Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Maintien de lignée murine hémophile A et B sous forme respirante
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Un poinçon dans l'oreille au quinzième jour de vie, deux minutes de contention comprises : 312 souris nées hémophiles A ou B en passent par là. 270 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 42 un niveau modéré, 270 sont tuées et 42 réutilisées, les reproducteurs des trios renouvelés tous les quatre mois finissant en banque de tissus. L'objet est l'entretien de l'élevage lui-même, pour alimenter en souris hémophiles A et B d'autres expériences sur la destruction des articulations. Le porteur précise que la souris hémophile, contrairement à la forme humaine de la maladie, ne saigne pas spontanément et ne saigne qu'après un traumatisme, et que les souris de génotype non hémophile sont mises à mort.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes de la destruction articulaire induite par l’hémophilie permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques mais également de disposer de nouveaux outils de diagnostic précoce. Ce projet nous permet donc d’obtenir des souris hémophile A et hémophile B en bonne santé et sans manifestations hémorragiques pour assurer la continuité de la lignée. Ce projet nous permet également d’acquérir des informations d’élevage spécifique aux modèles employés afin de mieux répondre aux critères des 3R.
Procédures
Durant la phase de maintien de la lignée, les souris ne subissent aucunes procédures, lors du bacrossing et génotypage, un prélèvement à l’oreille est réalisé au 15ème jour de vie, durée éstimée à 2min : contention + prélèvement.
Impact sur les animaux
Au cours du maintien, le modèle est maintenu sous la forme hémophile homozygote KO pour les modèles d’hémophilies A et B et ne fait attendre aucune nuisance de type saignement, mortalité foetale ou post-natal, seul les portées des souris hémophiles A sont réduites (4-6 animaux par portée) par rapport aux souris hémophiles B (8-10 animaux par portée). Le poiçon réalisé à l'oreille à 15jours de vie des animaux, selon les bonnes pratiques vétérinaires, se superpose avec l'opération d'identification et ne nous fait attendre aucune douleur. Seule la contention des animaux peut engendrer un léger stress chez les animaux, stress compatible avec la survie des animaux.
Devenir
Au cours de la procédure 1 : les souris sont mise en reproduction et tous les 4 mois les trios sont renouvelés. Les souris issus des anciens trios sont mis à disposition pour la réalisation de prélèvement post mortem et ainsi constituer une banque de tissus contrôle. A la fin de la procédure 2, les animaux sont mis en reproduction et les animaux de génotype non hémophiles sont mis à mort.
Remplacement
Le recours aux modèles in vitro ou in silico est impossbile dans l'étude de l'arthropathie hémophilique, en effet, le modèle d'étude nécessite un système vasculaire et locomoteur fonctionnel et en lien direct.
Réduction
Les animaux nécessaires au maintien de la lignée sous forme respirante sont limités à 3 trios reproducteurs maximum par modèle d’hémophilie soit 6 trios au total la première année. A la fin de cette première année, les données acquises nous permettrons de réviser le nombre de souris.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal par l'application des points limites stricts et spécifiques du projet et l'utilisation d'anesthésie et d'antalgie lors des gestes expérimentaux.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, les souris sont maintenues en élevage jusqu’à leur puberté avant d’être mises en reproduction.
Etude du transfert de la leptine périphérique vers le cerveau chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées au terme d'une heure d'expérience pour que leur cerveau soit prélevé, 72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une instillation dans le nez pendant deux minutes alors qu'elle est éveillée, une injection dans l'abdomen trente minutes plus tard, puis passe sur la table d'opération sous anesthésie. Il s'agit de vérifier qu'un peptide administré par le nez fait passer la leptine du sang vers le cerveau, pour éviter l'injection directe dans le cerveau lors des expériences suivantes et viser, à terme, l'obésité et le diabète. Le porteur affirme que les traitements "ne devraient pas entraîner de douleur, d'inflammation ou de changements de comportement" tant que les doses sont respectées, alors que cette heure se termine par une chirurgie dont les souris ne se réveillent pas.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de valider chez la souris, la voie d’administration intranasale de l'octapeptide OP et de l’antagoniste de son récepteur dans la facilitation du transport de la leptine periphérique vers le cerveau et ses effets. Il s’inscrit dans une étude plus vaste qui vise à comprendre comment le système OP/récepteur influence ce transport en portant un éclairage sur les mécanismes de contrôle du poids et de l'appétit. Ce projet vise plus spécifiquement à proposer la voie intranasale, non-invasive, comme une alternative efficace à l’administration intracérébroventriculaire de l’OP, ouvrant ainsi la perspective d’une approche translationnelle vers une nouvelle stratégie thérapeutique des troubles métaboliques et de l'obésité.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet devraient permettre des avancées significatives dans la recherche fondamentale et translationnelle concernant le mode d'accès de la leptine au cerveau. La littérature rapporte l’efficacité de l’OP, administré par la voie intracerebroventriculaire, à faciliter l’accès de la leptine au parenchyme et à activer sa signalisation. Cette étude pourrait démontrer que l’instillation d’OP favorise, de la même façon, le passage de cette hormone hypoglycémiante périphérique au cerveau pour y produire son effet anorexigène. Cette validation aura des conséquences positives sur les futures expériences pré-cliniques en s’affranchissant définitivement du geste invasif d’administration intracérébroventriculaire stéréotaxique voire clinique avec une voie d’auto-administration facile et acceptable par les patients.
Procédures
Dans le cadre de cette étude, les souris seront soumises à trois gestes techniques sur une durée totale d’une heure. Tout d'abord, une administration intranasale (2 minutes environ) sera réalisée sur des animaux vigiles suivie d'une injection intrapéritonéale (2 minutes) après trente minutes. Enfin, une chirurgie terminale sous anesthésie et couverture analgésique sera effectuée en vue du prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
À priori, nous ne prévoyons pas d'incidents majeurs chez les animaux utilisés dans ce projet qui s’étend sur 1 heure. Cependant, une surveillance accrue sera mise en place dans la seconde demie-heure pour les animaux injectés afin de détecter tout signe d'hypoglycémie. Il est important de noter que les traitements ne devraient pas entraîner de douleur, d'inflammation ou de changements de comportement préjudiciables au bien-être des animaux, tant que les doses définies sont respectées. La chirurgie thoracique terminale est précédée d’une prise en charge analgésique et anesthésique.
Devenir
Mise à mort des animaux pour des analyses post mortem.
Remplacement
Le projet scientifique vise à valider la voie d’administration intranasale d’OP pour faciliter le transport de la leptine produite par le tissue adipeux vers le cerveau afin d’envisager un transfert en clinique humaine comme un nouveau traitement contre l'obésité et le diabète. Dans la mesure où aucun modèle de substitution permettant de mener à bien cet objectif physiologique n’est actuellement disponible et devant la complexité des mécanismes mis en jeu et leur interconnexion, l’étude sera réalisée in vivo chez la souris, puis ex vivo. De plus, de nombreux modèles de souris ont déjà été développés afin de mieux appréhender l’origine des dérèglements centraux de l’homéostasie énergétique et proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques.
Réduction
En accord avec nos expériences antérieures et pour limiter le nombre d’animaux utilisés, l’étude est conduite sur des lots de 12 souris (6 males et 6 femelles) par condition de traitement qui suivront l’ensemble des gestes expérimentaux. Ces effectifs nous assurent d’obtenir des données statistiquement comparables, y compris en fonction du sexe.
Raffinement
Les souris sont maintenues en cage standard conformément à la réglementation avec un enrichissement du milieu de vie constitué de nids en copeau de peuplier au moins une semaine avant le début du projet. Les gestes expérimentaux sont menés dans une pièce adjacente de la zone d’hébergement. Par ailleurs, les animaux sont surveillés avant et pendant toute la durée du protocole (1 heure d’expérimentation par animal) et leur score confronté à la grille de score détaillée incluant des points limites adaptés. Les gestes techniques sont réalisés en présence d’une médication appropriée.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré (in vivo sur animal entier) peut nous permettre de comprendre, de façon globale, la contribution du système OP/récepteur dans l’homéostasie énergétique et comment il peut être instrumentalisé pour rééquilibrer les dysfonctions de la leptine liées aux pathologies associées. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie (taille et coûts d’entretien réduits, bonne performances reproductives). De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques de l’altération du comportement alimentaire car elle est relativement sensible à une modification de son régime alimentaire. Afin de mener à bien nos objectifs, nous effectuerons nos expériences sur des souris adultes âgées de 6 à 10 semaines. En effet, à cet âge les souris ont terminé leur croissance longitudinale et la prise de poids est minimale après cette période.
Identification des mécanismes moléculaires du développement des cellules épendymaires multiciliées chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Comprendre comment se forment les cellules ciliées qui tapissent les cavités du cerveau, et l'origine de certaines maladies neurologiques : 2 037 souris vont y être utilisées. 1 987 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 un niveau léger, et toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Des femelles gestantes sont gavées ou reçoivent un traceur sous la peau, leurs petits sont biopsiés à la queue le jour de la naissance, puis certains reçoivent une injection dans le cerveau suivie d'impulsions électriques, deux minutes par animal. Le porteur indique que le gavage peut léser l'œsophage et provoquer des mises bas prématurées ou difficiles, et que l'électroporation peut entraîner des microlésions du cerveau ou le rejet du souriceau par sa mère, tout en estimant à cinq ou dix animaux la taille optimale par stade d'analyse, pour un total de 2 037 souris.
