Système endocrinien
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Tests de molécules à visées thérapeutiques sur un modèle murin de syndrome métabolique (obésité, diabète, fibrose hépatique (NASH)).
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Nourries de régimes riches en graisses et en sucre pour développer obésité, diabète et stéatose hépatique, 990 souris, dont certaines au foie ou au système immunitaire humanisé, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude. Elles subissent des prises de sang répétées, dont certaines au sinus rétro-orbital sous anesthésie, et des tests de résistance à l'insuline et au glucose qui, avec la mise à jeun et une injection intrapéritonéale de glucose, durent de 5 h 30 à 13 h 30. Le porteur entend mettre ce protocole "à disposition des chercheurs" et y tester des candidats médicaments, en 33 études de quatre groupes. Pour ce niveau de souffrance déclaré modéré, il liste parmi les signes possibles des accidents vasculaires cérébraux, des crises cardiaques, une encéphalopathie hépatique, une ascite et des vomissements de sang.
Objectifs
L’objectif du projet est de développer un modèle murin de syndrome métabolique, c'est-à-dire une association d'anomalies mêlant dans ce cas obésité, stéatose hépatique non alcoolique (NASH) qui est une pathologie caractérisée par un excès de graisses dans le foie qui n'est pas due à une consommation élevée d'alcool et le développement de diabète qui est donc une résistance à l’insuline. Ce syndrôme sera reproduit grâce à des régimes riche en graisse et en sucre mimant les régimes occidentaux et permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de cette pathologie et de tester de nouveaux candidats médicaments puisqu'aucune thérapie curative n'est approuvée.
Bénéfices attendus
En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire et/ou un foie humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier un syndrome métabolique (diabète, NASH, obésité) et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.
Procédures
Prélèvements sanguins : la fréquence et les volumes seront déterminés sur base du poids de la souris. La durée des prélèvements est de 10 à 15 secondes. Test de résistance à l’insuline et test de résistance au glucose comprenant une mise à jeun suivie de prise de sang pour analyse de la glycémie et injection intrapéritonéale d’une solution de glucose. Durée totale du test entre 5h30 et 13h30.
Impact sur les animaux
Pour le développement de ce modèle pathologique divers signes cliniques pouvant entraîner un inconfort pourront être observés: en lien avec le développement d’un diabète de type II : polyphagie, polyurie – polydipsie, troubles de la vision, asthénie, pathologie cardio-vasculaires (accident vasculaire cérébral, crise cardiaques), néphropathie, neuropathie, rétinopathie; en lien avec l’obésité: accumulation de graisse viscérale et augmentation du poids pouvant entraîner une difficulté à se mouvoir, pathologie cardio-vasculaire; en lien avec une insuffisance hépatique : état général dégradé, encéphalopathie hépatique, ictère, asthénie, anorexie, ascite, troubles de la coagulation, vomissement (hématémèse), diarrhée (méléna ou hématochésie). Des nuisances peuvent également être induites par les prélèvements sanguins et les injections et les effets potentiellement toxiques de composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Le modèle induisant des modifications délétères pour la santé de la souris, les souris seront mises à mort en fin d'étude.
Remplacement
Il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement qui mimerait le développement d'un syndrôme métabolique (diabète, obésité, NASH) tout en objectivant l’efficacité de molécules agissant, entre autres, sur l’activité du système immunitaire, la mort cellulaire, le stress oxidatif ou les taux d’insuline et de lipides dans le sang. Les modèles murins en général, et plus particulièrement la souris avec un foie et/ou un système immunitaire humanisé(s), constituent donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre cette maladie.
Réduction
Un total de 990 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 33 études de 4 groupes (contrôle négatif, contrôle positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe. Le nombre d'animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur les effets attendus de la série, ainsi que des tests statistiques paramétriques et non paramétriques. Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Six morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. À leur entrée dans le projet, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle cumulative de scores (donnés entre parenthèse) prenant en compte : l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, l’activité, la couleur des muqueuses et le score corporel. Les souris seront évaluées quotidiennement et l’échelle sera appliquée dès que nécessaire. Une souris avec un score clinique ≥ à 7 sera euthanasiée pour raison éthique. Le poids sera monitoré 1 à 3 fois par semaine. Le suivi de l’évolution pondérale pourra être adapté au stade de l’étude. Une perte de plus de 25%, calculée à partir du poids mesuré le plus élevé, sera considérée comme une raison de mise à mort. Une augmentation importante du poids et une obésité entraînant une invalidité sera aussi considérée comme une raison de mise à mort. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les prélèvements au sinus rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
L'utilisation de modèles murins dans les syndromes métaboliques a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Par ailleurs, nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire ainsi que l'humanisation du foie chez les souris. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre avec cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de l'age de 16 semaines pour les animaux humanisés, ceci prenant en compte une période d'humanisation de 12 semaines (minimum) qui peut être réalisée à partir de l'age de 3 à 4 semaines. Les animaux non humanisés seront utilisés à partir de l'age de 6 à 8 semaines afin d'utiliser des animaux adultes. Les études seront réalisées sur des groupes d'âges homogènes.
Etude de l’incidence d’un gène sur le développement de la souris EU : 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Identifiées par ablation de la dernière phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, 1 320 souris subissent ensuite jusqu'à trois prélèvements sanguins au cours de leur vie, sur animal vigile sous contention. 880 sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 440 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 120 réutilisées ensuite dans d'autres expériences. Le porteur qualifie la biopsie de phalange de non douloureuse au motif que les fibres nerveuses ne sont pas encore myélinisées à cet âge, et écrit que ces procédures n'entraînent "généralement pas de souffrance", tout en listant les signes qui déclenchent une mise à mort immédiate : posture inhabituelle, poil hérissé, dos voûté, retrait des congénères. Les souris dont le gène est inactivé dans l'intestin peuvent développer des diarrhées et des troubles de la croissance, et toutes sont tuées pour prélèvement d'organes.
Objectifs
L’absence de la protéine fonctionnelle étudiée augmente considérablement le risque de fausse couche, et les patients mutés présentent des troubles neurologiques. De plus, ces patients présentent des troubles intestinaux. Notre étude vise à démontrer ses activités tissu-spécifiques. Cette étude sera multisite est se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de mieux comprendre les différents rôles du gène étudié.
Procédures
Les souris seront identifiées et génotypées par ablation de la dernière phalange au sein de l’EU1. Un groupe subira 4 prélèvements sanguins sur animal vigile sous contention, chaque prélèvement durera 1 minute au maximum et une prise de sang juste à la mise à mort sera réalisée. Le dernier groupe recevra, par animal vigile sous contention, une injection d’analgésique en intra-péritonéale, cette procédure durera un maximum d’1 minutes puis, 30 minutes plus tard elle sera suivie d’une injection IP d’anesthésique en dose léthale sous contention pour une durée maximale d’1 minute, cette chirurgie sera terminale sous anesthésie en vue du prélèvements d’organes. Les différentes expérimentations de l’étude seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs de ce projet (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Pour les souris nulles, ayant le gène d’intérêt excisé, nous serons très attentifs aux phénotypes. Ne connaissant pas précisément le rôle du gène étudié, nous ne pouvons le prévoir. Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée, ces animaux ayant une inactivation au niveau de l’intestin, un dysfonctionnement digestif pouvant entrainer des diarrhées. Pour les souris ayant une inactivation dans le cortex/neurones, le comportement sera surveillé. Chaque animal subira au maximum 3 prélèvements sanguins au cours de sa vie. Pour l’ensemble des procédures, à l’exception de la chirurgie sans réveil, les expérimentations faites sur les animaux de l’études sont en classe modérée, les gestes expérimentaux réalisés pouvant provoquer un stress et un inconfort lors des prélèvements.
Devenir
Les animaux produits serviront au maintien des lignées et à produire les cohortes nécessaires aux expériences décrites dans la saisine, tous les animaux sont mis à mort en fin pour prélèvements d’organes
Remplacement
Le gène d’étude étant exprimé dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (e.g. intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption). Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles.
Réduction
Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Ce projet utilisera au maximum 1320 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids de façon hebdomadaire. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, en cas de saignement, un point de compression sera effectué pour le stopper. Les points de prélèvement seront surveillés et si une infection est constatée une désinfection sera faite. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Nous prenons le parti de réaliser une injection d’analgésique avant l’anesthésie sans réveil pour éviter toute souffrance éventuelle. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Le transfert des souris entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué dans des boites prévues à cet effet et par du personnel compétent formé, les 2 animaleries appartenant au même site, le trajet sera fait en intérieur et durera 15 minutes avec une durée totale de transfert inférieur à 2h de la cage d’origine à la cage de destination.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle afin de mimer les pathologies humaines dues aux mutations du gêne d’intérêt. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 à 30 semaines correspondant à des adultes, 50 semaines et plus correspondant à des séniors, âges où des symptômes visibles apparaissent dans les physiopathologies humaines.
Etude de l’incidence d’un gène sur le développement de la souris EU : 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Toute souris qui montre une posture inhabituelle, le poil hérissé, le dos voûté ou un retrait de ses congénères est sortie de l'étude et tuée immédiatement. 1 320 souris vont être utilisées, 880 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 440 engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 120 réutilisées ensuite dans d'autres expériences. Chaque animal est identifié par l'ablation de la dernière phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, puis peut subir jusqu'à trois prélèvements sanguins au cours de sa vie, sur animal vigile sous contention. Le porteur indique que les souris produites servent d'abord au maintien des lignées et à la fabrication des cohortes nécessaires aux expériences, pour un gène dont il annonce ne pas connaître précisément le rôle.
