Alimentation animale

14 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis rejoindront le troupeau de l'élevage. Leur régime est modifié pour provoquer une sub-acidose du rumen, un inconfort digestif, pendant que des prélèvements par sondage gastro-oesophagien sont réalisés quatre fois et qu'un bolus de mesure du pH est posé dans le rumen. L'objectif déclaré est de tester si l'analyse de l'air exhalé peut détecter ce trouble digestif sur le terrain. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit ce désordre et qu'il est "indispensable" de recourir aux bovins.

Objectifs

L'objectif principal du projet est faire la preuve de concept qu’une analyse volatolomique de l’air exhalé par le ruminant peut être un indicateur non-invasif de santé du rumen en discriminant deux situations alimentaires contrastées en termes de densité énergétique : une ration basée sur des fourrages représentant une alimentation non intensive Vs une ration basée sur des céréales caractéristique d’une alimentation intensive. L'objectif secondaire est d'identifier parmi d’autres matrices non invasives, et plus simples à prélever que l’air exhalé, la ou les combinaisons de matrices qui permettent de discriminer simplement sur le terrain l’état de santé digestive des animaux soumis aux situations nutritionnelles précitées. Les quatre autres matrices envisagées en complément de l’air exhalé sont : fèces, urine, lait, poils (contenant de la sueur).

Bénéfices attendus

Description de nouveaux indicateurs non invasifs et rapidement utilisables sur le terrain pour évaluer le bon fonctionnement du rumen sur le terrain. Il est attendu de faire la preuve de concept que la mesure du volatolome grâce à un appareil portable peut etre développée sur le terrain pour evaluer le bon fonctionnement du rumen d'animaux laitiers.

Procédures

Les animaux seront soumis à une modification de régime alimentaire susceptible d'entraîner l'apparition d'un inconfort digestif et une diminution possible des performances zootechniques. L'objectif du projet étant de monitorer les modifications du volatolome de différentes matrices en lien avec les paramètres fermentaires du rumen. Les prélèvements par sondage gastro-oesophagien seront réalisés 4 fois par animal sur la période expérimentale de 10 semaines. La pose des bolus ruminaux de suivi du pH interviendra dès le premier jour de l'expérimentation. Enfin, nous réaliserons des prélèvements de poils (sueur), d'air exhalé, d'urine et de fèces 4 fois sur l'ensemble de la période expérimentale.

Impact sur les animaux

La sub-acidose est un désordre digestif fréquent chez les bovins en production laitière, entraînant un baisse du pH ruminal.

Devenir

Les procédures étant classées "légères", il n'est attendu aucune gêne, stress ou souffrance résiduelle chez l'animal à la fin de l'expérimentation. Les animaux pourront donc rejoindre le reste du troupeau de l'établissement utilisateur et retrouver les conditions de logement, d'alimentation et de vie classique du troupeau laitier.

Remplacement

La sub-acidose est un désordre digestif fréquent chez les bovins en production laitière. Aucun modèle in vitro / in silico n’est actuellement disponible permettant de reproduire de façon fiable et précise ce désordre. L’évaluation de solutions de détection de ce désordre dans le volatolome doit se faire chez l’animal.

Réduction

Le nombre d'animaux recrutés (14 vaches laitières), d'après notre expérience concernant la variabilité individuelle des paramètres fermentaires du rumen, est le minimum pour obtenir des résultats statistiques fiables. Cet effectif a été validé par la réalisation d'un test de puissance. Les données zootechnique (production et composition du lait, ingestion, NEC, poids vif, etc…) seront analysées à l’aide de modèles mixtes avec mesures répétées. Les données volatolomique seront analysées selon des analyses déjà reportées pour d'autres bases de données métabolomiques : analyses multivariées et univariés seront utilisées pour étudier l’effet du régime alimentaire au cours du temps . Les analyses multivariées permettront en particulier d’explorer les composés organiques volatiles comme biomarqueurs candidats du régime alimentaire et du fonctionnement ruminal.

Raffinement

Les conditions de logement des animaux en stabulation libre répond aux exigences réglementaires et va même au-delà grâce à des équipements pemettant un confort optimum des vaches (matelas, brosses) et un suivi fin de leur santé et de leur bien-être (outils d'élevage de précision). Le recours a des procédures faiblement invasives, mises en oeuvre par du personnel formé et habitué à ces prélèvements, assure que ceux-ci se feront dans les meilleures conditions possibles pour les animaux. Cet essai a également pour but d'évaluer l'intérêt de la mesure de paramètres non invasifs qui pourraient être considérés comme marqueurs de la sub acidose. De ce point de vue le projet est également respectueux de la règle des 3R puisque la mesure d'indicateurs non invasifs pourrait à terme remplacer les mesures susceptibles d'altérer le bien-être de l'animal.

