stress, une réduction de l'activité phagocytaire contre les pathogènes, la réduction de la réactivité aux stimuli auditifs et de l'acuité visuelle, une altération du développement cérébral. Dans ce contexte, il est nécessaire de déterminer les besoins en acides gras essentiels des alevins de truite arc-en-ciel dès leur premier repas pour pouvoir établir les effets sur la physiologie métabolique du poisson ainsi que sur leur capacité de tolérance au stress pour à terme pouvoir remplacer, de la manière la plus adaptée aux besoins du poisson, la farine et l’huile de poisson dans les aliments aquacoles. Pour répondre à cela, un essai d’alimentation de 12 semaines comprenant 8 traitements sera conduit en triplicat sur des truites arc-en-ciel dès leur premier repas élevées dans des conditions optimales. Au total, 7200 poissons seront utilisés pour cet essai d'alimentation soit 900 poissons par traitement. Les 8 traitements correspondront à 8 aliments présentant des profils en acides gras différents. Les aliments sont formulés sur la base de la composition des aliments actuellement commercialisés chez la truite, de façon à couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels de l’animal. Après 12 semaines de nutrition, afin d’évaluer la capacité des alevins à tolérer un stress, en d'autres termes la robustesse des alevins, en fonction de l’aliment reçu, un sous-groupe de 720 poissons (n=90 par traitement) sera soumis à un stress de confinement pendant 10min puis remis dans de bonnes conditions. Le reste des poissons mis en élevage ne sera pas stressé.

Bénéfices attendus

Cette expérimentation permettra de définir le ratio optimal en acides gras essentiels dans l’aliment à destination des alevins de truite arc-en-ciel dès leur premier repas pour déterminer l’influence de différents apports en acides gras essentiels par la nutrition sur la sensibilité et la résilience à un stress chez la truite arc-en-ciel et donc des indications sur sa robustesse. Malgré le contrôle des conditions d’élevage, les poissons sont soumis à de multiples perturbations liées aux systèmes de production ou aux variations de leur milieu. Ces perturbations peuvent être à l’origine d’une augmentation de la fragilité des animaux et d’une dégradation de leur bien-être et de leur état de santé. Favoriser la robustesse des poissons est donc une solution pour lutter contre ces perturbations. L'expérimentation permettra d’établir chez la truite arc-en-ciel le lien entre la nutrition en acides gras (stockage, mobilisation et transfert des acides gras), et la réponse physiologique face à un stress (paramètres liés au bien-être, aux systèmes immunitaire et inflammatoire). Cette expérimentation servira de base pour la définition de formules alimentaires durables (sans huile et farine de poisson) adaptées le plus possible aux besoins nutritionnels des alevins de truite dès leur premier repas afin de favoriser la robustesse du poisson.

Procédures

Un sous-groupe de poissons (720) sera soumis après 12 semaines d'élevage à un stress de confinement de 10 min suivi par un retour dans de bonnes conditions d'élevage.

Impact sur les animaux

L'élevage ne créera aucune nuisance ou effet indésirable sur les animaux car c'est un protocole classique d'élevage avec des aliments qui répondent entièrement aux besoins nutritionnels des poissons. Le stress de confinement (procédure expérimentale réalisée sur 720 poissons) a été réduit au temps minimal permettant de voir une réponse physiologique au stress. Il entrainera une hausse de l'hormone de stress (cortisol) qui entrainera une hausse de la consommation en oxygène. Le retour à de bonnes conditions dès la fin du stress entrainera dans un premier temps une augmentation de l'activité de nage du poisson puis ensuite le poisson reviendra progressivement à son état physiologique avant stress (dans les 2h suivant le stress), cela permettra donc de limiter au maximum les nuisances chez le poissons.

Devenir

120 poissons stressés seront euthanasiés 40 minutes après le stress de confinement pour des prélèvements biologiques en vue d'analyses biologiques. Le confinement est généralement considéré comme un défi stressant pour les poissons, mais, contrairement aux facteurs de stress tels que les changements de température, la disponibilité de l'oxygène ou les infections parasitaires, le confinement ne remet pas directement en cause l'état de santé du poisson donc n'impactera la future vie du poisson. Ainsi, les 600 poissons restants stressés par confinement non utilisés pour les prélèvements biologiques seront remis dans un circuit classique d'élevage mais ne serviront plus à des expérimentations animales.

Remplacement

L'étude porte sur l'impact d'un régime alimentaire sur le métabolisme et la résistance au stress des animaux, elle ne peut donc pas être appréhendée sur lignée cellulaire ou par modélisation.

Réduction

Pour une espèce comme la truite, il est nécessaire d’avoir une biomasse d’élevage minimale d’élevage pour optimiser le bien-être de l’animal et éviter tout comportement agressif (relation dominant/dominé). Une faible densité d’élevage altère la survie, la croissance et l'efficacité alimentaire de la truite arc-en-ciel avec une altération de ses réponses physiologiques. Afin de réduire au maximum le nombre de poisson mis en élevage tout en maintenant une densité d’élevage optimale, les poissons seront élevés lors des premiers jours dans des petits paniers (20x20cm) placés dans des bassins avec un renouvellement d’eau important. Ensuite, les poissons, lorsqu’ils auront atteint la taille de 0.5 gramme, seront transférés dans des cages plus grandes (60 x 60 cm) toujours dans une optique de préserver une biomasse d’élevage optimale. Les effectifs ont donc été calculés à partir de données d’expérimentations précédentes et de la littérature pour maintenir des densités d’élevage optimales qui ne modifient pas le comportement des poissons ainsi que ses réponses physiologiques. Le nombre d’individus à utiliser a ainsi été réduit le plus possible (en adaptant la taille des paniers à celle des poissons) mais calculé pour obtenir des résultats statistiquement fiables. En effet, des études antérieures sur la nutrition des alevins de la truite arc-en-ciel nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet. La croissance, ainsi que le métabolisme des alevins de truite arc-en-ciel, est sujette à une très forte variabilité. Ainsi, le nombre d'animaux utilisés a été calculé au plus juste pour permettre de détecter des différences pour les paramètres physiologiques, biochimiques et moléculaire étudiés. Pour la mise en place du stress par confinement, nous avons prévu un nombre d'animaux minimal en réalisant le stress dans une petite épuisette permettant de réaliser le stress de confinement dans les meilleures conditions possibles