Objectifs
Les objectifs de notre projet de recherche sont d'une part de comprendre comment les cellules souches se développent le long des parois des ventricules du cerveau pour former différents types de cellules gliales. D'autre part, nous cherchons à comprendre l'origine de pathologies humaines telles que les ciliopathies et les maladies psychiatriques. Nous souhaitons donc utiliser des souris génétiquement modifiées afin de mimer ces pathologies humaines et ainsi identifier l'origine développementale de ces pathologies. A plus long terme, ce projet permettra de mieux identifier l'origine des dysfonctionnements dans certaines pathologies neurologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'identifier les cascades moléculaires complètes du développement des cellule multiciliées du cerveau, les épendymaires qui tapissent les murs ventriculaires et les cellules du plexus choroïde. Nous pourrons ainsi mieux comprendre les étapes qui dysfonctionnent dans des conditions pathologiques telles que les tumeurs cérébrales et les maladies neurologiques (220 000 nouveaux cas chaque année en France). A plus long terme, nous pouvons envisager de nouveaux traitements thérapeutiques pour améliorer les conditions de vie des patients.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à différents gestes techniques selon les questions scientifiques: 1- prélèvement caudal unique sur des souris vigiles le jour de la naissance de quelques secondes pour génotypage, 2- injection sous cutanée unique en quelques secondes de femelles gestantes et vigiles d'un traceur afin de réaliser un marquage des cellules d’intérêt chez les embryons puis euthanasie réglementaire des animaux sous analgésie et anesthésie en quelques minutes à différents stades, 3- gavage unique en quelques secondes de femelles gestantes et vigiles avec une solution permettant d’induire le modèle expérimental puis euthanasie des animaux par une méthode réglementaire en quelque secondes à différents stades, 4- injection unique au niveau cérébral sous analgésie et anesthésie, application d’impulsions électriques permettant l’introduction du traceur génétique chez les nouveaux-nés (environ 2 minutes par animal) puis euthanasie des animaux par une méthode réglementaire à différents stades.
Impact sur les animaux
Les injections effectuées afin de procéder à un marquage cellulaire, une analgésie ou une anesthésie seront réalisées par voie sous-cutanée et pourront induire un stress pendant la contention ainsi qu’une douleur légère de courte durée consécutive à l’introduction de l’aiguille. La molécule administrée par gavage aux femelles gestantes peut avoir un impact sur le déroulement de la gestation des femelles, provoquer des mises bas prématurées ou des difficultés de mise bas et avoir aussi un impact sur les embryons et nouveaux-nés. De plus, la méthode d’administration par gavage peut induire des lésions de l’œsophage ou de l’inflammation. L’électroporation à la naissance (injection au niveau du cerveau suivi de l’application de quelques impulsions électriques) peut entraîner des microlésions du cerveau et pourrait dans de rare cas entraîner un rejet par la mère ou un défaut de prise de poids. Concernant les anesthésies, les effets secondaires peuvent être les suivants : détresse respiratoire, réveil de l’animal et stress thermique. Dans le cadre de l'identification génétique des animaux, une biopsie caudale sera réalisée à la naissance. Les effets indésirables peuvent être le stress engendré par la contention/manipulation, la douleur légère et locale ainsi que la possibilité de saignement à la suite de la biopsie.
Devenir
L'ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites. Pour l'ensemble du projet, les cerveaux des souris seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
Aucune technique ou outil biologique n'est actuellement disponible pour mimer correctement le développement des cellules multiciliées de cerveau de mammifères que nous étudions. En effet, nos résultats expérimentaux de cultures primaires démontrent que seuls certains aspects du développement épendymaire peuvent être étudiés in vitro. Certains mécanismes moléculaires semblent mal récapitulés dus, en partie, à la non-conservation de la structure tridimensionnelle de l'épithélium ventriculaire. De façon similaire, les résultats préliminaires obtenus sur des cultures d'organoïdes démontrent l'absence de cellules épendymaires dans ces modèles.
Réduction
Un total de 2037 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous utiliserons des mâles ou des femelles indifféremment pour réduire le nombre d'animaux et la taille de chaque stade d'analyse a été optimisée pour pouvoir utiliser le test statistique approprié et obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Nous estimons à 5 ou 10 animaux la taille optimale par stade d'analyse en fonction de la procédure.
Raffinement
Trois catégories de mesures de raffinement seront mises en œuvre et concerneront les aspects liés aux procédures, l'établissement de points limites ainsi que l'hébergement et l'enrichissement de l'environnement des souris. Nous réduirons au maximum l'inconfort des souris car les procédures que nous mettrons en œuvre sont établies afin de limiter la douleur, l'angoisse ou le stress. Nous appliquerons des soins et ou actes nécessaires. Durant les procédures expérimentales, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Nous examinerons en parallèle le comportement et l'apparence des souris ayant subi une procédure pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté. La présence de points limites définis et adaptés pour chacune des procédures nous permettra de détecter toute souffrance chez les souris consécutivement, ou non, à la réalisation d'un acte et non conduiront à l'arrêt de la procédure en cours. Les animaux sont hébergés dans des conditions respectant la règlementation en vigueur à savoir : l’hébergement en surpression, les portoirs avec des cages ventilées individuellement, le nombre d’animaux par cage), eau et nourriture à volonté, change litière et biberon hebdomadaire, vérification quotidienne, température et hygrométrie contrôlées, intensité et durée d’éclairage définies, enrichissement du milieu (papier kraft, coton et maison en carton). L'ensemble des procédures seront toujours réalisées par des personnes formées et compétentes.
Choix des espèces
Le projet a pour objectif d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement des cellules multiciliées des mammifères. Nous utiliserons le modèle murin car la souris présente un développement proche de celui de l’homme. De plus la durée de gestation courte ainsi que la taille des portées permettent de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences et à partir de peu de parents. La disponibilité d’un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiées, qui permettent d'induire ou inhiber l'expression de certains gènes d'intérêt, fait du modèle murin un modèle de choix pour répondre aux questions scientifiques. Nous utiliserons des femelles adultes matures sexuellement qui seront rendues gestantes par accouplement contrôlé afin de connaître précisément le stade de gestation afin d’induire les modèles expérimentaux. Par la suite les animaux seront étudiés au cours du développement cérébral (entre le jour de la naissance et 20 jours postnatal) parce que nous avons établi que les cellules d’intérêt sont spécifiées avant le stade embryonnaire et entièrement différenciées et matures au 15ème jour postnatal et constitue donc notre fourchette d’analyses dans ce projet.
Rôles de protéines associées à la neuroinflammation dans les traumatismes de la moelle épinière [EU 1/2]
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Surnuméraires issus de croisements réalisés pour un autre projet, 192 souris sont transférées d'un site à l'autre sur 2,7 kilomètres avant d'être opérées. 96 d'entre elles subissent une section de la moitié de la moelle épinière, trente minutes sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les 96 autres un niveau modéré, toutes tuées pour que leurs tissus soient prélevés. La patte arrière du côté lésé reste paralysée, le contrôle du sphincter urinaire est altéré, des escarres peuvent se former, et les souris passent par des tests de marche, de coordination, de force d'agrippement, de qualité du nid sur vingt-quatre heures et de temps de toilettage, échelonnés de sept jours avant la lésion à six semaines après. Le porteur indique que les cultures de cellules nerveuses ne reproduisent pas la complexité de l'organisme et conclut que le recours aux animaux "demeure crucial" pour envisager des applications cliniques.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière touchent 2.5 millions de patients dans le monde (dont 40 000 en France) et induisent des symptômes allant de troubles neurologiques minimes à la tétraplégie complète souvent associés à des douleurs chroniques. Bien que les lésions de la moelle épinière touchent des personnes relativement jeunes (moyenne d’âge à 40 ans), le nombre de patients plus âgés est en nette croissance dans les pays industrialisés. L’étude de cette pathologie représente un enjeu majeur. Il n'existe aucun traitement curatif efficace pour aucun des symptômes induits par une lésion de la moelle épinière. Il est donc de grand intérêt de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à augmenter la récupération motrice et sensitive suivant une lésion de la moelle épinière. Après une lésion de la moelle épinière une cicatrice se forme et constitue un obstacle à la transmission des informations depuis le cerveau au reste du corps ainsi que du corps vers le cerveau. Les cellules immunitaires du système nerveux central jouent un rôle prépondérant dans les réponses neuroinflammatoires suite à une lésion de la moelle épinière. Nous voulons étudier si l’absence d’expression de protéines spécifiques qui sont modulées après lésion de la moelle épinière et associées à la neuroinflammation favorise une meilleure récupération. . Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière induisent des symptômes allant de la paraplégie partielle à la tétraplégie complète. Il n’y aucun traitement permettant de soigner les patients. Développer des travaux visant à favoriser la récupération après lésion de la moelle épinière représente donc un enjeu majeur tant sur le plan de la santé individuelle que sur le plan économique et social. Nous cherchons à caractériser les conséquences de l’absence d’expression de deux protéines spécifiquement dans un type de cellule du système nerveux au niveau de la moelle épinière dans un contexte pathologique tant sur le plan cellulaire et tissulaire que comportemental. Nous obtiendrons des informations importantes sur le rôle de ces protéines qui restent méconnues à ce jour dans les lésions de la moelle épinière lors de la mise en place et le maintien de l’inflammation. Cette étude permettra de déterminer précisément leur importance après lésion moelle épinière chez les deux sexes et d’envisager des stratégies appropriés pour une approche visant à développer des thérapies adaptées.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Les animaux recevront des injections quotidiennes (moins d’1 minute) en intra-péritonéal durant 5 jours à l’âge de 5-8 semaines. Les animaux seront transférés du site 1 vers le site 2 selon la réglementation et avis du vétérinaire. Sur le site 2, les animaux subiront des lésions de la moelle épinière sous anesthésie générale et analgésie (30 min ; n=96). Les animaux seront évalués au niveau comportemental pour déterminer les fonctions motrices et évaluer l’anxiété avant et après lésion de la moelle épinière. L’évaluation comportementale analysera l’activité motrice spontanée durant 8 minutes, la marche et la coordination des animaux durant 10 minutes et la force d’agrippement des animaux (2 minutes par animal par session). Les manipulations peuvent engendrer un stress léger. Les tests seront faits 7 jours et 24 heures avant la lésion, puis à J3, J5, J7, J10 et J14 postopératoire puis 1 fois par semaine jusque 6 semaines post-opératoires. Les comportements de type anxieux seront évalués par des tests qui évaluent la qualité du nid fait par un animal durant 24 heures, le temps de toilettage durant 5 minutes, et le temps que met l’animal à aller au contact de la nourriture durant 5 minutes. Ces tests seront effectués deux fois, au début et à la fin de la procédure. Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d’organes post-mortem.