Choix des espèces

Les troubles digestifs chez la vache laitière, tels que la sub-acidose ruminale, sont des désordres courants avec des répercussions économiques importantes en élevage (perte de production, frais vétérinaires...). Le recours à des bovins est indispensable pour étudier le volatolome des différentes matrices susceptibles d'être utilisées pour la détection précoce de ce type de troubles. La sub-acidose n’est pas une pathologie mais un désordre digestif fréquent chez les bovins, laitiers notamment, en production. Nous aurons donc recours à des vaches laitières en lactation.

56 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Soumis pendant trois mois à un régime obésogène, ils reçoivent un gavage quotidien, quatre prélèvements sanguins sous anesthésie, des tests de tolérance au glucose et le test du labyrinthe en croix surélevé, pour mesurer les effets d'un extrait végétal sur le poids et le comportement. Le porteur présente cette étude comme une étape avant de passer à l'espèce cible, le chien, et affirme que le rat permet d'analyser des organes non prélevables chez le chien. Sur le remplacement, il conclut à l'absence de méthodes in silico et in vitro capables de répondre aux questions posées.

Objectifs

Les plantes fournissent un ensemble important de composés bioactifs qui forment la base de nombreux produits thérapeutiques. Parmi ces plantes, une est traditionnellement utilisée pour ses propriétés sédatives, anti-spasmodiques et anti-inflammatoires et son extrait sera utilisé pour notre étude. L'objectif est d'étudier les effets de la supplémentation en extrait végétal standardisé sur la prise de poids et le comportement chez le rat. Les résultats obtenus nous permettront d'appronfondir ceux réalisés chez le modèle cible, le chien qui ont été menés il y a quelques mois. Notre hypothèse est que la supplémentation en extrait botanique standardisé de la plante étudiée mettrait en jeu des mécanismes multiples (anti-inflammatoire, métabolique, antioxydante, augmentation de la diversité microbienne, réduction du comportement hyperphagique, action calmante) grâce à l'action combinée de ses composants bioactifs dont l'action serait supérieure à celle exercée par le traceur actif seul. Notre premier objectif est d'étudier les effets de notre extrait et de son traceur sur le profil métabolique des rats soumis à un régime obésogène (hyperlipidique/hyperglucidique) par leur suivi clinique et biologique (analyse du microbiote intesinal, des paramètres biochimiques comme les cytokines ou encore métaboliques comme le taux de cholestérol ou de lipides sériques). Notre second objectif sera d'analyser l'effet sédatif de notre extrait végétal standardisé en comparaison à son traceur actif en utilisant le test du labyrinthe en croix surélevé et en dosant un neurotransmetteur dont le rôle principal consiste en une régulation dite « inhibitrice » de l'activité cérébrale, l'acide gamma-aminobutyrique (GABA).

Bénéfices attendus

Les protocoles mis en oeuvre dans le cadre de ce projet devraient permettre de déterminer si l’extrait végétal standardisé testé (comparativement à son traceur) est apte à prévenir l’inflammation et les perturbations métaboliques associées à l'obésité. Notre hypothèse principale est que l’action synergique des composants majeurs (acides phénoliques, flavonoïdes, anthocyanes) de l’extrait végétal standardisé étudié

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions. Pendant 3 mois, 48 rats suivront un régime obésogène (hyperlipidique/hyperlipidique) et la totalité des rats (soit 56 rats) auront 4 prélèvements sanguins sur une période de 3 mois ( à 0, 4, 8 et 12 semaines) d'une durée de 20 min environ par rat ( anesthésie (10 min) + prélèvement sanguin (5 min) + réveil (5 min)) ; 4 tests de 5 minutes dans un labyrinthe en croix surélevé ( à 0, 4, 8 et 12 semaines); 3 tests de tolérance au glucose d'une durée de 2h (prélèvements d'une goutte de sang d'une durée d'1 min à différents temps (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes); à 0, 6 et 12 semaines); des recueils de selles d'une durée de 10 minutes environ (4 fois, à 0, 4, 8 et 12 semaines) ; et seront gavés oralement quotidiennement pendant 3 mois (chaque gavage durera environ 2 à 5 minutes), puis seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

L'exposition des rats au régime obésogène peut induire des troubles métaboliques, les traitements du projet viseront à les prévenir/réduire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Le remplacement des rats n’est pas possible pour répondre aux questions du projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in-silico et in-vitro). Les rats sont utilisés afin de valider les effets de l'extrait végétal étudié avant de passer sur l'espèce cible : le chien ; pour limiter le nombre d'expérimentations sur celui-ci. L'utilisation du rat nous permet aussi d'étudier des organes, non prélevables chez le chien.

Réduction

Nous utilisons 8 rats par groupes afin d'avoir un nombre suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents et anticiper les différences interindividuelles pour répondre aux objectifs de l'étude. Le nombre de prélèvement étant répété sur chaque rat, cela permet de réduire leur nombre au minimum et d'avoir des données suffisantes pour répondre aux questions posées par une utilisation optimisée de ces dernières sur chaque animal.

