Recherche fondamentale

Pour tester la fermeture d'un tympan perforé par des feuillets de cellules cultivées, 24 lapins de deux mois sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour les prélèvements. Chaque animal subit d'abord une perforation totale du tympan sous anesthésie générale, puis un mois d'attente destiné à vérifier que la perforation ne se referme pas d'elle-même, puis une reconstruction chirurgicale d'une heure. Les deux oreilles sont opérées, ce qui porte à 48 le nombre d'oreilles incluses et permet au porteur d'annoncer une réduction du nombre d'animaux. Quatre de ces oreilles sont perforées puis laissées telles quelles, sans aucune tentative de reconstruction.

Objectifs

La tympanoplastie est le terme communément utilisé pour désigner la chirurgie de la perforation tympanique. Les causes sont multiples et la chirurgie vise à fermer cette perforation pour éviter les surinfections, faciliter l’appareillage auditif, améliorer l’audition lorsqu’elle est atteinte et prévenir la migration épidermique dans l’oreille moyenne à partir des berges de la perforation. C’est également le geste technique clé de reconstruction après l’exérèse d’un cholestéatome de l’oreille moyenne, afin d’éviter une récidive secondaire. Ce travail se base sur l’ingénierie tissulaire qui regroupe l’ensemble des techniques permettant la génération de substituts tissulaires ex vivo. Plus précisément, c’est ici la technique des feuillets cellulaires, issue de l’ingénierie tissulaire, qui va être utilisée dans cette étude. Celle-ci combine l’utilisation de cellules progénitrices provenant du périchondre auriculaire et l’induction de la différenciation chondrogénique par des facteurs de croissance présents dans le milieu de culture. Le projet de recherche va donc s’articuler autour de la réalisation d’une tympanoplastie, après perforation tympanique induite chez le lapin, par l’utilisation de feuillets cellulaires en superposition. On cherchera alors à évaluer la qualité de fermeture de la perforation par l’étude de son aspect macroscopique, de son intégration immunohistochimique ainsi que par sa capacité vibratoire. L’objectif principal de l’étude va donc être axé sur la réalisation d’une tympanoplastie chez le modèle animal (ici le lapin) à partir de la superposition de feuillets cellulaires en multicouche (MLCS), après perforation tympanique induite. Le but sera alors d’étudier la qualité de cette fermeture par superposition de feuillets cellulaires comparativement à une tympanoplastie standard utilisant du cartilage auriculaire et de l’aponévrose temporale. Les critères d’évaluation seront alors : la fermeture complète, partielle ou inexistante de la perforation tympanique, l’intégration immunohistochimique de la greffe avec le tympan restant, les capacités vibratoires du tympan avant et après tympanoplastie et la survenue de surinfections après le geste. Les perspectives pourront être une application in vivo chez l’homme, dans le cadre de fermetures tympaniques simples ou de reconstruction après exérèse de cholestéatome. Cette dernière constituant un enjeu important, étant donné le risque élevé de récidive de cette pathologie.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de l’étude s’attachera à vérifier la fermeture ou non de cette perforation à l’aide de cette greffe tympanique faite à partir des feuillets cellulaires. Nous pourrons ensuite évaluer la qualité de fermeture de la perforation selon le nombre de feuillets utilisés ou le type de cellule à l’origine du feuillet. Les critères secondaires pourront être : - L’étude immunohistochimique de l’intégration du feuillet sur le tympan du lapin - La mesure de la vibration tympanique. Les perspectives de l’étude seraient une potentielle application chez l’homme pour la fermeture de perforations tympaniques. On peut imaginer qu’il serait intéressant de pouvoir refermer une perforation tympanique sur oreille saine avec une superposition de feuillets cellulaires dont l’épaisseur est la plus fine possible. Ceci visant alors à reproduire une structure la plus proche possible du tympan initial. A contrario, la reconstruction tympanique après exérèse de cholestéatome nécessite une certaine résistance afin d’éviter les récidives et donc une superposition de feuillets cellulaires avec une épaisseur plus importante. La création de ces substituts cartilagineux pourrait trouver notamment un bénéfice non négligeable pour les patients ayant subi de multiples récidives de cholestéatome et dont la réserve cartilagineuse (conque, tragus...) commencerait à s’épuiser. Par ailleurs, le degré de transparence de ces feuillets pourrait faciliter la surveillance clinique des patients opérés d’un cholestéatome. Les perspectives d’application de ces feuillets cellulaires s’étendent évidemment au-delà du domaine de l’otologie. On pourrait alors envisager également une application future en rhinologie pour la greffe cartilagineuse des rhino septoplasties. D’autres études seront alors nécessaires.