Raffinement

Les mesures de raffinement viseront à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux : volume d'eau adapté avec renouvellement en continu, rythme jour/nuit naturel, et de suffisamment de congénères pour exprimer un répertoire comportemental riche. Au début de l'élevage, les jeunes alevins seront élevés dans des paniers pour pouvoir obtenir une densité d'élevage suffisante au démarrage au vu de la petite taille des animaux. Le panier sera directement plongé dans le courant d’eau. La cuve sera nettoyée tous les jours avec un tuyau siphonnant. Dès que les poissons auront atteint une densité correcte, ils seront relâchés dans un bac d’élevage plus grand. Le stress de confinement a été réduit au temps minimal (10min) permettant de voir une réponse physiologique au stress, le retour à de bonnes conditions dès la fin du stress permettra de limiter au maximum les nuisances chez le poissons. Les animaliers en charge des élevages contrôleront le comportement et les mortalités des animaux au cours du stress mais aussi de l'élevage. En cas de dépassement des points limites, les animaux concernés seront anesthésiés puis euthanasiés par surdose d'anesthésiant.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale (première production piscicole française). L'essai démarrera avec des alevins de truite dès le 1er repas.

144 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis pendant six mois à des régimes incluant des arrêts de nourriture de trois jours, à des tests de tolérance au glucose avec ponctions répétées de la queue et à des IRM sous anesthésie avec pose d'un cathéter dans la veine caudale, pour évaluer les effets du jeûne sur le cœur. Le porteur indique que les ponctions et la pose du cathéter peuvent provoquer stress, douleur et risque d'infection. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico n'existe et que l'expérimentation animale est "nécessaire" pour valider son hypothèse de cardioprotection.

Objectifs

Le jeûne est une méthode d’alimentation consistant à ingérer peu ou aucune nourriture sur une période allant de 12h à plusieurs semaines chez l’Homme. Cette coutume ancestrale est pratiquée par de nombreuses religions et, plus récemment, a reçu une attention croissante pour d’autres raisons de santé, économique et écologique. On distingue le jeûne intermittent, qui consiste à se priver de nourriture pendant une période de 14h sur une journée, le jeûne intermittent prolongé (3 – 5 jours) et le jeûne thérapeutique (1 à 3 semaines). En France, jeûner n’est pas proposé dans un cadre médicalisé. Pourtant, il a été prouvé que le jeûne retarde les processus liés à l’âge (stress oxydant, inflammation…), protège le cerveau des maladies neurodégénératives et diminue la croissance tumorale. Le jeûne intermittent prévient et réverse tous les aspects du syndrome métabolique chez le rongeur et chez l’Homme. En cardiologie, des études précliniques sur des rats mâles ont démontré une diminution de la fibrose myocardique liée à l’âge en prévenant l’inflammation et en maintenant les antioxydants. De plus, le jeûne intermittent diminue l’apoptose et l’inflammation puis prévient le remodelage du myocarde sur modèles d’infarctus du myocarde. Plusieurs jours de jeûne améliorent la diffusion de l’oxygène du capillaire à la mitochondrie de myocarde murin suggérant une amélioration de l’énergie cellulaire. Les objectifs de cette étude sont de caractériser les effets du jeûne intermittent et du jeûne thérapeutique sur le cœur de rat et de déterminer si ces derniers sont protecteurs lors d’un stress aigu induit par un épisode d’ischémie-reperfusion et dans un modèle de cardiomyopathie prédiabétique (induit par un régime riche en graisse et en sucre). Plus précisément, nous souhaitons caractériser le profil cardiométabolique du jeûne, notamment le métabolisme énergétique et le profil lipidique myocardiques. Notre hypothèse est que les changements physiologiques et métaboliques induits par le jeûne intermittent et/ou thérapeutique seraient cardioprotecteurs. Enfin, nous souhaitons déterminer s’il y a un effet du genre et comparer les mécanismes du jeûne intermittent et du jeûne thérapeutique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux caractériser les effets des jeûnes intermittent et thérapeutique sur la fonction cardiaque, le métabolisme énergétique et le remodelage du profil lipidique. Nous souhaitons savoir si ces méthodes sont cardioprotectrices envers un stress aigu (ischémie/reperfusion) et chronique (modèle de prédiabètes induit par le régime riche en graisse et en sucre). Enfin, nous évaluerons l’effet du genre de ces régimes.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents régimes décrits ci-après : régime normal pendant 6 mois ; régime normal pendant 3 mois puis nourris un jour sur deux pendant 3 mois ; - régime normal pendant 3 mois avec deux arrêts de la nourriture pendant 3 jours (à 4.5 et à 6 mois) ; régime riche en graisse et en sucre pendant 6 mois ; régime riche en graisse et en sucre pendant 3 mois puis nourris un jour sur deux avec le même régime pendant 3 mois ; régime riche en graisse et en sucre pendant 6 mois avec 2 arrêts de la nourriture pendant 3 jours à 4.5 et 6 mois. Tous les animaux seront soumis à trois tests de tolérance au glucose sur animaux vigiles. Celui-ci comprend une injection intrapéritonéale et 6 prélèvements de gouttes de sang dans la queue de l’animal (mesure de glycémie). Cette procédure sera répétée trois fois à 3, 6 et 9 mois. Tous les animaux seront soumis à trois examens d’imagerie IRM avec insertion d’un cathéter dans la veine caudale sous anesthésie générale. Cette procédure sera répétée trois fois à 3, 6 et 9 mois.

Impact sur les animaux

La procédure sur la mise en place des régimes peut entrainer un léger stress chez les animaux mais ne doit pas entrainer d'effet indésirable notable et a déjà fait l’objet de nombreuses publications au niveau international. L'eau quant à elle restera à disposition ad libitum. Le test de tolérance au glucose fait l’objet d’injection en intrapéritonéale et de ponctions répétées au bout de la queue de l’animal pour mesure de la glycémie pouvant générer un stress pour l’animal et un risque d’infection. Les animaux réagissent et cicatrisent bien, notre groupe a l’habitude de travailler avec ces mesures et fera le nécessaire pour surveiller tout évènement indésirable (stress, infection). Les anesthésies et les examens d’imagerie in vivo par IRM sont également des nuisances pour les animaux mais l’imagerie reste l’exploration la moins invasive de nos jours. Enfin, la pose d’un cathéter se fera sous anesthésie pou diminuer le stress de l’animal, cela peut augmenter la douleur après réveil ainsi que le risque d’infection que nous surveillerons quotidiennement.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure (après l'IRM à 9 mois) pour pouvoir prélever le cœur et réaliser des expériences ex vivo en cœur isolé afin de caractériser le métabolisme énergétique et le profil lipidique cardiaque par spectroscopie par résonance magnétique.