Raffinement

L'exposition des rats au régime hyperlipidique/hyperglucidique peut induire des troubles métaboliques, les traitements du projet viseront à les prévenir/réduire. L'hébergement respecte les recommandations en vigueur chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (mise à disposition de carrés de coton, des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). Un suivi régulier des animaux est assuré par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). Les protocoles expérimentaux sont optimisés pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus. Nous utilisons des points limites adaptés et des critères d'arrêt de souffrance détaillés à chaque procédure.

Choix des espèces

Les rats sont acclimatés à l'âge de 6 semaines avant de commencer l'étude à 8 semaines (cycle de 12h jour/nuit). Cela permet d'éviter des résultats faussés par le stress induit lors du changement d'environnement. L'exposition des rats Wistar à un régime obésogène (hyperlipidique/hyperglucidique) permettra d'étudier la capacité de l'extrait végétal standardisé testé à prévenir le développement de troubles métaboliques associés à l'obésité. Les effets de cet extrait végétal ne peuvent être étudiés de manière pertinente sur des modèles in silico et in vitro. Nous utilisons le rat afin de compléter notre étude faite sur l'espèce cible (chien) et ainsi valider les effets de notre extrait végétal standardisé sur le comportement du rat tout en poussant les analyses sur des organes spécifiques (comme l'étude de la réactivité intestinale qui requiert l'analyse de l'intestin en chambre d'organes isolés ou encore le dosage d'un neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central, non prélevables chez le chien.

6 vaches laitières vont être utilisées, gardées vivantes et réutilisées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent six prélèvements de fèces, de lait, d'urine et de sang au cours de l'essai, pour tester l'effet d'une levure vivante ajoutée à une ration pauvre en protéines sur la production laitière et les émissions de méthane. Le porteur met en avant un "gain économique" et une réduction de l'empreinte environnementale. Il justifie un effectif de deux vaches par groupe par un plan expérimental croisé où chaque animal est son propre témoin.

Objectifs

L'objectif de ce travail est d’étudier l’effet de la supplémentation de la levure vivante Actisaf sur les performances de production laitière, la physiologie (digestibilité, métabolisme azoté, fermentations ruminales), la prédiction des émissions de méthane par les acides gras du lait chez la vache laitière

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont multiples : 1) tester l’effet de levure vivante sur les performances zootechniques, 2) comprendre si la levure vivante ajoutée dans une ration pauvre en protéines permet les même performances qu’une ration riche et par conséquent assurer un gain économique en réduisant l’empreinte environnementale, 3) comprendre l’effet de la levure vivante sur le métabolisme, fermentation ruminales et statut immunitaire avec des rations contrastées

Procédures

Prélèvements de fèces, de lait, d'urine et de sang à raison de 6 prélèvements par vache sur la totalité de l'essai

Impact sur les animaux

Même si toutes les précautions seront prises durant l’essai pour atténuer les effets indésirables sur les vaches, il se peut que les animaux soient dans un état d’inconfort lors de leurs contentions pour des prélèvements de sang par exemple.

Devenir

Les animaux sont gardés en vie à l'issue de chaque procédure. Durant la procédure expérimentale, il n’y aura pas d’intervention qui nécessite l’arrêt de l’utilisation des vaches après la fin de l’essai. Les vaches continueront à être hébergées dans les même conditions (bâtiment, aliment, soin), surveillées par des personnes dédiés (chercheurs et techniciens) et aussi par des vétérinaires si besoin. Les prélèvements durant l’essai n’engendrent pas une dégradation de l’état général des animaux, ni leur bien-être. Notre procédure est de classe légère et par conséquent permet la réutilisation des animaux après la fin de l’essai.

Remplacement

La digestibilité varie selon les rations et aussi d’un animal à un autre ayant même potentiel de production. Sa mesure nécessite l’utilisation des animaux dans des cages métaboliques pour obtenir des résultats pertinents. Néanmoins, elle peut aussi être prédite par des équations issues de la bibliographie, mais cette estimation nécessite une importante quantité de données pour valider la robustesse du modèle. Dans le cas présent, nous utiliserons la méthode de prélèvement ponctuel de fecès ainsi que la méthode indirecte de mesure de digestibilité (iNDF) in vitro avec incubation des échantillons fécaux et d’aliment. Poiur cette procédure, nous ne pouvons remplacer complètement l'animal mais on substituons une partie du protocole in vivo en in vitro.

Réduction

Nous utilisons un plan expérimental en carré latin qui nous permet de réduire le nombre d’animaux à utiliser dans notre projet. Le nombre d’animaux a été déterminé en utilisant un logiciel statistique et en se basant sur les données bibliographiques. L’essai sera mené en un design expérimental en cross-over. Ainsi, toutes les vaches reçoivent les 3 traitements successivement. L’avantage de l’essai croisé est d’être, à effet identique, plus puissant que l’essai en parallèle. La prise du sujet comme son propre témoin diminue la variabilité de la mesure de l’effet traitement. L’évaluation de l’écart type faite dans le calcul du nombre d’animaux nécessaire (n) tient compte de ce principe. Pour l’étude de performances, d'après le calcul d’effectifs et compte-tenu de la variance connue à ce jour, animaux par groupe permettent de détecter une différence significative (critère continu gaussien) avec un risque de 1ere espèce (faux positifs) de 5% et un risque de 2eme espèce (faux négatifs) de 20% en ce qui concerne les paramètres zootechniques principalement ciblés pendant cette étude. Nous avons donc choisi d’évaluer 2 vaches par groupe Cet effectif est en accord avec les études récentes portant sur les performances zootechiques des vaches ayant reçu des levures vivantes soit en modifiant la teneur en azote dégradables, la teneur en amidon ou la dose.

