Système endocrinien

256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie de tissu pour génotypage, cinq jours d'injections consécutives, puis seize semaines d'un régime riche en graisses ou d'eau sucrée au fructose, avant six heures de jeûne et un prélèvement de sang terminal. Le porteur attend qu'elles deviennent en surpoids et pré-diabétiques, avec un foie plus gras, et signale que les souris privées de production intestinale de glucose présentent un phénotype anxieux léger. Des organes sans utilité pour ce projet seront aussi prélevés afin de constituer une banque de tissus, le porteur affirmant que l'étude "nécessite l'utilisation d'animaux" parce que la stéatose met en jeu des échanges entre organes.

Objectifs

L’obésité connait une croissance alarmante et représente un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux traitements proposés. Une consommation trop importante en graisses et en sucres est un acteur majeur de l’obésité. Parmi les sucres mis en cause, le fructose, retrouvé dans les fruits ou de nombreux produits issus de l’industrie agro-alimentaire (boissons sucrées notamment) est l’un des plus dangereux. En effet, la surconsommation de fructose conduit à une accumulation de graisses dans les cellules du foie, conduisant à un désordre métabolique appelé stéatose hépatique, ou foie gras. Si la surcharge en graisses se poursuit, la stéatose peut évoluer après plusieurs années en cirrhose, avec un risque de cancer du foie. Ainsi, comprendre comment réduire l’impact de la consommation de fructose sur la santé du foie est primordial. En dehors des périodes de repas, l’intestin est capable de produire du sucre (glucose). Ce glucose spécifique, produit en très petites quantités n’est pas nocif pour l’organisme. A l’inverse, il joue un rôle de molécule signal capable d’informer certaines régions clé du cerveau ; Ainsi il exerce des effets bénéfiques anti-obésité, anti-diabète et anti-stéatose hépatique (foie gras). On sait maintenant que l’activation génétique de la production intestinale de glucose protège des troubles induits par une alimentation trop riche en graisses et en sucres. Et à l’inverse, l’absence de production intestinale de glucose favorise l’apparition de ces troubles, malgré une alimentation saine. Ce projet vise à déterminer si la production intestinale de glucose est capable d’éviter ou de diminuer l’apparition d’un foie gras lors d’une consommation excessive de fructose associée ou non à une alimentation trop riche en graisses. Pour cela, nous allons étudier des souris normales et des souris génétiquement modifiées chez lesquelles l’intestin ne permet pas de produire du glucose ou bien au contraire d’en produire davantage par rapport aux souris normales. Chez ces souris, nous étudierons les effets d’une surconsommation de fructose. Les souris recevront du fructose dans l’eau de boisson ou une alimentation riche en graisses pendant au maximum 16 semaines. La prise de poids sera suivie toutes les semaines. Après 16semaines, les souris seront mises à jeun puis les taux de sucre et de graisses sanguins seront mesurés. Nous évaluerons le niveau de stéatose hépatique (foie gras).

Bénéfices attendus

La prévention et le traitement de l’obésité et de ses complications est un enjeu majeur de santé publique, et une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu est nécessaire. Une consommation excessive de fructose (retrouvé notamment dans les boissons sucrées), est extrêmement néfaste puisque cela conduit à l’accumulation de graisses dans les cellules du foie. En effet, avec un fort pouvoir sucrant à moindre coût, le fructose est de plus en plus utilisé par les industriels et ses effets néfastes sur le corps sont de plus en plus décrits. A l’inverse des sucres issus de l’alimentation, le sucre produit par l’intestin est bénéfique puisqu’il est capable de diminuer l’obésité, le diabète et l’accumulation de graisses dans le foie induits par une alimentaire trop riche en graisses et en sucres. Ce projet a pour but de déterminer si la production de glucose par l’intestin pourrait protéger des effets néfastes de la consommation de fructose sur le foie. Ce projet permettra alors d’élargir encore un peu plus le spectre des effets bénéfiques de la production de sucre par l’intestin, et de pouvoir la proposer comme cible thérapeutique intéressante contre l’obésité et ses complications. Par ailleurs, ce projet permettra pour la première fois de déterminer s’il existe des différences entre les mâles et les femelles en ce qui concerne les effets la production intestinale de sucre ou du fructose sur la stéatose hépatique.

Procédures

- Le projet comporte une partie d’élevage des souris génétiquement modifiées. Par conséquent, il comporte des interventions à visée de génotypage. Ainsi, une biopsie de tissu (geste réalisé en quelques secondes) sera réalisée pour vérifier la modification génétique. - Les souris recevront des injections pendant 5 jour consécutifs. Ce geste est réalisé en quelques secondes. - Les souris recevront pendant 16 semaines, soit une alimentation standard ou une alimentation riche en graisses avec de l’eau normale, soit de l’eau contenant du fructose dans le biberon. - Les souris seront pesées toutes les semaines (geste réalisé en quelques secondes), et la consommation de boisson mesurée 2 fois par semaines. - Après 16 semaines de traitement, une mesure du taux de sucre dans le sang (glycémie à partir d’une goutte de sang et un glucomètre ; réalisé en quelques secondes) et un prélèvement de sang terminal et seront réalisés (en quelques secondes). Cela sera réalisé après une mise à jeun de 6h. - Enfin, les animaux seront mis à mort par une méthode respectant l’éthique animale, afin de prélever leurs organes (dont le foie pour analyser sa teneur en lipides).

