Recherche fondamentale

Seuls des mâles adultes de deux à quatre ans, écartés de l'effort reproducteur annuel de la colonie, sont retenus dans ce projet sur un primate à saisonnalité marquée. 22 prosimiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit deux biopsies testiculaires d'un millimètre carré sous anesthésie générale, à trois mois d'intervalle, chaque prélèvement étant suivi d'une ponction de sang à la patte arrière. Les 22 animaux retournent ensuite dans la population de l'établissement, avec un suivi de cicatrisation renforcé et des cachettes supplémentaires pour limiter les agressions entre congénères que le porteur qualifie de naturelles.

Objectifs

La compétition spermatique in-utero est à l’origine de l’évolution du système reproducteur des mâles chez de nombreuses espèces, dont les primates. Les variations saisonnières du statut sexuel des femelles peuvent intensifier la compétition entre mâles reproducteurs. Ceci peut engendrer des variations physiologiques du système reproducteur des mâles au cours de la saison de reproduction, telles qu’une augmentation du taux de testostérone, une augmentation du volume testiculaire, ou encore la réactivation de la spermatogenèse. Plus largement, l'objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes génétiques sous-jacents à la variation phénotypique de la reproduction saisonnière chez les primates en identifiant les gènes qui sont impliqués dans la spermatogénèse et la maturation spermatique, en particulier ceux impliqués dans des fonctions particulières telles que la réponse au stress oxydatif ou à l’immunité.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre d'augmenter la compréhension de l’impact des variations moléculaires associées à la reproduction saisonnière chez les primates, dans une approche comparative. L’espèce concernée faisant partie de la branche primitive des primates, les résultats de ce projet contribueront à clarifier les processus évolutifs qui ont contribué la régulation du système reproducteur chez l'humain. L'objectif sera ici de mettre en évidence les mécanismes moléculaires responsables de l’arrêt momentané puis de la reprise de la spermatogenèse selon la saison chez un primate saisonnier. Ceci permettra ainsi de progresser dans la compréhension de l’ensemble des nombreux contributeurs à la régulation de la fertilité chez les mâles, tels que ceux observés au niveau du système immunitaire ou encore pour lutter contre le stress oxydatif. Par ailleurs les résultats attendus ont également un intérêt biomédical, avec une transposition des résultats obtenus aux perturbations possibles des voies moléculaires impliquées dans l'altération du processus de spermatogenèse chez l'humain, qu'elles soient liées à des blessures ou des maladies et qui peuvent mener à l’infertilité.

Procédures

Chaque animal du projet aura 2 prélèvements successifs, réalisés sous anesthésie générale et à 3 mois d'intervalle. Les prélèvements consisteront en une biopsie testiculaire de 1mm² réalisée avec un dispositif stérile dédié, suivie d'un prélèvement sanguin réalisé à la patte arrière de l'animal, dans la limite de 200µL maximum de sang par animal et par prélèvement.

Impact sur les animaux

Les gestes associés à cette procédure sont maîtrisés par les expérimentateurs et réalisés sous contrôle vétérinaire. Seuls les individus mâles adultes ne présentant aucune contre-indication vétérinaire et n'étant pas programmés pour contribuer à l'effort reproducteur annuel participeront à ce projet. De plus, un contrôle quotidien renforcé sera réalisé les jours suivant l’échantillonnage afin de s’assurer de la bonne cicatrisation des zones de biopsie et de l’absence d’interactions antagonistes au sein des groupes. Un enrichissement adapté et renforcé sera mis en place dans les hébergements concernés. Les produits vétérinaires utilisés dans cette procédure sont régulièrement utilisés au sein du laboratoire et les effets secondaires potentiels sont bien identifiés. Enfin, une étude pilote sur 2 animaux sera menée en amont afin de s'assurer du maintien du bien-être animal sur le long-terme et de valider la mise en place de la procédure expérimentale d'échantillonage sur la majorité des animaux (N=20) concernés par ce projet.

Devenir

A l'issue de l'unique procédure de ce projet qui sera appliquée 2 fois sur une durée de 3 mois, les 22 animaux du projet retourneront dans la population.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'utilisation des animaux par des méthodes alternatives compte-tenu de la nature des processus explorés. L'animal utilisé dans ce projet est un modèle particulièrement adapté à l’étude de l’influence de la saisonnalité sur la spermatogenèse chez les primates, car il est soumis à une compétition spermatique extrême lors de la saison de reproduction qui est très courte. Les mâles participent à une compétition intense pour l’accès à l’accouplement, sachant que les femelles vont s’accoupler avec plusieurs mâles lors de la période de reproduction. A cause de cette très forte compétition spermatique, les mâles ont un des plus haut ratio taille des testicules/ taille du corps chez les primates ; leurs testicules vont augmenter de 4 à 5 fois leur volume initial en préparation de la saison de reproduction. Ce processus démarre 2 à 3 mois avant l’entrée des femelles en oestrus et la spermatogenèse est totalement arrêtée au cours de la saison de repos.

Réduction

Nous collecterons 44 biopsies testiculaires et 44 échantillons sanguins sur 22 mâles adultes au total (phase pilote + expérimentale). Chaque mâle sera donc échantillonné à deux reprises: au cours de la réactivation de l’activité sexuelle (quelques semaines avant l'accouplement) puis lorsque l’axe reproducteur est complètement actif (pendant la période d'accouplement). Ces deux périodes de l’année correspondent à des états physiologiques, et en particulier de l’axe reproducteur, très contrastés et très bien documentés, qui supplanteront la potentielle variabilité inter-individuelle. Comme nous souhaitons réaliser du séquençage ARN sur ces échantillons, ce nombre d'individus total est conditionné par le fait qu'une analyse de puissance de l'expression génique différentielle attendue a été effectuée.

Raffinement

Une étude pilote va être menée sur 2 individus en amont du projet afin de valider la procédure et de s'assurer du maintien du bien-être animal après la procédure. Tous les produits vétérinaires utilisés dans la procédure sont connus et leurs effets sont maîtrisés par les expérimentateurs. Dès l'apparition éventuelle d'inconfort, ou de souffrance (absence d’alimentation, prostration, agressivité anormale, réaction à la palpation), l'animal sera sorti du projet et un suivi vétérinaire sera enclenché. D'un point de vue zootechnique, un enrichissement adapté sera développé au sein des zones d'hébergements concernées afin de limiter les intéractions antagonistes qui existent de manière naturelle entre les animaux, notamment lors de la periode de reproduction. Ainsi des cachettes supplémentaires seront ajoutées, les zones de fourragements seront multipliées et le taux d'occupation des hébéregement pourra être diminué si nécessauire.