Impact sur les animaux
Une anesthésie peut induire une hypothermie transitoire et un dessèchement de la cornée. Les injections quotidiennes en intra-péritonéal peuvent induire un stress pour l’animal. Le transport et le changement de site peut induire un stress pour l’animal. Nuisances motrices : paralysie de la patte arrière du côté de la lésion de la moelle épinière (hémisection). Une récupération spontanée du support de poids est observée dès le 5ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Nuisance urinaire : le contrôle du sphincter urinaire est altéré après une hémisection, une récupération spontanée est observée dès le 7ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Suite à la chirurgie les animaux sont observés quant au développement de signes légers relatifs à la détérioration de l’état de santé de l’animal. 24-48hrs suivant la lésion, les animaux peuvent présenter des signes de douleurs. Suite à la chirurgie, une perte de poids est observée pendant 1 à 2 jours après la lésion. A cause de la paralysie des escarres peuvent se former. Suite à la lésion, des comportements de dominance peuvent être observés. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Devenir
A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés afin collecter les tissus d’intérêt pour faire des analyses post mortem histologiques et cellulaires.
Remplacement
Pour éviter l'expérimentation animale, on encourage l'utilisation de cultures de cellules nerveuses. Cependant, ces cultures ne peuvent pas reproduire entièrement la complexité des organismes vivants. Les modèles animaux de traumatisme de la moelle épinière sont actuellement considérés comme la méthode la plus adaptée pour étudier cette pathologie, car ils reproduisent de manière fidèle les différents aspects pertinents chez l'humain. Ces modèles permettront d'explorer les changements provoqués par l'absence d’expression de 2 protéines du système nerveux de manière spécifique dans un type de cellule et faciliteront l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. L'utilisation d'animaux est nécessaire à cette étape préclinique et demeure cruciale pour envisager des applications cliniques.
Réduction
Les animaux sont utilisés pour plusieurs analyses, les deux sexes sont utilisés. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire. Nous avons également calculé le nombre d'animaux avec un logiciel de biostatistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant des effectifs pertinents pour répondre à notre hypothèse biologique. Ces animaux sont générés et aussi utilisés dans le cadre d’une autre demande de projet et nous utiliserons les animaux surnuméraires issus des croisements effectués sur le site 1. De plus, cela évitera de développer cette lignée en doublon dans l'animalerie du site 2.
Raffinement
Les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages de transport agréées sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 2,7km). Puis période d’acclimatation pour les animaux d’une période de 7 jours sur le site d’accueil. Afin de réduire le stress, les expérimentateurs seront toujours les mêmes au cours de l’étude et les animaux seront habitués aux tests. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement de l’environnement (hutte, coton). Pour la gestion de la douleur, utilisation d’anesthésiants et d'analgésiques adaptés mais compatible avec les lésions de la moelle épinière et le type de données analysées. Afin de réduire la souffrance : soins quotidiens spécifiques. L'absence de signes anormaux sera vérifié 2 fois par jour après la lésion. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux le plus utilisées dans le cadre de la recherche sur les lésions de la moelle épinière, en particulier avec le développement de plusieurs modèles chirurgicaux différents (section, compression, contusion). Ces 2 souches de souris génétiquement modifiées n’expriment pas une protéine du système nerveux central dans un type de cellules associé à la neuroinflammation. Cela en fait donc des modèles de choix pour déterminer les conséquences de l’absence de ces protéine après une lésion médullaire sur l’inflammation. Les animaux sont opérés à 3 mois et observés pendant 6 semaines. Nous utilisons des animaux adultes car les souris plus jeunes présentent des phénomènes de récupération spontanée non seulement plus importants mais surtout non homogènes. Ceci n’est ni compatible avec des analyses statistiques fiables ni avec notre optique de transposition à la clinique.
Développement d’un modèle rongeur diurne pour l’étude du rôle de l’ABCA4 dans le développement de la maladie de Stargardt (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
208 rats des sables, des rongeurs diurnes de l'espèce Psammomys obesus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous seront tués pour analyser leur rétine. Âgés de 10 à 20 jours et encore avec leur mère, ils reçoivent sous anesthésie une injection d'une dizaine de minutes sous la rétine. Dans la plupart des expériences, un œil reçoit ainsi une construction qui inactive le gène en cause dans la maladie de Stargardt, l'autre une construction témoin. Suivent des électrorétinogrammes de moins d'une heure, des examens d'imagerie et de fond d'œil, tous sous anesthésie, et des transports entre deux établissements. La thérapie génique évoquée ne viendrait qu'ensuite : "Si le modèle récapitule les caractéristiques principales de la maladie il sera utilisé dans une deuxième phase", écrit le porteur.
Objectifs
La maladie de Stargardt est une maladie qui affecte l’œil, et constitue la forme de dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Elle touche souvent des personnes jeunes et provoque un handicap visuel lourd dû à la perte de la partie centrale de la rétine, nommément la macula qui est riche en cônes. Les mécanismes pathogènes ont été largement analysés dans une souche de souris modifiée qui n‘exprime pas le gène responsable. Néanmoins, ces souris ne présentent pas les déficits observés chez les patients. Contrairement aux rongeurs nocturnes (rat et souris), le rongeur diurne appelé Rat des Sables (Psammomys obesus) présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, car nous avons montré que sa rétine riche en cônes ressemble fortement à celle de l’homme. L’objectif du projet qui est un projet multisite qui se déroule dans deux établissements utilisateurs est de développer un nouveau modèle animal dans lequel le gène responsable sera invalidé spécifiquement dans la rétine. Les conséquences de la mutation induite seront étudiées par des méthodes non-invasives permettant de suivre la dégénérescence lente de la rétine grâce à l’évaluation longitudinale de la fonction de la rétine et à l'obtention d'images de l’œil. Des analyses cellulaires et moléculaires viendront compléter l’étude. Ainsi, ce modèle permettra d’éclaircir les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie de Stargardt. Si le modèle récapitule les caractéristiques principales de la maladie il sera utilisé dans une deuxième phase pour tester une thérapie génique, potentiellement capable de contrecarrer la dégénérescence et maintenir la fonction des photorécepteurs.
Bénéfices attendus
L’utilisation du modèle rongeur Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme chez l’homme, va permettre d’étudier les mécanismes de la maladie de Stargardt et de tester une potentielle thérapie génique. Il est évident que si des effets bénéfiques suite à l’administration de la thérapie géniques ont constatés, cela ouvre des perspectives importantes pour les patients atteints de la maladie de Stargardt, qui est actuellement sans traitement.
Procédures
Les procédures décrites dans ce projet comprennent une injection sous-rétinienne (EU1/2) et une analyse fonctionnelle de la vision à l'aide de méthodes non invasives, nommément électrorétinogramme (ERG, EU1/2), tomographie par cohérence optique (OCT, EU2/2) et fond d'œil (EU2/2). L'injection sous-rétinienne s’effectue sous anesthésie gazeuse suivie d’une anesthésie locale et de l’application d’un gel limitant le dessèchement de l’œil. Sa durée est d'environ 10 minutes pour chaque animal. ERG (< 60 minutes), OCT et fond d'œil (< 15 minutes) sont des méthodes non invasives, réalisées sous anesthésie car elles nécessitent l’immobilité de l’animal.
Impact sur les animaux
L’injection sous-rétinienne chez les nouveaux nés de Psammomys obesus, n’engendre, en général, aucune lésion ni altération de la fonction visuelle. Toutefois nous ne pouvons exclure l’apparition d’une infection, d’une inflammation ou de dommages à l’œil injecté lors de son développement ou d’une douleur transitoire. L’ERG et l’imagerie sont des méthodes non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière mais une inflammation de l’œil n’est pas à exclure suite à l’ERG, même si son occurrence est minimisée à travers l’utilisation de gel ophtalmique. Le transport entre les deux EU pourra induire un stress aigu transitoire chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour analyses ultérieures moléculaires et cellulaires de la rétine.
Remplacement
A ce jour aucun modèle in vitro ne permet de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles (ce qui nous concerne ici). Toutefois, la technique de modification du gène responsable de la maladie de Stargardt a été validée par analyse génomique et par nos observations expérimentales précédentes.
