Système endocrinien

Une tumeur implantée, deux administrations orales de matières fécales murines, jusqu'à quatre injections d'immunothérapie et des prises de sang hebdomadaires: 1 508 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles subit en plus une intervention chirurgicale de cinq minutes sous anesthésie générale pour l'injection d'un traceur. Le porteur ramène les contraintes à une douleur et une gêne modérées liées à l'implantation de la tumeur, à un inconfort lors du gavage fécal et à une perte de poids possible. Il ne précise ni la nature du traceur, ni les immunothérapies employées, ni le calcul qui aboutit à cet effectif, dont il indique seulement qu'il découle d'un "nombre maximal théorique d'animaux par groupe".

Objectifs

Des précédentes études ont montré l'impact de la composition du microbiote intestinal (MI) sur la réponse immunitaire et la réponse aux traitements par immunothérapies contre le cancer. Il a d’abord été montré que la prise d’antibiotiques (ATB), en créant une dysbiose intestinale, est associée à une diminution de l’efficacité de ces immunothérapies dans de nombreux types de cancers. Puis, des compositions spécifiques du microbiote intestinale ont été mises en évidence comme étant associées à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies. Ensuite, des travaux sur des modèles de souris ont permis de démontrer que la transplantation de microbiote fécal (TMF) à partir de selles de patients répondeurs ou résistants aux immunothérapies conduisait à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies chez ces souris, respectivement. Finalement, la transplantation de microbiote fécal chez les patients parait être une approche efficace pour contourner la résistance aux immunothérapies induite par une dysbiose intestinale. Malgré des résultats prometteurs en clinique, il est nécessaire de comprendre les mécanismes qui expliquent la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. L'objectif principal de ce projet est de décrire les effets de la transplantation de microbiote fécal sur le système immunitaire et son implication dans la réponse antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de comprendre les mécanismes expliquant la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. Cela permettra par la suite de mieux sélectionner les donneurs pour la transplantation, ainsi que de mieux sélectionner les patients pouvant recevoir la transplantation de microbiote fécal. De plus, ce projet apportera plus de compréhension sur les liens existants entre le microbiote intestinale, le cancer et la réponse aux immunothérapies. Enfin, par la compréhension des ces mécanismes, les patients ayant une dysbiose intestinale et résistants aux immunothérapies pourront bénéficier d'une tranplantation de microbiote fécal afin de contourner cette résistance.

Procédures

Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation d'une tumeur (une fois, d'une durée d'1 minute), l'administration orale de matières fécales murines (2 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie (4 fois maximum, durée 1 minute), l'injection au niveau de la queue (une fois, durée 1 minute, anesthésie locale). De plus, il est prévu pour certaines procédures d'utiliser un traceur pour suivre la migration cellulaire, nécessitant une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale, d'une durée de 5 minutes (une fois). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, au maximum 1 fois par semaine (durée 5 minutes). Les injections seront réalisées sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures une douleur et une gêne modérée liée à l'implantation d'une tumeur, un inconfort lié à l'administration de matières fécales par voie orale au moment de l'administration, ainsi qu'une potentielle perte de poids liée à la tumeur, aux traitements et à l'administration des matières fécales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure, afin de prélever les organes pour analyser les tissus, les cellules, doser des protéines ou de l'ADN.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles, dont certaines dites "GO-NO-GO", et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. Notre critère de jugement principal est le suivi de la croissance tumorale. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière quotidienne permettra le suivi clinique de la souris ainsi que de son comportement, permettant l’éventuelle mise en place de mesures d'analgésie. Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale. Les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières. Les points limites précoces seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique et l'immunotlogie sont proches de celle de l’Homme et bien connues. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des bactéries et de la transplantation de microbiote fécal sur l’immunité et la réponse antitumorale. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cette âge là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.

Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids sont tuées. 439 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des bactéries productrices d'acides gras par la bouche et par voie rectale, cette seconde voie sous anesthésie légère, et subissent un test de tolérance au glucose qui commence par une coupure d'un millimètre au bout de la queue, décrite par le porteur comme une douleur modérée à cicatrisation rapide. L'objet est de comprendre comment ces bactéries agissent sur l'axe intestin-cerveau, avec pour horizon des thérapies probiotiques contre l'obésité, le diabète et les troubles du comportement alimentaire, que le porteur range parmi les applications potentielles.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'identifier et de caractériser les mécanismes moléculaires par lesquels les souches bactériennes productrices d'acides gras polyinsaturés influencent l'axe intestin-cerveau et régulent l'équilibre énergétique chez la souris. Cette recherche vise à élucider comment ces interactions microbiennes peuvent moduler les fonctions intestinales et neurologiques, ainsi que leur impact sur le métabolisme énergétique global. Les résultats de cette étude permettront de mieux comprendre les bases biologiques sous-jacentes des effets du microbiote intestinal sur la santé métabolique et neurologique, ouvrant ainsi la voie au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter des conditions telles que l'obésité, le diabète et les troubles du comportement alimentaire.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus incluent une meilleure compréhension des interactions microbiote-intestin-cerveau, l'identification de nouveaux biomarqueurs et de cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement des maladies métaboliques et neurologiques. Les applications potentielles incluent le développement de nouvelles thérapies probiotiques et l'amélioration des stratégies de santé publique.

Procédures

Les souris seront soumises à la technique de l'enrichissement de flore, une technique de classe modérée consistant à inoculer des bactéries dans le microbiote intestinal des souris, par voie orale et/ou rectale. C'est une technique qui necessite une contention de courte duree (

Impact sur les animaux

Au vu de l'expérience dans le type de procédures mises en œuvre dans ce projet, qui ont toutes été déjà optimisées, il n'y pas de nuisances ou effets indésirables prévues qui pourraient conduire à la mise à mort anticipée des animaux. En ce qui concerne l'acte "d'enrichissement de flore", l'inoculation des bactéries productrices d'acides gras polyinsaturés par gavage chez l’animal est une technique qui necessite une contention de courte duree (

Devenir

Mise à mort pour prélèvement d'organes

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux, avec la contribution de produits du microbiote intestinal, en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux énergétiques en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons effectué un travail en amont qui nous a permis d'identifier les bactéries, non virulentes et qui peuvent croître dans des conditions préférable à la souris, grâce à des analyses in vitro et in silico. Ainsi cette sélection a abouti à ne retenir que les bactéries candidates les plus fiables et ce sont elles qui seront testées in vivo, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Les échantillons prélevés chez chaque animal permettront de générer un grand nombre d’informations sur des marqueurs moléculaires. De plus, nous avons estimé la taille des échantillons (n=8) permettant une analyse statistique efficace grâce aux données de la littérature.

Raffinement

Les animaux seront maintenus avec leurs congénaires dans les milieux enrichis avec les morceaux de bois, une maison et des tubes en carton, ce qui permettra d'améliorer leur bien être. Les souris seront également observés quotidiennement et un suivi de poids et de la prise alimentaire seront réalisés 1 fois par semaine. Cela nous permettra d'identifier rapidement les animaux en souffrance. En cas de perte supérieure à 15% la souris sera euthanasiée. Pour réduire le stress infligé aux animaux, l'enrichissement de flore par voie rectale sera effectué sous anesthésie légère après passage dans une chambre d'induction à l'isoflurane, et le diamètre de la sonde est adaptée à la taille de l'animal. Les sondes sont en plastique ce qui ne causera pas de blessure à l'animal. L'inoculation par voie orale sur animal vigile est préférée car à la fois plus simple pour l'expérimentateur et mieux tolérée par l'animal. Pendant le test de tolérance au glucose, les prises de sang seront réduites au minimum pour permettre le dosage d'insuline (nécessitant 5ul de plasma).

Choix des espèces

Les modèles précliniques de souris sont des outils complémentaires et essentiels, partageant avec l'humain de fortes homologies dans les régulations physioplogiques, en particulier le contrôle de l'homéostasie glucidique et de l'adiposité. Les souris nous seront livrées à l'âge 3 semaines et nous commencerons nos expérimentations à 4 semaines (après une semaine d'acclimatation), car leur flore intestinale est encore immature, et cela permettra à nos bactéries de s'implanter plus facilement, sauf pour la procédure 1, nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines, car c'est une étude pilote.

Diabète déclenché par une injection unique d'une molécule toxique pour le pancréas, ou installé sur douze semaines par un régime gras et de l'eau sucrée : 540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent jusqu'à 24 prélèvements sanguins pour confirmer l'installation de la maladie, puis sept injections intrapéritonéales en quatorze jours, puis un test de tolérance au glucose de deux heures après cinq heures de jeûne. Le porteur décrit une augmentation de l'émission d'urine, une soif accrue et une perte de poids possible, et qualifie l'induction du diabète de "strictement nécessaire". Les souris sont ensuite tuées pour prélever pancréas, foie, muscles et tissus adipeux, à la recherche de facteurs musculaires qui pourraient un jour régénérer des cellules productrices d'insuline chez des patients.