Raffinement

Pour le raffinement du protocole, nous nous sommes contraints à réduire le nombre d’échantillons à prélever et par conséquent réduire le nombre de manipulation sur les animaux qui pourrait engendrer du stress. Les prélèvements d’échantillons de fèces et d’urine se feront au même moment pour réduire au maximum la manipulation et contention des animaux. Les animaux seront surveillés en permanence pour contrôler leur comportement et chaque risque de souffrance ou de détresse. Des critères physiologiques comme la production laitière, l’état de la mamelle, l’ingestion, le poids et la note d’état corporel serviront comme critères de prise de décision. Des critères d’évaluation allant de 0 à 3 pour chaque critère seront établis avec 0 (état normal) et 3 (changement très important par rapport à la normale). Dans le cas d’un changement important, le recours à l’avis d’un vétérinaire sera pris en compte.

Choix des espèces

La vache est considérée comme une productrice de gaz à effet de serre et donc un modèle pertinent pour notre étude. De plus, à nos connaissances, il n’y a pas d’étude sur les effets de l’ajout de levures vivantes dans des rations pauvre en protéines sur les paramètres zootechniques et environnementaux. L’évaluation des ingestions, de l’efficacité et de la digestibilité n’est possible qu’avec des mesures quotidiennes des quantités ingérées. Dans ce projet, les animaux seront inclus à partir de 45 jours de lactation (variable selon l’adaptation des vaches au auges) car l'objectif étant de tester l'effet du probiotique Actisaf Sc 47 durant cette période.

125 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardés en vie. Des chiots reçoivent des aliments à tester et subissent des prises de sang hebdomadaires et des collectes d'urine, pour évaluer l'appétence et la tolérance digestive de formulations commerciales. Le porteur affirme que le protocole "n'entraîne ni douleur ni souffrance" et suit un standard américain de l'industrie (AAFCO). Il conclut qu'aucun modèle ne peut approcher la digestion d'un aliment complet chez le chien et que des essais in vivo restent "nécessaires".

Objectifs

Pour évaluer la bonne prise alimentaire et la tolérance des aliments chiots il est nécessaire de procéder à des évaluations. Pour être complets, ces tests doivent comprendre le suivi clinique, pondéral et alimentaire des animaux, ainsi qu’une évaluation de la tolérance digestive, des mesures d'odeur de selles, des analyses d'urines et des paramètres sanguins.

Bénéfices attendus

Connaissances sur les besoins nutritionnels et le comportement alimentaire des chiots en croissance. Formulation de produits au plus près des besoin des chiots pour leur garantir une appétence et une tolérance digestive optimales. Identification de nouvelles solutions nutritionnelles.

Procédures

La recolte d'urine et prise de sang seront faites avec les animaux vigiles. Une analyse de la biochimie sanguine au maximum une fois par semaine et par animal. Les paramètres pour les prises de sang incluent les mesures de la fonction rénale et hépatiques (urée, créatinine, phosphatase alcaline, albumine, gamma glutamyl transférase, glutamate-pyruvate transaminase, protéine totale, cholestérol, globuline, et bilirubine totale). L’hématologie inclura la numération des hématies et le dosage de l’hémoglobine, numération des globules blancs et plaquettes. Une analyse d’urines (couleur, turbidité, pH, protéine totale, glucose, cétones, bilirubine et sang, densité spécifique et sédiment) pourra être réalisée à la discrétion du vétérinaire. La collection d’urine se fera par collecte libre (free-catch): les urines émises par mictions spontanées sont collectées grâce à des boxes spécialement aménagés munis de plans inclinés, et récoltées dans des collas. Pendant les sorties d'exercice, les urines sont collectées directement lors de la miction. La récolte des urines se fait sur un maximum de 3 jours, seulement sur des chiots en fin de croissance (> 8 mois), et au maximum 1 fois par quinzaine (3 jours d'urines collectées tous les 15 jours). Lors de prises de sang, le volume minimum nécessaire (comme spécifié par les laboratoires d’analyses) pour analyse les marqueurs sera prélevé : 4ml/prise (sans exceder 15 % du volume sanguin sur une période de 28 jours). La prise de sang sera fait par un vétérinaire et si l’animal ne se débat pas: -sur la phase de prélèvement uniquement : 15 secondes (maximum 30 secondes) -En incluant la phase de contention, de tonte, de désinfection et de prélèvement 2 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les animaux seront suivis quotidiennement par des techniciens animaliers et des vétérinaires à des rythmes réguliers et définis et continuent les sorties quotidiennes habituelles. Ce protocole n'entraîne ni douleur, ni souffrance. Le stress éventuel lors de réalisation de prises de sang est minimisé par un personnel qualifié et des animaux habitués dans notre centre.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie et recevront un suivi vétérinaire et des soins adaptés à leur état de santé.