Réduction
Pour la majorité des expériences chaque animal est son propre contrôle. A savoir un œil est injecté avec une construction contrôle et l’autre avec une construction qui permet d'obtenir l’inactivation du gène impliqué dans la maladie de Stargardt. Le nombre d'animaux a été évalué au maximum en prenant en compte le risque potentiellement engendré par l’injection, ainsi que la variabilité interindividuelle pour aboutir à des résultats significatifs lors de la comparaison entre l’œil contrôle et l’œil traité. Il s'agit également d'une étude où le même animal est suivi à plusieurs temps après injection (étude longitudinale) ce qui contribue à réduire le nombre d'animaux utilisés. Dans cet avenant le nombre total d’animaux de la procédure 1 a été réduit car les données obtenues ont permis de déterminer que la dégénérescence débute précocement et que les temps de mise à mort tardifs initialement prévus ne sont pas nécessaires.
Raffinement
Les animaux au stade de développement P10-20 sont hébergés avec leur mère et leur fratrie, afin de respecter les interactions sociales et dans un environnement enrichi (matériel de nidification et bâton à ronger), afin de stimuler leur activité motrice. Après le sevrage les animaux sont hébergés en groupes sociaux comprenant 2 à 3 individus de même sexe, afin de respecter les interactions sociales et dans un environnement enrichi (bâton à ronger, tunnel), afin de stimuler leur activité motrice. Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum, qui est adaptée selon l’état physiologique des animaux (mère allaitante, animaux sevrés, adultes). Lors de l’injection sous-rétinienne les animaux au stade de développement P10-20 sont placés sur tapis chauffant et sous anesthésie générale, à laquelle est rajoutée une anesthésie locale de l’œil. Après l’intervention, l’application d’un gel ophtalmique permet d’éviter un desséchement de la cornée. Lors de l’ERG, de l'OCT et du fond d'œil, les animaux sont placés sous anesthésie, complétée d’une analgésie locale pour l’ERG. L’application de gel ophtalmique permet ici aussi d’éviter tout desséchement de l’oeil. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être : deux fois par jour le jour d’une intervention (injection, FO + OCT, ERG), puis une fois par jour jusqu’à la fin de la procédure. Pendant ces surveillances, l’aspect des yeux sera minutieusement inspecté. En cas d’infection ou de douleur manifeste, les animaux seront mis à mort immédiatement selon une méthode adaptée à l’âge de l’animal. Les deux sites expérimentaux sont distants de moins de 10 km. Les animaux sont transportés entre sites expérimentaux, en présence de la personne habituée à les manipuler, dans des boites de transport pour animaux de laboratoire contenant litière et enrichissements type bâton et frisure, nourriture et eau gélifiée. Lors du précédent projet, les animaux n'ont montré aucun signe de stress à leur arrivée dans chacun des sites.
Choix des espèces
Pour cette étude nous utiliserons un modèle rongeur diurne Psammomys obesus. Par comparaison avec la souris, la rétine de Psammomys obesus est de plus grande taille et est enrichie en cellules nerveuses photosensibles (ou photorécepteurs) de type cônes (40% versus souris 3%). Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l’injection sous rétinienne et l’étude des cônes, qui sont impliqués dans la maladie de Stargardt. Nous utiliserons des animaux aux stades postnataux P10-20 (jours après la mise bas), car ce stade correspond à la période où la maladie de Stargardt se déclare chez l’homme (entre 7 et 12 ans), et la protéine ciblée n’est encore que peu exprimée dans les photorécepteurs.
Etude de l’activité neuronale in vivo sur l’animal en comportement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une craniotomie de deux heures permet d'injecter un virus dans le cerveau puis d'y implanter une puce et une fibre optique, après une biopsie de la queue le jour de la naissance. 2 158 souris vont être utilisées, toutes tuées sous anesthésie profonde pour que leur cerveau soit analysé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie porte des mutations censées reproduire le retard mental, l'autisme ou la schizophrénie, une autre est exposée au THC ou au CBD avant la naissance ou juste après, l'objet étant de suivre l'activité de leurs réseaux de neurones pendant qu'elles se comportent, fibre au crâne. Le porteur annonce des tests des fonctions sociales, cognitives et émotionnelles répartis sur dix jours, dont il donne les durées à la minute sans nommer un seul de ces tests, et décrit les démangeaisons provoquées par les sutures du crâne comme un effet indésirable attendu.
Objectifs
Notre projet concerne l’étude des changements de l'organisation fonctionnelle des réseaux neuronaux dans des modèles murins de maladies neuropsychiatriques (retard mental, autisme et schizophrénie) et l’élucidation des mécanismes cellulaires de plasticité sous-jacents à cette réorganisation. La compréhension de ces mécanismes et de leur impact sur les comportements implique l'utilisation de modèles murins mutants qui reproduisent les altérations observées chez les patients souffrant de ces maladies et des modèles d’exposition in utéro ou néonatale aux cannabinoïdes qui sont les substances illicites (THC) ou légales (CBD) les plus utilisées par les femmes enceintes. Le projet incorporera l’utilisation d’animaux des deux sexes étant donné l’existence de différences sexuelles en ce qui concerne la vulnérabilité et la prévalence des troubles neuropsychiatriques et l’utilisation de cannabinoïdes à différentes périodes de la vie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter une preuve de concept de l'importance des facteurs génétiques et environnementaux dans l’émergence des maladies neuropsychiatriques. Il permettra de comprendre les mécanismes par lesquels les déficiences génétiques et les atteintes environnementales interagissent avec le sexe pour provoquer des changements durables et persistants de l’activité des réseaux neuronaux et du comportement. Les résultats issus de ce projet auront donc un fort impact en science fondamentale et dans le monde académique. Son caractère multidisciplinaire permettra des avancées significatives dans la compréhension de la santé mentale. A plus long terme, il serait envisageable de mener des études translationnelles pour relier les résultats des modèles animaux aux populations humaines.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront amenés à subir plusieurs types d'intervention : a) une biopsie caudale (quelques secondes), b) une chirurgie d'injection de virus et d’implantation (2 heures), c) des tests de leur comportement afin d'analyser leurs fonctions sociale, cognitives et émotionnelles (à 4 âges différents selon la série suivante : Jour 1 à 3 : jour et nuit, Jour 6 : 20min, Jour 7 : 5 min, Jour 8 et 9 : 15 et 10 min, Jour 10 : 8 min). A la dernière étape du protocole expérimental, le cerveau sera prélevé post-mortem après une chirurgie terminale sous anesthésie pour analyser l’expression de différentes protéines dans les tissus.
Impact sur les animaux
Dans le cas d’animaux subissant l’ensemble d’une procédure, l’ensemble des nuisances ou effets indésirables attendus peuvent être résumés selon les points suivants : - douleur légère de courte durée générée par la biopsie caudale - les douleurs post-opératoires lors du réveil post-chirurgical (craniotomie, implantation de la puce et de la fibre). Ces douleurs sont minorées par les soins post-opératoires et l’administration d’antalgiques. - le risque infectieux lié à l’intervention chirurgicale demeure extrêmement faible, car les chirurgies sont réalisées dans le strict respect des règles d’asepsie. - les démangeaisons pouvant être provoquées par les sutures de la peau du crâne - l’inconfort des animaux reliées à la fibre pendant le comportement.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux subissent une anesthésie profonde terminale pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Le but de ce projet est de comprendre les mécanismes par lesquels des défauts génétiques et les atteintes environnementales interagissent avec le sexe pour provoquer des changements durables et persistants dans l’activité des réseaux neuronaux et leur impact sur les comportements sociaux. Par conséquent, l'utilisation de modèles in vitro n'est pas applicable pour ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés : - un même animal sera utilisé plusieurs fois pour différents tests au sein d’une même procédure et de façon longitudinale lorsque cela est possible. - nous déterminerons le nombre minimal d'animaux nécessaires pour atteindre une puissance statistique satisfaisante en utilisant préférentiellement les tests permettant de comparer deux groupes non-pairés ou plusieurs groupes de facteurs. - nous raffinerons nos pratiques d’élevage afin d’obtenir uniquement les génotypes d’intérêt. Il est essentiel de souligner que tous les animaux générés seront d’intérêt pour le projet, génotypes et sexes, et seront donc tous inclus dans les expériences.
Raffinement
Nous utilisons plusieurs stratégies de raffinement à différentes étapes des procédures. Stabulation : Dans les cages d’hébergement, les souris bénéficient d’enrichissement pour diminuer l’ennui, l’anxiété et favoriser le bien être : dômes cartonnés, ou tunnels en carton et/ mini-rouleaux de papier foisonnant. Outre l’enrichissement de l’environnement, cela permet de favoriser la nidification, de réduire l‘ennui, et d’augmenter le sentiment de sécurité. Suivant l’âge des animaux, la surface impartie dans la cage sera adaptée. Chirurgie : Chaque intervention invasive est effectuée sous analgésie et anesthésie. Lors de la chirurgie, les canules sont descendues et remontées très doucement pour réduire le traumatisme tissulaire. Les constantes biologiques et souffrance des animaux sont particulièrement surveillées dans les heures et jours suivant les interventions invasives afin de leur donner les soins post-opératoires nécessaires. Le personnel a reçu toutes les habilitations nécessaires, notamment pour améliorer le bien-être des animaux (manipulation, enrichissement), reconnaitre les signes éventuels d'inconfort ou de souffrance, et pratiquer les gestes adaptés en fonction de la situation (administration d’analgésiques, d’antalgiques ou euthanasie si l’animal n’est pas soulagé par les médications). Tests comportementaux : pour limiter le stress, les souris sont familiarisées avec la salle d'expérimentation, et sont manipulées par le même expérimentateur. La température de la salle d'expérimentation et de la chambre d’enregistrement sont maintenues constantes. Pendant l’enregistrement du comportement dans l’arène LMT, les souris ont eau et nourriture ad libitum. Les souris bénéficient d’enrichissement comprenant deux maisons et un tunnel en polycarbonate et de plusieurs cylindres de coton pour stimuler l’activité naturelle et diminuer l’ennui et le stress et faciliter la thermorégulation de l’animal et favoriser son bien-être.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent pour nos études car il présente une organisation des réseaux cérébraux et des réponses comportementales similaires à celles trouvés chez l’Humain. La souris est un modèle couramment utilisé en neurosciences, ce qui rend nos résultats pertinents pour une large communauté scientifique. Il existe également de très nombreux modèles de souris génétiquement modifiés qui reproduisent de manière très fidèle les pathologies neuropsychiatriques humaines. Une partie de nos expériences impose l’utilisation de souris modélisant le retard mental, l’autisme et de la schizophrénie. L’aspect neurodéveloppemental de notre projet, centré sur l’étude de l’activité des réseaux neuronaux et des comportements tout au long de la vie, nécessite l’utilisation de souris à différents stades postnataux : du stade périnatal jusqu’au stade adulte, ainsi que des animaux âgés.