Procédures

Le but de l’étude est d’induire une perforation sur des tympans de lapins puis de procéder à une reconstruction tympanique par des feuillets cellulaires. Au total, 24 lapins seront sujet à une perforation tympanique totale (chirurgie rapide pratiquée sous anesthésie générale et durant environ 20 minutes). On attendrait alors un délai minimal de 1 mois avant de réaliser la tympanoplastie, dans le but de vérifier l’absence de cicatrisation spontanée du tympan. L'intervention se déroule également sous anesthésie générale et dure environ 1 heure. Une mesure de la vibration du tympan est effectuée par tympanométrie, qui est un test complètement indolore, durant quelques secondes et ne necessitant pas de contention ou de sédation. Il consiste en l'introduction d'une sonde au niveau du conduit auditif du lapin durant la mesure.

Impact sur les animaux

Les procédures chirurgicales sont pratiquées sous anesthésie générale afin de limiter au maximum le stress et la douleur chez les animaux. Il existe des risques d'infection liés à la chirurgie pouvant mimer une otite. Ceux-ci seront limités par la détersion des zones cibles. Une antibiothérapie locale et générale sera administrée si elle devait survenir.

Devenir

Les lapins seront mis à mort afin de pratiquer les prélèvements.

Remplacement

Les études de développement de nouvelles techniques chirurgicales pour la tympanoplastie exigent l’utilisation de modèles pour leur validation préclinique avant l’utilisation en routine clinique. Le modèle animal qui correspond le mieux avant un potentiel essai clinique dans des études sur le tympan qui soit le plus similaire possible à l’homme est le lapin. Sa taille et positionnement du tympan permet d’étudier la tympanoplastie de façon similaire à celle de l’homme. De plus, le prélèvement des cellules progénitrices provenant du périchondre auriculaire est bien connu du laboratoire et permet d’éviter les rejets cellulaires. La culture cellulaire postérieure est également maitrisée. L’utilisation de feuillets cellulaires pour cette tympanoplastie prévoit de mesurer entre autres la vibration tympanique, un modèle in-vitro est donc inenvisageable dans ce cas.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est basé sur des données antérieures, sur des données de la littérature et sur l'utilisation de tests de puissance statistique. Les mesures réalisées se font sur les deux oreilles incluant des contrôles, réduisant ainsi le biais possible et le nombre final d'animaux à utiliser. Ainsi nous prévoyons d’utiliser un premier lapin pourvoyeur de cellules progénitrices pour preparer les feuillets en amont et une expérimentation comprenant 24 lapins ( 48 oreilles, cf description plus haut). Ces derniers subiront ou pas une perforation tympanique et une reconstruction selon le schéma suivant, 1 mois plus tard : 10 oreilles (perforation + greffe d’une superposition de 4 feuillets cellulaires), 10 (perforation + greffe de 2 feuillets cellulaires), 10 (perforation et greffe d’un feuillet cellulaire constitué à partir d’un autre type cellulaire), 10 (perforation + greffe cartilagineuse et aponévrose temporale), 4 (perforation sans intervention) et 4 (groupe contrôle, pas de perforation induite. Nous avons considéré que le nombre de 10 oreilles était un minimum pour obtenir des résultas exploitables d’un point de vue statistique.