Remplacement

Le protocole et les procédures utilisés sont conformes aux standards définis par l'AAFCO ( Association of American Feeding Control Officials) et suivent le processus normal d’évaluation des projets R&D. De plus, aucune autre étude ne peut être utilisée comme alternative à celle actuellement en place. Le protocole a pour objectif d'évaluer l'appétence et la tolérance digestive d'aliments destinés aux chiots en croissance. A ce jour, il n’existe pas de modèle qui puisse approcher la digestion, absorption et métabolisation d’un aliment complet dans cette espèce. Il est donc nécessaire de passer par des essais in vivo au cours desquels les chiens reçoivent la formulation d’aliment à évaluer.

Réduction

Le nombre d'animaux inclus pour chaque étude est issu de la recommandation américaine lors de la réalisation d’un protocole dit "AAFCO" (Association of American Feeding Control Officials) utilisé par l’intégralité de la profession, soit 1 lot de 10 chiots ou chatons issus au minimum de 3 différentes mères. 10 chiots inclus au début de l’étude pour avoir au moins 8 retenus à la fin.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement par des techniciens animaliers et des vétérinaires à des rythmes réguliers et définis et continuent les sorties quotidiennes habituelles. Ce protocole n'entraîne ni douleur, ni souffrance. L'état d'anxiété lors de réalisation de prises de sang est minimisé par un personnel qualifié et des animaux habitués dans notre centre.

Choix des espèces

Chaque espèce animale possède son propre métabolisme, ses propres performances digestives , ainsi que ses propres préférences alimentaires et facteurs d’appétence pour un aliment donné. Il est donc important d’utiliser les espèces auxquelles les aliments sont destinés. Il n’existe pas à ce jour de modèle qui puisse approcher la tolérance digestive ainsi que de prédire l’appétence d’un aliment complet chez le chien. Il faut donc passer par des essais in vivo au cours desquels les chiots reçoivent la formulation de l’aliment à évaluer. Des études in vitro n’apporteraient aucune information pertinente. Stade chiots : de 2 à 12 mois pour les chiens de moins de 25 kg à l'age adulte et de 2 à 18 mois pour les chiens de plus de 25 kg à l'age adulte, la croissance étant plus longue chez les chiens de grandes races. Indépendemment de l'âge, les chiots devront peser plus de 500g pour être inclus dans ce projet.

100 mulets-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Capturés en milieu naturel, ils sont exposés sur trois nuits à une lumière artificielle nocturne, puis tués par surdose d'anesthésique pour prélèvement de sang, de muscle et de foie, afin de calibrer un protocole de mesure du stress lié à la pollution lumineuse. Le porteur décrit un stress à la capture et au transport et une perte de poids légère pendant l'acclimatation, sans autre manipulation directe. Il présente l'étude comme pilote, préalable à un dispositif de plus longue durée qui fera l'objet de futures demandes d'autorisation.

Objectifs

Ce projet est une étude pilote destinée à concevoir un protocole d’alimentation et de mesure indirecte du stress chez le mulet-porc, dans le cadre du développement d’un projet expérimental sur un plus long terme. Celui-ci visera à analyser l'effet sur la biodiversité aquatique, d'une forme de stress spécifique aux milieux urbains, à savoir la pollution lumineuse nocturne. Nous avons choisi de réaliser cette étude sur des mulets-porcs juvéniles car il s’agit d’une espèce commune, largement répandue dans les milieux aquatiques urbanisés européens et connue pour se nourrir exclusivement de biofilms (couches de micro-organismes qui se forment sur des surfaces en contact avec l'eau) lorsqu’ils sont juvéniles. Ce comportement alimentaire est recherché car le projet global cherchera à analyser les effets du stress lumineux sur une fonction essentielle au fonctionnement des écosystèmes aquatiques : l’interaction alimentaire plante-poissons. Les poissons seront capturés en milieu naturel par nos soins grâce à des filets spécifiques à la pêche aux civelles donc sans risque de blessure des animaux et transportés dans nos installations. Nous mettrons ensuite à leur disposition des biofilms produits naturellement sur place, et ferons évoluer la lumière de telle façon à simuler les modes d'éclairage urbain les plus répandus. Nous verrons ainsi les effets de cette pollution lumineuse à la fois sur l’alimentation des poissons (quantités ingérées, fréquences des repas) et sur leur niveau de stress. Pour la quantification de celui-ci, de l'eau des aquariums sera régulièrement prélevée et analysée, avant qu'une fois les poissons euthanasiés, on réalise des mesures sur leur sang, muscles et foie. C'est ensuite la recherche de la présence de cortisol dans l'eau et/ou dans le sang qui nous permettra d'évaluer le niveau de stress des poissons exposés aux effets de la lumière. Des prélèvements d’organes et tissus renseigneront en parallèle sur l’évolution de la composition en lipides en fonction du mode d’alimentation, et ce afin d’évaluer l’effet sur l’interaction alimentaire biofilm-poisson.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de cette étude pilote à court terme sont de tester la faisabilité et les paramètres d’un protocole de mesure indirecte du stress du poisson en réponse à un stress lumineux. A moyen terme, l’étude pilote permettra de concevoir un dispositif expérimental réaliste pour étudier les réponses comportementales (en particulier alimentaires) et le stress induit par la pollution lumineuse nocturne chez le mulet-porc. Cette espèce de poisson a été choisie puisqu’elle représente un maillon essentiel au bon fonctionnement des écosystèmes aquatiques soumis à pression urbaine. A long terme, la démarche expérimentale permettra d’apporter des éléments de connaissance scientifique fondamentale robustes sur la réponse de la biodiversité aquatique, et plus généralement du fonctionnement des écosystèmes aquatiques, à divers facteurs de stress urbain. Ils alimenteront des recommandations de gestion des espaces publics urbains, notamment pour ce qui concerne la réduction, la mitigation ou la gestion des effets des éclairages publics sur l'environnement.