Remplacement

A l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode de substitution in vitro et in silico pour étudier l'effet des jeûnes intermittent et thérapeutique sur la physiologie et le métabolisme cardiaque. De plus, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider notre hypothèse de cardioprotection de ces régimes face à des stress aigu et chronique selon le sexe. De nombreuses similitudes existent entre la physiologie cardiaque des rongeurs, particulièrement celle du rat, et celle de l'homme. Les modèles pathologiques chez les rongeurs sont utilisés au laboratoire depuis de nombreuses années et toutes les techniques d'imagerie/ spectroscopie de résonance magnétique dans ce projet ont été caractérisées au sein même du laboratoire.

Réduction

Notre approche expérimentale permettra de réduire de façon drastique le nombre d'animaux en accord avec la règle des 3R. En effet, l'étude in vivo permettra de réaliser un suivi longitudinal de l’animal sans sacrifice et l'étude ex vivo sera réalisée sur le même animal. Le nombre d'animaux dans ce projet est le minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Nous souhaitons obtenir un effectif final de n=10 par groupe et nous envisageons 20% de perte de données (problème technique d’imagerie et de spectroscopie, problème de prélèvement du cœur pour l’expérience ex-vivo). Nous prévoyons donc 10 + 2 (20% de perte) = 12 rats par groupes. L’effectif de 10 animaux par groupe est déterminé à l’aide d’une analyse statistique (Statistica) prévoyant, pour un risque alpha de 5% et un risque béta de 10%, une amélioration de 25% de la fonction cardiaque dans nos modèles animaux pathologiques pour revenir à des valeurs physiologiques observées chez des animaux contrôles.

Raffinement

Les rats seront acclimatés pendant 14 jours avant le début de l'étude. La procédure sur la mise en place des régimes ne doit pas entrainer d'effets indésirables. Les durées et fréquences sont déterminées en fonction des données de la littérature (1 jour sur 2 pour le jeûne intermittent et 3 jours de jeûne thérapeutique). L'eau sera mise à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Tout au long des régimes et du projet, le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. Un animalier ou un chercheur contrôlera le bien-être des animaux tous les jours. Pour le test de tolérance au glucose et la mesure de l'insuline à jeun ou l'anesthésie ne peut pas être réalisée, une compresse d'eau chaude sera placée sur la queue de l'animal afin de faciliter le prélèvement de la goutte de sang le plus rapidement possible. Afin d'éviter toute infection, la queue de l'animal sera désinfectée avant et après la procédure avec de la Vétédine. Les jours suivants, nous vérifierons la bonne cicatrisation de la queue de l'animal. Pour la procédure d'IRM in vivo, les rats seront anesthésiés par un mélange d’isoflurane (Vetflurane 2%) et d’oxygène (1L/min) à l’aide d’une chambre d’induction et le bien-être animal sera assuré par le maintien des constantes vitales de l'animal. Durant les anesthésies, les yeux seront hydratés (Ocrygel) et la température maintenue à 37°C par couverture chauffante et monitoring par sonde rectale. Durant l'IRM, une injection d'adénosine (poudre chez Sigma Aldrich) à 0.33 mg/kg/min diluée en solution de chlorure de Sodiul à 0.9% à usage vétérinaire (B.Braun) sera réalisée via un cathéter disposé dans la veine caudale, le volume maximal est de 3 ml pendant 10 minutes maximun. La respiration et l'ECG seront surveillés pendant toute la durée de l'examen. Le comportement des animaux sera étroitement surveillé et une grille d'évaluation de la douleur sera remplie et le point limite déterminé en fonction des principes de Morton et Griffiths. Enfin, pour la procédure ex vivo sur le coeur isolé perfusé, nous réaliserons une euthanasie par injection d'euthasol (140mk/mg, IP) avant de prélever le cœur afin de ne pas faire souffrir l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de rat soumis à ces régimes a été choisi car des études des jeûnes ont été réalisé sur cette espèce. De plus, nous souhaitons comparer nos résultats de cardioprotection avec ce qui a déjà été fait dans le laboratoire dans un souci de respect des 3R. Nous souhaitons également tester la cardioprotection des jeûnes sur le modèle de rat nourri avec un régime HFS qui permet de développer un modèle de prédiabète reproduisant la même genèse que chez l’Homme et de suivre ces effets sur l’organisme, en particulier le coeur. Le modèle HFS a été récemment décrit par notre équipe pour induire un état prédiabétique. Les rates soumises à ce régime présentent une altération de l’homéostasie glucidique, une dysfonction cardiaque précoce des trois mois de régime, ainsi qu’une sensibilité plus importante aux lésions d’ischémie-reperfusion caractérisée par une altération du métabolisme énergétique et de la fonction cardiaques, par comparaison aux rates contrôles sous-alimentation normale.

2 vaches vont être utilisées, gardées vivantes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans la caillette, huit semaines de perfusions digestives continues de nutriments, puis l'obturation chirurgicale du cathéter, avec un suivi comportemental et des prises de sang pour mesurer le stress et l'inflammation. Le projet cherche à mettre au point une chirurgie moins invasive que la canule permanente du duodénum, présentée comme un raffinement au service d'études futures sur la digestion des ruminants. Le porteur affirme que les systèmes in vitro et in silico ne peuvent reproduire la répartition des nutriments entre organes et justifie le recours à l'espèce bovine.