Raffinement

Le bien-être des animaux est pris en charge dès leur arrivée. Une personne habituée au travail avec les lapins est en charge de leur réception et surveillance quotidienne. Les conditions d'habituation et d'hébergement sont prévues pour assurer un maximum le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés ensemble au cours du projet. Une acclimatation à l'animalerie sera faite à l'arrivée des animaux depuis le site du fournisseur. Hébergement, enrichissement et alimentation seront adaptés pour limiter les comportements anormaux avec un suivi journalier des comportements individuels et alimentaires ainsi que des interactions sociales. Nous prévoyons l'installation des lapins en batteries d'hébergement avec enrichissements mais également la sortie quotidienne en parc afin de garantir une surface plus grande avec un enrichissement supplémentaire et la possibilité de réaliser de l'exercice à souhait. Ce type d'hébergement mixte batterie / sol avec de la paille permet d'avoir les lapins plus détendus. La personne en charge de leur bien-être a une grande habitude des lapins, et s'occupera de les suivre tous les jours. De plus, une période d'habituation est prévue afin de permettre aux lapins de prendre connaissance avec la cage de contention et de s'y rendre plus facilement. Des caresses et récompenses aident à cette habituation qui durera minimum une semaine. Les gestes techniques nécessaires à l'étude sont bien réfléchis et le timing prévu au plus réel afin de ne pas avoir des temps de latence qui imposeraient une contention ni une anesthésie plus longue que le strict minimum. Des récompenses sont également prévues à la fin de chaque expérience. Les manipulations des animaux seront faites par du personnel formé, expérimenté et avec du matériel adapté. L'observation des groupes sera faite et des scores de bien-être sont prévus pour chacune des procédures. Des points limites ont été définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

Notre choix s’est porté sur le lapin pour i) c’est l’espèce gold standard utilisée pour la réalisation de tympanoplastie selon les données de la littérature iI) la question de taille du tympan pour pouvoir réaliser les chirurgies aisément, et iii) parce que nous avons l’habitude de ce modèle animal ayant déjà eu une première expérimentation sur l’otopoïèse. Aussi, l’anatomie de son oreille moyenne et la taille de la membrane tympanique et de l’oreille externe chez le lapin seraient adaptées à nos procédures expérimentales. Lapins d’environ 6-8 semaines à l'arrivée au laboratoire, donc environ 2 mois au moment des observations. Ils ont l’oreille déjà développée et sont assez légers et moins grands pour les garder en observation le temps des expériences.

Un infarctus du myocarde provoqué en trente minutes chez l'adulte et en quinze chez le souriceau d'un jour, une artère fémorale ligaturée ou excisée, un muscle lésé par une anse refroidie appliquée trois fois quinze secondes : 7 110 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure. Certaines reçoivent en plus une injection quotidienne de toxine. Les échographies obligent à les transporter vers un second établissement, transport que le porteur compte lui-même parmi les sources de stress. Le projet vise à comprendre le rôle des cellules du microenvironnement musculaire dans la régénération, et le porteur justifie le choix de la souris par la disponibilité d'animaux génétiquement modifiés et par la consanguinité des lignées, qu'il présente comme un gage de reproductibilité et donc de réduction des effectifs.

Objectifs

Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs. Ce projet a pour objectif de caractériser les mécanismes cellulaires impliqués dans les pathologies affectant le muscle squelettique et cardiaque, y compris les pathologies cardiovasculaires comme l’infarctus du myocarde, les myopathies et les blessures chroniques du muscle squelettique. Par ailleurs, le manque d’irrigation locale des membres inférieurs sont fréquentes dans différentes pathologies chroniques y compris le diabète. Malgré le succès de certains traitements, ces maladies chroniques restent encore aujourd’hui fréquentes et très peu soignables, elles ont donc un impact majeur sur la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de répondre à un sujet de santé publique et de besoins scientifiques et cliniques afin d’améliorer la compréhension de ces pathologies affectant le muscle et le traitement des patients.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes biologiques menant aux lésions musculaires. Notre étude permettra notamment de comprendre le rôle de certaines cellules dans la régénération ou les lésions chroniques des muscles. Ces avancées pourraient, à terme, permettre de développer de nouvelles thérapies pour réparer ou régnérer les muscles. Ceci pourrait concerner, par exemple, l’infarctus du myocarde, qui est la première cause de mortalité en France.