Objectifs
L’absence de la protéine fonctionnelle étudiée augmente considérablement le risque de fausse couche, et les patients mutés présentent des troubles neurologiques. De plus, ces patients présentent des troubles intestinaux. Notre étude vise à démontrer ses activités tissu-spécifiques. Cette étude sera multisite est se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de mieux comprendre les différents rôles du gène étudié.
Procédures
Les souris seront identifiées et génotypées par ablation de la dernière phalange au sein de l’EU1. Un groupe subira 4 prélèvements sanguins sur animal vigile sous contention, chaque prélèvement durera 1 minute au maximum et une prise de sang juste à la mise à mort sera réalisée. Le dernier groupe recevra, par animal vigile sous contention, une injection d’analgésique en intra-péritonéale, cette procédure durera un maximum d’1 minutes puis, 30 minutes plus tard elle sera suivie d’une injection IP d’anesthésique en dose léthale sous contention pour une durée maximale d’1 minute, cette chirurgie sera terminale sous anesthésie en vue du prélèvements d’organes. Les différentes expérimentations de l’étude seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs de ce projet (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Pour les souris nulles, ayant le gène d’intérêt excisé, nous serons très attentifs aux phénotypes. Ne connaissant pas précisément le rôle du gène étudié, nous ne pouvons le prévoir. Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée. Pour les souris ayant une inactivation dans le cortex/neurones, le comportement sera surveillé. Les animaux issus des croisements sont identifiés amputation de la première phalange. Cette procédure est réalisée entre 7 et 10 jours après la naissance, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées. Le prélèvement de la biopsie est alors non douloureux. La phalangectomie nous permettra de récupérer une biopsie des animaux afin de déterminer leurs génotypes. Chaque animal subira au maximum 3 prélèvements sanguins au cours de sa vie. Pour l’ensemble des procédures, à l’exception de la chirurgie sans réveil, les expérimentations faites sur les animaux de l’études sont en classe modérée, les gestes expérimentaux réalisés pouvant provoquer un stress et un inconfort lors des prélèvements.
Devenir
Les animaux produits serviront au maintien des lignées et à produire les cohortes nécessaires aux expériences décrites dans la saisine, tous les animaux sont mis à mort en fin pour prélèvements d’organes
Remplacement
Le gène d’étude étant exprimé dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (e.g. intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption). Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles.
Réduction
Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Ce projet utilisera au maximum 1320 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids de façon hebdomadaire. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, en cas de saignement, un point de compression sera effectué pour le stopper. Les points de prélèvement seront surveillés et si une infection est constatée une désinfection sera faite. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Nous prenons le parti de réaliser une injection d’analgésique avant l’anesthésie sans réveil pour éviter toute souffrance éventuelle. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Le transfert des souris entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué dans des boites prévues à cet effet et par du personnel compétent formé, les 2 animaleries appartenant au même site, le trajet sera fait en intérieur et durera 15 minutes avec une durée totale de transfert inférieur à 2h de la cage d’origine à la cage de destination.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle afin de mimer les pathologies humaines dues aux mutations du gêne d’intérêt. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 à 30 semaines correspondant à des adultes, 50 semaines et plus correspondant à des séniors, âges où des symptômes visibles apparaissent dans les physiopathologies humaines.
Combinaison de deux inhibiteurs dans un modèle de xénogreffe chez des souris immunodéficientes et des modèles d’hypercroissance 4/5
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Poids, comportement et aspect du poil servent de points limites déclenchant la mise à mort anticipée. 12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties sur cinq établissements. Chaque animal peut recevoir un implant d'œstrogène posé sous anesthésie, une injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines, huit prélèvements sanguins, cinq gavages au tamoxifène, des injections intrapéritonéales deux fois par semaine et des gavages quotidiens pendant jusqu'à trente semaines, plus une ligature vasculaire. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique et histologique, celles de l'élevage restant en vie pour la reproduction, à l'exception des mâles immunodéficients.
Objectifs
Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.
Bénéfices attendus
Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements
Procédures
Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)
Impact sur les animaux
Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.
Devenir
Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.
Remplacement
Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.
Raffinement
Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.
Génotypage invasif des lignées transgéniques murines
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Les souris dont le génotype ne présente pas d'intérêt sont tuées pour cette seule raison, les autres partant vers des projets de recherche ou vers l'élevage, où elles seront tuées en fin de période reproductive. 90 000 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie de la queue entre le septième et le dixième jour de vie, sans anesthésie ni analgésie, le porteur écrivant que celles-ci "induiraient des nuisances supplémentaires" et que la partie distale de la queue n'est pas encore ossifiée à cet âge. Ce chiffre de 90 000 n'est rattaché à aucun calcul, seulement à l'adaptation des croisements aux besoins de plusieurs dizaines d'équipes, dont certaines utilisent ces lignées pour des formations réglementaires à l'expérimentation animale.
Objectifs
Notre centre assure l'hébergement, le soin et l'élevage de lignées murines impliquées dans de nombreuses thématiques de recherche (comme par exemple la biologie du développement, la reproduction, la physiopathologie des maladies du système nerveux, l’étude du vieillissement) ou dans des formations pour des étudiants de Licence ou Master et des formations réglementaires pour l’expérimentation animale. Le présent projet vise à identifier les génotypes des animaux dans divers modèles de souris. Plusieurs dizaines d’équipes utilisent des modèles murins mutants et transgéniques pour étudier leur comportement et/ou les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la régulation des processus physiologiques ou physiopathologiques dans les systèmes cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, reproducteur, endocrinien/métabolisme, et pendant le développement.
Bénéfices attendus
Le maintien des lignées par croisement nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter une dérive génétique par croisement consanguin, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité du fond génétique et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux. L’étude des différents modèles murins mutants et transgéniques permettra de faire des avancées significatives dans la connaissance des processus physiologiques ou physiopathologiques dans les systèmes cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, reproducteur, endocrinien/métabolisme, de la biologie du développement et du comportement animal. Ces connaissances pourront permettre le développement de traitements contre différentes pathologies des domaines concernés.
Procédures
Prélèvement d'une biopsie caudale par animal (contention et biopsie moins d'1 minute, prélèvement en lui même moins d'1s). Si un animal doit être re-prélevé lors de sa vie, il le sera par encoche à l’oreille et génotypage sur le fragment de tissu prélevé (contention et biopsie moins d'1 minute, prélèvement en lui même moins d'1s).
Impact sur les animaux
La biopsie de l’extrémité de la queue, pour le génotypage des animaux, pourra générer une légère et brève douleur. Des petits saignements peuvent être constatés lors du prélèvement de la biopsie caudale, cela ne dure que quelques secondes. Toutes les contentions, manipulations représentent un stress léger pour les animaux.
Devenir
Les animaux disposant d’un génotype d’intérêt seront utilisés dans les projets de recherche préalablement autorisés par le ministère dans le cadre d’une utilisation continue. Les autres animaux seront soit utilisés dans les élevages puis euthanasiés en fin de période reproductive, soit euthanasiés pour génotype sans intérêt, par une méthode réglementaire adaptée à l’âge des animaux concernés.
Remplacement
Nos projets s’intéressent à la physiologie de l’organisme qui implique l’interaction entre différents organes et l’environnement. Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro, nos projets s’intéressent à des systèmes complexes impliquant l’interaction entre différents organes et l’environnement et nécessitent une étude à l’échelle de l’organisme. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. Les résultats obtenus au laboratoire sont toutefois complémentaires à ceux obtenus chez l’homme. L’anatomie, la physiologie et les comportements murins sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques de transgénèse conditionnelle pour l’étude de la fonction des gènes.
Réduction
Le nombre total d’animaux du projet sera de 90 000. Pour le maintien de lignées et la production des animaux pour l’expérimentation, lors de réunions avec les concepteurs des différentes équipes, nous adaptons les croisements (choix des génotypes et nombre de portée) pour effectuer un élevage raisonné. Le choix des génotypes des reproducteurs est effectué pour obtenir le maximum d’animaux ayant un génotype d’intérêt dans la descendance et donc pour générer le moins d’animaux possible. Les croisements sont arrêtés dès le bon nombre d’animaux avec le génotype d’intérêt obtenus.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement. En cas de bagarre un enrichissement supplémentaire pourra être ajouté (type maisonnette en carton). Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de souffrance possible. Les animaux ne sont séparés que le temps strictement nécessaire pour la procédure. De même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé. La biopsie caudale est prélevée lors du marquage par tatouage, entre P7 et P10, et n'induit donc pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'inconfort, du fait que la partie distale n'est pas encore ossifiée. Le geste est très rapide et les souriceaux rapidement remis avec leur mère et observés pour vérifier qu’elle les reprend bien en charge. L'absence de saignement et la bonne cicatrisation sont vérifiés. La méthode de prélèvement est éprouvée, précise, rapide et standardisée. Elle a été élaborée pour limiter les effets indésirables (stress, douleurs) et ne nécessite pas ni anesthésie ni analgésie, qui induiraient des nuisances supplémentaires.
Choix des espèces
La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées transgéniques permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. Notre centre assure l’hébergement, le soin et l’élevage de lignées murines impliquées dans de nombreuses thématiques de recherche (comme par exemple la biologie du développement, la reproduction, la physiopathologie des maladies du système nerveux, l’étude du vieillissement) ou dans des formations pour des étudiants de Licence ou Master et des formations réglementaires pour l’expérimentation animale. Les animaux sont manipulés avant le sevrage (entre le 7ème et le 10ème jour après la naissance), pour minimiser le stress de contention : ainsi sexage, tatouage et biopsie sont réalisés en même temps.