Choix des espèces

Outre sa proximité phylogénétique avec l’humain, l'espèce utilisée dans ce projet est un modèle particulièrement adapté pour l’étude des mécanismes impliqués dans le contrôle de la reproduction, qui est saisonnière même en captivité, ce qui est rendu possible par un contrôle du régime photopériodique. Seuls des animaux mâles adultes, matures sexuellement (entre 2 et 4 ans) et n'étant pas programmés pour contribuer à l'effort reproducteur annuel seront échantillonnés. Les résultats attendus ont un intérêt biomédical, avec une transposition des résultats obtenus aux perturbations possibles des voies moléculaires impliquées dans l'altération du processus de spermatogenèse chez l'Homme, qu'elles soient liées à des blessures ou des maladies et qui peuvent mener à l’infertilité.

Tuées à la fin du projet pour que leurs muscles plantaires soient prélevés et analysés, 72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs leur sectionnent des tendons au cours d'une chirurgie de dix minutes sous anesthésie, afin de mettre le muscle plantaire en surcharge, et le porteur admet des douleurs modérées et un inconfort possibles les jours suivants. Six groupes reçoivent ensuite une injection quotidienne, pendant trois ou dix jours selon le groupe. Le projet cherche à comprendre pourquoi certaines fibres musculaires rapides ne grossissent jamais, et le porteur écarte les cultures cellulaires au motif qu'il reste "encore impossible" d'obtenir des fibres musculaires adultes in vitro.

Objectifs

Les muscles adultes peuvent être plus ou moins forts, et plus ou moins résistants à la fatigue, lors d’activités d’endurance. Ces caractéristiques dépendent de leur composition. En effet, il existe quatre types de fibres musculaires qui ont chacune des fonctions différentes : les fibres de type I ont une bonne résistance à la fatigue, tandis que les fibres IIb apportent de la force aux muscles. Les fibres IIa et IIx ont des capacités intermédiaires en termes de force et de résistance à la fatigue. Notre étude s’intéresse aux fibres IIb et IIx car ces fibres ne grossissent jamais beaucoup, même à l’entraînement. De plus, avec l'âge ou dans certaines maladies graves comme la sclérose latérale amyotrophique ou l’amyotrophie spinale infantile, ces fibres s'affaiblissent et disparaissent rapidement, entrainant une grande perte de force. Comprendre pourquoi ces deux fibres sont sensibles à l'affaiblissement et peu réactives à l'augmentation de volume est très important, notamment dans la lutte contre les effets du vieillissement. A la suite d’une surcharge d'activité sur le muscle plantaire, les fibres de type I et IIa grossissent, mais pas les fibres IIb. A sept jours de surcharge, deux substances sont libérées qui se lient à des récepteurs sur les différents types de fibres musculaires et pourraient aider à augmenter la masse musculaire. L’objectif de ce projet est de déterminer si ces molécules jouent un rôle clé dans le contrôle de la masse musculaire en bloquant leurs récepteurs dans les muscles soumis à un effort intense.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le contrôle de la masse et de la fonction musculaire impliqués dans plusieurs pathologies et d’améliorer la prise en charge des patients pour permettre à plus long terme d’améliorer la qualité de vie (favoriser le bien vieillir et l’autonomie). De manière plus large, nous nous intéressons à la résistance à l’hypertrophie des fibres musculaires glycolytiques à contraction rapide qui sont également touchées préférentiellement au cours du jeûne, dans les cachexies cancéreuses, la sclérose latérale amyotrophique, les insuffisances cardiaques.

Procédures

Les souris sont divisées en 6 groupes (G1,G2, G3, G4, G5, G6) et seront soumises aux interventions suivantes : - une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie d'une durée de 10 min (tous les Groupes) - Une injection 1 fois par jour d'une durée de 1 minute pendant 10 jours (G1, G2 et G3), et pendant 3 jours (G4, G5 et G6)

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une douleur légère liée et de courte durée liée aux injections. Les animaux opérés pourront ressentir des douleurs modérées et de l’inconfort liées à la lésion des tendons, la surcharge du muscle plantaire ainsi qu’à l’inflammation les jours suivant l’opération.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du projet afin de récupérer les muscles plantaires et réaliser des analyses d'anatomie et de biologie moléculaire

Remplacement

Compte tenu du fait qu'il est encore impossible d'obtenir des fibres musculaires adultes en culture, le modèle animal reste indispensable pour étudier les effets de médicaments sur des organes.

Réduction

Les effectifs ont été calculés en utilisant une étude statistique garantissant la validité des données obtenues et l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les souris sont opérées sous anesthésie, analgésique pré et post opératoire. Les souris sont placées sur un plateau chauffant (37°C) pendant la période de réveil post opératoire. Une grille de score adaptée a été mise en place afin d’assurer cette surveillance durant toute toute la période du protocole. Un enrichissement sous forme de tubes et de maisons sera mis dans les cages. Les souris sont hébergées par groupe de 4 par cages et une visite par jour est effectuée entre les jours J0 et J13 puis une fois tous les 2 jours entre les jours 14 et 21.

Choix des espèces

L’hypertrophie musculaire induite par la surcharge d'activité est bien démontrée dans le modèle souris et il retrace ce qu'on observe chez l'homme. Les animaux sont utilisés à l'âge adulte (8 semaines) pour s’acquitter de l'effet de croissance chez des souris plus jeune qui sont encore en train de grandir.

Trente-trois séances de contention dans le noir, la queue glissée dans un manchon de mesure, répétées trois jours d'affilée toutes les quatre semaines de la douzième à la cinquante-deuxième semaine de vie : 4 864 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Certains groupes reçoivent une alimentation très riche ou très pauvre en sel, ou un glucocorticoïde dans l'eau de boisson, pendant deux semaines. Le projet porte sur le rôle de trois gènes dans la fonction de la glande surrénale et l'hypertension artérielle, que le porteur juge "impossible à analyser in vitro". L'effectif par groupe double, de huit à seize souris, parce que la surrénale est trop petite pour être coupée en deux et fournir assez de matériel.