Objectifs

Les diabètes de type 1 et 2 sont caractérisés par une augmentation de la concentration du sucre dans le sang entrainant notamment des maladies du cœur et des reins mettant ainsi en jeu la vie des patients diabétiques. L’excès de sucre dans le sang se met en place lorsque le pancréas produit de façon insuffisante l’insuline qui est l’hormone capable de baisser la concentration de sucre dans le sang. La piste thérapeutique explorée vise à augmenter la production d’insuline par le pancréas pour traiter ces maladies. Les muscles squelettiques de souris peuvent produire différents facteurs capables d’augmenter le nombre de cellules productrices d’insuline sur des pancréas de souris mis en culture, en stimulant la formation de nouvelles cellules productrices d’insuline à partir de cellules souches du pancréas. L’objectif sera donc de tester si ces facteurs peuvent également agir chez la souris de laboratoire diabétique (dans un modèle de diabète de type 1 et un modèle de diabète de type 2), en augmentant le nombre de cellules productrices d’insuline et par conséquence la quantité d’insuline produite.

Bénéfices attendus

Le diabète de type 1 est caractérisé par un déficit total en cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline, la seule hormone hypoglycémiante de l’organisme. Le diabète de type 2 est caractérisé par une résistance à l’insuline associée à une carence relative en insuline. En France, on dénombre 4,3 millions de personnes diabétiques. La prévalence augmente depuis des années et est passée de 5,6 pour cent en 2015 à 6,07 pour cent en 2021 (source Santé Publique France et Fédération Française des diabétiques). Si les tendances restent identiques, 520 000 personnes deviendront diabétiques d’ici 2027 en France. 90 pour cent des diabétiques sont atteints du diabète de type 2, maladie touchant préférentiellement les adultes et associée à l’obésité. 10 pour cent des patients sont atteints du diabète de type 1 dont le déclenchement est observé majoritairement chez l’enfant et est lié à une dérégulation du système immunitaire. Des traitements contre cette maladie existent avec notamment des anti-diabétiques oraux pour le diabète de type 2 et des injections quotidiennes d’insuline pour le diabète de type 1. Néanmoins, des nouvelles pistes de traitement doivent être explorées pour tenter de restaurer une production endogène d’insuline, permettant une régulation physiologique de la glycémie, notamment en stimulant la formation de nouvelles cellules productrices d’insuline dans le pancréas. Le projet actuel a donc pour objectif de définir le potentiel thérapeutique de différents facteurs pour restaurer chez la souris diabétique un nombre suffisant de cellules productrices d’insuline et ainsi permettre de normaliser la concentration de sucre dans le sang chez la souris diabétique.

Procédures

Une partie des animaux subira une induction d’un diabète qui se fera par injection unique sur animal vigile d’une molécule toxique pour une population de cellules du pancréas (quelques secondes par animal) effectuée après une mise à jeun courte (4h). Des prélèvements sanguins de faible volume effectués quotidiennement pendant 5 jours après l’injection permettront de confirmer l’induction du diabète. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal soit 5 prélèvements sur la durée de maintien. Une autre parte des animaux sera nourri par un régime riche en graisse associé à l’administration de sucre dans l’eau de boisson pendant 12 semaines. Des prélèvements sanguins de faible volume (quelques microlitres) effectués 2 fois par semaines permettront de confirmer l’induction du diabète. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal soit 24 prélèvements sur la durée de maintien. Les souris seront ensuite soumises à des traitements administrés par injections intrapéritonéales tous les 2 jours. Chaque souris recevra 7 injections sur une période de 14 jours. Les injections seront effectuées sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. A la fin des traitements, les souris seront soumises à l’un des deux tests pour évaluer soit la tolérance au glucose ou celle à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun courte (5h), les souris seront injectées en intrapéritonéal et 5 à 7 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les souris concernent principalement l’induction d’un diabète chez les souris. Le diabète est associé à une augmentation de la concentration de sucre dans le sang pouvant impacter le bien-être des animaux avec notamment une augmentation de l’émission d’urine, de la prise de boisson et éventuellement une perte de poids. L’induction de cette pathologie est malheureusement strictement nécessaire pour mener à bien ce projet puisque notre objectif vise à identifier des thérapies innovantes pour traiter le diabète. L’induction du diabète de type 1 sera effectuée par administration unique d’un agent par injection au niveau de l’abdomen pouvant être source de stress et d’une douleur de courte durée au point d’injection. L’induction du diabète de type 2 sera effectuée en alimentant les animaux avec un régime hyperlipidique et du sucre dans l’eau de boisson. Le changement de régime pourra induire un léger stress. De même, le suivi glycémique longitudinal des animaux pourra induire un stress et une douleur de courte durée. Les traitements reposent sur une injection intrapéritonéale tous les 2 jours, pouvant ainsi induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection pour les animaux. Le traitement pourrait induire une production accrue d’insuline chez les souris non diabétiques. De ce fait, des épisodes d’hypoglycémies modérées pourraient prendre place chez les souris non diabétiques. D’autres effets secondaires pourraient être observés mais sont difficiles à prévoir et une surveillance accrue des souris sera réalisée quotidiennement. Les tests métaboliques, qui comprennent une injection intrapéritonéale puis plusieurs prélèvements sanguins de faible volume afin de suivre la glycémie, peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Ils peuvent également induire un stress et une légère sensation de faim pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun.