Etude du comportement alimentaire chez des souris atteintes de glycogénose de type Ia :EU1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Observer pendant trois jours comment mangent des souris rendues incapables de produire du glucose : 23 souris sont utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une biopsie de tissu sert d'abord à les génotyper, puis cinq injections sous-cutanées en cinq jours déclenchent la maladie hépatique, avant un transfert vers un second établissement et trois à quatre jours d'isolement dans des cages qui enregistrent chaque accès à la mangeoire. Le porteur indique que ces souris peuvent développer des hypoglycémies se traduisant par de la prostration, une baisse de la température corporelle et parfois la mort, décès observé chez moins de 2 % des souris de l'élevage. En cas d'hypoglycémie, la souris reçoit une injection de sucre et une partie de sa cage est posée sur une plaque chauffante, et les tumeurs hépatiques que ce modèle développe vers 12 à 15 mois ne constitueront pas un point limite puisque les procédures s'arrêtent à six mois.
Objectifs
La glycogénose de type Ia (GSDIa) est une maladie métabolique rare due à l’absence de production de sucre (glucose) par l’organisme. Cette fonction est essentielle pour maintenir les taux de sucre dans le sang (glycémie) constante en dehors des repas. Contrairement aux diabétiques, les patients atteints de GSDIa développent des hypoglycémies sévères. Une baisse du taux de sucres dans le sang conduit à un mal-être important, qui peut conduire au coma, et à la mort en quelques minutes. Ainsi, les patients doivent manger régulièrement (toutes les 3h environ), y compris la nuit. Ces perturbations du rythme biologique ont un fort impact sur l’ensemble de fonctions physiologiques. Ainsi, la prise de nourriture à un temps inapproprié par rapport au cycle biologique, par exemple durant la période de sommeil, entraine un dérèglement de certaines réactions biologiques, en particulier dans le foie. Des résultats préliminaires obtenus dans un modèle de souris atteintes de GSDIa montrent des dérégulations dans le foie des souris, qui pourraient être entrainées par une modification du rythme biologique. L’objectif de ce projet est d’étudier la prise alimentaire et la structuration des repas de souris atteintes de GSD Ia sur une période de 3 jours, avec un accès continu à la nourriture. Le projet se déroulera dans deux établissements différents, l’un produira les souris et l’autre sera chargé de l’étude du comportement alimentaire.
Bénéfices attendus
L’étude des paramètres des repas (fréquence-quantité) devrait permettre de confirmer que les souris atteintes de GSDIa mangent régulièrement, tout au long de la journée et de la nuit, afin de limiter le développement d’hypoglycémie. Ces données seront utiles pour expliquer les origines des perturbations de l’horloge biologique observées au niveau du foie.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, une biopsie de tissu sera prélevée pour caractériser leurs gènes. Pour obtenir les souris atteintes de glycogénose de type 1a, les souris transgéniques sélectionnées et leur souris contrôles (souris saines) subiront une injection d’un produit chimique par voie sous-cutanée pendant 5 jours de suite à l’âge de 6-8 semaines dans l’établissement utilisateur EU1 Après transfert par un transporteur agréé dans l’EU2, ces souris seront ensuite isolées pendant 3 jours afin d’étudier leur comportement grâce à des cages détectant quand la souris accède à la mangeoire ou au biberon. L’appareillage permet aussi de déterminer la quantité de nourriture et le volume d’eau ingérés sur 24h. Afin de limiter le stress induit par l’isolement des souris, une période d’acclimatation progressive (isolement d’une demi-journée, puis d’une journée, avec remise avec leurs congénères entre chaque période) à leur nouvel environnement sera programmée sur les 3 jours précédents les enregistrements de prises alimentaires. Les animaux seront ensuite regroupés dans leur cage d’origine en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les souris subiront une série d’injections de 5 injections par voie sous-cutanée qui peuvent entrainer une légère douleur liée à la piqure. Ce projet concerne une pathologie caractérisée par le développement d’hypoglycémies lors de jeûnes courts (entre les repas), et par des atteintes hépatiques menant à long terme au développement de tumeurs du foie. En ciblant la pathologie dans le foie par transgenèse, le modèle de souris atteintes de GSDIa utilisé dans cette étude reproduit toute la pathologie hépatique observée chez l’homme et est viable. Cependant, ces souris peuvent développer des hypoglycémies si elles ne s’alimentent pas régulièrement, car elles ne peuvent pas utiliser leur stock de sucres accumulé dans le foie. Les hypoglycémies entrainent un mal-être, observé par la prostration des animaux, une baisse de la température corporelle, et possiblement le décès de l’animal (qui a été observé dans moins de 2% des souris de l’élevage grâce à une observation renforcée des animaux). Les souris développent aussi des tumeurs hépatiques autour de 12-15 mois ce qui ne constituera pas un point limite dans ce projet puisque les procédures seront limitées à 6 mois. Enfin, les souris seront isolées physiquement afin de mesurer leur prise alimentaire et leur rythme de prise de nourriture. Cet isolement sera limité à 4 jours. Il peut entrainer un stress chez l’animal.
Devenir
A l’issu du projet, l’avis vétérinaire désigné sera demandé pour chaque animal afin d’évaluer la gravité réelle subie au cours du projet. Ces animaux mis en procédure sévère ne pourront pas être utilisés dans un autre projet et seront mis à mort.
Remplacement
L’étude du comportement alimentaire des souris atteintes de GSDIa nécessite de travailler sur les animaux vivants. Ce modèle animal reproduit toute la pathologie hépatique de cette maladie rare, y compris les modifications de l’horloge biologique liées probablement aux adaptations des prises alimentaires des souris régulièrement nuit et jour afin d’éviter le développement d’hypoglycémies.
Réduction
Afin de pouvoir réaliser une analyse statistique, le nombre d’animaux a été limité à 11 souris par groupe (avec une souris supplémentaire pour les souris atteintes de glycogénose en cas de décès d’un congénère), soit au total 23 animaux, sur une période de 2 ans. Ce nombre a été calculé pour obtenir une puissance d’étude élevée et tenir compte de la variabilité inter-individus. Les résultats des 2 groupes de souris étudiés seront comparés par un test statistique.
Raffinement
Afin d’éviter la mort précoce des animaux atteints de GSDIa, la pathologie a été induite uniquement dans le foie et à l’âge adulte ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies chez les souris nourries et de passer la période néonatale sans phénotype dommageable (pas de retard de croissance). Pour éviter les réactions inflammatoires liées à l’injection du produit chimique utilisé pour générer les souris transgéniques, les traitements seront réalisés par injections sous-cutanées. La connaissance de ce modèle animal a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie et en limitant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes accessibles directement dans la cage) et au biberon. L’état de bien-être sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (état du pelage, mouvements/posture de la souris, morsures...) et du comportement des animaux pour détecter tout mal -être occasionné par une hypoglycémie (fiche de suivi des animaux fournie aux zootechniciens). En cas d’hypoglycémie, la souris sera systématiquement injectée avec une solution de sucre et une partie de sa cage sera placée sur une plaque chauffante afin de maintenir sa température corporelle. Dans ce projet, aucune souris ne sera mise à jeun. A leur arrivée dans le deuxième établissement, les souris seront hébergées pendant une période de 15j au minimum afin de s’acclimater à leur nouvel environnement. L’enrichissement sera conservé tout au long de l’étude. Les souris seront ensuite hébergées progressivement dans les cages d’enregistrement de la prise alimentaire pour les habituer à l’isolement. Un suivi du poids sera effectué quotidiennement lors de l’isolement de l’animal. Pour réduire le stress de l’isolement, les cages sont transparentes et sans couvercle permettant aux souris un contact visuel sonore et olfactif. Des céréales (type Kellogg’s) seront proposées aux souris à la fin de chaque période d’isolement comme récompense. En cas de petites plaies, une crème à base de teintures mères et d’huiles essentielles qui apaise et cicatrise sera systématiquement appliquée par les zootechniciens en charge du suivi du bien-être animal.
Choix des espèces
Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production de sucre par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Les expériences seront donc réalisées avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme et qui reproduisent toute la pathologie hépatique observée chez les patients. Pour cela, un modèle de souris reproduisant la pathologie hépatique de la glycogénose de type Ia a été obtenu par transgenèse en ciblant uniquement la perte de production de sucre par le foie. Ce modèle murin est unique et viable. En effet, l’élevage des deux autres modèles d’animaux atteints de glycogénose de type Ia (souris et chien qui présentent une perte totale de la production de sucre par l’organisme est très complexes car la plupart des animaux meurt avant le sevrage. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 6 semaines et 6 mois.
Implication des peptides bioactifs issus de protéines agroalimentaires sur le métabolisme énergétique et glucidique, l’hypertension et le stress oxydatif
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Une partie des 768 rats utilisés est génétiquement hypertendue, retenue pour éviter d'avoir à provoquer l'hypertension par un produit chimique. Tous sont tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : un gavage oro-gastrique par jour pendant trois semaines, six prélèvements sanguins par incision de la queue lors des tests de tolérance au glucose, quatre jours en cage métabolique isolée, jusqu'à vingt minutes de contention par mesure de pression artérielle. Le porteur reconnaît que la répétition des gavages peut irriter ou léser l'œsophage et que l'isolement, jusqu'à dix-neuf semaines, induit du stress, tout en qualifiant les cages métaboliques d'"indispensables". L'enjeu déclaré est de confirmer chez le rat des effets de protéines agroalimentaires déjà observés in vitro, et la mise à mort sert à prélever le plasma, la muqueuse intestinale, le cœur, les reins, le foie et les poumons.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont : - D’étudier l’effet des protéines issues de l’agro-alimentaire (différentes sources : végétales, animales, poissons) sur le métabolisme énergétique, le métabolisme glucidique intestinal (effet des protéines seules ou couplées à un inhibiteur de l'absorption du glucose), la prise alimentaire, la sécrétion de certaines hormones impliquées dans le métabolisme énergétique ainsi que certains marqueurs de l’oxydation. - De comprendre les mécanismes impliqués dans la digestion des protéines en relation avec la régulation de la prise alimentaire. - D'étudier l'effet des protéines issues de l'agro-alimentaire (différentes sources : végétales, animales, poissons) sur la tension artérielle ainsi que sur le dosage de certaines enzymes impliquées dans l'hypertension artérielle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une confirmation des résultats déjà obtenus in vitro. Cela démontrerait l'effet bénéfique des protéines alimentaires sur la santé, plus particulièrement dans la prévention contre le diabète de type 2, l'hypertension et l'obésité et donc de prévenir ces pathologies en utilisant une alimentation adaptée voire personnalisée.