Objectifs

L’hypertension artérielle est un facteur de risque cardiovasculaire qui affecte jusqu’à 45% de la population. Bien qu’il existe un large arsenal thérapeutique, le contrôle optimal de la pression artérielle n’est pas atteint chez quasiment deux tiers des patients. Ces dernières années des gènes responsables d’hypertension ont été identifiés ainsi que des gènes de prédisposition au développement de formes secondaires d’hypertension artérielle. L’étude du rôle de ces gènes est indispensable pour mieux comprendre les causes de cette hypertension artérielle et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques plus efficaces. L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle de trois nouveaux gènes et de l’interaction de deux de ces gènes identifiés comme jouant un rôle dans le développement d’hypertension artérielle et dans la réponse physiologique de la glande surrénale à des modification de l’apport sodé ou en glucocorticoïdes.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de comprendre le rôle de différents gènes identifiés comme impliqués dans l’hypertension dans la réponse adaptative aux variations des apports sodés ou des apports en glucocorticoïdes. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables du développement de certaines formes d’hypertension artérielle permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et ainsi d’améliorer la prise en charge de patients.

Procédures

Des mesures de pression artérielle sur souris vigile seront réalisées toutes les 4 semaines chez des souris de 12 à 52 semaines : L’animal sera placé dans un dispositif de contention, dans le noir. La queue de l’animal sera placée dans le manchon (« capteur de pouls ») afin d’enregistrer la pression. L’ensemble du protocole dure environ 15 minutes et est répété 3 jours d’affilé. Ce geste sera répété toutes les 4 semaines, soit 33 fois au cours de la vie de l'animal. Certains groupes d’animaux recevront une alimentation riche ou pauvre en sel ou un glucocorticoîde dans l’eau de boisson pendant 2 semaines. Un prélèvement unique de sang sera réalisé sous anesthésie profonde. Ce geste dure 1 minute). L’injection du mélange anesthésique sur souris vigile, réalisé avant le prélèvement de sang dure moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

La contention de l’animal lors des mesures de pression artérielle peut engendrer un stress. L’injection du mélange anesthésique peut entrainer une douleur et un stress de courte durée. Le prélèvement de sang ainsi que la contention pré anesthésie peuvent occasionner une douleur et un stress de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes qui seront analysés par différentes approches.

Remplacement

Bien que des approches in vitro aient été développées pour étudier la fonction de gènes impliqués dans le développement de l’hypertension ou de gènes de prédisposition au développement de l’hypertension, le modèle animal seul permet de reproduire la complexité des réactions mises en jeu dans le développement de l’hypertension.

Réduction

A partir de données de la littérature, de l’expérience du laboratoire et des analyses de puissance statistique, il a été déterminé un nombre minimum de 8 souris par groupe expérimentale. Cependant la taille de la surrénale ne permet pas de couper le tissu en deux pour réaliser toutes les expériences souhaitées sur un même tissu. Il est donc nécessaire de prévoir 16 animaux par lot au lieu de 8 pour avoir assez de matériel et garantir une analyse statistique fiable. Les analyses observationnelles seront complétées et vérifiées par les approches in vitro.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d’hébergement et d’élevage sons standardisées et contrôlées durant toute la vie de la souris. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par l’utilisation d’analgésiques adaptés. Une surveillance journalière sera mise en place et une grille d’évaluation établie afin de permettre de mettre fin à l’expérimentation de façon anticipée. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les expérimentateurs ou par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes de souffrance ou de mal-être.

Choix des espèces

La souris (Mus Musculus) est un modèle de choix, en raison de ses caractéristiques génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Ce raisonnement s'applique tout particulièrement à l'étude de l’hypertension artérielle, maladie complexe et impossible à analyser in vitro. Afin de pouvoir suivre le développement post-natal de la glande surrénale ainsi que l’effet de différents régimes sodés ou de l’apport en glucocorticoïdes, il est nécessaire d’utiliser des animaux jeunes, entre 2 et 9 semaines. Au-delà, un cycle complet de transdifférenciation du cortex de la surrénale a eu lieu et les analyses sont donc moins pertinentes. Le développement d’une hypertension artérielle est un processus long, justifiant de suivre les souris sur plusieurs mois (jusqu’à l’âge de 52 semaines).

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids sont mises à mort, le poids n'étant relevé qu'une fois par mois. 57 souris déficientes en lipase hormono-sensible vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser l'expression de leurs gènes. Vigiles, elles subissent des évaluations comportementales et motrices de cinq à trente minutes chacune sur quatre jours, avec préhension d'une à cinq minutes et stimulations électriques, sans qu'aucun test soit nommé. Le porteur qualifie le stress lié à ces dispositifs de "léger à modéré", et écrit ailleurs que les mêmes tests génèrent "peu de stress".

Objectifs

La quantité et la distribution de la masse grasse évolue au cours de l’âge. Les souris déficientes en HSL présentent moins de masse grasse répartie différement que les souris contôles. L’objectif est de déterminer les liens entre masse grasse (caractéristiques du tissu adipeux) et le déclin fonctionnel lié au vieillissement par phénotypage comportemental. Ces travaux peuvent déboucher sur l’identification de nouveaux biomarqueurs de fragilité.

Bénéfices attendus

Au cours du vieillissement, les tissus adipeux sont affectés précocémment par les phénomènes de sénescence cellulaire. Cette étude permettra d’avoir une compréhension plus fine des processus de vieillissement dans les tissus adipeux, de déterminer l’importance de l’évolution de la masse grasse dans les complications liées à l’âge et d’identifier des marqueurs et des facteurs de risque précoces.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à une série d'évaluations comportementales et motrices, d'une durée de 5 à 30 minutes chacune, et réparties sur 4 jours non consécutifs.

Impact sur les animaux

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent un certains niveau de stress : préhension de une à cinq minutes lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement ainsi que des stimulations électriques. Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent un stress léger à modéré lié notamment à la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement et l'exploration d'un nouvel environnement non familier.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et les tissus seront récupérés afin de réaliser des analyses d’expression des gènes.