Procédures

Les poissons seront capturés en milieu naturel avec des techniques de pêche au filet. Toutes les précautions seront prises pour éviter des blessures aux animaux au cours de cette étape. Ils seront ensuite transportés pendant deux heures dans des sacs de transport adaptés. Les poissons, d’une espèce capable de vivre aussi bien dans l’eau douce que dans l’eau salée, seront ensuite acclimatés à l’eau de l’aquarium, d’une salinité plus basse que celle des milieux de capture, par le respect de seuils d’acclimatation progressifs accompagnés d’observations comportementales continues. Ils resteront ensuite en quarantaine sanitaire pendant 21 jours. Puis, ils seront alimentés avec un aliment naturel, le biofilm (la couche de micro-organismes qui se forme sur des surfaces en contact avec l'eau), dont l’appétence en condition de captivité sera testée. Si ce biofilm venait à être négligé, des granulés commerciaux le remplaceront. Certains poissons seront ensuite soumis à un stress lumineux nocturne d’une durée au total courte (3*12 h maximum d’exposition nocturne). L’ensemble des poissons destinés à l’expérimentation sera euthanasié à diverses étapes pour les besoins des prélèvements indispensables à l’interprétation des résultats : prises de sang pour y mesurer le cortisol qui sera comparé aux mesures réalisées dans l’eau, extraction de muscles et de foie pour analyse des profils en lipides. Ces profils illustrent pertinemment le rôle des plantes dans le fonctionnement des réseaux alimentaires de l’écosystème.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à un stress lors de leur capture et pendant leur transport, qui durera environ deux heures, ainsi que lors du transfert dans l’aquarium. Au cours de la procédure visant à habituer les poissons à se nourrir en captivité de biofilms, une perte de poids des animaux, légère mais sans conséquences sur leur bien-être, est possible. Ensuite, au cours de la procédure destinée à tester un protocole de mesure indirecte du stress, certains individus seront exposés aux effets d'une lumière nocturne, d’intensité légère, pendant 3 nuits, c'est à dire durant 36 heures non consécutives. C’est l’effet de ce stress, mimant une exposition à la pollution lumineuse nocturne, qui est recherché. Les effets attendus sont d’ordre comportemental (mobilité accrue, frénésie alimentaire, stress modéré), et d’ordre physiologique (accumulation de cortisol dans le sang et excrétion de cortisol dans l’eau du milieu). En dehors de ces nuisances légères, aucune manipulation directe n’est prévue sur les animaux. Tous seront néanmoins euthanasiés (selon le mode réglementaire, c’est-à-dire qu’une fois que les poissons auront été anesthésiés par balnéation, une augmentation de la quantité du produit anesthésique dans l’eau produira leur euthanasie) en fin d’expérimentation pour les besoins de prélèvements de sang, muscle et foie nécessaires à l’interprétation des résultats.

Devenir

Les 100 poissons impliqués sont euthanasiés. 10 le sont dès le début du projet, servant ainsi de « témoins », 20 à 30 autres le sont à la fin de la période d’alimentation par le biofilm ou les granulés, ceci pour la détermination du profil lipidique. Enfin, 60 seront euthanasiés après l’exposition à la lumière. Ces euthanasies sont justifiées par le besoins de prélèvements destinés à recueillir les paramètres indispensables aux résultats de l’étude pilote déployée dans le cadre de l‘élaboration d’un dispositif multiannuel. Celui-ci fera l’objet de futurs dépôts de demandes d’autorisation d’expérimenter au fur et à mesure de l’avancée du projet.