Procédures
- La mesure de l’effet des protéines sur la régulation de la glycémie est réalisée en donnant les protéines (avec ou sans inhibiteur de l’absorption du glucose), puis 30 min après, du glucose par gavage oro-gastrique à l’aide d’une sonde de gavage. Pendant cette procédure, des prélèvements sanguins sont réalisé sur animaux vigiles au niveau de la queue avant (à min) et après 15, 30, 60 et 90 et 120 min après avoir donné le glucose (soit 6 prélèvements). - Des prélèvements sanguins sont réalisé sur animaux vigiles au niveau de la queue avant et après gavage oro-gastrique de protéines afin de mesurer les niveaux plasmatiques de certaines hormones intervenant dans la régulation de la prise alimentaire (0 ; 30 et 60 min après ingestion des protéines, soit 3 prélèvements), de la tension artérielle (0 min et 4 h après ingestion des protéines, soit 2 prélèvements). - La mesure de la prise alimentaire en utilisant des cages métaboliques pendant 4 jours maximum (un jour d’acclimatation et 3 jours de test avec un gavage oro-gastrique par jour). Les cages métaboliques permettent la mesure en continue de la prise alimentaire, de la prise de boisson et de la dépense énergétique. - Afin de mesurer l’effets des protéines sur la régulation de la prise alimentaire sur du long-terme, les animaux reçoivent les protéines 1 fois par jour par gavage oro-gastrique pendant 3 semaines. - La mesure de la pression artérielle est mesurée de la même façon que chez l’Homme. Pour cela, les animaux sont placés dans des cages de contentions pour limiter leurs mouvements et la mesure est réalisée au niveau de la queue du rat. Cinq mesures de la pression artérielle est prises avant gavage et après gavage (2,4 et 6h). Les animaux sont replacés dans leur cage d’hébergement après chaque mesure. - Afin de mesurer l’effets des protéines sur la régulation de la pression artérielle sur du long-terme, les animaux reçoivent les protéines 1 fois par jour par gavage oro-gastrique pendant 3 semaines. En fin d’expérimentation, les animaux reçoivent les protéines par gavage oro-gastrique et sont mise à mort après anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
- L’incision de la queue lors des prélèvements de sang entraîne une douleur légère de courte durée et sans réitération au cours de la procédure de test oral de tolérance au glucose, il est donc préférable à l’utilisation répétée de l’aiguille pour le prélèvement dans la queue. - L’isolement des animaux sur le long terme (19 semaines maximum), ainsi que la contention répétée pour les prélèvements de sang (moins de 5 minutes par prélèvement de sang), pour la pression artérielle (20 minutes par mesure de la pression artérielle) ou pour les gavages (moins de 5 minutes) induit de l’inconfort et du stress chez les animaux mais il est nécessaire à l’obtention d’une réponse individuelle. - Le gavage oro-gastrique en tant que tel n’entraîne pas de douleur mais la répétition des gavages peut entraîner des lésions ou une irritation au niveau de l’œsophage, en particulier dans les procédures où les animaux reçoivent un gavage journalier pendant 3 semaines. - L’utilisation des cages métaboliques ou l’animal est isolé pour la mesure de la prise alimentaire, de boisson et la dépense énergétique sur 4 jours induit un stress chez l’animal car il change de pièce sur plusieurs jours, avec un accès à la nourriture différent (mangeoire plus petite et suspendue pouvant entraîner une difficulté pour se nourrir). L’utilisation de ces cages est cependant indispensable pour la mise en évidence d’un effet individuel sur la prise alimentaire. - La mesure de la pression artérielle n’entraîne pas de douleur mais peut entraîner une gêne de courte durée (le temps de la mesure) au niveau de la queue car plusieurs mesures sont réalisées pour chaque temps (0 ;2 ;4 et 6h, donc 4 mesures espacées sur la même journée). - En fonction des protéines, il est possible que le gavage atteigne le volume maximal pouvant être donné aux animaux, ce qui est un inconfort supplémentaire pour l’animal de courte durée.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de récupérer le plasma pour des dosages hormonaux en lien avec la régulation de la prise alimentaire, l’oxydation ou en lien avec la régulation de l’hypertension artérielle. De plus, certains tissus tels que la muqueuse intestinale pour les modifications dans l’expression des gènes induites par les protéines, le cœur, les reins, le foie, les poumons afin de mesurer les marqueurs de l’hypertension artérielle, seront prélevés.
Remplacement
L’objectif de cette expérimentation est de tester l'effet hypoglycémiant, satiétogène, antioxydant et antihypertenseur de protéines agro-alimentaires d'origines variables. Pour cela, des rats seront gavés avec ces différentes protéines et les effets observés seront comparés aux effets chez des rats gavés par une solution sans protéine (eau ou solution isocalorique). Un test in vitro sur une lignée intestinale et des tests biochimiques sont utilisés au laboratoire en parallèle afin de minimiser l’utilisation des animaux mais ces tests, basés sur un dosage hormonal ou enzymatique, ne permettent pas de mettre en évidence l’effet des protéines sur la prise alimentaire. De plus, ces tests in vitro ne permettent pas de prendre en compte le système complexe du corps (interactions intestin-cerveau- pour la régulation de la prise alimentaire, interactions reins-poumons-cœur pour la régulation de la tension artérielle) A cette étape l’utilisation des animaux est indispensable.
Réduction
Des études in vitro au laboratoire ont préalablement été réalisées afin de sélectionner les protéines à tester, ce qui permet de réduire le nombre de groupe par étude et donc le nombre d’animaux. Le principe de réduction a été appliqué et le nombre réduit à 8 animaux par groupe, ce qui est un minimum pour les analyses statistiques, compte tenu des possibilités de problème individuel de croissance sur les animaux. Les animaux peuvent recevoir différentes protéines pour une même procédure après un temps de repos suffisant. Ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés mais également de sélectionner les protéines ou les doses données. Enfin, après mise à mort, le plasma et les organes collectés sont divisés et placés dans différents tubes pour réaliser différents tests sur un même individu. De cette façon, le nombre d’animaux est également réduit.
Raffinement
Dans la mesure du possible, les animaux sont automatiquement placés par deux dans les cages d'hébergement afin d'éviter le stress d'isolement de l'animal. Pour les procédures de mesure de la prise alimentaire en cages métaboliques et de prise alimentaire sur le long terme, les animaux sont placés individuellement par cage dès leur arrivée afin de diminuer le stress d’isolement avant le début de l’expérimentation. Cependant, les cages sont placées de telle sorte que les animaux arrivent à se voir entre eux (pas de cage isolée sur le portoir). De plus, toutes les cages contiennent de l'enrichissement (tunnel rouge, litière mais également des rondins de bois pour les animaux qui ne sont pas dans les procédures de prise alimentaire). Afin de diminuer le stress induit par les différentes procédures, les animaux sont entraînés avant le début des expérimentations, au gavage, aux cages métaboliques, à la contention, à la mesure de la pression artérielle. De plus, le choix de travailler sur des animaux génétiquement hypertendus pour mesurer l’effet des protéines sur la pression artérielle, permet de ne pas induire l’hypertension chimiquement, ce qui entre dans le principe de raffinement. Tous les animaux mais en particulier les animaux hypertendus sont surveillés tous les jours et après chaque gavage (dans l’heure qui suit le gavage mais surtout 24h après le gavage). Les périodes de mise à jeun des animaux sont toujours réalisées dans la période de repos (lumières allumées) des animaux lorsque les animaux mangent peu. Ceci permet de diminuer le stress que la privation de nourriture peut engendrer.
Choix des espèces
Le choix du rat est lié à l’abondance de bibliographie sur de telles études mais ce modèle est également préféré à la souris compte tenu du volume de sang pouvant être prélevé, permettant de doser toutes les hormones d’intérêt et de réduire le nombre d’animaux. Des rats mâles sont choisis plutôt que des femelles afin de limiter les effets des cycles hormonaux. Le modèle de rats hypertendus a été sélectionné car il permet d'étudier l'effet des protéines sur un modèle hypertendu sans induction chimique de l’hypertension. Des rats âgés de 12 semaines seront utilisés dans le protocole. A ce stade les rats sont adultes et leur poids est stabilisé. Le facteur croissance n’impactera pas la prise alimentaire. Des rats hypertendus âgés de 16 semaines seront utilisés dans le protocole. A ce stade, ces rats seront tous hypertendus au début de l'expérimentation.