Remplacement

Ce projet vise à étudier l'impact de la masse grasse sur les capacités globales des individus âgés, notamment les fonctions physiques et mentales. Pour répondre à cette question, l'étude nécessite un organisme vivant et intact capable d'intégrer des processus physiologiques complexes (métabolisme, vieillissement) et de manifester des comportements. Or, les tests comportementaux utilisés pour évaluer ces processus ne peuvent être reproduits par des approches sur cultures cellulaire. L’utilisation d’un modèle animal demeure indispensable pour cette étude, car il n’existe à notre connaissance aucun modèle alternatif reproduisant les effets du vieillissement et permettant une comparaison avec des modifications de la répartition des tissus graisseux (lipodystrophie). Le modèle de la souris a été choisi en raison de son espérance de vie plus courte et de la similarité de ses processus physiologiques avec l'Homme. Cette approche in vivo est la seule manière fiable et peu invasive d'étudier l'interaction entre la masse grasse et le déclin fonctionnel.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum en se basant sur les données de la littérature et ce nombre a été corrigé par un calcul de puissance statistique.

Raffinement

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent peu de stress (préhension lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement). Une habituation aux gestes de manipulation sera effectuée avant chaque lot de tests pour limiter le stress généré par l’expérimentateur. De plus, Les animaux seront suivis quotidiennement afin d'identifier le plus précocement possible tout signe de souffrance ou de stress. Si l’animal présente des signes de détresse, comme une diminution modérée du poids corporel (en 10 et 20%), ou une aggressivité inhabituelle ou une prostration, l’animal sera placé en surveillance rapprochée. Des mesures de renforcement de l’enrichissement peuvent être mis en place comme la nourriture liquide, nidification supplémentaire. Si les signes persistent ou s’aggravent, l’animal sera temporairement exclu de l’étude et recevra si nécéssaires des soins adaptés. Si l’animal présentent des singes cliniques critiques ou irréversibles comme l’apathie, la perte de poids >20% (poids mesurés tous les mois), difficultés de déplacements, alors l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous cherchons à étudier les capacités d’un individu d’âge avancé en fonction de la quantité de masse grasse. Cela nécessite de l’étudier sur des organismes vivants, humains ou modèles animaux. La souris semble un choix plus approprié pour cette étude grâce à l’espérance de vie plus courte et des processus physiologiques similaires à l’Homme. Pour étudier la fragilité et les processus de vieillissement, une évaluation initiale sera effectuée à l'âge adulte (12 mois). L'objectif est d'identifier des marqueurs précoces liés à ces phénomènes.

Caractériser la pharmacocinétique de produits en vue d'une autorisation de mise sur le marché : 72 furets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour quantifier ces produits dans leurs organes. Chaque animal reçoit jusqu'à trois administrations, par voie intraveineuse, intratrachéale, intranasale ou orale, puis subit jusqu'à vingt prélèvements sanguins sous anesthésie sur cinq mois et jusqu'à cinq lavages broncho-alvéolaires de vingt minutes. Les furets sont mis à jeun deux à cinq heures avant chaque anesthésie pour limiter les vomissements. Le porteur justifie l'espèce par sa proximité pulmonaire avec l'humain et par la recommandation de tester sur un rongeur et un non-rongeur, et résume les bénéfices attendus en une phrase, contribuer au développement et "éventuellement" à la mise sur le marché de nouveaux produits.

Objectifs

L’autorisation de mise sur le marché (AMM) d’un produit (médicament, agent de contraste…) nécessite au préalable de caractériser notamment sa pharmacocinétique (PK) et sa pharmacodynamique (PD). La pharmacocinétique consiste à évaluer l’absorption, la diffusion, la métabolisation et l’excrétion du produit par l’organisme. Elle permet notamment d’améliorer les dosages et la posologie du produit par l’étude de sa concentration sanguine au cours du temps. Elle permet également de déterminer les voies d’administrations optimales selon la métabolisation du produit dans l’organisme. La pharmacodynamique consiste quant à elle à évaluer les effets du produit sur l’organisme. Ce projet a pour objectif de caractériser la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de produits après administration chez le furet.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera au développement et éventuellement à la mise sur le marché de nouveaux produits.

Procédures

Les animaux recevront une injection de produit en dose unique ou répétée (maximum 3 administrations) par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale, intratrachéale, intranasale ou pers os. Ces administrations seront réalisées en moins de 1 minute sur animaux vigiles ou en environ 10 minutes sur animaux anesthésiés. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 8 fois pour des études courtes (moins de 2 semaines) et au maximum 20 fois pour des étude longues (5 mois). Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes soit 10 minutes au total en comprenant le temps d’anesthésie volatile. Des lavages broncho-alvéolaires pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 5 fois. Ces lavages s’effectuent en moyenne en 20 minutes avec le temps d’anesthésie. L’ensemble des prélèvements seront réalisés autant que possible lors d’une même anesthésie. Pour limiter le risque de vomissements, les animaux seront mis à jeun entre 2 et 5h avant chaque anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes avec ou sans anesthésie susceptibles d’induire un stress : pesées, suivi clinique, mise à jeun, administration des produits, prélèvements de sang et lavages broncho-alvéolaire. Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration, pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (risque de pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies répétées, inflammation locale des sites d’injection).

Devenir

L’ensemble des animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements d’organes dans le but de réaliser la quantification ex-vivo des produits par différentes analyses.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire afin de pouvoir caractériser la pharmacocinétique et notamment la biodistribution d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable la biodistribution d’un produit dans un organisme vivant.

Réduction

Cette étude a fait l’objet d’une réflexion étayée par des connaissances statistiques et des données de la littérature scientifique afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Toutefois, pour obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’évaluer la biodistribution du traitement testé, des groupes de minimum 6 animaux seront utilisés. Si nécessaire, lors de phases amont, des études pilotes pourront être réalisées sur un nombre limité d’animaux (3 par groupe minimum). Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé lors de ce projet, les analyses seront réalisées également en amont de l’administration des produits afin que chaque animal soit son propre contrôle.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines minimum sera respectée durant laquelle une période d’habituation pourra être mise en place si nécessaire. Cette phase consiste à caresser, porter et faire rentrer les animaux dans la boîte d’induction d’anesthésie qui sera ensuite utilisée lors des anesthésies pour les actes techniques. Les 3 premiers jours, les animaux ne seront pas stimulés pour s’habituer aux locaux et au personnel. Avant le démarrage de l’étude, le vétérinaire assurera une visite de contrôle clinique. Les animaux seront hébergés en groupes avec des enrichissements et appropriés à leurs besoins (distinction stricte entre les aires de repos avec des panières et linges permettant la nidation et des zones où ils pourront faire leurs besoins). Des hamacs comme aires de repos en hauteur et des jeux comme des balles avec des clochettes à l’intérieur, des hochets avec des objets à l’intérieur émettant du bruit à la manipulation, des tubes PVC organisés en un réseau à sorties multiples et servant également de cachettes pour les furets seront ajoutés au parc ou cages d’hébergement. Une alternance des jouets pour stimuler l’intérêt des animaux sera respectée afin d’éviter l’ennui. Un temps de jeux quotidiens (hors weekend et jours fériés) de 15 à 30 minutes avec les animaliers, en particulier ceux réalisant les soins quotidiens des animaux, sera également respecté pour habituer progressivement les animaux au contact humain et diminuer le stress lors des manipulations. Les animaux seront observés quotidiennement et ce depuis leur arrivée jusqu’à leur euthanasie. De plus, durant l’étude, le poids des animaux sera mesuré régulièrement (a minima une fois par semaine), accompagné d’un suivi clinique plus précis basée sur une grille de scoring (comportement général, écoulements nasaux et oculaires, aspect du pelage, difficultés respiratoires, aspect des muqueuses). En cas d’apparition de signes cliniques anormaux, des examens cliniques approfondis pourront également être réalisés par un vétérinaire responsable du suivi. Les signes cliniques observés seront pris en charge (injection de fluides, analgésiques, antibiotiques, etc…) dans la mesure où les actions n’interfèrent pas avec les produits injectés. Enfin, le personnel réalisant les actes sera habilité, formé et expérimenté.