Procédures

- Infarctus du myocarde chez la souris adulte anesthésiée (1x par souris) durée = 30 minutes. Réalisé par EU1 - Infarctus du myocarde chez le souriceau anesthésié (1x par souris) durée = 15 minutes. Réalisé par EU1 - Échocardiographie chez la souris et le souriceau anesthésié (1x par souris) durée = 15 minutes ainsi que le stress lié au transport vers le site n°2 pour l’échocardiographie. Réalisé par EU2 - Constriction puis excision d’un segment d’artère fémorale sur souris adulte anesthésiée = 15 minutes. Réalisé par EU1. - Ligature de l’artère fémorale chez la souris adulte anesthésiée (1x par souris) durée = 15 minutes. Réalisé par EU1 - Dans certaines expériences, injection de toxine: quotidien, 10 secondes. Réalisé par EU1 - Blessure localisée du muscle par anse refroidie (1x par souris) = 3x 15 secondes. Réalisé par EU1 - Ligature de l’artère fémorale et injection de toxine chez la souris adulte anesthésiée = 15minutes. Réalisé par EU1 - Chirurgie terminale sous anesthésie pour prélèvement d’organes. Réalisé par EU1.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés aux procédures : inconfort lié à la préhension des animaux, douleur aux points d'injections. Effets de la chirurgie cardiaque : douleur modérée post-opératoire de quelques jours. Effets de la chirurgie des membres inférieurs : Douleur, inconfort léger de courte durée liés à la ligature de l’artère fémorale et au point d’injection. Stress lié au transport des souris vers l'EU n°2 pour les échocardiographies. L’induction de l’anesthésie gazeuse pour la réalisation de l’échocardiographie est stressant pour l’animale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour analyse des organes.

Remplacement

Notre projet s’intéresse à l’interaction de différents types de cellules du microenvironnement musculaire, y compris les cellules immunitaires, stromales et endothéliales. Comme l’étude de ces interactions cellulaires est multicellulaire et multi-organes (réponse immunitaire, inflammation, régimes), elle ne peut pas être effectuée sur des cellules isolées in vitro et nécessite un modèle murin in vivo, qui a un système immunitaire similaire à l’homme.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible tout en assurant des résultats significatifs, qui seront confirmés par des analyses statistiques appropriées, en fonction des questions posées. Ce nombre tient compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation. Un grand nombre de données de transcriptomiques étant déjà disponible pour la communauté scientifique, des analyses informatiques pilotes ont déjà été performées pour étayer nos hypothèses.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales et la mise en place de points limites spécifiques et précoces. Pour l’ensemble des procédures chirurgicales, une supplémentation hydrique par injection sera effectuée en pré et post opératoire. Une analgésie pré et post opératoire sera réalisée le cas échéant. Pour la procédure d’infarctus du myocarde, le maintien au chaud de la cage sera effectué sur les 48h per-opératoire. Un renforcement de l’enrichissement par de la litière douce (cellulose) et du gel hydrique sera apporté. Le transport des animaux vers le site numéro 2 pour les échocardiographies sera effectué par un transporteur agrée. Les animaux seront dans des boites de transport contenant des croquettes, de l’hydrogel et du coton (ainsi que de la litière).

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour étudier les pathologies musculaires, car des modèles sont bien établis et récapitulent les pathologies chez l’homme. Le choix de l'espèce murine nous permet également d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés cruciaux dans l’étude précise des cellules d’intérêt de ce projet. La consanguinité des modèles utilisés permet une reproductibilité des résultats et une réduction du nombre d’animaux utilisés. Les souris seront âgées de 1 jour à 30 semaines, car nous étudierons ces pathologies chez le souriceau et à l’âge adulte.

Pour identifier les gènes dont l'inactivation freine le cancer du sein triple négatif, 180 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse post-mortem. Des cellules tumorales prélevées sur une patiente, modifiées par CRISPR, leur sont greffées dans la glande mammaire pendant une anesthésie d'une heure, puis la tumeur est mesurée au pied à coulisse au fil de sa croissance. Une partie reçoit en plus une combinaison de chimiothérapies. Le porteur annonce une douleur qui peut persister à mesure que la tumeur se développe et une perte de poids pouvant atteindre 20 % du poids normal, avec mise à mort dès l'atteinte d'un point limite fixé sur la taille de la tumeur.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent et la première cause de décès par cancer chez la femme en France. Bien que la prévention et de nouvelles options thérapeutiques aient amélioré son prognostique, des phénomènes de résistance aux traitements et l’évolution métastatique de cette pathologie justifient la recherche de nouveaux traitements. Il est aujourd’hui possible de déterminer quels sont les gènes qui sont essentiels à la viabilité d’une cellule et d’en déduire ainsi quelles sont les protéines dont la manipulation par de petits composés chimiques pourrait constituer une approche thérapeutique. Cette investigation repose sur l’outil CRISPR/Cas9 (Prix Nobel de chimie 2020 à J. Doudna & E. Charpentier) qui permet d’interroger si un gène est nécessaire pour la survie d’une cellule dans le contexte d’intérêt. Notre objectif est d’appliquer cette technique aux transplantations de tumeurs humaines (PDX). Les PDXs sont actuellement parmi les modèles les plus proches des tumeurs des patients et permettent ainsi la réalisation d’études dont le potentiel prédictif clinique est très élevé. Ce projet devrait donc permettre de prédire la réponse thérapeutique des cancers du sein.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer les gènes dont le ciblage pourrait présenter un intérêt thérapeutique sur une variété de modèles de cancer du sein. Nos premiers efforts se concentreront sur le sous-type de cancer du sein pour lequel les besoins thérapeutiques sont les plus importants (tumeur triple négative) mais sera ensuite étendu à d’autres sous-types si les résultats sont prometteurs. Les gènes seront initialement identifiés par un criblage génétique, cette technique permet de questionner l’essentialité (contribution à la viabilité) de nombreux gènes en une seule expérience. Les candidats les plus intéressants seront ensuite validés un par un. Cela ouvrira potentiellement la voie à une étude clinique.