Objectifs

Ce projet porte sur le développement d’alternatives à l’utilisation de ruminants fistulés avec des canules permanentes pour développer de futurs essais sur la digestion et le métabolisme avec des vaches opérées par des techniques chirurgicales moins invasives. Il répond ainsi aux principes de réduction du nombre de bovins canulés de façon permanente et de raffinement des approches chirurgicales (règles des 3R). L’élevage des bovins doit faire face à de nombreux enjeux, tels que limiter les impacts environnementaux et la compétition avec l’alimentation humaine. Pour cela, il est nécessaire de bien connaitre les processus de digestion afin d’optimiser l’apport de nutriments (azotés, minéraux, vitamines) à l’animal et les processus métaboliques qui permettent à l’animal à la fois d'utiliser ces nutriments pour les différentes fonctions (immunitaire, reproduction, la synthèse de viande et de lait) et limiter leurs rejets dans l’environnement (pollutions). Du fait de la digestion microbienne dans le rumen, pour établir les recommandations sur les nutriments absorbés dans l’intestin grêle, il faut pouvoir maitriser leurs apports, ce qui ne peut se faire que par des perfusions de ces nutriments dans un compartiment post-rumen (comme la caillette ou le duodénum). L'objectif de cette demande d’autorisation est donc de soumettre à l’évaluation, une procédure chirurgicale moins lourde que la pose de la canule permanente du duodénum en la remplaçant par la pose d’un cathéter dans la caillette de petit diamètre. La chirurgie se fera sous anesthésie et analgésie locale. Une vérification de l’adéquation de la prise en charge de la douleur à la pose et de la bonne récupération des animaux à l’issue de la pose et après l’obturation du cathéter sera effectuée par un suivi multiparamétrique (grilles comportementales et paramètres sanguins du stress et de l’inflammation). Une vérification de la fonctionnalité du système de perfusion des nutriments dans la caillette sur un temps comparable à un essai de perfusions de nutriments dans le duodénum sera également réalisée.

Bénéfices attendus

Le bénéfice majeur de ce projet est de pouvoir réduire le nombre de bovins canulés du tube digestif de façon permanente et de raffiner les procédures en permettant de développer une approche chirurgicale (règles des 3R) moins invasive (anesthésie et analgésie multimodales locales vs. anesthésie et analgésie générale). Le bénéfice scientifique de la mise au point d’une telle procédure est de poursuivre le travail sur l’amélioration des systèmes d’alimentation des ruminants visant à calculer au plus juste les apports alimentaires en terme de nutriments absorbés dans l’intestin et leur effet sur le métabolisme. Ces différentes études nécessitent la connaissance / la maitrise des apports par perfusions digestives des nutriments étudiés. Pour éviter les modifications (transformations, utilisations, synthèses) dues à la digestion microbienne dans le rumen, ces perfusions doivent être réalisées dans les compartiments digestifs se situant en aval du rumen (comme la caillette équivalent de l’estomac chez les monogastriques). En effet, les recommandations alimentaires actuelles en acides aminés, vitamines et minéraux sont incomplètes en termes de composés et de situation d’élevage. Il est important, dans une démarche de transformation agroécologique des systèmes d’élevage, de pouvoir préciser les besoins des ruminants, les apports réels dans la ration, la biodisponibilité pour l’animal et le statut de déficit (carence en calcium, insuffisances en vitamine, acides aminés limitants), ou d’excès (pollutions) correspondant. Ces aspects ne peuvent être évalués qu’au travers d’expérimentations visant le plus souvent à relier des apports maitrisés de ces différents composés aux réponses de leurs biomarqueurs sanguins chez les ruminants. Ainsi, des projets sur l’étude de l’effet de certaines vitamines, minéraux et acides aminés (méthionine) sur la fourniture d’antioxydants et la santé des ruminants laitiers dans un concept d'une seule Santé (nutrition de l’animal et santé de l'animal et de l’homme par les produits laitiers) sont en cours d’évaluations. De plus, des études seront menées pour maitriser l’apports de nutriments tels que les acides aminés et le phosphore pour établir leurs recommandations tout en limitant leurs impacts environnementaux (excès d’azote ou de phosphore, deux sources de pollutions). Ces études nécessiteront le recours à l’apport de nutriments pour l’intestin par perfusions digestives dans la caillette.

Procédures

Les 2 vaches subiront 3 étapes décrites ci-dessus : - Etape 1 : Pose d'un cathéter dans la caillette sous anesthésie locale et analgésie. Dans cette procédure qui dure 14 jours, l’animal aura une intervention chirurgicale et la douleur sera gérée grâce à des antalgiques adaptés, et grâce à un suivi multiparamétrique (grilles comportementales et prises de sang pour dosage d’hormone du stress). - Etape 2 : Perfusions digestives de nutriments sur deux vaches munies d'un cathéter dans la caillette. Ces perfusions seront réalisées en continue (24h/24) durant 4 séquences de 7 jours (soit 8 semaines, ce qui correspond aux temps de perfusions de nutriments dans le duodénum). Ces perfusions ne sont pas douloureuses, et sont réalisées sur animal vigile. - Etape 3 : Obturation du cathéter de la caillette placé en sous-cutané sous anesthésie locale. Dans cette procédure qui dure 14 jours, le suivi de la bonne cicatrisation se fera par une approche mutiparamétrique (grilles comportementales et prises de sang pour dosage d’hormone du stress).

Impact sur les animaux

La présence d'un cathéter de la caillette n'engendre pas de nuisance pour les animaux, une fois qu'ils ont récupéré de la chirurgie (sous anesthésie locale, anti-inflammatoire et analgésique de type dérivé morphinique). La contention physique pour la réalisation des prises de sang (via des cathéters à la jugulaire) sera brève et très légère (tenue de la tête avec un licol) par des personnes formées et habituées à ces manipulations. Ce stress sera de courte durée et sans douleur pour les animaux. Lors des essais de perfusions de nutriments il existe un petit risque de développement d'un point d'infection à la sortie du cathéter au niveau de la peau. Pour pallier à ce risque, une surveillance quotidienne de cette zone sera effectuée avec un nettoyage par des antiseptiques de la zone deux fois par semaine. En cas de début d'infection, notre vétérinaire sera consulté. Ce cathéter ne peut pas être retiré car il est cousu à la caillette mais il peut être raccourci (coupé au raz de la peau) et obturé par un nœud avant d'être placé en sous-cutané. Ceci permet une cicatrisation complète de la peau au niveau du point de sortie. Pour éviter toute nuisance au moment de l'obturation du cathéter et de son placement en sous cutanée, les animaux seront de nouveau placés sous anesthésie locale et un suivi multiparamétrique sera effectué sur les jours suivants. Une fois le point de sortie du cathéter cicatrisé, nos collègues n'ont constaté aucun développement d'infection sous cutanée. Cependant, la zone sous-cutanée où se trouve placé le cathéter fera l'objet d'une surveillance hebdomadaire des animaux tout au long de leurs vies (par exemple au moment de la traite ou de l’alimentation) pour vérifier l’absence de rejets.

Devenir

A chaque étape (pose d'un cathéter à la caillette, perfusions de nutriments et obturation du cathéter en sous-cutanée) l'animal est gardé en vie. Cette décision sera prise par le responsable de l'établissement utilisateur ou son délégataire.