Choix des espèces

Le modèle furet a été choisi car il constitue un modèle plus proche de l’homme que la souris à la fois sur le plan anatomique et au niveau physiologique et particulièrement pulmonaire. Cela en fait une espèce particulièrement pertinente pour l’étude de composés à visée thérapeutique ciblant les maladies respiratoires, permettant une meilleure transposition des résultats précliniques vers l’homme. De plus, il est souvent utilisé comme modèle préclinique intermédiaire permettant de conforter des résultats préliminaires obtenus en modèle souris qui est souvent un prérequis des agences réglementaires pour mieux prédire la biodistribution humaine et évitant ainsi le recours aux primates non-humains. Il est également fortement recommandé de réaliser les études de PK/PD sur deux espèces : rongeur et non-rongeur. Par ailleurs, ce modèle a l’avantage d’être plus grand qu’une souris permettant ainsi de réaliser des prélèvements tels que les prélèvements sanguins de façon plus fréquentes et en plus grandes quantités. Les animaux sélectionnés pour ce projet seront âgés au minimum de 3 mois correspondant au début du stade adulte.

Jusqu'à six injections par animal, des tests de suspension et d'agrippement répétés treize fois sur quatre mois, puis une chirurgie de vingt minutes sans réveil pour mesurer la contractilité du muscle : 1 008 souris porteuses d'une mutation myopathique vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyses moléculaires et histologiques des muscles injectés. Le projet vise à optimiser une thérapie génique que l'équipe dit avoir déjà validée dans le muscle, l'administration par voie sanguine ayant échoué lors des essais antérieurs. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de poursuivre dans ce modèle et que seule l'injection dans le sang permettra de vérifier l'effet à l'échelle d'un "organisme entier". La lignée fait l'objet d'une autorisation d'élevage pour phénotype dommageable, alors que le même document décrit des souris au comportement locomoteur, au poids, à la longévité et à la fertilité comparables à ceux des souris non modifiées.

Objectifs

Nous développons des approches thérapeutiques pour une maladie génétique rare du muscle, causée par des mutations dans un gène codant une protéine impliquée l’entrée et le transport de vésicules à l’intérieur de la cellule. Nous avons démontré que l'injection dans le muscle d’un virus thérapeutique exprimant une molécule ciblant la forme mutée de la protéine permet de restaurer la structure et la fonction du muscle dans un modèle murin de la maladie, lorsqu’elle est administrée à l’âge d’un mois. Cependant, le traitement est moins efficace chez les souris plus âgées qui présentent une atteinte musculaire plus prononcée. Par ailleurs, les essais d’administration systémique visant à traiter l’ensemble des muscles via la circulation sanguine se sont révélés inefficaces, même chez les souris âgées d’un mois. L’expression de la molécule thérapeutique dans la cellule par l’intermédiaire d’un vecteur viral est dépendante de son entrée dans la cellule et de son transport jusqu’au noyau. Nos travaux antérieurs ont montré que le vecteur est moins bien acheminé chez les souris malades et que ce phénomène s’empire avec la progression de la maladie. Ainsi la pathologie elle-même, semble compromettre l’efficacité de l’administration du traitement. L’objectif de ce projet est d’évaluer des stratégies thérapeutiques alternatives permettant d’acheminer efficacement la molécule de thérapie génique, notamment à travers l’utilisation de différentes combinaisons de vecteurs viraux ou non viraux.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’une maladie neuromusculaire rare et invalidante (prévalence estimée inférieure à 1 pour 100 000 naissances), pour laquelle aucun traitement curatif n’est actuellement disponible. La faiblesse musculaire progressive entraîne une perte d’autonomie, altérant significativement la qualité de vie des patients et nécessitant une prise en charge pluridisciplinaire. La réussite de ce projet représentera une avancée cruciale dans l’évaluation préclinique de notre molécule et permettra d’envisager le développement de traitements qui, à ce jour, n’existent pas pour les patients atteints de cette maladie. Par ailleurs, ce travail enrichira notre compréhension des différentes voies d’administration (virale et non virale) de thérapies géniques dans un contexte où la transduction virale est altérée. Les stratégies optimisées et les données générées pourront être extrapolées à d’autres pathologies caractérisées par des défauts similaires de délivrance du vecteur, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques

Procédures

Toutes les souris participant à cette étude recevront une thérapie via différentes voies d’injections (entre 1 à 6 injections maximum par souris selon le protocole suivi) réparties sur plusieurs semaines. Suivant la voie, les animaux seront vigiles ou anesthésiés. L’acte technique dure 2 minutes maximum et sera répété 6 fois maximum. Afin d’évaluer la force musculaire des animaux et donc l’efficacité des thérapies testées, certains animaux suivront des tests de force non invasifs (capacité à s’agripper ou à se suspendre). Les animaux seront vigiles lors de ces tests, chaque test pourra durer 5 minutes maximum et ils seront répétés 13 fois maximum sur 4 mois. Tous les animaux auront une chirurgie en phase terminale sans réveil afin de tester la contractilité musculaire. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie et durera 20 minutes. Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La lignée de souris présente un phénotype dommageable. Les souris hétérozygotes développent progressivement une atrophie et une faiblesse musculaire (mais sur certain muscle uniquement et après mesure spécifique de la force). Elles n’ont pas d’autre signe clinique, et présentent un comportement locomoteur, un poids, une longévité et une fertilité comparables à ceux des souris non génétiquement altérées. Les manipulations nécessaires aux différentes procédures peuvent provoquer un léger stress chez l’animal. Les différentes injections dureront quelques minutes et sont susceptibles d’occasionner une douleur au moment de l’injection et, secondairement, un saignement et/ou hématome, une inflammation locale et rarement une infection. Les administrations répétées comportent un faible risque de péritonite. L’anesthésie gazeuse utilisée peut entraîner une perturbation de la thermorégulation et, dans de rares cas, une détresse cardio respiratoire. Les tests comportementaux de 5 minutes maximum pourront engendrer de la fatigue musculaire. Enfin, une chirurgie sans réveil sera effectuée sur certains animaux, l'anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de protocole selon la réglementation en vigueur pour études moléculaires et analyses histologiques des muscles injectés.

Remplacement

L’efficacité et l’absence de toxicité de notre approche thérapeutique ont été démontrées au préalable sur des cellules de patients en culture. La validité du modèle de souris de la maladie est reconnue par les experts du domaine et par plusieurs publications dans des articles à comité de lecture ainsi que par des présentations lors de congrès internationaux. Nous avons préalablement démontré l’efficacité et l’innocuité de l’approche dans le muscle de souris du modèle en utilisant un vecteur de type virus thérapeutique. Le but de ce projet est l’optimisation de cette thérapie dans le modèle de souris en testant différent véhicule pour délivrer le médicament dans tout l’organisme. Il est indispensable pour le développement préclinique de la molécule de poursuivre l’étude dans ce modèle. Seule l’administration du traitement dans le système sanguin permettra de vérifier son efficacité et sa potentielle toxicité à l’échelle d’un organisme entier.

Réduction

Le nombre maximal théorique de souris impliquées si toutes les procédures sont réalisées est de 1008. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et nos études précédentes afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. La réalisation des procédures et des étapes à l’intérieur des procédures seront réalisées de manière successive et adaptative, dans un ordre permettant de limiter le nombre d’animaux en fonction des résultats positifs ou négatifs. Les organes et tissus de souris issus de ce projet seront conservés en banque pour d’autres projets de l’équipe, évitant ainsi de nouveau prélèvements. Grâce à ces mesures de réduction, nous limitons au strict nécessaire le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant la validité statistique et scientifique de chaque protocole.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Un enrichissement de leur environnement est mis place avec au moins 2 éléments aux choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’entretien des animaux ainsi que les expériences seront réalisés par un personnel titulaire des autorisations et formations nécessaires. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse pour éviter toute douleur ou gêne, elles durent moins d’une minute par souris. Une analgésie sera pratiquée avant certaines injections pour éviter toute gêne. L’anesthésie gazeuse est réalisée en maintenant la thermorégulation en utilisant un tapis chauffant. Les jours suivants les injections une surveillance renforcée des souris sera exercée par l’animalier en charge de la lignée ou les personnes en charge des protocoles. Les mesures de forces sont non invasives et seront réalisés entre 1 et 13 fois maximum par souris afin de limiter un stress répété. Les mesures de forces en fin de projet seront réalisées sous anesthésie et analgésie et sans réveil. Les animaux ne développent habituellement pas de phénotype conduisant à une diminution de leur locomotion mais le cas échéant, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. La lignée fait l’objet d’une autorisation d’élevage pour phénotype dommageable. Dans toutes les procédures, des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur excessive (retrait ou vocalisation excessive à la manipulation, prostration ou agitation anormale) seront considérées comme points limites et critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduira à l’euthanasie des animaux concernés.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé est le plus adapté pour développer et tester notre traitement, car la molécule étudiée cible précisément la mutation génétique présente chez ces animaux. Il s’agit du plus petit modèle de mammifère reproduisant cette myopathie, reconnu par les experts du domaine et largement utilisé dans des études publiées et présentées lors de congrès internationaux. Nous avons déjà montré que le vecteur viral thérapeutique que nous utilisons est sûr et efficace dans le muscle de ces souris. Il est donc indispensable, à ce stade du développement préclinique, de poursuivre les tests dans ce modèle afin d’optimiser l’efficacité du traitement et de vérifier l’absence d’effets indésirables sur l’ensemble de l’organisme, après une injection dans le sang. Les souris de ce modèle développent progressivement des symptômes musculaires à partir d’un mois, qui s’aggravent jusqu’à environ huit mois. Cependant, leur déplacement, leur fertilité et leur durée de vie restent normaux. Nos travaux précédents ont montré qu’entre un et deux mois, un défaut apparaît dans le transport du vecteur thérapeutique à l’intérieur des cellules, et que ce défaut s’accentue avec la progression de la maladie. Les procédures seront réalisées sur des souris adultes âgées de 1 à 6,5 mois. Les souris âgées d’un mois serviront à évaluer la capacité de nos approches à améliorer la diffusion du traitement dans tout l’organisme, tandis que celles de trois mois, présentant des signes intermédiaires de la maladie, permettront de mesurer l’efficacité du traitement pour stopper ou inverser son évolution.

Des tâches de locomotion de dix secondes, répétées pendant une heure au cours d'une unique séance : 412 souris vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue par une chirurgie terminale sous anesthésie profonde. Elles subissent avant cela une ou deux chirurgies d'une à deux heures pour injection virale et implantation d'un dispositif d'enregistrement, certaines étant isolées vingt-quatre à quarante-huit heures. Le porteur reconnaît que ces chirurgies entraînent inévitablement un stress et des douleurs, avec une perte de poids et un risque que l'animal endommage sa cicatrice à force de se gratter. Il s'agit d'enregistrer l'activité de neurones inhibiteurs pendant la marche libre, et l'effectif de 412 animaux est présenté comme "défini mathématiquement au plus juste", sans que le calcul soit donné.