Devenir

Notre étude nécessite le prélèvement d’organes afin de caractériser l’effet des traitements mis en œuvre sur la pathologie étudié (le diabète). Ainsi, l’euthanasie des animaux est strictement nécessaire afin de répondre aux enjeux scientifiques du projet.

Remplacement

Les cellules bêta pancréatiques produisent l’insuline qui va agir sur ses tissus cibles pour stimuler le stockage du glucose, inhiber la production de glucose et la lipolyse. Lorsque l’insuline est produite en quantité insuffisante, la concentration de glucose dans le sang n’est plus régulée et augmente de façon chronique. C’est l’hyperglycémie qui est le symptôme premier du diabète, maladie multi-organes. Nous développons des stratégies afin de former de nouvelles cellules bêta dans le pancréas. Dans un premier temps, par des études in vitro sur un modèle d’explant de pancréas avec des résultats très prometteurs, puis in vivo sur un modèle de souris diabétiques pour augmenter la production d’insuline et résoudre l’hyperglycémie. Un organisme vivant est nécessaire pour établir la preuve d’efficacité des traitements par nos différents facteurs dans des modèles animaux de ces maladies humaines. Il n’est pas possible de recréer en culture de cellules la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires rentrant en jeu et de tester le potentiel thérapeutique de nos facteurs sur la résolution du diabète.

Réduction

Un total de 540 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous analyserons sur chaque souris les cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline mais également les tissus cibles de l’insuline tels que le foie, les muscles squelettiques et les tissus adipeux gonadiques et sous cutanés. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe tout en nous assurant que nous obtiendrons des résultats statistiquement fiables. En effet, en raison des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (formation, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés . La principale contrainte concerne le développement du diabète nécessaire pour mener à bien ce projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés à la pathologie avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids et de la glycémie sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nos résultats ont montré chez la souris adulte que le muscle squelettique rendu insulino-résistant produisait des protéines appelées myokines pour lesquelles nous avons montré qu’elles possédaient in vitro la capacité de stimuler la formation de nouvelles cellules bêta sur un modèle d’explants pancréatiques. Notre projet vise à tester cette même capacité chez la souris adulte normale et diabétique de type 1 et de type 2 justifiant le choix de cette espèce. Justification du stade de développement : Notre projet vise à définir le potentiel thérapeutique de nos traitements pour former de nouvelles cellules bêta et à permettre une nouvelle production d’insuline par le pancréas adulte dans des modèles de souris diabétiques de type 1 et de type 2. Il convient donc d’utiliser des souris adultes pour ce projet.

1 760 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun voyant ses pattes arrière immobilisées par un adhésif seize heures par jour, de la naissance au vingt-huitième jour. Les ratons sont séparés de leur mère cinq heures au douzième jour, certains sont ensuite soumis à une course forcée sur tapis roulant trente minutes par séance, trois jours par semaine pendant quatre semaines, d'autres à des vibrations du corps entier quinze jours de suite. Une injection de marqueur dans le muscle après ouverture de la peau, une étude électrophysiologique d'une heure trente et un prélèvement de sang par section du bout de la queue complètent le protocole, avant la mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur annonce des contremesures qui permettraient aux enfants alités ou atteints d'un trouble de la coordination un développement harmonieux, quand ce qui est acquis ici est l'immobilisation quotidienne de rats nouveau-nés.