Remplacement

Il s’agit de mettre au point de nouvelles approches chirurgicales moins invasives en remplacement de la pose de canules permanentes du duodénum, pour pouvoir étudier in vivo la digestion et le métabolisme des nutriments absorbés par l’animal et les réponses de l’animal à ces variations de flux de nutriments digérés. Les réponses multiples des animaux en termes de digestion et répartition des nutriments entre différentes fonctions comme la synthèse de lait par la mamelle (ex : exportation de calcium dans le lait), la reconstitution des réserves (ex : calcification osseuse) et les fonctions de santé ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants ; les cultures cellulaires de différents tissus ne miment en effet pas la répartition des nutriments qui s’opère entre différents organes et fonctions. Des systèmes ayant été mis en œuvre par le passé pour étudier des phénomènes d’absorption épithéliale (type cellules ou chambres de Ussing) nécessitent d’utiliser des fragments de paroi du tube digestif fraichement prélevés mais sont peu reproductibles et donc peu utilisables pour des comparaisons entre groupes d’individus recevant des alimentations contrastées, par exemple. Leur intérêt repose plutôt pour l’étude de mécanismes biologiques d’absorption ou de transfert trans-épithélial. Enfin, les systèmes in vitro d’étude des phénomènes de digestion intestinale (comme le TIM gastro-intestinal system proposé par le TNO) ne sont pas adaptés aux modèles ruminants dont l’étape de digestion et fermentation ruminale entraine une modification trop importante du bol alimentaire pour le mimer dans un système in vitro de ce type et les spécificités des phénomènes biologiques d’absorption (liés à l’espèce ou au type de composés d’intérêt dont certains nécessitent des protéines de transport membranaires ou intracellulaires) ne sont pas transposables à des systèmes de membranes non biologiques. Compte tenu de l’absence presque totale de données dans la littérature pour certains de composés d’intérêt (vitamines par exemple), une approche in silico est actuellement impossible.

Réduction

Notre stratégie d’expérimentation est de réduire au maximum le nombre d’animaux participant à ces tests méthodologiques de raffinement des procédures chirurgicales. Pour la procédure de pose de cathéters dans la caillette, il s’agit d’adapter une technique pratiquée couramment en médecine vétérinaire, l'omentopexie, qui consiste en la fixation de la caillette sur le flanc droit. L’introduction d’un cathéter dans la caillette est pratiquée par nos collègues Canadiens (Doepel et al., 2006) qui nous ont guidé dans le développement du mode opératoire. Nous souhaitons faire la demande pour seulement 2 chirurgies pour 2 vaches, sachant que 2 autres vaches ont déjà été utilisées pour réaliser la même procédure sur un autre site. Notre vétérinaire maitrise à la fois la technique d’omentopexie et celle de poses de cathéters. Ce nombre de deux animaux a été raisonné avec notre vétérinaire pour rester faible mais suffisant pour être capable de reproduire le geste. Ainsi 4 animaux auront (2 par sites) été utilisés pour mettre au point cette nouvelle méthodologie sachant que les essais futurs nécessitant ces techniques utiliseraient également 3 à 5 animaux.

Raffinement

Tout est mis en œuvre pour le raffinement des conditions d'hébergement qui seront réduites au maximum individuellement et les surfaces par animal respectent les normes en expérimentation. De plus, lors de la pose du cathéter à la caillette, et de son obturation, le protocole médicamenteux est adapté afin de s'assurer de la prise en charge de toute douleur lors de ces actes. Pour cela des antiinflammatoires ainsi que des antalgiques sont administrés sur 9 jours post opératoires pour permettre à l'animal de se remettre dans de bonnes conditions. Pour vérifier que son bien-être n'est pas impacté, des grilles comportementales seront mises en œuvre (au moment de la pose et de l'obturation du cathéter à la caillette) deux fois par jour de J-2, J-1, J0, J1, à J2, puis une fois par jour à J3, J6, J8, J10 et J13, ce qui permettra d'adapter si besoin le protocole de prise en charge de la douleur (analgésie et/ou anti-inflammatoire). Elles comportent des critères relatifs aux comportements (changements de comportements, postures antalgiques, etc.), des paramètres zootechniques (ingestion, etc.) et physiologiques (température rectale, fréquences cardiaque et respiratoire, etc.), et des critères liés à l’aspect des cicatrices. Des prises de sang sont réalisées en parallèle des grilles comportementales pour vérifier l'évolution d'une hormone indicatrice du stress (cortisol sanguin) et des protéines de l’inflammation (Haptoglobine et interleukines) pour vérifier si une douleur résiduelle existait malgré l’analgésie multimodale pratiquée.

Choix des espèces

Ces techniques permettront de continuer de travailler sur les recommandations alimentaires en nutriments et micronutriments des vaches dans un concept d’évolution agroécologique. En effet, il s’agit de réduire certains apports nutritionnels pour diminuer les rejets polluant pour l’environnement tout en maitrisant le volume et la qualité technologique du lait. Il s’agit aussi d’intégrer dans ces conditions le concept d’une seule santé pour l’animal et l’homme en apportant les nutriments nécessaires à une bonne santé de la vache, du veau, tout en améliorant la qualité nutritionnelle des laits pour l’homme (protéine idéale, calcium, vitamines, antioxydants, micronutriments etc.). Pour cela, des études de digestion et métabolisme de certains nutriments et métabolites spécifiques sur les vaches laitières sont requises pour diffuser des recommandations d’alimentation d’animaux adultes. Il faut donc travailler sur l'espèce bovine. Le troupeau est constitué de vaches Prim'Holstein, la race de vaches laitières la plus utilisée.

430 bovins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gardés en vie puis envoyés à l'abattage pour la vente commerciale des carcasses. Ils subissent un écornage, jusqu'à onze prises de sang, des prélèvements de fèces et deux biopsies de tissu adipeux, pour mesurer l'efficacité alimentaire et des marqueurs de qualité de la viande selon les régimes d'engraissement. Le porteur revendique un "besoin constant d'animaux" et présente le projet comme une source de références techniques pour la filière et sa valorisation économique. Il affirme que le recours aux bovins est "obligatoire" puisqu'ils sont l'espèce cible de l'élevage étudié.