Objectifs

Pour marcher, courir ou simplement bouger, notre système nerveux doit constamment ajuster la communication entre les neurones sensoriels (qui perçoivent les mouvements) et les motoneurones (qui les déclenchent). Dans la moelle épinière, des neurones appelés GABApré jouent un rôle clé dans ce réglage fin, en modulant les signaux entre les muscles et les motoneurones. Mais on connaît encore mal comment ces neurones agissent pendant le mouvement, car la plupart des recherches ont été faites ex vivo, dans des conditions peu naturelles. Ce projet a pour but de mieux comprendre le rôle des neurones GABApré pendant la marche libre chez la souris, en enregistrant leur activité en temps réel. Nous verrons aussi comment le blocage de ces neurones affecte la capacité de l’animal à s’adapter à des mouvements plus complexes. Enfin, une étude anatomique nous aidera à savoir si certains GABApré ont des rôles différents selon leur position dans la moelle, ce qui pourrait révéler une spécialisation fine dans le contrôle moteur.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera plusieurs bénéfices, à court et à long terme. À court terme, il permettra de mieux comprendre comment la moelle épinière ajuste les signaux sensoriels pour produire des mouvements fluides et adaptés. Grâce à des techniques innovantes, nous pourrons observer pour la première fois l’activité de certains neurones en temps réel, chez des animaux en mouvement libre. Ce travail contribuera aussi au développement de nouvelles méthodes de recherche combinant enregistrements neuronaux, manipulations ciblées et mesures précises du comportement. À long terme, ces avancées pourraient avoir des retombées pour la recherche médicale. En comprenant mieux les mécanismes naturels de filtrage sensoriel, ce projet pourrait ouvrir la voie à des stratégies thérapeutiques plus ciblées pour traiter certaines affections neurologiques, comme la spasticité, les douleurs neuropathiques ou les troubles moteurs liés à des lésions de la moelle épinière.

Procédures

Les animaux subiront, sous anesthésie, une chirurgie d’environ 1 à deux heures pour injection virale et/ou implantation de dispositif d’enregistrement (2h quand il s’agit des deux objectifs combinés) ou bien 2 chirurgies d'une heure avec un délai de récupération de 2 à 4 semaines. Deux semaines après la ou les chirurgies, ou 1h après dans le cas d’expériences terminales, les animaux effectueront des tâches comportementales de locomotion fine. Ces tâches durent une dizaine de secondes et sont répétées pendant un maximum 1h. Une seule session comportementale est prévue. Tous les animaux subiront une chirurgie terminale sous anesthésie profonde pour prélèvement de tissus.

Impact sur les animaux

Les chirurgies entraînent inévitablement un stress et des douleurs chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entraîner une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparaît également en quelques jours. Les tests comportementaux envisagés peuvent également être source de stress pour les animaux, ainsi que les contentions et les injections effectuées pendant les tests. Certains animaux devront être isolés pendant 24 à 48h, ce qui est également un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.

Remplacement

Le projet porte sur le rôle de l’inhibition présynaptique dans le contrôle de la locomotion, c’est-à-dire un circuit comprenant une sortie physiologique complexe. Un tel circuit est impossible à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doit être intact pour pouvoir être étudié. Il est impossible à modéliser numériquement car les propriétés des différents éléments sont encore méconnues. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini mathématiquement au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement fiables et robustes. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et obtenir des résultats spécifiques de genre. Les expériences seront effectuées de façon séquentielle, afin de finaliser les expériences de mise au point des différents outils avant d’effectuer les expériences de comportement, ce qui permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les chirurgies sont espacées d’au moins 2 semaines. Un temps d’habituation à la pièce et au dispositif d’enregistrement est prévu, sur 20-30 minutes pendant deux jours consécutifs. Pendant les tests comportementaux, une couverture de 5cm de mousse souple est placée sous le dispositif expérimental, afin d’amortir une éventuelle chute de l’animal. Les animaux sont manipulés grâce à une petite coupelle en plastique, afin d’éviter la préhension répétitive par la queue. Des animaux qui ne subissent par les chirurgies sont herbergés avec les animaux tests. Ils sont présents sur la plateforme d’arrivée des tests de comportements, réduisant ainsi le stress des animaux tests.

Choix des espèces

Pour étudier comment certains neurones contrôlent les mouvements, nous utilisons la souris. Ce choix est justifié car la souris permet de cibler très précisément des neurones grâce à des outils scientifiques avancés. Cela aide à comprendre comment les signaux qui freinent ou modulent les mouvements fonctionnent. La souris permet aussi d’enregistrer l’activité des neurones tout en observant les animaux bouger librement, ce qui est difficile à faire avec d’autres animaux. De plus, beaucoup d’études existent déjà sur les circuits nerveux de la moelle épinière de la souris, ce qui facilite l’analyse des résultats. Nous travaillons avec des souris d’au moins 21 jours, car à cet âge les circuits de contrôle des mouvements sont complètement développés et stables. Cela garantit que les résultats ne sont pas influencés par la croissance.

Soumises à une laparotomie de quarante-cinq minutes pour une électroporation in utero du placenta, 72 souris gestantes sont utilisées dans ce projet, qui compte 1 008 souris au total, toutes tuées à l'issue dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur descendance passe des tests sensorimoteurs quotidiens, avec un test moteur de trente minutes à quinze puis quarante-cinq jours. L'objet est de réprimer deux facteurs placentaires pour reproduire les effets d'une exposition prénatale à l'alcool sur la migration des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. Le porteur écrit que l'électroporation in utero n'entraîne "aucune nuisances ou effets indésirables sur l'embryon", alors que le projet consiste à provoquer chez ces embryons des troubles du neurodéveloppement.