Caractérisation de différents déterminants moléculaires sur la survenue de l’Insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (ICFEP)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Cathétérisées au ventricule gauche après une échocardiographie sous anesthésie, 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les deux interventions durent quinze et trente minutes par animal, sur des souris transgéniques privées de certaines protéines dans un organe précis. Le projet cherche pourquoi la relaxation du cœur se dégrade davantage chez les femmes après la ménopause, en explorant un axe entre le foie et le cœur. Le porteur justifie la mise à mort par le "bien être à long terme de la souris", au motif que la chirurgie qu'il vient de pratiquer risque de provoquer des complications.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont responsables de 4 millions de décès par an en Europe et représentent la principale cause de décès. Cependant, l'incidence des MCV varie considérablement en fonction du sexe, du statut hormonal et du statut métabolique. En effet, avant la ménopause, les femmes semblent être protégées des MCV par rapport aux hommes du même âge, mais leur incidence et leur gravité rejoignent ensuite celles des hommes après la ménopause, suggérant ainsi un rôle protecteur des œstrogènes. Parmi les MCV, l'insuffisance cardiaque (IC) avec fraction d'éjection préservée (ICFEP), caractérisée par une dysfonction diastolique (relaxation cardiaque) et une function systolique normale ( contraction cardiaque) est désormais considérée comme la forme prédominante d’IC (>50%). L’ICFEP présente un dimorphisme cardiaque puisque les femmes âgées sont davantage touchées par rapport aux hommes. Aujourd’hui, le diagnostic précoce de la maladie est difficile et, contrairement à l’ICFER (IC à fraction d’éjection réduite), il n’existe que peu de médicaments efficaces. Ce constat provient du fait que l‘on connait très mal le fonctionnement de la relaxation cardiaque et ses régulateurs, d’où la nécessité urgente d’étudier ces mécanismes. Dans ce contexte, dans l’équipe, nous avons identifié récemment Ephrine-B1 comme un déterminant moléculaire de la diastole. Plus récemment, des données de microscopie électronique du tissu cardiaque ont révélé des régulateurs potentiels d’Ephrine-B1 avec notamment le rôle des œstrogènes et le rôle du métabolisme hépatique . Aussi, l’OBJECTIF DU PROJET consistera maintenant à explorer, dans différents modèles de souris le rôle de ces différentes pistes moléculaires dans la régulation spécifique de la fonction diastolique cardiaque, mais également de la fonction systolique. Les différences mâles/femelles chez ces animaux nous permettront également d’explorer la dimension dimorphique sexuelle de l’ICFEP.
Bénéfices attendus
Les mesures de pressions intra-cavitaires et les échocardiographies permettront de connaitre avec précision les fonctions de relaxation et de contraction du cœur et nous permettront ainsi de définir la présence ou non d’une ICFEP chez nos animaux. Ce projet nous permettra pour la 1ère fois, au travers la régulation de la protéine Ephrine-B1, d’apprécier le rôle des œstrogènes et du métabolisme hépatique dans la relaxation cardiaque et donc de présenter l’axe foie/cœur comme un nouvel axe thérapeutique potentiel dans l’ICFEP. En effet, les dysfonctions métaboliques du foie pourraient donc entrainer des dysfonctions de la relaxation cardiaque. En accord avec cette hypothèse, les maladies métaboliques du foie touchent les mêmes catégories de patients que l’ICFEP avec, de la même façon, une incidence plus élevée chez les femmes. A terme, ce projet devrait permettre de mieux appréhender l’ICFEP touchant différemment les hommes et les femmes et une meilleure prise en charge thérapeutique personnalisée.
Procédures
IL y a 2 intervention : l'échocardiographie, non invasive sous anesthésie légère - Durée: 15 min / souris et l'intervention 2: cathétérisme ventricule gauche cardiaque, procédure chirurgicale Durée : 30 min / souris
Impact sur les animaux
Une mauvaise gestion de l'anesthésie pourrait entrainer soit la mort prématurée de la souris ou, au contraire, un réveil de cette dernière en cours de chirurgie. Cependant, le manipulateur peut ajuster en temps réel le % d'anesthésique. De plus, le système du cathéter est doté de sonde permettant de mesurer le rythme cardiaque qui est un excellent indicateur de la qualité de l'anesthésie.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, l'acte chirurgical présente un risque de développer des complications post opératoires. Pour le bien être à long terme de la souris, il est nécessaire d'euthanasier les animaux à la fin de cette intervention.
Remplacement
Pour diagnostiquer l’ICFEP, il est nécessaire d’évaluer la fonction cardiaque diastolique (mesures des flux et vitesses de relaxation en Echocardiographie Doppler-Intervention 1 + mesures de pression intra-cavitaires par cathétérisme ventricule gauche-Intervention 2) mais aussi la fonction systolique (Echocardiographie-Intervention 1) sur animal entier vivant. Aujourd’hui, il n’existe pas de méthodes alternatives permettant d’obtenir l’ensemble de ces données fonctionnelles cardiaques nécessaires pour étudier l’ICFEP, à part ces 2 interventions fonctionnelles sur l’animal.
Réduction
Les souris utilisées pour l'échocardiographie sont les mêmes que celles utilisées pour le cathétérisme ventriculaire. Par ailleurs, des études antérieures de notre équipe mais également d’autres équipes ont démontré que 20 souris par groupe est le minimum pour faire une analyse statistiquement correcte pour les mesures de pressions cardiaques intra-cavitaires en tenant compte de la variabilité de mesure dans les cas pathologique d’ICFEP mais également en tenant compte des animaux pour lesquels il est quelquefois impossible d’introduire le cathéter au niveau ventriculaire.
Raffinement
Les mesures de raffinement mises en place pour minimiser le stress et améliorer la qualité de vie au quotidien de nos animaux est une alimentation et une source d'eau ad libitum. Un enrichissement du mileu est fait grâce à l'utilisation de morceaux de papier et de cartons permettant au souris de fabriquer un nid. De plus, des tunnel en cartons sont également utilisés pour occuper au quotidien nos souris. Concernant l’intervention 1 (imagerie cardiaque), nous utilisons une anesthésie légère par inhalation car c’est une intervention non invasive. Nous utilisons également une table thermorégulée pour le bon maintien de la température de la souris. Le point limite de cette intervention est une mauvaise adaptation de l'animal à l'anesthésie (respiration haletante ou trop diminuée), qui est compensée par une régulation immédiate de la concentration de produit délivré. Pour l’intervention 2 (chirurgie), l’anesthésie se fait comme pour l’intervention 1 (imagerie cardiaque) mais nous utilisons en plus à la fois une analgésie globale et une analgésie locale. Ceci nous permet d’avoir une couverture maximale de la douleur lors de la procédure chirurgicale. Cette intervention 2 est une chirurgie donc elle peut entrainer une diminution de la température corporelle de la souris, et pour palier à cela nous utilisons un tapis chauffant. Pour éviter un dessèchement des yeux, un gel occuloprotecteur est également utilisé. Les points limites concernant cette intervention 2 sont l’hémorragie, une mauvaise réaction aux analgésiques et ou anesthésiques. L'expertise chirurgicale de l'expérimentateur permet de gérer toute complication et le cathéter, capable de détecter la fréquence cardiaque de l’animal, permet de réagir au plus vite si l’un de ces points limites est atteint. Cela est couplé à une surveillance visuelle constante de l’animal et de la zone chirurgicale.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris car nous avons pu générer grâce à cette espèce différents modèles transgéniques présentant une délétion (= absence d'expression) de différentes protéines d’intérêt dans un organe spécifique pour étudier la régulation de la fonction diastolique cardiaque à l’âge adulte chez le mâle et la femelle. Les animaux sont tous utilisés au stade postnatal 60 jours (P60) quand le coeur a fini définitivement sa maturation.
Mieux comprendre la physiopathologie de la dénutrition sévère et son dimorphisme sexuel lors d’interventions probiotiques et vaccinales
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Sevrées à 21 jours puis nourries quatre à huit semaines avec un régime carencé en macronutriments et en micronutriments, des souris juvéniles reçoivent ensuite par gavage des probiotiques, une souche vaccinale, puis une souche bactérienne virulente qui provoque une infection intestinale. 1 140 souris vont être utilisées, 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 660 dans des procédures d'un niveau sévère, avec six prélèvements sanguins caudaux par animal. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le porteur écrit pourtant que son modèle "ne présente pas de signe manifeste de souffrance hors un retard de croissance", tout en reconnaissant que la combinaison de la dénutrition et de l'infection peut faire souffrir les souris non vaccinées.
Objectifs
Près d'une personne sur trois dans le monde souffre de malnutrition. L'apparition précoce de la malnutrition a des conséquences désastreuses plus tard dans la vie. Au moment du sevrage, un changement du microbiote intestinal (flore intestinale) se produit et induit une réaction immunitaire qui protège des pathologies futures liées au système immunitaire. La malnutrition entrave ce processus, entraînant une plus grande sensibilité aux maladies non transmissibles, aux infections et une diminution de l'efficacité vaccinale. Développer de manière durable des thérapies nutritionnelles pour contrer la dénutrition est une priorité sanitaire mondiale notamment chez les enfants souffrant de dénutrition sévère aigüe (Severe Acute Malnutrition, SAM). La guérison de la SAM nécessite la prise en compte simultanée des paramètres de croissance, immunitaires et du microbiote intestinal. De par sa complexité, le modèle animal reste incontournable. Récemment, nous avons développé un modèle de SAM chez la souris mâle juvénile qui récapitule fidèlement les principales caractéristiques de la SAM observés chez les enfants. La prépondérance des différences entre les hommes et les femmes dans la malnutrition plaide en faveur de l'inclusion des deux sexes dans la recherche, et lors de la conception de thérapies. Dans notre modèle murin de la SAM, nous avons démontré que le microbiote intestinal et l'immunité intestinale ne sont pas restaurés lors d’une intervention nutritionnelle et ce malgré un retour de croissance. Il faut donc étudier comment restaurer l’ensemble de ces paramètres simultanément. Les probiotiques sont des microorganismes vivants et non pathogènes qui, lorsqu'ils sont administrés en quantités suffisantes, confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte. Certaines souches ont démontré leur capacité à limiter les retards de croissance et les infections intestinales. Dans ce projet nous étudierons donc 1/ le dimorphisme sexuel de la SAM, 2/ l’impact de la SAM sur l’efficacité vaccinale vis-à-vis d’une infection à Salmonella enterica Typhimurium, 3/ la capacité de probiotiques à améliorer la SAM et 4/ la capacité de probiotiques à améliorer l’efficacité vaccinale vis-à-vis d’une infection intestinale.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : ce projet permettra l'identification des mécanismes à l'origine des différences entre les mâles et les femelles dans la dénutrition ainsi que la caractérisation de ses effets lors d’interventions vaccinales et probiotiques. Ce projet permettra non seulement de disséquer la pathogénie de la dénutrition mais aussi de fournir les connaissances manquantes pour améliorer les interventions thérapeutiques. Ce projet permettra notamment l’identification de nouvelles thérapies pour restaurer le microbiote intestinal et l'immunité, pour in fine renforcer l’écosystème intestinal général face aux infections et optimiser la formulation des régimes thérapeutiques et des vaccins. Ce projet fera avancer les connaissances dans les domaines de la nutrition, l'immunité, l'infection, la vaccinologie et le microbiote intestinal. Bénéfices à long terme : ce projet fournira des informations importantes pour concevoir des thérapies nutritionnelles adaptées aux garçons et aux filles souffrant de malnutrition. Des stratégies multifactorielles comprenant des probiotiques devraient fournir des approches thérapeutiques durables en favorisant aussi bien la reprise de poids et la croissance, que la maturation du système immunitaire et du microbiote intestinal.