Objectifs

L'agriculture est depuis toujours en constante évolution. Pour l'aider dans cette mutation la recherche agronomique a initié de nombreux programmes de recherche, auparavant orientée vers l'augmentation des performances et de l'amélioration de la productivité des espèces animales élevées et destinées à produire du lait et/ou de la viande. Aujourd'hui, elle s'orienterait plutôt à maintenir le niveau de production des animaux (ovins, bovins...) tout en prenant plus en compte les contraintes du milieu, les risques environnementaux (production des gaz à effet de serre, polution des sols...) ou attentes sociétales (bien être animal, qualité des produits, traçabilité de l'alimentation...). Pour répondre à une partie de ces enjeux, notre établissement utilisateur a un besoin constant d'animaux. Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants , les animaux modèles utilisés sont ici des bovins issus du troupeau allaitant.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à acquérir des références techniques sur les pratiques en élevage pour engraisser les bovins avec le maximum d’herbe et de fournir des repères sur la qualité des viandes ainsi produites. Ces pratiques seront mises en perspective avec les coûts de production et d’opportunité que leur application engendre. Il s’agira aussi d’identifier au sein de la filière des solutions pour mieux valoriser la qualité des viandes issues d’une finition maximisant l’herbe et porteuses d’une meilleure répartition de la valeur ajoutée.

Procédures

Ecornage : 1 fois /animal en début d'expérimentation et d'une durée de quelques minutes (100 animaux max). Prises de sang : 4 fois /animal durant l'expérimentation (180 animaux) et 11 fois/animal durant l'expérimentation (250 animaux) (intervalle entre chaque prélèvement minimum une semaine) et d'une durée de moins d'une minute à chaque fois. Prélèvement de féces : 2 fois /animal en début et milieu d'expérimentation (180 animaux) et 6 fois/animal (250 animaux) et d'une durée de moins d'une minute à chaque fois. Biopsie de tissu adipeux : 2 fois /animal (430 animaux max) en début et milieu d'expérimentation et d'une durée d'une dizaine minutes à chaque fois. Digestibilité : 1 fois /animal en milieu d'expérimentation et de maximum 13 jours (80 animaux).

Impact sur les animaux

Faible risque de troubles digestifs (acidose). Risques modérés liés à la manipulation des animaux lors des interventions (accident de pesée etc..)

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issue de toutes les procédures mais seront destinés à l'abattage pour vente commerciale des carcasses à la fin des expérimentations.

Remplacement

Le contexte du projet est l'élevage de ruminants où l'animal est, par conséquent, au centre des préoccupations. Le projet a pour objectif la recherche d’indicateurs peu on non invasifs capables de traduire la variabilité observée chez l’animal en croissance/engraissement. De fait avoir recours à des bovins (animal cible) est obligatoire.

Réduction

Les procédures pour réduire le nombre d'animaux seront mises en oeuvre dès que possible et serviront à limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés et la sévérité des procédures appliquées. Dans certains cas une approche en carré latin pourra être utilisée (dans ce cas l'animal est son propre témoin et soumis aux différents régimes alimentaires expérimentaux) pour réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour raffiner les procédures expérimentales, les conditions d'hébergement et l'utilisation des animaux par exemple en limitant la durée d'hébergement en stalles de digestibilité, en ayant des temps de repos suffisant entre procédures pour les animaux. De plus les animaux seront suivis quotidiennement pour s'assurer de la bonne santé des animaux.

Choix des espèces

Le contexte du projet est la prédiction de l’efficience et de la qualité des carcasses en fonction des régimes alimentaires en phase d'engraissement, d’où l’intérêt à travailler avec des bovins en croissance/engraissement.

14 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés ensuite pour un autre projet ou placés. Ils reçoivent un probiotique dans leur alimentation pendant 31 jours, avec trois prises de sang sous sédation et des séjours en cage à métabolisme jusqu'à seize heures pour recueillir les fèces. Le porteur évalue l'effet de ce complément, "FlorEquilibre", sur la digestibilité et la flore intestinale. Il affirme que l'effet sur le microbiote peut difficilement être reproduit hors de l'animal.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'effet, chez le chat, de la distribution dans l'alimentation d'un probiotique, FlorEquilibre, sur la digestibilité et la flore intestinale. Les paramètres mesurés pour évaluer l'efficacité du probiotique seront la consistance et les analyses chimiques et microbiologiques des fèces, les paramètres hématologiques et biochimiques, la digestibilité, la prise alimentaire et le poids corporel.

Bénéfices attendus

Chez le chat, la flore intestinale peut être perturbée: - lors du sevrage, de la croissance, - lors de changements d'environnement comme l'arrivée dans un nouveau foyer ou un séjour en chatterie, - lors de situations potentiellement stressantes comme un voyage, l'arrivée d'autres animaux dans le foyer, une hospitalisation, - lors d'une vaccination ou de prises de médicaments comme des antibiotiques, - lors d'un changement d'alimentation ou de l'ingestion d'aliments inhabituels par exemple pour les chats qui ingèrent différentes proies. Les animaux âgés, et certaines races prédisposées comme le Sphinx ou le Bengal, ont également une plus grande sensibilité digestive. L'administration de probiotiques présente alors un avantage pour rééquilibrer la flore intestinale et aider l'animal à mieux surmonter ces perturbations.

Procédures

1. Alimentation individuelle pendant toute la durée de l'étude, 1 fois par jour (environ 10 minutes après habituation), 2. Traitement avec un complément alimentaire pour un des groupes, 1 fois par jour pendant 31 jours avec l'alimentation (environ 10 minutes), 3. Examen clinique effectué par un vétérinaire, 1 fois par période x 3 périodes (avant traitement, pendant traitement et post-traitement) (environ 15 minutes), 4. Pesée une fois par semaine (environ 5 minutes), 4. Prélèvement de fèces en cage à métabolisme, 24h maximum x 17 jours (pour la plupart des chats, les fèces seront émises entre 16h la veille et 8h le matin du jour de prélèvement soit 16h en cage à métabolisme), 5. Prélèvements de sang, 1 fois par période x 3 périodes (environ 1 minute).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont: douleur et stress suite aux trois prises de sang (même si le stress sera réduit par une sédation préalable), placement en cage à métabolisme pour le prélèvement de fécès. Les effets indésirables qui pourraient survenir sont des troubles digestifs liés au traitement probiotique même si la formulation est déjà disponible sur le marché et administré à la dose recommandée.

Devenir

Les animaux auront subi une procédure modérée avec un très faible risque d'effet indésirable. Sauf avis contraire du vétérinaire référent de l'Etablissement Utilisateur, les animaux pourront être réutilisés pour un autre projet. Cependant, s'il s'avère qu'un animal a du mal à se laisser manipuler et/ou n'est pas très à l'aise dans un environnement avec plusieurs autres congénères, il pourra être placé.