Evaluation du risque de saignement de Fabs anti-plaquettaires dans des modèles de saignements intracérébraux et de leur potentiel anti-thrombotique dans un modèle de purpura thrombotique thrombocytopénique (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 340 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 150 un niveau modéré. Un saignement est provoqué dans leur cerveau au cours d'une chirurgie de quarante-cinq minutes, suivie de cinq à dix injections, de quatre prises de sang en un mois, d'une IRM de vingt minutes et d'un transport entre deux établissements. Il s'agit de mesurer le risque hémorragique de deux anticorps antiplaquettaires et leur effet sur les micro-caillots, les cerveaux étant prélevés après la mise à mort pour quantifier le saignement. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible" de remplacer la souris par de l'in vitro, quelques lignes après avoir indiqué que l'effet antithrombotique de ces mêmes anticorps a déjà été confirmé in vitro sur du sang humain.
Objectifs
Les plaquettes sanguines ont un rôle primordial dans l’arrêt des saignements. Elles sont aussi impliquées dans la thrombose, c’est-à-dire la formation d’un caillot, qui se développent dans une artère malade. La paroi de l’artère malade induit le recrutement de plaquettes et la formation du caillot, appelé thrombus. Ce phénomène peut aboutir à un accident vasculaire cérébral (AVC). Nous avons généré deux agents antiplaquettaires. Ils ont montré qu’ils empêchaient la formation de caillot dans un modèle in vitro. De plus, des modèles de saignement ont montré qu’ils augmentaient moins le saignement que les antiplaquettaires actuellement utilisés en clinique. Ces agents pourraient être utilisés dans le traitement des AVC. Les traitements antiplaquettaires actuels sont peu utilisés car ils présentent un risque de saignement trop important qui pourrait être fatal pour le patient. Les options thérapeutiques sont donc limitées. Les agents pourraient présenter moins de risque de saignement et donc être utilisés dans cette pathologie. Les agents pourraient également être utilisés dans le traitement du Purpura Thrombotique Thrombocytopénique (PTT). Les patients présentant cette pathologie ont des tout petits caillots dans les vaisseaux sanguins ainsi qu’une diminution des plaquettes due à leur consommation des plaquettes lors de la formation de ces caillots, conduisant à des saignements. Nos agents pourraient réduire les petits caillots sans augmenter les saignements chez les patients PTT. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer le risque de saignement des agents dans deux modèles de saignements cérébraux et leur potentiel anti-thrombotique dans un modèle de PTT. Les agents seront comparés à des traitements déjà utilisés en clinique. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet portent sur 2 aspects : - AVC : les agents pourraient présenter un risque de saignement plus faible que les traitements antiplaquettaires classiques et donc représenter un nouveau traitement pour les patients présentant un AVC. - PTT : les agents pourraient réduire la formation de petits caillots chez les patients PTT sans augmenter le saignement, ce qui représenterait un nouveau traitement pour les patients PTT. Ce projet pourrait permettre à long terme de mieux traiter les patients présentant un AVC ou un PTT.
Procédures
Dans les modèles de saignements cérébraux, les animaux seront soumis à une chirurgie (45 min, EU1), à des injections (5 à 10, EU1), à des prélèvements de sang (4 sur 1 mois, EU1) et à un IRM (20 min, EU2). Dans le modèle PTT, les souris seront soumises à des injections (4, EU1) et à des prélèvements de sang (2, EU2).
Impact sur les animaux
Une des nuisances attendues est un impact de l’anesthésie sur la respiration. Concernant les injections, on peut s’attendre à une douleur localisée. Le transport et les anesthésies pourront causer du stress. Le prélèvement de sang peut entrainer un saignement localisé de courte durée. On pourra observer des saignements au site d’incision lors de la chirurgie et, au réveil, on s'attend à un impact sur le comportement, l'apparence physique, la nutrition et la motricité ainsi qu’à des signes de douleur notamment au site chirurgical. Dans le modèle antigène – anticorps, on s’attend à des saignements en cas de blessure, à un impact sur le comportement et sur l’apparence physique.
Devenir
A l’issue de la procédure de saignement cérébraux et d’AVC, les animaux anesthésiés sont mis à mort afin de prélever les cerveaux pour quantifier le saignement cérébral. Dans la procédure de PTT, une grande quantité de sang est prélevée pour évaluer l’impact de nos agents sur le PTT, ce qui nécessite la mise à mort de l’animal.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d’agents dans des modèles de saignements cérébraux et de PTT. Dans les deux cas, le processus étudié est complexe et relève du fonctionnement de l’organisme complet (vaisseaux, pression artérielle, circulation du sang…). Il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par de l’in vitro du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus. Cependant, l’effet anti-thrombotique de nos agents a déjà été confirmé in vitro dans un modèle de perfusion de sang utilisant du sang humain de donneur sain.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 20 à 45 souris/groupe pour la mise au point des modèles et à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats lors des expérimentations.
Raffinement
Les animaux disposent de 14 jours d’acclimatation entre leur arrivée à l’animalerie et leur utilisation en procédure. Une habituation à la contention d’une durée de 5 jours est prévue. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Le changement d’hébergement en fonction des groupes n’est réalisé que si nécessaire. Aucun regroupement n’est réalisé afin d’éviter le risque de conflits, nous séparerons seulement les souris qui ne subiront pas l’expérimentation des souris qui la subiront. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie et analgésie de l’animal avant et pendant chaque opération. • Par utilisation de gel ophtalmique pour protéger les yeux de l’animal endormi • Par l’application d’une goutte d’anesthésique local sur l’œil après les injections au niveau de l’oeil • Par injection de sérum physiologique avant les procédures chirurgicales afin d’assurer l’hydratation de l’animal. • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont maitrisés et caractérisés. Les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant la forme humaine du récepteur plaquettaire ciblé, permettant d’étudier l’effet des agents sur les saignements cérébraux et dans le traitement du PTT. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris adultes et ne présentant pas encore de vieillissement.
Comprendre l’action de la toxine botulique administrée en péri-nerveux et évaluer son bénéfice dans un modèle murin de douleur neuropathique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
L'administration périnerveuse de toxine botulique est déjà en essai clinique chez des patients, et c'est son mécanisme d'action, resté inconnu, que ce projet cherche à établir chez la souris. 1 456 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses immunohistochimiques, 1 376 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 80 sous anesthésie sans réveil. Une chirurgie de dix minutes leur lèse un nerf, puis elles subissent jusqu'à vingt-trois tests d'évaluation de la douleur de dix minutes chacun, espacés de vingt-quatre heures. Le porteur écrit que chez certaines la douleur "ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude", et présente les tests nociceptifs comme des épreuves sur lesquelles les souris "gardent le contrôle" en retirant la patte.
Objectifs
La douleur neuropathique est définie par comme « une douleur consécutive à une lésion ou une maladie affectant le système somatosensoriel ». En France, la prévalence de la douleur chronique est de 31,7 %, dont 6,9 % avec des caractéristiques neuropathiques. Elles restent sous diagnostiquées en général, affectant considérablement la qualité de vie des patients et engendrant des problèmes socio-économiques importants. Les recommandations françaises actuelles préconisent l’utilisation de traitements antidépresseur ou anticonvulsivant en première intention, avec cependant des réponses thérapeutiques souvent faibles et des effets indésirables notables. D’autres alternatives thérapeutiques semblent émerger et notamment la toxine botulique de type A (TBA). Récemment une nouvelle voie d’administration émergeante, l’administration périnerveuse de TBA autour du nerf impliqué dans la douleur neuropathique est aujourd’hui en essai clinique. Cependant, le mécanisme d’action de la TBA lorsqu’elle est administrée en périnerveux reste non élucidé. La TBA est normalement recaptée par des terminaisons nerveuses. Ainsi, l’objectif de ce projet vise à comprendre comment la TBA administrée au niveau du nerf est captée pour ensuite permettre une action dans les neurones, cela permettra de comprendre son mécanisme d’action dans cette application locale nouvelle. Nous évaluerons également dans notre modèle animal si l’administration de TBA en périnerveux permet de prévenir l’installation d’une douleur neuropathique ou permet son soulagement une fois cette dernière installée et quel est son mécanisme dans la cadre pathologie. Cela permettra de proposer un mécanisme et une validité afin de développer cette voie application nouvelle en clinique.