Procédures

Dans le lot d’animaux concerné par cette demande, un ensemble de cellules tumorales issues du cancer du sein d’une patiente et modifiée génétiquement pour avoir un gène unique inactivé sera injecté dans la glande mammaire d’animaux anesthésiés et sous traitement analgésique (durée de l’anesthésie estimée à 60 min ). Les animaux seront ensuite suivis et la taille de la tumeur sera mesurée grâce à un pied à coulisse . Pour un sous-ensemble des animaux inclus dans cette étude, les animaux seront traités par une combinaison d’agents chimio-thérapeutiques à des doses n’entrainant pas d’effet adverse chez la souris.

Impact sur les animaux

Les principaux gestes qui seront effectués sur les animaux impliquent la greffe de cellules humaines dans la glande mammaire. Les nuisances attendues sont la douleur liée à l’intervention chirurgicale au niveau de la glande mammaire L'ensemble de la procédure peut entraîner une douleur modérée, qui peut persister au stade suivant du développement de la tumeur et une perte de poids ne dépassant pas 20 % du poids corporel normal.

Devenir

Les souris seront mises à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Nous effectuons des criblages génétiques sur lignées cellulaires et organoïdes afin de limiter au maximum le recours aux animaux. Toutefois, en raison de l’importance des interactions avec le microenvironnement, l’étude de la progression tumorale dans un contexte aussi proche que possible de celui du patient reste une phase indispensable pour passer rapidement aux essais cliniques impliquant des patients.

Réduction

Nous avons fait des expériences pilotes avec nos collaborateurs pour déterminer le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles . En pratique, une expérience pilote a été menée pour déterminer le nombre de souris nécessaire à ce que la représentativité de la librairie soit maintenue. En d’autres termes, c’est le nombre minimum de souris pour qu’aucun gRNA soit aléatoirement perdu. Nous avons pu établir que 5 souris par réplica sont nécessaires pour la librairie que nous souhaitons utiliser. La librairie a été réduite au maximum pour ne cribler que les gènes susceptibles d’être pertinent thérapeutiquement.

Raffinement

Pour le bien-être des animaux, les procédures techniques seront limitées au strict nécessaire. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et avec recours aux analgésiques. Dans le cas où un animal présenterait des signes d'inconfort ou de douleur au cours de l'expérience, des analgésiques seront administrés. De plus, nous avons établi des points d'arrêt très précoces pour chaque expérience, en terme de taille de tumeurs, qui nous permet néanmoins de répondre à notre question scientifique. Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective, l’état des animaux. Dès l’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Un des problèmes du traitement des cancers est l’existence de cellules résistantes aux traitements et leur apparition en cours de traitement. Le projet a pour but d’identifier les gènes nécessaires au développement tumoral pouvant être des cibles thérapeutiques. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (culture in vitro, organoïdes), l’utilisation du modèle souris, espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie, reste indispensable pour récapituler pleinement l’environnement tumoral. Les lignées murines immunodéficientes permettent la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris), sans provoquer de rejet de la greffe. Ces xénogreffes de tumeurs de patients récapitulent remarquablement bien les tumeurs humaines et constituent donc un modèle idéal pour l’étude des gènes impliqués dans la progression tumorale Des souris adultes pubères de 6 à 10 semaines seront incluses dans les procédures expérimentales, après le développement du tissu épithélial mammaire. Ce choix est justifié par le fait que le cancer du sein touche principalement la femme adulte (99%).