Remplacement

Il est nécessaire pour déterminer l'efficacité d'un probiotique de déterminer son effet sur le microbiote intestinal, un mélange complexe de micro-organismes qui peut difficilement être reproduit en totalité in vitro. De plus, les interactions avec l'organisme, la matrice alimentaire lors de l'administration conjointe à l'aliment, la variabilité interindividuelle, ne pourraient pas être prises en compte. Enfin, pour des contraintes réglementaires, il est impératif de mener trois études indépendantes sur l'espèce cible. Il n'est donc pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En revanche, vu que le probiotique est déjà mis sur le marché, il y a peu de risques d'effets indésirables avec un tel traitement.

Réduction

Le nombre de groupes, soit un sans traitement et un traité avec la dose recommandée, est défni par la guideline de l'EFSA (European Food Safety Authority) "Guidance on the assessment of the efficacy of feed additives". Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé lors des deux essais précédents. Ce nombre de 7 animaux par groupe ne peut donc pas être modifié, les trois essais devant obligatoirement être les mêmes. Cependant, compte-tenu de la procédure effectuée sur ces chats et de l'absence d'effets indésirables du traitement, ces chats pourront ensuite être soit réutilisés pour une procédure légère ou modérée, soit proposés à l'adoption à la fin du projet.

Raffinement

Bien que les prélèvements de fèces soitent réalisés en cage à métabolisme, les cages seront aménagées pour réduire au maximum l'inconfort de l'animal : grille des cages recouverte de tapis caoutchouc et de VetBed, litière pour la récolte des fèces nettoyée immédiatement, jouets et brosses dans la cage, possibilité de sortir chaque chat sous surveillance pour qu'il puisse intéragir avec les manipulateurs et d'autres chats. Les chats seront également habitués aux cages à métabolisme pendant la période de pré-traitement. De plus, si un chat n’a pas fait de fèces le matin, il pourra être sorti des cages à métabolisme après le repas et isolé dans une des parties de la volière commune où ils sont hébergés habituellement jusqu’à récupération des fèces. Pendant toute la durée du projet, les chats seront suivis quotidiennement par un vétérinaire. La douleur et le stress qui pourraient être engendrés par les prises de sang seront attenuées par une sédation préalable. Même si le traitement est administré à la dose recommandée, des effets indésirables liés au traitement probiotique pourraient survenir. Cela devrait être essentiellement des troubles digestifs transitoires. Si les troubles persistent plus de trois jours, l'animal sera exclu de l'étude et des soins adaptés seront mis en place le cas échéant par le vétérinaire en charge du suivi quotidien des animaux.

Choix des espèces

L'espèce choisie est l'espèce cible pour laquelle le probiotique est mis sur le marché Les animaux seront des chats adultes âgés de 1 à 7 ans, comme dans les deux essais précédents. La guideline de l'EFSA "Guidance on the assessment of the efficacy of feed additives" recommande en effet que les animaux utilisés pour les essais soient des animaux en bonne santé et appartenant à un groupe homogène. D'où le choix d'écarter les animaux trop jeunes (en croissance avec un microbiote non mature, non stérilisés) et trop âgés (risque de problèmes de santé accrus).

144 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit trois prises de sang sous contention manuelle, décrite comme stressante, autour du sevrage à quatre semaines, pour tester un aliment enrichi en acides aminés encapsulés censé agir sur le microbiote digestif. 36 porcs sont tués dix jours après le sevrage pour prélever leurs tissus digestifs, les 108 autres partant à l'abattoir pour la consommation humaine une fois le poids d'abattage atteint. Le porteur situe le bénéfice attendu du côté de la réduction des antibiotiques en élevage et affirme que la réponse ne peut se mesurer que sur un animal vivant.

Objectifs

Le développement de solutions nutritionnelles a depuis de nombreuses années mobilisé les acteurs de l’alimentation animale et de la recherche pour accompagner la réduction de l'utilisation des antibiotiques lors du sevrage des porcelets. Parmi ces solutions nutritionnelles, celles ciblant le microbiote digestif et la production de métabolites bactériens d’intérêt peuvent aider à renforcer la santé digestive lors du sevrage. Les acides aminés sont des nutriments essentiels à la croissance et à la santé des porcs. Ce sont aussi des nutriments pour les microorganismes présents dans le tube digestif. La fermentation de certains acides aminés par les micro-organismes produit des métabolites exerçant des propriétés antiinflammatoires, trophiques, anti-oxydantes, etc. sur la muqueuse digestive. L’objectif général de ce projet est d’évaluer l’intérêt d’apporter dans l’alimentation du porc des acides aminés encapsulés dans une structure lipidique (particules) pour ne pas être absorbés par l’intestin grêle et être disponibles pour produire, par fermentation, des métabolites dans le gros intestin. Des effets positifs de ces métabolites sur la physiologie et les défenses intestinales et in fine sur la santé du porcelet au sevrage sont attendus.

Bénéfices attendus

Outre d’être des nutriments pour l’animal, les acides aminés sont aussi des nutriments pour le microbiote digestif. Il est attendu que les acides aminés testés arriveront dans le gros intestin pour y être utilisés par la flore digestive et ne seront pas ou peu absorbés par l'intestin grêle. Il est également attendu que ces acides aminés vont modifier la composition du microbiote et leur fermentation par ce microbiote pour produire des métabolites bactériens qui peuvent exercer des effets bénéfiques sur la physiologie intestinale et ainsi préserver la santé des porcelets au cours du sevrage. Nos résultats permettraient d'accompagner les efforts importants des éleveurs de porcs en termes de réduction de l'utilisation des antibiotiques lors de cette période critique de l'élevage des porcs charcutiers.

Procédures

Trois prises de sang seront effectuées sur les porcelets avant le sevrage, 10 jours puis 4 semaines après le sevrage en utilisant du matériel stérile à usage unique. A chaque fois 8 ml de sang seront prélevés par du personnel expérimenté.

Impact sur les animaux

Ce projet a pour finalité de tester une solution nutritionnelle visant à atténuer les effets du sevrage des porcelets tel qu'il est effectué en élevage commercial de porc: les porcelets sont sevrés à un jeune âge (4 semaines) , un âge où les porcelets sont encore immatures du point de vue immunitaires et digestifs et sont donc particulièrement susceptibles aux troubles digestifs se traduisant par des diarrhées. Trois prises de sang seront réalisées en assurant la contention des porcs manuellement. Cette contention est une action stressante pour les porcs.