Objectifs

Les premières années de la vie sont déterminantes pour le développement de l’enfant et de la santé de l’adulte qu’il deviendra, et elles programment sa santé future (cf. concept des « 1000 premiers jours » lancé par l’Unicef). La jeune enfance est donc une période critique du développement au cours de laquelle les individus vont développer les compétences motrices et cognitives essentielles pour leur existence. Or, certains enfants sont contraints à l’hypoactivité parce qu’ils sont alités (maladie, accident, paralysie cérébrale…). D’autres, qui souffrent d’un trouble développemental de la coordination, présentent des atypies sensorimotrices. L’hypoactivité ou les troubles moteurs précoces sont à l'origine d'un développement anormal et durable de l'organisation et des fonctions du système nerveux. Ils conduisent à des troubles cognitifs et à un risque accru d’émergence de maladies civilisationnelles à l’âge adulte (diabète, hypertension...). Les objectifs de ce projet sont 1/ de fournir des preuves d'une altération du dialogue muscle-cerveau dans les déficits neurodéveloppementaux induits par l'hypoactivité et 2/ dans une perspective translationnelle, de développer des stratégies innovantes pour restaurer un dialogue efficace et robuste entre le muscle et le cerveau afin de contrecarrer les déficits. L’étude sera réalisée sur un total de 1760 rats dans le respect du principe des « trois R » (remplacement, réduction, raffinement). L’une de nos priorités majeures sera de minimiser l'inconfort, le stress ou la douleur des animaux et de maintenir le nombre d'animaux utilisés dans les procédures expérimentales au minimum. Les interventions invasives seront menées dans les conditions appropriées d'anesthésie et toutes les mesures nécessaires seront prises pour minimiser la douleur pendant et après les interventions. Dans le cas où la vie d'un animal devra être interrompue, cela sera effectué rapidement pour minimiser la douleur et dans le respect des procédures éthiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’avancer dans la compréhension des effets de l’hypoactivité au cours du développement (enfance) et de proposer des contremesures efficaces pour permettre un développement sensorimoteur et cognitif harmonieux.

Procédures

- La procédure de restriction sensorimotrice consiste à immobiliser les pattes postérieures pendant 16h chaque jour, de la naissance à P28. La pose de l'adhésif chaque soir dure env 1 min et le retrait chaque matin 1-2 min. - Prise alimentaire : les ratons sont isolés de la mère pendant une durée de 5 heures le 12e jour postnatal. - L'analyse IRM est réalisée une seule fois et dure env. 1 heure, depuis l’anesthésie jusqu’à l’euthanasie finale. - Les animaux du groupe "exercice" seront entrainés à marcher sur la tapis 10 minutes / jour, 5 jours consécutifs, puis seront soumis à une course sur tapis roulant pendant 30 min, 3 jours /semaine, 4 semaines consécutives. - Vibration corps entier : pendant 15 jours consécutifs, avec un maximum de 15 min / jour. - Avant l’euthanasie, une goutte de sang sera recueillie par section de la pointe de la queue pour mesures de paramètres sanguins au moyen de bandelettes. Cette procédure très rapide ne génère pas plus de douleur pour l’animal que, pour les personnes diabétiques, le fait de se piquer le bout du doigt pour obtenir une goutte de sang. En outre, une pommade anesthésique sera appliquée préalablement. - Injection de marqueur rétrograde dans le muscle : cette procédure, réalisée sous anesthésie, nécessite d'ouvrir la peau pour injecter une petite quantité de marqueur dans le muscle au moyen d'une aiguille très fine. L’animal recevra une injection d’analgésique. La durée totale de l’intervention n’excèdera pas 30 min. - Une étude électrophysiologique (réflexe H) et mécanique (propriétés contractiles) : le niveau d’anesthésie sera vérifié tout au long de la procédure, en veillant toujours à ce que l'animal ne présente aucun signe d'inconfort. La durée totale de l’ensemble de cette procédure est de l’ordre de 1h30. À la fin, les animaux seront mis à mort par euthanasiant chimique et différents tissus seront alors prélevés. - tests comportementaux : réalisés chaque semaine pendant 2 mois. Ils sont répartis sur 5 jours consécutifs, l'ensemble des tests réalisés les 3 premiers jours n'excède pas 30 minutes / jour. Le 4e jour, le test de fatigue dure jusqu'à ce que l'animal refuse de courir. La durée est de l'ordre de 30 min à 1h. Le 5e jour, le test dure toute la nuit mais l'animal est laissé dans sa cage d'hébergement.