Procédures
Consommation d’un régime alimentaire carencé en macro- et micronutriments durant 4 semaines ou 8 semaines. Prise de poids sur animaux vigiles quotidienne ou hebdomadaire, durée estimée à 2 minutes/souris. Contention des souris associée à l’administration par gavage de probiotiques, de molécules servant à étudier la perméabilité intestinale ou la capacité d’absorption des graisses, d’une solution de glucose (2g/Kg pour suivi glycémique), de souche vaccinale et souche virulente de bactéries causant des infections intestinales sur animaux vigiles : durée estimée à environ 30 secondes/souris (gestes de contention 10 secondes + de gavage 10 secondes). Mise à jeun 4h00 ou sur la nuit : 1 fois durant la procédure. Prélèvements sanguins sous-mandibulaire sur animaux endormis : 1 à 2 fois/souris sous mélange à 4% d'isoflurane et 96% d'oxygène. Prélèvements sanguins caudaux sur animaux vigiles : 6 fois/souris.
Impact sur les animaux
Le but de ce projet est de suivre l’impact d’une alimentation entrainant une dénutrition sévère sur la physiologie, l’immunité et le microbiote intestinal des individus. Grâce à notre expérience dans ce domaine, nous savons aujourd’hui que notre modèle murin de malnutrition ne présente pas de signe manifeste de souffrance hors un retard de croissance chez les mâles juvéniles. Nous nous attendons à ce que les femelles juvéniles soient moins sévèrement impactées du fait de leur capacité à mieux résister à certaines carences en vitamines. Dans ce projet, nous nous intéressons donc à caractériser les différences entre mâles et femelles lors d’une dénutrition apportée par un régime fortement carencé en macro- et micronutriments. Ces différences seront également étudiées lors d’essais vaccinaux réalisés avant l’infection. L’administration du vaccin ne devrait pas induire de souffrance particulière chez les animaux. Par contre la combinaison d’une malnutrition et d’une infection intestinale peut engendrer une souffrance liée à une réponse immunitaire faible chez les groupes d’animaux qui n’auront pas été vaccinés. Afin de renforcer le système immunitaire et contrer les effets de la dénutrition, des probiotiques seront également testés chez les souris dénutries et vaccinées. L’administration des probiotiques ne devraient pas induire de souffrance particulière chez les animaux. Des gavages seront également réalisés sur animaux vigiles. Les gestes de contention (10 secondes), de gavage (10 secondes) génère du stress chez l’animal que nous évaluons à environ 30 secondes/intervention de ce type. En fonction de la procédure cette intervention est occasionnelle, hebdomadaire ou quotidienne. De même, nous allons mettre à jeun les souris 4h00 ou sur la nuit ainsi que réaliser des prélèvements sanguins qui généreront également du stress.
Devenir
De par la nécessité de prélever des organes vitaux pour analyses, tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures.
Remplacement
De nos jours la complexité de l’écosystème intestinal et notamment l’interaction entre système immunitaire et microbiote intestinal ne peut être reproduite in vitro, les organoïdes ne peuvent pas remplacer l’animal dans ce projet. L’étude de la physiologie, de l’immunité et du microbiote intestinal des individus, implique de facto l’utilisation d’animaux.
Réduction
Grâce à un test effectué au préalable sur 6 souris femelles (3 souris sur régime contrôle (Ctrl) + 3 souris sous régime SAM), nous avons pu réaliser un test statistique basé sur la prise de poids hebdomadaire des souris, et calculer l’effectif nécessaire par expérience pour obtenir une puissance du test 80% minimum, avec un risque de se tromper de 5%. Ceci nous amène à un nombre sujets de 5/groupe pour une puissance du test de 81%. Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de souris utilisées. En parallèle des souris femelles, nous allons utiliser certaines souris mâles que nous allons décomptés d’une autre DAP et non de cette DAP. Nous allons également étudier certains paramètres avant la mise à mort des souris, qui seront par la suite mises à mort pour l’analyses d’autres paramètres. Nous aurons donc besoin de 5 souris/groupe. Nous réaliserons 3 expériences indépendantes pour chaque lot de souris enrôlé dans chaque procédure. Le nombre de souris utilisé est justifié au sein de chaque procédure expérimentale, soit 1140 souris. Nous aurons également 60 souris mâles qui seront décomptés dans une autre DAP.
Raffinement
Les souris seront hébergées à raison de 5 souris/cage maximum avec la nourriture et l’eau fournies à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nos visites quotidiennes pour la surveillance des souris seront réalisées plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. La souffrance potentielle induite par ce régime et son impact sur l’efficacité vaccinale sera prise en compte dans le respect du bien-être animal, et les souris seront observées quotidiennement ou 2 fois par jour afin de prévenir l’apparition de points limites : prise alimentaire et poids corporel, signes cliniques (fièvre, respiration), comportement, apparence générale (poils et sécrétions). Des mesures adéquates seront prises pour soulager la douleur comme l’administration éventuelle d’un analgésique.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de caractériser l'impact d'une dénutrition sévère sur la physiologie, le système immunitaire et le microbiote intestinal afin de proposer un régime thérapeutique durable aux enfants souffrant de SAM. Il est maintenant bien reconnu que le système immunitaire et le microbiote intestinal de la souris sont suffisamment proches de celui de l’Homme pour pouvoir utiliser la souris comme modèle avant qu’une transposition ne soit faite chez l’Homme. De plus, l’épithélium intestinal murin est anatomiquement et physiologiquement proche de celui de l’Homme. Aucun autre organisme modèle de petite taille (danio zébré, drosophile) ne possède une telle structure aussi similaire. Par ailleurs, le modèle murin est celui pour lequel les effets de la dénutrition ont été validés chez les souris mâles. Enfin, le modèle infectieux que nous souhaitons utiliser est très bien décrit et étudié chez la souris. L’ensemble de ces critères fait de la souris l’espèce animale la plus appropriée pour effectuer notre étude. Nous utiliserons des souris mâles et femelles sevrées à 21 jours afin d’être au plus proche des conditions de développement de la SAM observée chez l’Homme entre trois et 24 mois lors du sevrage. En effet, l’épithélium intestinal des rongeurs est immature à la naissance. L’intestin grêle de la souris continue à se développer après la naissance et sa maturation est fortement associée à la période de sevrage. Le sevrage est donc une étape clef dans la structuration de l’épithélium intestinal, le développement immunitaire et la maturation du microbiote intestinal des rongeurs. Par ailleurs notre étude chez les mâles a montré que la dénutrition induite à 21 jours reproduit les principaux critères de dénutrition décrits chez l’Homme. A cet âge la maturité du système immunitaire, la physiologie et la maturation du microbiote intestinal sont en cours de développement chez la souris, tout comme ça l’est chez l’enfant à bas âge.
Les volailles peuvent-elles équilibrer leur statut redox par automédication ?
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Deux prises de sang au sinus occipital sont pratiquées sur des poulets éveillés, à deux semaines d'intervalle, pendant leur exposition à une élévation de température en fin d'élevage. 200 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués à six semaines pour prélever leur foie et leur muscle. Le porteur décrit chez eux un halètement, un déploiement des ailes pour dissiper la chaleur et une baisse de la prise alimentaire. Ce projet, déclaré au titre du bien-être animal et de la nutrition animale, cherche à savoir si les poulets consomment d'eux-mêmes un aliment antioxydant quand ils en ont "besoin".
Objectifs
Les poulets sont fortement vulnérables à l’élévation de température ambiante en raison de leur capacité limitée à réguler leur température interne et à dissiper la chaleur au regard de leur croissance. Nous proposons dans ce projet exploratoire de tester la capacité des poulets à mettre en œuvre un comportement d’automédication en régulant leur statut redox (indicateur de stress cellulaire pouvant affecter de nombreuses fonctions physiologiques) lors d’une exposition à un stress thermique de chaleur en fin d’élevage, une période pendant laquelle les poulets sont plus vulnérables à l’élévation de la température ambiante. Des aliments supplémentés ou non avec des molécules antioxydantes seront mis à disposition des animaux pendant toute la période d’élevage. Le comportement alimentaire individuel de poulets vis-à-vis d’aliments supplémentés ou non avec des molécules antioxydantes sera analysé pendant toute la période d’élevage. Les données permettront de savoir si les poulets consomment les différents aliments de manière aléatoire ou préférentielle au cours de leur vie et notamment au cours du stress thermique. L’hypothèse est que les poulets ne consomment un aliment supplémenté en antioxydant que s’ils en ont besoin pour équilibrer leur statut redox (notamment pendant la période de stress thermique), et que sinon, ils éviteraient de le consommer. Un panel de marqueurs du métabolisme, du statut redox et d’inflammation sera dosé dans le sang des animaux avant la mise en place du stress thermique et deux semaines plus tard correspondant à la fin de l’élevage, ainsi que dans le foie, organe cible du stress oxydant et de sa régulation, et le muscle dont dépend directement la qualité de la viande.