Devenir

Les 108 porcs laissés en vie sont destinés à la consommation humaine. A l'issue de la procédure ils seront élevés jusqu'au poids d'abattage, abattus dans un abattoir commercial avant de rejoindre la chaine alimentaire. Les 36 porcs de la procédure 2 seront euthanasiés 10 jours après le sevrage pour réaliser des prélèvements de tissus et de contenus digestifs nécessaires aux mesures prévues par le protocole.

Remplacement

L'objectif de ce projet est d'évaluer in vivo l'intérêt d'utiliser des acides aminés encapsulés pour modifier le microbiote du porcelet après le sevrage. Le projet fait suite à des projets réalisés sur des modèles in vitro afin de sélectionner les acides aminés qui seront testés et leur comportement dans des systèmes digestifs artificiels. Il constitue une première étape permettant de confirmer sur animal vivant la modification du microbiote dans les parties basses de l'intestin (gros intestin). La finalité étant la préservation de la santé et la croissance des porcelets au cours de la période critique du sevrage, notre projet a aussi pour objectif d'évaluer un ensemble de réponses mesurables uniquement sur un animal vivant comme le poids, des concentrations sanguines d'indicateurs de la santé et la prévalence des diarrhées.

Réduction

3 lots de 48 porcs (144 au total) seront impliqués dans ce projet. 108 de ces animaux permettront d'évaluer l'effet des traitements expérimentaux sur la vitesse de croissance et l'évolution d'indicateurs sanguins de la réponse au sevrage (inflammation, statut oxydant, intégrité digestive). De précédentes expériences ont montré qu'entre 20 et 40 porcelets étaient suffisants pour mettre en évidence un effet de l'alimentation sur la croissance et les indicateurs sanguins mesurés en postsevrage. L'effectif utilisé ici est dans la fourchette haute car nous nous attendons à des effets très faibles des acides aminés encapsulés sur la croissance dans la mesure où l'aliment témoin non supplémenté est formulé pour couvrir les besoins les porcs. 36 porcs (3 x 12) seront abattus dix jours après le sevrage pour collecter les contenus et tissus digestifs. La littérature montre des effets de supplémentations nutritionnelles avec des effectifs très variable. Dans nos conditions expérimentales, un effectif de 12 est un optimum pour prendre en compte l'influence de facteurs autres que le lot expérimental (mère, sexe).

Raffinement

Les animaux seront suivis et les actes expérimentaux réalisés par du personnel expérimenté en restectant des points limites pour chaque procédure. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter et corriger, si cela n’interfère pas avec le protocole expérimental, les problèmes de santé par des mesures adéquates (prise en charge médicale et exclusion du protocole ou bien euthanasie). Les prises de sang sont réalisées avec une contention manuelle et du matériel vétérinaire à usage unique conformément aux bonnes pratiques.

Choix des espèces

Ce projet est réalisé sur le porc qui est l'espèce cible du projet. Le projet vise à apporter des éléments scientifiques sur le mode d'action des acides aminés médié par le microbiote. Une finalité est d'utiliser ces connaissances en élevage de porc pour accompagner la réduction déjà très conséquente de l'utilisation des antibiotiques au moment du sevrage des porcelets, l'additif étant supposé limiter le risque de dysbiose favorisant les troubles digestifs et diarrhées infectieuses. Les porcs seront impliqués dans ce projet pendant une période qui correspond à la période dite de postsevrage débutant à l'âge moyen de 4 semaines, âge où les porcelets sont séparés de leur mère, jusqu'à l'âge de 10 semaines. Cette pratique est conforme aux pratiques dans les élevages de porcs.

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle pharmacologique d'épilepsie infantile, elles subissent une chirurgie de 45 minutes pour implanter des électrodes d'électroencéphalogramme, restent isolées en cage individuelle et donnent des prélèvements de sang. Le projet teste si le jeûne intermittent réduit les crises et permet de baisser les doses de médicaments antiépileptiques. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative aux animaux pour évaluer un modèle épileptique.

Objectifs

Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime riche en protéine et gras, et faible en sucres, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 1 modèle pharmacologique d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Ce modèle présente des crises dites "absence atypiques", retrouvées chez des pathologies infantiles graves telle que le syndrome de Dravet ou Lennox-Gastaut. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique, en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications qui accompagnent le régime IF.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.

Procédures

Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que deux prélèvements sanguins. L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement. Les animaux implantés avec des connecteurs pour enregistrement EEG courent le risque de se les arracher mutuellement. Ils sont donc isolés en cage individuelles pour la durée du protocole et seront surveillé deux fois par jour. Ils auront un enrichissement spécifique (sizzle, nid en carton, coton), ils seront en contact visuel et olfactif avec les congénères et seront manipulés régulièrement.

Impact sur les animaux

Le régime du jêune intermittent ou intermittent fasting (IF) a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que le modèle d'épilepsie que nous utilisons n'induit pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui induisent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant , dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.

Remplacement

Il n'existe d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.

Réduction

Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).

Raffinement

Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille de carton, igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques afin d'intervenir si besoin.

Choix des espèces

L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur le modèle d'épilepsie utilisé.

1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire des épilepsies-absence, elles subissent la pose chirurgicale d'un implant crânien d'enregistrement (EEG) de 45 minutes et des prélèvements sanguins, pour tester si un jeûne intermittent réduit les crises. Le porteur indique que ces crises ne sont ni douloureuses ni convulsives et classe la procédure en modéré à cause de la chirurgie et des prélèvements. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal pour évaluer un modèle épileptique.

Objectifs

Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime cétogène riche en protéines et gras, et faible en carbohydrates, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 2 modèles d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique (ex. ethosuximide, valproate), en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications métaboliques, physiologiques et transcriptomiques qui accompagnent le régime IF.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.

Procédures

Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que des prélèvements sanguins à un mois minimum d'interval (voir chronogramme en annexe). L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement.

Impact sur les animaux

Le régime IF a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que les modèles d'épilepsie que nous utilisons n'induisent pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui provoquent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant EEG, dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.

Remplacement

Il n'existe pas d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.

Réduction

Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).

Raffinement

Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.

Choix des espèces

L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Nous utilisons les animaux à partir de 6 semaines car c'est l'âge à laquelle les crises d'absence commencent à se manifester. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur nos modèles génétiquement modifiés.