Remplacement

Les finalités de l’expérimentation pilote sont de juger de la faisabilité et du calibrage d'un protocole d’alimentation et de mesure du cortisol excrété par des animaux vivants dans l’eau du milieu suite à une exposition à un stress léger. L’expression du stress et les réponses comportementales complexes attendues ne peuvent pas être abordées par l’usage d’un modèle de remplacement simplifié (par exemple, des cultures cellulaires) en l’état actuel des connaissances. De plus, le choix d’une espèce sauvage très répandue dans les écosystèmes aquatiques urbanisés d’Europe, plutôt que d’un modèle biologique expérimental plus standardisé (poissons zèbres ou medaka par exemple) permettra d’optimiser les résultats du projet à large échelle.

Réduction

Le nombre d’animaux intégrés à l’étude pilote est limité au strict minimum requis pour une analyse statistique fiable de l’effet de l’exposition lumineuse sur le comportement alimentaire des animaux. L’expérimentation est constituée de 3 procédures qui s’enchainent sur tout ou partie des mêmes animaux afin d’optimiser leur usage. Ce nombre de 100 inclut un total de 10 surnuméraires capturés pour pallier une mortalité potentielle pendant la capture, le transport et l’acclimatation aux conditions d’hébergement (soit une mortalité estimée à environ 10%).

Raffinement

En dehors des étapes de capture, transport et transfert, les poissons ne seront jamais manipulés. Une fois pêchés, les poissons seront placés dans des viviers de dimensions adaptées à leur nombre et à leur taille, puis placés délicatement dans des sacs de transport gonflés aux 2/3 à l'oxygène pur et hermétiquement fermés. Ces sacs seront déposés dans un contenant assurant leur stabilité pendant le transport jusqu'au site expérimental. Une fois les poissons sur place, des seuils progressifs d'acclimatation leur permettront de s'habituer à l'eau de leur aquarium. Par ailleurs, le seul transfert qui sera réalisé ensuite sera celui du lot de 60 poissons destinés à l’exposition lumineuse ; il sera effectué à l'aide d'épuisettes à mailles fines, entre le bac de quarantaine où auront été accueillis les poissons dès leur arrivée sur site, vers les aquariums où se dérouleront les expositions lumineuses. Les poissons seront nourris pendant l'expérimentation. La qualité, la quantité et la fréquence de l’alimentation seront ajustées en fonction des observations réalisées in situ. Au moins une fois par jour, des animaliers formés de longue date viendront contrôler visuellement l’état des poissons. Des mesures continues des différents paramètres de l’eau (température, pH, …) ainsi que des mesures ponctuelles des produits azotés, garantes de la qualité de l'eau, permettront de maintenir des conditions environnementales optimales tout au long de l’expérimentation. Les bassins seront dimensionnés pour offrir un espace de mobilité confortable aux animaux (bassins de 30 L pour des individus de 8±2 cm de longueur totale). Les poissons ne seront jamais isolés mais placés en groupes de minimum 5 à maximum 100 individus selon les étapes. Toutes les étapes expérimentales auront lieu dans une même salle dédiée afin que les poissons s’habituent à un environnement visuel et sonore unique et constant. Enfin, les aquariums seront nus car un abri serait de peu d’intérêt pour le mulet-porc qui est une espèce mobile se déplaçant dans la colonne d’eau en dehors des activités alimentaires qu'il mène sur le fond. La présence d’une cache pourrait par ailleurs nuire à l’interprétation des résultats. Cependant, une des parois de chaque aquarium sera munie d’un décor mimant un décor de rivière afin potentiellement d’améliorer le confort des animaux.

Choix des espèces

Le mulet-porc est une des rares espèces de poissons connues pour se nourrir de biofilms au stade juvénile, ce comportement alimentaire spécifique étant essentiel pour atteindre les objectifs de long terme envisagés dans le projet global supportant l’étude pilote. Ces objectifs viseront au développement d’une démarche expérimentale multiannuelle intégrant différents représentants de la biodiversité aquatique (poissons et plantes d’espèces diverses). De plus, la capture de mulets-porcs en milieu saumâtre puis leur placement en milieu dulcicole pour l’expérimentation sont possibles puisqu’il s’agit d’une espèce dont le cycle de vie se déroule à la fois en eau salée et en eau douce. Le mulet-porc est par ailleurs largement répandu dans les milieux aquatiques urbanisés mondiaux dont l’étude est ciblée par le projet global, ce qui permettra d’optimiser la portée des résultats dans un contexte international. C’est aussi l’espèce la plus abondante dans les zones où les captures sont envisagées : ainsi, l’impact de celles-ci sur les ressources naturelles sera minimisé. Les poissons impliqués seront des juvéniles de 8±2 cm de longueur totale. Cette taille est en effet celle à laquelle les mulets-porcs sont décrits comme consommateurs exclusifs de biofilms en milieu naturel. Le fait de choisir des juvéniles limitera aussi les effets potentiels des captures sur les ressources naturelles. Enfin, des poissons de petite taille sont recherchés afin d’optimiser le compromis entre confort des animaux et conditions optimales pour la fiabilité des mesures du cortisol dans l'eau.