Bénéfices attendus
Nous postulons que la TBA administrée en périnerveux pourrait non seulement avoir un potentiel thérapeutique dans le soulagement de la douleur neuropathique installée, mais pourrait également être bénéfique dans la prévention de son initiation et de son maintien. Cela laisse entrevoir une possibilité thérapeutique supplémentaire chez des patients douloureux chroniques dont l’arsenal thérapeutique actuel reste modeste. Cela pourrait apporter des preuves de concepts supplémentaires pour généraliser l'utilisation de la TBA en administration périnerveuse. De plus l’élucidation du mécanisme d’action de la TBA administrée en périnerveux pourrait également permettre révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, mais aussi d’en comprendre davantage sur la physiopathologie de la douleur neuropathique
Procédures
Chirurgie d'une durée de 10 minutes sur animal anesthésié et une injection sous anesthésie d'une durée de 5 minutes. Les animaux subiront au maximum 23 tests d'évaluation de la douleur d'une durée de 10 minutes avec un délai de 24h entre chacun. Tous les animaux subiront une chirurgie pour prélèvement terminal d'une durée de 10 minutes.
Impact sur les animaux
Chez certains animaux, il y a présence de douleur qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les chirurgies vont induire une réponse inflammatoire classique et attendue qui permet la mise en place de ces modèles. Certains animaux subiront des tests comportementaux nociceptifs sur lesquels ils gardent le contrôle (retrait de la patte). Un effet antidouleur de la toxine botulique A est attendu.
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour réaliser des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse de l’action de la toxine botulique administrée en périnerveux dans un modèle de douleur neuropathique nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. De plus, il n’existe pas d’études in vivo montrant la présence de nervi nervorum, les rares études décrivant cette structure étant faites par immunohistochimie sur tissus humain ou murin.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Les groupes expérimentaux concernant les expériences comportementales seront constitués au maximum de 14 souris mâles et 14 souris femelles. Pour les groupes expérimentaux concernant les analyses immunohistochimiques ils seront constitués au minimum de 4 animaux par groupe et au maximum de 10 selon les mises au point techniques nécessaires. Un calcul statistique a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d'analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (habituation des animaux aux locaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).
Etude de l’effet de gènes spécifiquement humains sur le développement des neurones et circuits neuronaux du cervelet aux échelles moléculaires et cellulaires
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Le ventre de souris gestantes est ouvert sous anesthésie pour injecter un gène humain dans le cerveau de leurs fœtus, suivi d'une électroporation de moins de quinze minutes. 910 souris vont être utilisées, mères, fœtus et nouveau-nés confondus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par une chirurgie terminale destinée à prélever le cerveau. L'objet est de savoir si treize gènes propres à l'espèce humaine modifient la forme et les connexions des neurones du cervelet, un protocole d'organoïdes cérébelleux humains existant depuis cette année mais restant, selon le porteur, à optimiser. Chez les mères, il décrit des douleurs après l'opération, une infection possible de la plaie et une rupture des points de suture qui constituerait un point limite, chez les fœtus une rare interruption de gestation, et chez les souriceaux une simple "gêne légère et momentanée".
Objectifs
L’espèce humaine présente des caractéristiques cognitives supérieures qui ont été en partie liées à l’évolution du cortex cérébral. Mais l’implication des autres régions du cerveau, comme le cervelet, reste largement inexplorée malgré son association avec les fonctions cognitives supérieures (comme le langage) et les troubles cognitifs (comme l’autisme et la dyslexie). De plus, le cervelet humain présente des caractéristiques divergentes par rapport à d’autres espèces, aux niveaux anatomique, fonctionnel et comportemental, dont les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents sont inconnus. Les mécanismes moléculaires qui participent à l’évolution des neurones et circuits neuronaux reposent en partie sur des gènes dupliqués spécifiquement humains (absents des génomes d’autres espèces) ou des gènes spécifiquement exprimés chez l’humain (expression absente chez les autres espèces). Le rôle de cette étude est d’étudier l’effet de ces innovations moléculaires sur le développement des neurones et circuits du cervelet. Nous avons une liste de 13 gènes candidats basés sur des données publiques d'expression de gènes au cours du développement dans le cervelet humain et non chez la souris et l’opossum. Pour étudier un effet fonctionnel de ces gènes, nous devons faire des expériences de gain-de-fonction dans un cervelet de Mammifère, c'est-à-dire exprimer artificiellement un gène humain pour mimer son action . Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous phylogénétiquement (=dans l'arbre des espèces animales). De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les objectifs de cette études sont : 1) d’étudier, parmi les gènes d’intérêts, lesquels sont suffisants chez la souris pour altérer la morphologie des neurones du cervelet, leur connectivité neuronale ainsi que sur la vitesse de maturation des neurones, 2) d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents pour les 3 gènes candidats dont l’effet sera le plus flagrant.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les effets de gènes spécifiquement humains dans le développement du cervelet de Mammifère. Cela permettra d’ouvrir un nouveau champ de l’évolution du système nerveux humain, en dehors du cortex cérébral. A plus long terme, les résultats pourraient mettre en évidence une sensibilité propre à notre espèce à certains troubles cognitifs (spectre autistique), moteurs (ataxie cérébelleuse) ou encore la dyslexie. Ils pourraient aussi ouvrir de nouvelles possibilités thérapeutiques pour ces troubles.
Procédures
Procédure 1: laparotomie sous anesthésie générale de la mère suivie d'injection ventriculaire cérébrale sur foetus suivie d'une électroporation (
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sur les animaux sont : - chez la mère : de rares problèmes post-opératoires comme des douleurs (associées à une perte de poids ou un état de prostration), l’infection de la plaie, ou une rupture des points de suture, qui constituraient un point limite. - chez le fœtus : une rare interruption de la gestation. - chez le souriceau : une gène légère et momentanée au point d'injection.
Devenir
Tous les animaux seront utilisés pour les procédures décrites.
Remplacement
Une première alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait l’utilisation d’une autre espèce de Vertébré tel que le poisson zèbre, qui possède également un cervelet. Cependant l’organisation et le développement du cervelet chez les Vertébrés non-Mammifères sont trop divergentes comparé aux Mammifères pour pouvoir interpréter nos expériences de gain de fonction. Une autre option alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait la culture in vitro de cellules souches de souris ou humaines, suivie d’une différentiation en organoïde cérébelleux. C’est une approche qui va être établie en parallèle dans notre laboratoire, pour laquelle un protocole existe depuis cette année pour les cellules humaines mais qui reste à être optimisé. En effet, ce type de culture ne permet pas à ce jour de récapituler l’ensemble des aspects anatomiques observés dans un cervelet in vivo (connectivité neuronale). De plus, ces approches ne permettent pas d’étudier des réseaux neuronaux dans un cervelet qui est intégré à un organisme in vivo, avec des stimulations sensorielles et un contrôle moteur, qui sont clefs dans la maturation neuronale cérébelleuse. De plus, ces approches in vitro manquent d'une composante critique que sont les fibres grimpantes qui proviennent d’une autre région du tronc cérébral, l’olive inférieure.
Réduction
Ce projet nécessitera au maximum 910 souris. Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. Dans nos différentes approches, nous voulons connaître l'effets de gènes humains sur le développement des neurones. Nous commencerons pour chaque gène candidat par 2 portées. Pour les gènes montrant des résultats flagrant, nous reproduirons nos résultats pour les confirmer et les consolider statistiquement. Cette approche permet de ne pas utiliser le nombre maximal de portées pour les gènes sans effet sur le développement neuronal (résultat négatif). Pour diminuer le nombre d'animaux, nous epxrimerons à chaque fois le gène di'intérêt dans la moitié des animaux de la portée, et une condition contrôle dans l'autre moitié. Ainsi, le nombre d’animaux a été estimé au plus juste de façon à répondre aux exigences pratiques et statistiques. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, avec un nombre maximal de 5 individus par cage, dans un environnement enrichi. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages quotidien. Soins spécifiques apportés à la mère gestante pendant la chirurgie : stéréllisation du champ opératoire, analgésie sous-cutanée et anesthésie locale avant l’opération suivies par une anesthésie par inhalation. Des analgésiques sont administrés en sous-cutané les jours qui suivent l'opération et la mère gestante est hébergée seule dans une cage enrichie jusqu'à la mise bas. La température des animaux est gardée constante grâce à un tapis chauffant jusqu’au réveil. La mère gestante ne retourne sur son portoir qu’une fois réveillé. Un suivi post-opératoire rapproché est effectué pendant les premières heures suivant l'opération puis le lendemain. Soins spécifiques apportés aux souriceaux pendant leur injection : le souriceau est anesthésié. puis est réchauffé avant de retrouver sa mère. Précautions pour l'injection intraventriculaire du foetus ou souriceau : une micropipette ultra mince est utilisée pour l’injection. Chaque procédure se termine par une chirurgie terminale sous anesthésie en vue du prélèvement du cerveau.
Choix des espèces
Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous phylogénétiquement. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les animaux seront utilisés au stade embryonnaire et aux stades postnatals, aux étapes critiques du développement des neurones et des circuits.