Impact sur les animaux

Pour les animaux du groupe RSM (soumis à une restriction sensorimotrice), la peau des pattes postérieures peut se trouver sensibilisée par l’application quotidienne d’adhésif médical. En outre, l’immobilisation peut induire des contractures musculaires. Lors du retrait du système d’immobilisation chaque matin, la peau est soigneusement inspectée et les mouvements de flexion et extension des pattes postérieures sont réalisés délicatement. L’ensemble des tests réalisés pour l’évaluation de la fonction motrice peuvent générer un stress modéré dû à la manipulation et au changement d’environnement. La durée de cette étude est estimée à 1h au maximum. En outre, la course forcée sur tapis roulant peut générer un stress et de possibles douleurs musculaires. Les animaux seront habitués à la course sur tapis roulant à faible vitesse pendant au minimum trois séances préalablement à l’exercice proprement dit. L’étude des propriétés musculaires peut générer de la douleur mais cet effet indésirable sera prévenu par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse et analgésie chimique.

Devenir

Les animaux des différents groupes expérimentaux seront mis à mort afin de prélever des tissus.

Remplacement

L'analyse comportementale nécessite d'être réalisée in vivo et ne peut être remplacée par des méthodes alternatives. L'analyse des propriétés musculaires pourrait être réalisée ex vivo. Cela nécessite un appareillage particulier, onéreux, et une longue période de tests. Des travaux préliminaires seront intégrés à cette étude, en parallèle de l’approche in vivo. Notre objectif est de privilégier cette alternative dans l'avenir.

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux par groupe se base sur la nécessité d’avoir suffisamment d’animaux pour que l’analyse statistique soit possible entre les deux groupes. La plupart des interventions sont non invasives et peuvent être réalisées sur les mêmes animaux. Toutefois, lors de l’euthanasie, deux types de perfusion différentes seront nécessaires pour prélever les tissus, ce qui oblige à prévoir deux lots d’animaux. En outre, pour éviter un effet éventuel de la portée (dû par exemple au comportement maternel), il faut diversifier les portées d’origine au sein d’un même groupe (par exemple, 10 animaux seront obligatoirement issus de 5 portées différentes au minimum).

Raffinement

Les rats seront hébergés en cage collective dans des condition de température et d’hydrométrie contrôlée avec une alimentation et un apport en eau à volonté. Ils bénéficieront d’une surveillance quotidienne et de pesées bi-hebdomadaires. Les expérimentations et les prélèvements seront effectués dans des pièces réservées à cet effet et différentes des locaux d'hébergement. Des anesthésiques et antalgiques adaptés au protocole seront utilisés. Des points limites adaptés seront appliqués. Les animaux présentant au minimum un point limite seront immédiatement retirés de l’étude et euthanasiés.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles animaux les plus couramment utilisés en recherche fondamentale ou appliquée chez les mammifères, notamment pour l’étude de pathologies humaines. Le laboratoire dispose du savoir-faire et des dispositifs expérimentaux nécessaires à l'étude de la fonction sensorimotrice chez les rongeurs. Les rats seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge de 3 mois, ce qui permettra d'étudier les conséquences chez le jeune adulte d'une restriction sensorimotrice subie au cours de l'enfance.

700 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune subissant jusqu'à cinq microcoupures de l'extrémité de la queue et cinq injections, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Les hormones administrées, glucocorticoïdes et hormones thyroïdiennes, peuvent selon le porteur induire une obésité, une résistance à l'insuline, une dyslipidémie, une myopathie, une ostéoporose et une hausse de la mortalité cardiovasculaire. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, trouver une molécule limitant les effets secondaires des traitements du syndrome de Cushing. Après avoir énuméré ces atteintes, le porteur écrit que la dose retenue se situe "dans la plage de doses sûres, sans aucun effet secondaire significatif signalé", et que l'injection et le prélèvement "n'entraînent pas de douleur".