Bénéfices attendus
Grâce à ce projet, nous comprendrons mieux les comportements et mécanismes d’adaptation à la chaleur des poulets de chair, particulièrement importante dans le cadre du changement climatique auquel sont exposés les animaux. Le projet permettra de déterminer s’il est possible d’atténuer les effets néfastes de la chaleur sur les poulets en leur proposant des aliments contenant des extraits végétaux permettant de revenir à un état physiologique non altéré.
Procédures
Deux prises de sang au sinus occipital seront effectuées sur les mêmes animaux à deux semaines d’intervalle en situation de stress thermique. Elles seront réalisées sur des animaux vigiles et ne dureront que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. L’exposition des animaux à un stress thermique d’élévation de température peut entrainer chez les poulets une réduction de la prise alimentaire et des manifestations de halètement et de déploiement des ailes pour réguler la température corporelle.
Devenir
Suite à la procédure de prise de sang pendant le stress thermique, les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus et organes à l’âge de six semaines.
Remplacement
L’étude du comportement d’automédication chez le poulet qui fait l’objet du projet ne peut se réaliser que chez l’animal et directement sur l’espèce cible (Gallus gallus domesticus, poule domestique).
Réduction
L’effectif de 200 animaux (50 animaux par groupe, 4 groupes) a été défini pour permettre de détecter statistiquement un effet de la chaleur et de l’aliment sur la stabilité du statut antioxydant des animaux dans 3 tissus (sang, foie, muscle), sur la base de données d’études précédentes réalisées dans des conditions comparables.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un bâtiment d’élevage standard, au sol sur litière avec copeaux de bois dans des parquets où ils resteront en groupe. La taille du parquet est suffisante pour permettre aux poussins de se déplacer avec une zone de repos significative en plus de l’espace mangeoire et abreuvement. Les animaux auront à disposition plusieurs enrichissements leur permettant de grimper et de se cacher (Perch'up) ainsi que le dispositif de mangeoires électroniques lui-même avec 8 accès d’aliments possibles. Le suivi des performances est continu pendant toute la durée de l’élevage et permet de disposer de suivi individuel. Toute manifestation de symptômes persistants définis par un point limite entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Les prises de sang seront effectuées dans un lieu différent des espaces d’hébergement.
Choix des espèces
Le poulet de chair a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les poussins éclos au couvoir commercial seront mis en place dans le bâtiment d’élevage et élevés jusqu’à l’âge de six semaines.
Rôle de la farine de krill dans la résistance au stress hypoxique chez la truite arc-en-ciel
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Nourries douze semaines avec quatre aliments expérimentaux contenant de la farine de krill, pesées cinq fois en lot, 720 truites arc-en-ciel passent de 30 à 200 grammes. La moitié est alors tuée dans un bain d'anesthésiant, sang, foie, muscle, fèces et carcasse prélevés. Les 360 restantes sont maintenues trois semaines de plus dans une eau appauvrie en oxygène, obtenue en baissant le niveau et le débit d'eau pour augmenter la densité, avant d'être tuées de la même façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur attend un pompage operculaire excessif, une nage désorientée et une remontée en surface avec tentatives de fuite, tout en écrivant qu'aucun signe de stress grave ne devrait apparaître, l'objet étant d'optimiser un aliment pour la première espèce piscicole produite en France.
Objectifs
Les salmonidés sont sensibles à un faible niveau d'oxygène dissous (OD), qui doit être supérieur à 7 mg/L dans les fermes piscicoles. Bien que les niveaux d'OD soient étroitement surveillés, des baisses soudaines et temporaires peuvent se produire pour de multiples raisons : hausse de la température de l'eau, de la densité de poissons dans les bassins mais également lors des manipulations des poissons. Une limite inférieure aiguë de 4,0 mg/L d'OD a été définie pour les systèmes de production de salmonidés. Ces baisses d’OD risquent de se produire plus fréquemment dans les années à venir en raison des températures extrêmes associées au changement climatique, ce qui peut poser des problèmes de bien-être et de performance. L’apport optimisé de micronutriments anti-oxydants tels que sélénium, la vitamine C et l’astaxanthine peut faire partie d'une stratégie de gestion préventive du stress dans les exploitations piscicoles. Des travaux ont montré qu’une supplémentation en sélénium, un anti-oxydant, dans un aliment à base de farines végétales améliorait la résistance au stress hypoxique des alevins de truite arc-en-ciel et des études ont suggéré une sensibilité au stress oxydant différente entre mâles et femelles. La farine de krill pourrait être un ingrédient fonctionnel intéressant du fait de sa richesse en anti-oxydants. Plusieurs études ont par ailleurs souligné les effets bénéfiques du remplacement de la farine de poisson par de la farine de krill sur la qualité de la chair, la croissance et la santé des poissons. Ce projet a donc trois objectifs : 1) étudier l'impact du remplacement de la farine de poisson par de la farine de krill sur les performances des truites arc-en-ciel juvéniles nourries avec un aliment à base de protéines végétales, 2) étudier l'impact nutritionnel de la farine de krill sur les défenses anti-oxydantes des truites en situation d'hypoxie, 3) étudier l’impact du sexe des poissons sur les performances de croissance et le métabolisme du stress.
Bénéfices attendus
Il est difficile d’éviter des baisses soudaines et temporaires des niveaux d'OD qui peuvent rapidement entraîner des mortalités massives, événements qui risquent de se produire encore plus fréquemment dans les années à venir en raison des températures extrêmes associées au changement climatique. Comme les poissons capturés ne peuvent échapper à des conditions d'élevage sous-optimales, cela peut poser des problèmes de bien-être et de performance avec des croissances et des consommations alimentaires plus faibles ainsi qu'une augmentation des paramètres liés au stress oxydant. Les micronutriments tels que le sélénium, la vitamine C et l’astaxanthine interviennent dans le métabolisme anti-oxydant et leur apport optimisé peut faire partie d'une stratégie de gestion préventive du stress. Les besoins en anti-oxydants nutritionnels dans les aliments piscicoles modernes à base d’ingrédients végétaux ne sont pas clairement identifiés par rapport aux aliments traditionnels riches en ingrédients marins où les farines et huiles de poissons sont progressivement remplacées par des ingrédients plus durables. En effet, cette transition crée de nouveaux défis car les recommandations nutritionnelles pour la plupart des vitamines et minéraux sont largement basées sur les aliments traditionnels et peuvent désormais s’écarter considérablement dans les nouveaux aliments alternatifs. Les données issues de ce projet devraient permettre de mieux caractériser le rôle de la farine de krill dans le métabolisme du stress chez les mâles et femelles de truite arc-en-ciel, première espèce piscicole produite en France. Les niveaux de remplacement de la farine de poisson par de la farine de krill ont été sélectionnés car décrits comme bénéfiques pour la chair, la croissance et la santé des poissons mais leurs effets sur la résistance au stress hypoxique ne sont pas connus. Une meilleure résistance au stress hypoxique des poissons d’élevage par une alimentation optimisée devrait permettre d’améliorer le bien-être et les performances de poissons.
Procédures
-Un total de 720 truites de 30 g sera nourri pendant 12 semaines avec 4 aliments expérimentaux contenant différentes teneurs de farine de krill couvrant tous les besoins nutritionnels des truites avec pesée en lot des 12 bassins toutes les 3 semaines, soit 5 pesées en tout sur animaux vigiles (conformes aux pratiques d’élevage). -Parmi ces 720 truites de 30 g nourries pendant 12 semaines, 360 seront euthanasiées au bout des 12 semaines à un poids d’environ 200 g par euthanasie dans un bain de tricaïne à 150 mg/L avec prélèvement de sang (1 mL) et de tissus : nageoires, foie, muscle, carcasses entières ainsi que les fèces. -Les 360 truites restantes de 200 g seront alimentées pendant 3 semaines supplémentaires avec les 4 aliments expérimentaux et soumises à un stress hypoxique chronique avec une teneur en OD de 5 ppm. Elles seront ensuite anesthésiées et euthanasiées dans les mêmes conditions que précédemment à l’issue des 3 semaines en conditions d’élevage hypoxique et les mêmes prélèvements seront réalisés.
Impact sur les animaux
Lors de l'essai nutritionnel, aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu du fait de la structure d'élevage adaptée et de la formulation des aliments utilisée. Lors du stress hypoxique réalisé dans les mêmes conditions d’élevage que l’essai nutritionnel mais avec une faible concentration d’OD (5 mg d’oxygène par litre, obtenu sur les 3 premiers jours par diminution du niveau d’eau dans les bassins pour augmenter la densité et diminution du débit d’eau), peu d'effets indésirables sont attendus car le niveau et la durée ont été définies de telle sorte à minimiser le stress. Cependant nous pourrions observer les comportements suivants qui ont été décrits dans la littérature chez des truites en situation de stress hypoxique aigu : pompage operculaire excessif, comportement de nage anormal (par exemple, perte d’équilibre), respiration près de la surface de l’eau avec ou sans tentative de fuite. Il convient de noter qu’aucun signe de stress grave ne devrait être observé chez les poissons car un niveau de 4 ppm est considéré comme la limite inférieure aiguë. Un niveau d’oxygène de 5 ppm est considéré comme un facteur de stress modéré lorsqu’il est testé pendant de courtes périodes.