Acquisitions des données in vivo pour le développement d’une plate-forme innovante d’enseignement de la physiologie expérimentale dans l’enseignement supérieur (LEARN « L3Rn »)
- Enseignement supérieur
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Un rat qui montre des signes de mal-être est retiré de l'étude, ce qui n'empêche pas sa réutilisation dans un autre projet. 108 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, aucun tué dans le cadre de ce projet, tous destinés ensuite soit à des expériences sur organes isolés, soit à des travaux pratiques et à la formation à la chirurgie. Ils subissent une à six anesthésies gazeuses pour être rasés des flancs, portent un gilet à capteurs enregistré jusqu'à vingt-quatre heures d'affilée sur une période allant jusqu'à six mois, sont parfois séparés visuellement et olfactivement de leurs congénères, et courent sur un tapis roulant jusqu'à trente minutes à 80 % de leur capacité, stimulés à la queue. Le porteur annonce que ces données serviront à construire des vidéos et une plateforme de simulation pour l'enseignement de la physiologie, et reconnaît qu'un risque de détresse cardio-respiratoire "ne peut être exclu" lors des anesthésies.
Objectifs
Bien que prenant en compte le contexte sociétal, l’enseignement de la physiologie à l’université continue d’inclure des animaux principalement en raison de l’absence de méthodes alternatives satisfaisantes. Les systèmes de simulation actuellement disponibles restent rares, rudimentaires, peu évolutifs et restreints à des conditions basiques. Ce projet vise à acquérir de façon non-invasive des données physiologiques de la fonction cardio-respiratoire, de la mobilité et des vocalisations chez le rat pour construire un ensemble de supports d’enseignement incluant des vidéos de démonstrations et une plate-forme digitale permettant de simuler différentes conditions en lien avec la vie quotidienne. Cela permettra à terme de réduire au maximum l’utilisation d’animaux en enseignement à l’université et d’envisager son remplacement dans certaines filières où l’acquisition de gestes pratiques n’est pas nécessairement obligatoire.
Bénéfices attendus
De tels outils pédagogiques permettront d’envisager à terme un remplacement de l’utilisation d’animaux pour les filières générales et une réduction significative de leur nombre et un raffinement des procédures pour les formations professionnalisantes.
Procédures
Les animaux seront soumis à une à six anesthésies générales volatiles durant quelques minutes en vue d’être rasés sur les flancs. Par la suite ils seront habillés avec un gilet contenant des capteurs physiologiques ; les enregistrements parfois quotidiens, pourront durer jusqu'à 24h pour une période allant jusqu'à 6 mois. Les rats seront observés en condition de vie quotidienne ou suivront un protocole d’exercice physique. Certains rats seront hébergés individuellement sans pour autant être isolés socialement (isolement visuel et olfactif), cet isolement des congénaires n'exédant pas 24h. D'autres rats seront contraints à une course sur tapis roulant n'exédant pas 30 minutes à maximum 80 % de leur capacité physique. Ils y seront encouragés par stimulation physique non douloureuse.
Impact sur les animaux
L'ensembre des rats subira des contraintes de niveau léger : notament trois brèves anesthésies générales volatiles pendant laquelle le risque de détresse cardio-respiratoire ne peut être exclu. Certains rats peuvent ne jamais s’adapter au protocole : port du gilet et surtout course contrainte. Ceci engendrerait un mal être et une prostration.
Devenir
L’ensemble des procédures du projet permet d’envisager la réutilisation totale des animaux. A ce jour, deux types de réutilisation sont envisagées : soit une réutilisation pour la réalisation d’experience sur organes isolés, soit une réutilisation en enseignement universitaire (Formation à la chirurgie, TP de licence professionnelle).
Remplacement
Ce projet n’offre pas une alternative complète à l’utilisation d’animaux puisqu’il nécessite l’utilisation des animaux vigiles pour la production initiale des données et la création de la base. En revanche il contribue de façon significative à chacun des 3R puisque les résultats du projet permettront d’envisager la réduction du nombre d’animaux utilisé en formation et en enseignement, de remplacer l’utilisation d’animaux en enseignement dans certaines filières générale et d’envisager le raffinement des procédures expérimentales par un suivi de paramètres physiologiques de façon non-invasive. C’est sur ces éléments que les acteurs du projet axeront leur communication (communication dans des conférences sur le bien- être animal) auprès de tous les acteurs du domaine.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été réduit au minimum afin de permettre d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour obtenir des statistiques descriptives (moyenne, écart-type,) pour chacune des conditions expérimentales et a été fixé à 5 à 24 rats par sexe. S'agissant d'études physiologiques et comportementales, l’effet du sexe et de l'âge doit être pris en compte. Le nombre d'animaux permettra de réaliser les supports didactiques à utiliser en TP ou en formation professionnelle. Un nombre minimal (inferieur à 5) sera utilisé pour la mise au point du dispositif de suivi et la finalisation des réglages techniques.
Raffinement
A leur réception, les rats bénéficieront d'une semaine d'acclimatation. Le milieu de vie de chaque rat sera enrichi le plus possible suivant les protocoles de la SBEA. La tonte des flancs est systématiquement réalisée sous brève anesthésie générale volatile. Les rats bénéficieront tous d'une phase individualisée d'acclimatation/habituation au port du gilet et aux phases d'enregistrement. L’utilisation de la technologie de télémétrie consistant en un dispositif radio non invasif maintenu dans un gilet ergonomique porté par l'animal, permet une surveillance combinée de l'activité cardiaque, de la fonction respiratoire et de l'activité locomotrice au cours de l’exercice physique. Ce dispositif couplé aux enregistrement vidéo et audio permet l'acquisition des données sans contrainte supplémentaire pour l'animal. Les séances d'exercice physique (course sur un tapis roulant) nécessitent le recours à une stimulations physique non douloureuse au niveau de la queue des animaux. Dans tous les cas, nous veillerons à ce que les exercices soient réalisés avec le moins de stimulations possibles. Si l’objectif d’apprentissage de la 1ère semaine n’est pas atteint, l’animal ne suivra pas la seconde semaine de conditionnement, il sera retiré du projet mais pourra être réutilisé dans d’autres projets. Tout signe de mal être d’un animal conduira à son retrait de l’étude, et ce même pendant la période initiale de stabulation.
Choix des espèces
L’espèce choisie est le rat adulte, qui constitue le modèle le plus utilisé en enseignement de la physiologie experimentale à l’université et qui présente une taille compatible avec le dispositif de suivi de la fonction cardio-respiratoire utilisé dans ce projet. Nous utiliserons des rats adultes d’un poids corporel de 250 à 450g (c’est-à-dire entre 8 et 24 semaines). Les animaux compris dans cette gamme de poids sont les plus utilisés dans le domaine cardiorespiratoire et en adéquation avec la taille de la version actuelle du dispositif. De plus, l’utilisation d’animaux de poids différents permet de valider la continuité des mesures même lors du changement de gilet lié à la taille des animaux.
Dynamique de l’échappement à l’inactivation du chromosome X dans les cellules immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées à l'issue de chaque procédure pour que leurs poumons soient prélevés, 1 156 souris vont être utilisées, 804 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 352 un niveau léger. Elles reçoivent des injections deux fois par semaine, une injection dans la trachée sous anesthésie générale et une instillation nasale, et une partie d'entre elles est irradiée pendant cinq minutes ou privée de macrophages pulmonaires. Infectées par la grippe, elles perdent du poids et voient leur température baisser, et développent une fibrose des poumons que le porteur qualifie de non létale et réversible. Sur le remplacement, il affirme que l'environnement des alvéoles pulmonaires "ne peut être reproduit in vitro", tout en annonçant développer en parallèle une culture de macrophages alvéolaires pour étudier les mêmes mécanismes.
Objectifs
La réponse immunitaire est généralement de plus forte amplitude chez les femmes comparées aux hommes. Cela les protège vis-à-vis des infections virales ou bactériennes, mais augmente également le risque de développer des pathologies auto-immunes comme le lupus érythémateux systémique (LES). Le récepteur toll like 7 (TLR7), codé sur le chromosome X, reconnait des ARN simple brin dérivés du soi ou de virus. Des études d’association génétiques ont identifié une mutation pour TLR7 associée à une perte de fonction conférant des formes sévères de COVID-19. L’inflammation et les réponses immunitaires sont régulées par des facteurs liés au sexe comme les hormones et les facteurs génétiques portés sur le chromosome X comme le gène TLR7. Nous avons mis en évidence que le gène TLR7 peut être exprimé en deux copies dans les cellules immunitaires femelles, ce qui leur confère un avantage fonctionnelle comparées aux cellules immunitaires de mâles. Nous avons développé des modèles génétiques rapporteur/délétère pour l’expression du gène Tlr7 chez la souris. Ces modèles nous permettent de suivre les cellules exprimant Tlr7 à partir des deux chromosomes X, et également de les éliminer de manière constitutive ou inductible. Nos objectifs scientifiques sont d’identifier précisément les cellules immunitaires exprimant Tlr7 à partir des deux chromosomes X, de caractériser leurs fonctions immunitaires à l’état basal et durant une infection par le virus influenza.
Bénéfices attendus
Les infections respiratoires par influenza ou coronavirus (comme le MERS ou SARS-CoV-2) sont plus sévères dans les individus âgés de plus de 65 ans. Il a été suggéré que les monocytes et macrophages pulmonaires ont un rôle dans la dysrégulation de la réponse immunitaire. Il existe des différences liées au sexe dans la susceptibilité au COVID-19 avec un risque de mortalité presque deux fois supérieur pour les hommes comparé aux femmes après 50 ans. Cette différence est maintenue à tous les âges. Les différences liées au sexe dans le remplacement des macrophages pulmonaires, promu par des infections récurrentes, le vieillissement ou des facteurs environnementaux peut être un mécanisme contribuant aux observations épidémiologiques. Ce biais de sexe n’ayant jamais été documenté, ce projet permettra de mettre en avant l’importance d’un double dosage des gènes codés sur le chromosome X dans la biologie des macrophages alvéolaires, en utilisant les modèles murins uniques que nous avons développés. Le double dosage des gènes codés sur le chromosome X pourrait contribuer au biais de sexe en permettant l’activation plus efficace des cellules immunitaires mais aussi en promouvant la maintenance et les fonctions d’homéostasie des macrophages alvéolaires chez les femmes.