Objectifs

Il a été récemment découvert qu’une protéine libérée par les cellules et les organes est impliquée dans un réflexe primitif de la faim. Cette protéine agit comme un stimulateur de production de graisse (lipogenèse) et un stimulateur de l'appétit. Elle a un mode de sécrétion unique, conservé au cours de l’évolution des organismes, notamment les cellules de mammifères. Cette protéine joue un rôle crucial en aidant les cellules et les organismes à s'adapter au stress nutritionnel, par exemple dans le cas de jeûne, nous pouvons observer sa libération rapide dans le milieu extracellulaire, déclenchant ainsi des réponses adaptatives, telles qu'une modification du comportement alimentaire chez la souris. Nous pouvons aussi observer que cette augmentation de niveau est prolongée dans des conditions telles que le vieillissement, l'obésité, les syndromes métaboliques (dont le syndrome de Cushing), l'inflammation chronique et l'insuffisance rénale. Il est donc essentiel d’étudier l’impact (patho)physiologique de ces dérégulations de la sécrétion de cette protéine. Nous avons mené des expériences préliminaires et avons découvert que l'activation de certains récepteurs stimule la libération de cette protéine à partir de cellules en culture et augmente sa concentration plasmatique chez la souris. De plus, la transcription des hormones thyroïdiennes régule à la baisse le niveau de la protéine. Le rôle des récepteurs des hormones thyroïdiennes doit donc être étudié dans le cadre de la thérapie métabolique. Ainsi, ces expériences nous permettront de clarifier les différents mécanismes d'action de deux hormones liées au métabolisme (thyroxine et glucocorticoïdes) avec notre protéine ainsi que de préciser si notre protéine d'intéret peut servir de pont pour participer aux effets synergiques et antagonistes entre ces hormones.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de trouver une molecule capable de limiter les effets secondaires (comme l'obésité) des traitements actuels pour soigner des syndromes métaboliques tel que le syndrome de Cushing

Procédures

Dans les deux premières procédures, les souris recevront une injection (durée moins d’une minute) et auront un prélèvement de sang (durée d’une minute). Dans les quatre autres procédures, les souris auront toutes 5 prélèvements de deux gouttes de sang après une microcoupure de l’extrémité de la queue (durée moins d’une minute) ainsi qu’un prélèvement de sang (durée d’une minute). Cinq injections (durée moins d’une minute), seront administrées en plus à certaines souris.

Impact sur les animaux

Les injections ou prélèvements sous anesthésie locale induisent des nuisances très limitées au site. Ils sont par ailleurs très petits, ce qui evite les risque d'infections. La contention, les prélèvements et les injections peuvent stresser transitoirement les animaux. Les hormones peuvent induire l'obésité, la résistance à l'insuline, la dyslipidémie, la myopathie, l'ostéoporose et une augmentation de la morbidité et de la mortalité thrombotiques cardiovasculaires. La dose de médicament à tester que nous allons utiliser se situe dans la plage de doses sûres, sans aucun effet secondaire significatif signalé.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Cette étude ne peut être conduite qu’exclusivement in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs ( in silico, organoïdes, organes sur puce) permettant d’étudier dans son ensemble notre problématique. En effet, il nous faut mesurer la concentration d’une protéine dans le sang et, en même temps, la variation de prise de poids sur un organisme entier selon les effets métaboliques que peuvent avoir certains traitements.

Réduction

Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Il existe des différences entre les sexes dans les réponses hormonales c’est pourquoi ces procédures seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne) et nous utiliserons des petites aiguilles stériles, ce qui évitera les risques d'infection. Le prélèvement sur la queue sera réalisé après une microcupure indolore qui se refermera très rapidement par coagulation. L'injection ou le prelevement n'entrainent pas de douleur mais nous mettrons en place une grille de suivi stricte des points limites qui permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués (l'atteinte d'un des critères entrainent l'euthanasie de l'animal). Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tous changements.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est un animal très utilisé en laboratoire, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé

12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, celles des procédures expérimentales tuées pour exploration anatomique et histologique, celles de l'élevage maintenues en vie pour la reproduction. Sur chaque animal s'enchaînent la pose chirurgicale d'un implant d'œstrogène, une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines, huit prélèvements sanguins à la queue, des gavages quotidiens pendant trente semaines, des injections intrapéritonéales deux fois par semaine et une ligature vasculaire, avec des transports entre cinq sites pour les séances d'imagerie. Le porteur indique que les tumeurs peuvent devenir douloureuses au-delà d'un certain volume et gêner l'alimentation, et que le gavage risque de perforer l'œsophage ou d'envoyer la solution dans les poumons, tandis que l'identification de nouveaux traitements des syndromes d'hypercroissance reste annoncée comme une possibilité. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'environnement complexe de ces cellules et que la souris est le seul mammifère chez lequel la protéine visée a été mutée.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

Une injection dans le cerveau, à l'âge d'un jour, sur des souriceaux éveillés retirés de leur mère : 50 nouveau-nés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le geste dure quinze secondes, après application d'une crème anesthésiante sur la peau du crâne. Le projet porte sur l'apprentissage de ce geste par le praticien, avec une solution colorée, la thérapie génique du syndrome de Prader-Willi restant l'objet d'un projet ultérieur. Chaque souriceau est tué deux minutes après l'injection pour que son cerveau soit prélevé et la diffusion du colorant vérifiée.