125 chatons vont être utilisés, gardés en vie à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des prises de sang, jusqu'à 4 ml par prélèvement, et des collectes d'urine, pour évaluer l'appétence et la tolérance digestive d'aliments industriels destinés aux chatons en croissance. Le porteur affirme que le protocole n'entraîne "ni douleur, ni souffrance" et que le stress des prises de sang est minimisé, l'objectif restant la formulation de produits commerciaux. Il indique qu'aucun modèle ne peut prédire l'appétence d'un aliment complet chez le chat, ce qui rendrait "nécessaire" le recours à l'essai sur les animaux.

Objectifs

Pour évaluer la bonne prise alimentaire et la tolérance des aliments destinés aux chatons, il est nécessaire de procéder à des évaluations. Pour être complets, ces tests doivent comprendre le suivi clinique, pondéral et alimentaire des animaux, ainsi qu’une évaluation de la tolérance digestive, des mesures d'odeur de selles, des analyses d'urines et des paramètres sanguins.

Bénéfices attendus

Connaissances sur les besoins nutritionnels et le comportement alimentaire des chatons en croissance. Formulation de produits au plus près des besoin des chatons pour leur garantir une appétence et une tolérance digestive optimales. Identification de nouvelles solutions nutritionnelles.

Procédures

La recolte d'urine et prise de sang seront fait avec les animaux vigiles. Une analyse de la biochimie sanguine au maximum une fois par seamine et par animal. Les paramètres pour les prises de sang incluent les mesures de la fonction rénale et hépatiques (urée, créatinine, phosphatase alcaline, albumine, gamma glutamyl transférase, glutamate-pyruvate transaminase, protéine totale, cholestérol, globuline, et bilirubine totale). L’hématologie incluera la numération des hématies et le dosage de l’hémoglobine, numération des globules blancs et plaquettes. Une analyse d’urines (couleur, turbidité, pH, protéine totale, glucose, cétones, bilirubine et sang, densité spécifique et sédiment) pourra être réalisée à la discrétion du vétérinaire. La collection d’urine se fera par collecte libre (free-catch). Lors de prises de sang, le volume minimum nécessaire (comme spécifié par les laboratoires d’analyses) pour analyse les marqueurs sera prélevé : 4ml/prise (sans exceder 15 % du volume sanguin sur une période de 28 jours). La collection d’urines devra prélever 5ml. La prise de sang sera fait par un vétérinaire et si l’animal ne se débat pas: -sur la phase de prélèvement uniquement : 15 secondes (maximum 30 secondes) -En incluant la phase de contention, de tonte, de désinfection et de prélèvement 2 minutes maximum

Impact sur les animaux

Les animaux seront suivis quotidiennement par des techniciens animaliers et des vétérinaires à des rythmes réguliers et définis et continuent les sorties quotidiennes habituelles. Ce protocole n'entraîne ni douleur, ni souffrance. Le stress éventuel lors de réalisation de prises de sang est minimisé par un personnel qualifié et des animaux habitués dans notre centre.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie et recevront un suivi vétérinaire et des soins adaptés à leur état de santé.

Remplacement

Le protocole et les procédures utilisés sont conformes aux standards AAFCO et suivent le processus normal d’évaluation des projets R&D. De plus, aucune autre étude ne peut être utilisée comme alternative à celle actuellement en place. Le protocole a pour objectif d'évaluer l'appétence et la tolérance digestive d'aliments destinés aux chatons en croissance. A ce jour, il n’existe pas de modèle qui puisse approcher la digestion, absorption et métabolisation d’un aliment complet dans cette espèce. Il est donc nécessaire de passer par des essais in vivo au cours desquels les chats reçoivent la formulation d’aliment à évaluer.

Réduction

Le nombre d'animaux inclus pour chaque étude est issu de la recommandation américaine lors de la réalisation d’un protocole dit AAFCO utilisé par l’intégralité de la profession, soit 1 lot de 10 chatons issus au minimum de 3 différentes mères. 10 chatons inclus au début de l’étude pour avoir au moins 8 retenus à la fin.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement par des techniciens animaliers et des vétérinaires à des rythmes réguliers et définis et continuent les sorties quotidiennes habituelles. Ce protocole n'entraîne ni douleur, ni souffrance. L'état d'anxiété lors de réalisation de prises de sang est minimisé par un personnel qualifié et des animaux habitués dans notre centre.

Choix des espèces

Chaque espèce animale possède son propre métabolisme, ses propres performances digestives , ainsi que ses propres préférences alimentaires et facteurs d’appétence pour un aliment donné. Il est donc important d’utiliser les espèces auxquelles les aliments sont destinés. Il n’existe pas à ce jour de modèle qui puisse approcher la tolérance digestive ainsi que de prédire l’appétence d’un aliment complet chez le chat. Il faut donc passer par des essais in vivo au cours desquels les chatons reçoivent la formulation de l’aliment à évaluer. Des études in vitro n’apporteraient aucune information pertinente. Les chatons seront âgés de 3 à 12 mois pour évaluer les besoins nutritionnels en croissance. Indépendemment de l'âge, les chatons devront peser plus de 500g pour être inclus dans ce projet.