Devenir
Après élevage des truites dans des conditions classiques optimisées avec des aliments fonctionnels contenant de la farine de krill pendant 12 semaines, la moitié (360 poissons) sera euthanasiée et prélevée pour analyse et l'autre moitié (360 poissons) sera remis en élevage pour 3 semaines supplémentaires en conditions d'élevage hypoxique (OD = 5 mg/L) avant euthanasie et prélèvement pour analyse.
Remplacement
S’agissant d’un essai nutritionnel chez des truites juvéniles et dans le but d’étudier le rôle de la farine de krill sur le métabolisme du stress chez les poissons d’élevage mâles et femelles, l’étude ne peut donc pas être réalisée sur des lignées cellulaires ou par des calculs et des modélisations informatiques.
Réduction
La réduction est un objectif réel, le nombre de poissons prélevé est calculé à minima, compte-tenu de la variabilité individuelle observée dans les essais nutritionnels et les analyses antérieurs, tout en maintenant des conditions d’élevage optimales pour les poissons avec une densité adaptée tout au long de l’essai (30-50 kg/m3). Ainsi le nombre de poissons mis en essai nutritionnel est de 60 poissons par bassin avec 3 bassins par régime alimentaire qui est le nombre standard de réplicats utilisé dans le domaine des essais d’alimentation des poissons. Le nombre de poissons par bassin correspond au minimum requis pour observer un comportement alimentaire normal et permettre d’avoir des nombres représentatifs dans l’analyse prévue. Le plan expérimental est défini de telle sorte qu’un seul échantillon tissulaire permettra d’explorer différents niveaux biologiques : analyse génétique (expression de gènes) et analyses enzymatiques et métaboliques.
Raffinement
Des conditions d’élevage classiques et optimisées seront utilisées : photopériode naturelle, température stable à 17°C +/- 1°C, qualité d'eau optimale avec dégazage (afin d’éliminer l’azote dissous) et niveau d’OD compris entre 8,5 et 9,5 ppm avec un débit adapté de 0,3 litre par seconde permettant un renouvellement de 5 à 7 fois par heure, taille et type de bassins adaptée à la taille des poissons (bassins extérieurs de 80 cm de diamètre et de 50 cm de haut pouvant contenir 150 à 220 L d’eau munis d’un couvercle et demi-couvercle occultant assurant la sécurité des poissons vis-à-vis des nuisibles (oiseaux) et limitant les perturbations liées à l’activité des agents de la pisciculture), densité optimale des truites, nettoyage régulier des bassins lors de chaque pesée toutes les 3 semaines. Les animaux seront nourris manuellement à satiété visuelle. Un suivi quotidien du bien-être animal sera évalué à l’aide d’une fiche d’évaluation quantitative du point limite. Lors du stress hypoxique, le comportement des poissons sera étroitement surveillé et des points-limites définis pour éviter toute souffrance grave. Cependant, aucun signe de stress grave ne devrait être observé chez les poissons car un niveau de 5 ppm peut être considéré comme un niveau de stress modéré.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est la première espèce piscicole produite en France et a donc un poids agronomique et commercial important, ce qui en fait un choix privilégié pour cet essai, en plus de son intérêt scientifique pour l’étude du métabolisme du stress et des défenses anti-oxydantes avec un nombre très important de protéines anti-oxydantes. Animaux au stade juvénile. Le but est de se placer dans des conditions de croissance optimales où l’effet de l’aliment sera le plus visible chez le poisson mais aussi de pouvoir récupérer différents tissus en quantité importante, ce qui justifie cette période et le poids moyen initial de 30 grammes permettant d'atteindre un poids moyen final de 200 grammes.
Etude des mécanismes protecteurs de l’inhibition du translocon dans la dysfonction adipocytaire dans le contexte de l’obésité chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Deux chirurgies d'implantation de pastilles à diffusion lente, six prises de sang à la queue et trois épreuves de gavage au glucose suivies d'insuline : 48 souris rendues obèses par un régime gras vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont toutes tuées à la fin, pour prélever les organes destinés aux analyses lipidiques, protéiques et d'expression génique. L'objectif déclaré est de savoir si bloquer une protéine du stress cellulaire, le translocon, limite le diabète et le foie gras associés à l'obésité. Le porteur retient la souris comme modèle intégré, seul moyen selon lui d'observer les communications entre organes, et fait débuter le régime gras à huit semaines d'âge pour écarter les effets du développement.
Objectifs
Le but de notre projet est de déterminer l’implication d’une protéine connue pour être jouer un rôle dans le stress cellulaire, le tranlocon, dans la dysfonction du tissu adipeux, un évènement se déroulant au cours de l’obésité et qui est central dans l’apparition des complications de l’obésité (diabète, maladies cardiovasculaires, foie gras). A l’aide de souries rendues obèses avec un régime gras et qui présentent une dysfonction adipocytaire, nous allons déterminer si l’inhibition du translocon avec un inhibiteur pharmacologique améliore la bonne santé du tissu adipeux et limite les complications de l’obésité (diabète et foie gras). Notre approche va nous permettre d’éclairer les mécanismes conduisant aux complications métaboliques de l’obésité et de développer des stratégies thérapeutiques afin d’en limiter les conséquences.
Bénéfices attendus
Compte tenu des enjeux médicaux, sociaux et économiques liés aux complications métaboliques de l’obésité, la dysfonction adipocytaire qui est un mécanisme physiopathologique clé du développement de ces complications a été largement étudiée dans une multitude de contextes. Cependant, les mécanismes initiateurs de la dysfonction adipocytaires demeurent encore mal connus. Le rôle du translocon dans cette dysfonction n’a, a notre connaissance, jamais été étudiée à ce jour. Ceci reflète un vaste champ de connaissances fondamentales à explorer. Nos résultats préliminaires obtenus dans des modèles cellulaires montrent que le translocon induit l’augmentation de marqueurs de la dysfonction adipocytaire. A court terme, ce projet permettra de déterminer quels sont les mécanismes fondamentaux en jeux et éventuellement d'identifier des leviers à actionner sur ceux-ci. A moyen terme, en démontrant la possibilité de moduler l’activité du translocon pharmacologiquement ce projet favorisera le développement de stratégies thérapeutiques pour diminuer les complications métaboliques chez les patients obèses.
Procédures
Dans ce projet, les animaux subissent deux procédures chirurgicales pour implanter et renouveler au bout de trois mois des pastilles permettant de délivrer l’inhibiteur pharmacologique ou le placébo. Tous les mois, à six reprises au cours de cette période, du sang sera prélevé en vigil au niveau de l’extrémité de la queue. Tous les deux mois, à trois reprises au cours de cette période et a une semaine d'intervalle, du glucose sera administré par gavage et de l'insuline en intrapéritonéale, puis du sang sera prélevé au niveau de l’extrémité de la queue, le tout sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : sédentarité due au régime obésogène, potentielle sensibilité au niveau des point de délivrance (injection intrapéritonéale, gavage oral) ou de prélèvements (sang à la veine caudale) (qui devrait être très limité au regard de la fréquence espacée dans le temps).
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour prélever les organes d'intérêt pour les analyses de contenu lipidique, de contenu protéique et de mesure d'expression génique.
Remplacement
Le projet global dans lequel la présente demande s'applique repose sur d'autres modèles expérimentaux qui permettent de remplacer un certain nombre d’animaux : nous utilisons notamment des adipocytes en culture. Ce modèle cellulaire permet de remplacer les modèles animaux dans l’affinage de la détermination du rôle du translocon dans la dysfonction adipocytaire. L’utilisation de modèle animal reste indispensable car il permet d’étudier une pathologie qui résulte d’une communication interorgane ne pouvant être étudié que dans un modèle intégré.
Réduction
Le projet préconise l’utilisation d’un nombre de 48 animaux, ce qui, dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs. Nous avons précédemment défini la cinétique de la mise en place de la dysfonction adipocytaire chez les souris nourries avec un régime gras et donc de déterminer le temps traitement le plus approprié et de réduire le nombre d’animaux et le temps de l’expérimentation.
Raffinement
Nous avons pris en compte le bien-être animal, la définition de points limites adaptés (signes cliniques notables ou spécifiques) couplé à un examen clinique quotidien des animaux par du personnel formé permettra de prévenir les risques de stress et de souffrances. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant des procédures adaptées en prêtant une attention particulière à la délivrance de l’inhibiteur pharmacologique (utilisation de pastilles à diffusion lente pour éviter toute injection quotidienne) et à la délivrance d’anesthétiques et d’antalgiques. Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et un tube tunnel en polycarbonate ) et les animaux sont hébergés en groupes sociaux.
Choix des espèces
Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques utilisés (obésité, diabète de type 2 et hépatopathie dysmétabolique pour ce projet) ainsi que la réponse physiologique intégrée et les communications inter-organes (conséquence systémiques d’une dysfonction adipocytaire à l’origine des complications de type diabétique et hépatique en ce qui concerne ce projet). Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé de longue date pour caractériser les différentes complications cardiaques associées aux dérégulations métaboliques. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires importants pour mieux comprendre les effets bénéfiques de l’inhibition du translocon. Pour tous les animaux débuterons l’administration de l’inhibiteur et du régime à 8 semaines d’âge de façon à travailler sur des animaux adultes. Le but de ce travail n’étant pas de déterminer l’effet de cette inhibition au cours du développement de l’organisme.