Objectifs

Nos travaux préliminaires ont permis d’identifier le rôle d’une famille de gènes dont l’absence est une cause principale du syndrome de Prader Willi. Il s'agit d'une maladie génétique rare sans traitement curatif qui réduit drastiquement l’espérance et la qualité de vie des patients - le syndrome de Prader Willi est suspecté après la naissance par des signes caractéristiques de faible tonicité, de difficulté de tétée puis des troubles de la croissance et comportementaux ; en cas de suspicion un test génétique permet de confimer ou infirmer la pathologie. Nos travaux sur cultures cellulaires ont permis de développer une molécule de thérapie génique qui semble capable d’exécuter les rôles des gènes manquants. Avant d'envisager des tests chez l'humain, il convient maintenant de tester cette thérapie sur la souris chez qui une modification génétique reproduit le syndrome de Prader Willi. Ces études sont indispensables avant d’envisager des essais chez l’humain. Pour être efficace, le traitement par notre thérapie génique doit se faire rapidement après la naissance. Cependant, du fait qu'elle ne peut être injectée dans le système sanguin, elle doit être injectée directement dans le cerveau des souris nouveau-nées. Le présent pré-projet vise à acquérir et valider dans notre structure le geste technique d’injection de solution chez la souris nouveau-née de un jour.

Bénéfices attendus

Acquisition d’un geste expérimental permettant l’injection d'une thérapie génique chez la souris nouveau-née, ce qui représente un intérêt pour les projets qui visent à la compréhension/correction de mécanismes cérébraux normaux et pathologiques.

Procédures

Une intervention : les souris subiront une injection intracrânienne à l'âge de 1 jour. Cette injection s'effectuera sur une durée de 15 secondes.

Impact sur les animaux

- Stress lié au retrait transitoire des souriceaux nouveau-nés de la portée - Stress léger maternel - Stress lié à la contention et douleur lié à l'injection intracranienne chez souriceaux nouveau-né vigile

Devenir

Deux minutes après l'injection intracrânienne, chaque nouveau-né sera mis à mort pour prélèvement du cerveau et observation de la bonne diffusion de la molécule colorée dans le cerveau.

Remplacement

Des études préalables sur modèles cellulaires ont permis de développer une thérapie génique du syndrome de Prader Willi. Il convient maintenant de l’administrer sur le souriceau nouveau-né chez qui l’efficacité du traitement sera évaluée en mesurant plusieurs paramètres biologiques et comportementaux, qui ne sont pas évaluables sur modèle non-animal. Ce pré-projet vise à acquérir et valider le geste expérimental d’administration intracranienne de cette thérapie génique chez le souriceau agé de un jour.

Réduction

Pour ce projet, il est prévu d’utiliser au maximum 50 nouveau-nés issus de 4 à 10 femelles souris. Nous estimons que deux vagues de dix nouveau-nés séparées d’au moins une journée seront nécessaires à la bonne acquisition du geste technique par le praticien. Si le rendement afin de valider le geste est de 90% dès la 2ième cohorte de 10 animaux (minimum 20 animaux en tout, vagues 1 et 2), le projet sera arrêté. Dans le cas contraire, une ou deux nouvelles vagues seront réalisées jusqu’à 50 animaux maximum avant de conclure au succès ou à l’échec de l’acquisition du geste.

Raffinement

Les mères seront hébergées avec des éléments d’enrichissement et de nidification (igloo en carton, bloc de coton) jusqu’à la mise bas, puis avec des éléments d'enrichissement classiques (buchettes; frisures de papier kraft) une fois le sevrage des nouveau-nés surnuméraires atteint. Pour les nouveau-nés utilisés, l’injection sera précédée d’une application sur la peau du crâne d'une crème anesthésiante. Dans le cas ou des juvéniles manifesteraient une agitation désordonnée continue considérée comme point limite, leur mise à mort sera réalisée sans attendre les 2 minutes de diffusion de la solution colorée.

Choix des espèces

La souris est l’animal pour lequel des modèles du syndrome de Prader Willi existent. Le développement pathologique chez la souris est proche de l’humain. Dans notre modèle animal, les animaux seront injectés dès le lendemain de leur naissance, afin de mimer le traitement précoce des patients SPW. En effet, le SPW implique des troubles neurodéveloppementaux dont les premières manifestations prennent place à la naissance.