Procédures
Les animaux recevront des injections plusieurs fois (2 /semaine sur une semaine maximum) pendant 1 minute. Une injection par voie intratrachéale sous anesthésie générale une seule fois pendant 3 minutes. L’irradiation sera faite une fois pendant 5 minutes. L’instillation nasale se fera une seule fois pendant une minute.
Impact sur les animaux
Dans le modèle de reconstitution les animaux seront irradiés ou déficients en macrophages alvéolaires. Dans le modèle d’infection à l’influenza, les souris présentent une baisse de température et une perte de poids. La fibrose pulmonaire n’est pas létale et est réversible.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés pour analyser leurs tissus, en particulier les poumons.
Remplacement
L’environnement des alvéoles pulmonaires ne peut être reproduit in vitro. La physiologie de l’infection, le recrutement des cellules ne peut s’étudier que dans un modèle in vivo. Nous nous attacherons à développer un modèle d’expansion de « macrophages alvéolaires like » in vitro afin d’étudier les mécanismes mis en jeu dans le maintien de l’inactivation de l’X ou son échappement.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'expériences effectuées nous utilisons un nombre d'animaux suffisant par expérience afin d'obtenir des résultats statistiquement interprétables et de faire des analyses différentes. Le nombre de lots et d’animaux par lot sont détaillés dans chaque procédure. De manière générale, nous avons estimé que 2 à 3 lots expérimentaux devront être produits afin de reproduire les expériences de façon indépendante. Nous allons comparer 2 conditions.
Raffinement
Les souris sont hébergées en portoirs ventilés. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par quinzaine. Les cages seront systématiquement enrichies (coton, igloo, tunnel) pour leur permettre de faire un nid. L'angoisse des animaux sera réduite par une période d'acclimatation à l'hébergement (1semaine) mais également par une habituation à la manipulation. Un protocole est mis en place avec la structure du bien-être animal (SBEA) pour prévenir toute douleur, souffrance ou angoisse de l'animal. De plus, les procédures et le suivi de l'animal seront effectués par des personnes compétentes et formées à l'expérimentation animale. Les animaux sont surveillés tous les jours par les zootechniciens du service, en accord avec la réglementation.
Choix des espèces
Ces expérimentations ne peuvent être conduites que chez la souris car nous avons développés de nombreux modèles génétiques sur le fond C57BL/6 pour suivre et éliminer les cellules exprimant le gène Tlr7 à partir du X inactif chez les femelles. Résumé des modèles génétiques de souris reporter/deleter utilisés : lignée#1 : XmXistKOTlr7WT XpXistWTTlr7MCH modèle biaisé dans lequel le X actif est fixé. Permet de suivre l’échappement de Tlr7. lignée#2 : XTlr7mCh XTlr7YFPCre Rosa26LSL-DTA rapporteur mCherry maternel/délétion cellules YFP paternelles ou rapporteur mCherry paternel/ délétion cellules YFP maternelles. lignée#3 : XmXistKO Tlr7WT XpXistWT Tlr7tdTomato DTR (human diphteria toxin receptor): rapporteur tdTomato et expression du récepteur à la toxine diphtérique de manière à éliminer les cellules exprimant Tlr7 sur le chr X porteur de cette construction. lignée #4 : Csf2rb-/- déficiente pour la chaine béta du récepteur au GM-CSF. Ces souris n’ont pas de macrophages alvéolaires. lignée #5 : Tlr7 fate-mapping model= Femelle R26LoxStopLox-tdTomato+/- Xm = XXistKO Tlr7WT Xp = XistWT Tlr7YFPCre. Les cellules exprimant Tlr7 à partir du Xp = Xi seront marquées de manière irréversible par la tdTomato suite à l’élimination du Stop par la YFPCre.
Rôle des protéines tyrosines phosphatases Shp1 et Shp2 dans la myélofibrose
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
L'objet est de tester des combinaisons de traitements ciblant deux protéines dans la myélofibrose, une maladie de la moelle osseuse. 1 082 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour que leur sang et leur moelle osseuse soient analysés, 512 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil, 504 avec un niveau de souffrance modéré et 66 avec un niveau léger. Elles sont gavées une à deux fois par jour pendant douze semaines alors qu'elles sont éveillées, et subissent jusqu'à douze prélèvements de sang à la queue, les suivants obtenus en grattant la croûte de la ponction précédente. Le porteur indique que les souris au phénotype dommageable peuvent présenter un retard de croissance, un amaigrissement ou une alopécie, et que la baisse de plaquettes provoquée par les traitements reste sans effet, une chute bien plus forte étant selon lui "nécessaire" pour observer un saignement.
Objectifs
La dérégulation de la production mégacaryocytaire et plaquettaire causée par la présence de mutations entraîne un dérèglement dans la production des cellules de la moelle osseuse (les mégacaryocytes) mais aussi des plaquettes et des globules rouges. Les traitements utilisés en clinique permettent de soulager les symptômes mais ne préviennent pas l’apparition de la maladie. Ainsi, l’objectif est de tester des combinaisons de traitements ciblant deux protéines identifiées comme étant de nouvelles cibles thérapeutiques intéressantes.
Bénéfices attendus
La mise en évidence de nouvelles cibles importantes impliquées dans le néoplasmes myéloprolifératifs (NMPs) permettra d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir l’apparition des symptômes et de la myélofibrose chez les patients. En effet, à ce jour, les médicaments utilisés en clinique ont apporté de nouveaux espoirs pour le traitement des NPMs mais leurs effets ont été essentiellement bénéfiques sur les symptômes mais ne parviennent pas à prévenir la myélofibrose. Un deuxième bénéfice important est de cibler certaines cellules spécifiques. Actuellement, les traitements utilisés touchent différentes cellules. Ce projet vise à identifier des cibles bien spécifiques des mégacaryocytes, qui sont les cellules impactées dans ces pathologies. L’identification des récepteurs et voies de signalisation nous permettra de les cibler spécifiquement.
Procédures
Les animaux seront soumis à un traitement par voie orale (gavage 1 à 2 fois par jour) sur animal vigile pendant 12 semaines maximum. Une autre procédure fait appel au prélèvement de sang à la queue de souris anesthésiée, puis par grattage de la croute pour les prélèvements suivants (12 maximum) (toujours sur souris anesthésiée). Un prélèvement de sang terminal sous anesthésie sera réalisé à la fin des 12 semaines de traitement.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont essentiellement liées au stress de contention au moment des injections ou lors des traitements par voie orale. Le prélèvement de sang à la queue pourra entrainer une douleur localisée et un saignement. Les traitements testés ont comme impact de diminuer modérément et transitoirement la quantité de plaquette, ce qui n’a pas d’impact sur l’animal (en effet, une diminution très importante de la quantité de plaquettes est nécessaire pour observer un saignement chez l’animal, ce qui n’est pas le cas ici). Le phénotype dommageable des animaux pourra entrainer des défauts physiques tels qu’un retard de croissance, amaigrissement ou une alopécie.
Devenir
En fin de projet, les animaux sont tous mis à mort pour récupérer et analyser le sang et la moelle osseuse.
Remplacement
La myélofibrose est une pathologie complexe, impliquant une cascade de réactions qu’il est difficile de reproduire in vitro. Il est nécessaire de recourir à des modèles animaux qui permettent de reproduire au plus près les caractéristiques de la pathologie humaine. Par conséquent, il est déterminant d’utiliser un modèle animal qui récapitule la myélofibrose induite par une mutation de pouvoir tester différents agents pharmacologiques sur l’évolution de la pathologie in vivo.
Réduction
Réduire : Le nombre d’animaux sera minimisé : une même souris sera destinée à l’analyse de plusieurs paramètres, et plusieurs champs seront acquis par animal permettant de visualiser le plus d’évènements cellulaires. Nous utiliserons à la fois les mâles et les femelles disponibles au laboratoire. Les tests statistiques seront utilisés pour analyser les données obtenues entre les différents génotypes de souris. Pour les études in vivo, le nombre d’animaux par lot est n=18. Pour les études in vitro, le nombre d’animaux par lot est n=6, nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’une quantité suffisante de sang par condition. Le sang d’un animal ne pouvant pas être utilisé pour les 5 tests, car en quantité insuffisante par animal. Les groupes sont comparés par des tests statistiques.
Raffinement
Raffiner : Les expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées maintenue au chaud tout au long de l'expérience pour éviter une hypothermie due à l'anesthésie/l’analgésie. Les souris seront préalablement habituées au gavage et à la contention. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédures. Pendant leur hébergement, un environnement calme et non stressant est privilégié avec un minimum de manipulation et la présence de frisure de papier, de coton et le carré de cellulose pour enrichir l'environnement ainsi que de la nourriture déposée au fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage.
Choix des espèces
Ce travail s’appuie sur des travaux publiés montrant la génération de souris génétiquement modifiées permettant de modéliser la myélofibrose humaine. C’est la seule espèce pour laquelle nous disposons du modèle dont les gènes d’intérêt sont inactivés. Nous nous baserons sur le même modèle : une lignée de souris présentant une mutation. Ces animaux seront traités avec différents agents pharmacologiques pour tester leur effet sur la numération plaquettaire et l’évolution de la maladie, afin d’évaluer leur rôle protecteur /curatif sur le compte plaquettaire et la myélofibrose.