Objectifs

Le projet présenté répond à un problème de santé public majeur, à savoir l’exposition prénatale à l’alcool. En effet, l’alcool présente de nombreuses cibles et notamment les vaisseaux sanguins. Il a été mis en évidence que l’exposition prénatale à l'alcool désorganise les vaisseaux sanguins et perturbe l’expression de certains acteurs importants dans la mise en place des vaisseaux, comme le Placental Growth Factor et la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome. Cette dérégulation des vaisseaux retentie sur la mise en place des cellules neurales qui utilisent les vaisseaux comme support de migration. En effet, les oligodendrocytes et les neurones inhibiteurs, qui migrent de manière vasculo-associée, présentent un défaut de positionnement à la suite d’une exposition prénatale à l'alcool. Enfin, l’exposition prénatale à l'alcool entraine des troubles du neurodéveloppement à la fois au niveau cognitif et moteur qui pourrait s’expliquer par le défaut de positionnement des cellules neurales. Le placenta est un organe transitoire présent au cours de la grossesse qui assure des fonctions endocrines, immunitaires et métaboliques. Il synthétise le Placental Growth Factor et la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome indispensables au bon développement du fœtus. En effet, la diminution au niveau du placenta de ces acteurs entraine une désorganisation des vaisseaux dans le cerveau, à l’image de celle observée à la suite d’une exposition prénatale à l'alcool et apporte une nouvelle preuve d’un axe placenta-cerveau fonctionnel. Cependant aucune étude ne fait le lien entre les acteurs placentaires et l’apparition de troubles du neurodéveloppement. Ce qui fait l’objet de cette étude. Le premier objectif ayant pour but d’étudier les effets de la diminution au sein du placenta du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome sur la mise en place des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. Le second objectif est d’étudier les conséquences sur le comportement sensorimoteur de la jeune descendance et le comportement moteur du jeune adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’une part de comprendre l’impact de l’environnement fœtal (notamment l'exposition prénatale à l'alcool) sur le devenir des individus et d’autre part d’identifier dès la naissance de potentiels cibles permettant de prédire l'apparition de troubles du neurodéveloppement. Nous nous attendons a observé qu’une diminution au niveau placentaire du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome ait un impact sur le développement du cerveau et le comportement des souriceaux en réponse à l'exposition prénatale à l'alcool, notamment dans la mise en place et la maturation des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs : soulignant le rôle important de l’axe placenta-cerveau. De plus, ce projet permettra le suivi à long terme des individus dont l’environnement fœtal aura été modifié par l'exposition prénatale à l'alcool.

Procédures

Les femelles gestantes (72 femelles) subiront une chirurgie d’électroporation in utero d’une durée de 45 minutes par femelle. La descendance suivra des tests sensorimoteurs, d’une durée maximale d’une minute par test, par animal et par jour. Le test moteur à P15 et P45 sera réalisé une fois par animal pour une durée de 30 minutes.

Impact sur les animaux

L’électroporation in utero n’entraine aucune nuisances ou effets indésirables sur l’embryon, l’injection dans le placenta peut provoquer une petite gène de quelques secondes lors de l’insertion de l’aiguille. La laparotomie réalisée sur la femelle gestante pourrait entraîner une douleur d'une durée estimée à 24 heures qui sera contrôlée par une analgésie pré- et post-opératoire.

Devenir

A chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. En effet, il est nécessaire d’étudier la mise en place des structures cérébrales des individus dont l’environnement maternel aura été modifié afin de mieux comprendre le rôle du placenta dans le neurodéveloppement et de pouvoir corréler ces observations avec les troubles du neurodéveloppement.

Remplacement

Dans ce projet visant à étudier l’impact de l’environnement fœtal sur le devenir des individus, les expériences in vivo ne peuvent à l’heure actuelle pas être remplacées par des études in vitro. Les études de l’interaction inter-organe placenta-cerveau ne peuvent se faire que sur des individus vivants et l’évaluation du devenir cognitif de ces individus dont l’environnement fœtal aura été modifié ne peut s’effectuer que par des études sur les animaux. Aucune approche de remplacement n’est aujourd’hui disponible dans les études pré-cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au minimum nécessaire pour atteindre l’objectif scientifique de cette étude. Les procédures comportementales de ce projet sont non invasives et un même animal sera soumis aux différents tests dès que possible. Le nombre d’individu est de 14 (7 dans chaque groupe). Avec une perte estimée à 30%, le nombre de femelles gestantes nécessaire est de 10 par groupe. Des animaux des deux sexes issus de la descendance seront utilisés pour cette étude puisqu’il a été démontré un effet sexe au cours du neurodéveloppement et lors de la mise en place des comportements. Lors des analyses, si aucun effet sexe n’est détecté, alors les animaux seront regroupés afin de réduire au maximum. Selon les expérimentations et les comparaisons à effectuer les tests statistiques appropriés seront choisis.

Raffinement

Pour raffiner, les femelles gestantes dont les souriceaux seront prélevés après la naissance seront hébergées dans des cages individuelles avec enrichissement (nid en carton, lanières de papier kraft, tunnel). Cet hébergement individuel est nécessaire afin d'éviter le cannibalisme des femelles entre les portées à la naissance. Les animaux seront maintenus dans un environnement contrôlé et stabilisé (température de 21°C, hydrométrie à 55 %, luminosité à 100 lux avec une durée de cycle jour/nuit 12h/12h). Après l’intervention, les femelles gestantes seront remises dans leur cage avec accès dans la cage à l’eau et à la nourriture. Elles seront par la suite surveillées par les porteurs du projet (suivi de la douleur, suivi des points de suture, prise de poids, évaluation du comportement). Si des points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde. A la naissance des souriceaux, ceux-ci seront manipulés lors des différents tests comportementaux et remis immédiatement, après chaque test, au contact de leur mère. Au jour 21, les souriceaux seront sevrés, séparés selon leur sexe et hébergés par 5 individus au maximum par cage contenant un environnement enrichi (nid, tunnel, lanières de papier kraft).

Choix des espèces

Ce projet s’inscrit sur une volonté de mieux comprendre la communication placenta-cerveau et d’identifier des marqueurs diagnostics d’atteintes cérébrales liés au changement de l’environnement placentaire capables d’avoir des répercussions sur le devenir des individus. La souris est un modèle de choix pour l’étude de nombreux systèmes complexes comme ceux retrouvés au cours du neurodéveloppement. De plus, la maturation corticale des souriceaux est le reflet de la maturation corticale du cortex humain. Ainsi, l’étude chez le souriceau permet de répondre à la problématique de la neuroplacentologie. Ce choix se justifie également par l’abondante littérature et par l’expérience du laboratoire qui contribuent à réduire le nombre d’animaux à utiliser. Les femelles gestantes seront utilisées au 13ème jour de vie embryonnaire afin de réalisée l’électroporation in utero placentaire. Ce stade développemental a été choisi sur la base des études précédentes et d’un point de vu neurodéveloppemental correspond au début des vagues de migration cellulaire des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. La descendance sera prélevée au 20ème jour de vie embryonnaire et au 2ème jour après la naissance afin d’évaluer les conséquences de la répression placentaire du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome, d’une part, sur le développement cortical du fœtus et sur son placenta apparié et d’autre part sur l’angiogenèse corticale et la migration vasculo-associée des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. La descendance sera étudiée en comportement et sera prélevée au 15ème jour après la naissance ou au 45ème jour après la naissance afin d’évaluer les conséquences de la répression placentaire du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome sur le comportement à court et moyen terme et sur le neurodéveloppement.