Impact sur les animaux

- Après 16 semaines de régime riche en graisses et/ou avec du fructose dans l’eau de boisson, les souris devraient être en surpoids, pré-diabétiques et avec un foie plus gras que celui des souris normales (mais sans impact sur leur mobilité). Dans cette étude, elles seront étudiées à un stade précoce du développement de l’obésité afin de limiter les complications liées à ces maladies. - Lors de la mise à jeun précédent la mise à mort (6h), l’ensemble des souris sont capables de maintenir une glycémie normale pendant ce temps court, ainsi aucun dommage supplémentaire n’est attendu chez les souris génétiquement modifiées par rapport aux souris normales. - Les souris sans production de sucre par l’intestin présentent un phénotype anxieux léger. Néanmoins, les conditions d’hébergement en milieu enrichi (nid, maison pour se cacher) sont suffisantes pour atténuer leur anxiété.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par une méthode éthiquement autorisée pour prélèvement du sang et de différents tissus. Des études moléculaires, histologiques et biochimiques seront réalisées afin d’évaluer l’impact de la production intestinale de sucre sur les effets du fructose et/ou du régime riche en graisses sur l’accumulation de graisses dans le foie. Des tissus non nécessaires à ce projet seront également prélevés afin de constituer une banque de tissus qui permettra à l’avenir de réduire le recours à des animaux supplémentaires.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles animaux puisque la pathologie étudiée, la stéatose hépatique, influence l’ensemble du métabolisme de l’organisme et implique des dialogues entre organes. De plus, le fructose est d’abord transformé par l’intestin en lipides (graisses), susceptibles de s’accumuler ensuite dans le foie. Le second site de transformation du fructose en lipides (graisses) est le foie. Ainsi, puisqu’elle implique de nombreux organes (et une communication entre eux), notre étude nécessite l’utilisation d’animaux. A l’issu des procédures, différents tissus non directement nécessaires à ce projet seront prélevés pour constituer une banque de tissus, commune au laboratoire et utilisable à l’avenir pour certaines analyses moléculaires sans nécessité d’animaux supplémentaires.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes. Ce nombre a été établi sur différents paramètres : La taille de l’effet, la puissance statistique ainsi que la variabilité entre les individus. Les années de pratique du laboratoire et du personnel qualifié nous ont permis de standardiser nos expérimentations le plus possible afin de diminuer les sources extérieures de variabilité inter-individus. Les modèles génétiquement modifiés nécessaires à ce projet sont conçus de telle sorte qu’ils permettent de produire à la fois des souris dont la PIG est réduite ou augmentée, et des souris témoins. Ainsi, l’utilisation des souris témoins issues de ces reproductions limite le recours à d’autres animaux, non génétiquement modifiés. De plus, afin de limiter la génération de souris avec un phénotype dommageable anxieux léger, le mâle ne sera pas constamment hébergé avec les femelles. Ceci évite ainsi une production en continu et permet d’obtenir un maximum d’animaux du même âge. De plus, un seul mâle sera nécessaire pour 2 cages de reproductions (contenant chacune 2 femelles). Enfin, les lots seront traités successivement afin de réduire le nombre de géniteurs nécessaires à l’obtention des groupes expérimentaux. Nous avons fait le choix ici d’étudier les mâles et les femelles afin de déterminer s’il existe une différence mâles/femelles des effets de la PIG et/ou du fructose sur la stéatose hépatique. Ainsi, si aucune différence n’est observée entre les sexes, les mâles et les femelles pourrons à l’avenir être regroupés dans des mêmes groupes expérimentaux, indépendamment du sexe. A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort afin de prélever différents tissus à analyser, mais également de nombreux autres tissus pour constituer une banque de tissus commune au laboratoire et utilisable à l’avenir pour certaines analyses moléculaires sans animaux supplémentaires.

Raffinement

D’après notre expérience, dans les conditions d’hébergement respectant la réglementation (en groupe et avec de l’enrichissement) aucun phénotype dommageable n’est observé chez les souris incapables de produire du glucose dans l’intestin. Cependant, une attention particulière sera portée sur toute manifestation de stress pour l’ensemble des animaux. Pour limiter leur stress, les animaux seront manipulés régulièrement par les personnes en charge des procédures expérimentales. Ils seront observés quotidiennement (état du pelage, mouvements/posture, morsures...) et pesés chaque semaine pour suivre leur prise de poids. L’échelle de grimace des souris sera utilisée quotidiennement pour nous aider à évaluer le bien-être des souris. En cas de petites plaies causées par les souris, une crème aux propriétés cicatrisantes et antiseptiques sera systématiquement appliquée par les zootechniciens. Nous aurons recours à des points limites définis et précoces. Plus précisément, nous serons attentifs au comportement, à l’apparence, et au poids de l’ensemble des souris. En cas d’atteinte d’un point limite, les souris pourront être mises à mort selon les méthodes autorisées par la législation si aucun moyen de traitement ou de prévention n’a été efficace. Les modèles génétiquement modifiés nécessaires à ce projet sont conçus de telle sorte qu’ils permettent de produire à la fois des souris dont la production intestinale de glucose/sucre est réduite ou augmentée, et des souris témoins. Ainsi, les souris témoins utilisées seront des souris issues des mêmes portées que les souris transgéniques, mais avec une production intestinale de glucose/sucre non modifiée. Ainsi, cela permet de maintenir l’ensemble des individus de la même portée, tout en s’affranchissant d’un éventuel effet cage lors de la mise en place des régimes. De plus, les cages seront séparées en fonction de leur traitement (en fonction de l’alimentation et s’ils ont du fructose dans le biberon).

Choix des espèces

Les effets de la production intestinale de glucose (sucre) sur le métabolisme glucidique et énergétique ont été étudiés chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Ainsi, le modèle murin est compatible avec notre étude en raison de la disponibilité des souris génétiquement modifiées et des nombreux outils d’analyse. De plus, les phénotypes des souris utilisées dans ce projet ont été largement caractérisés. L’invalidation de la production intestinale de glucose sera faite à l’âge de 7 semaine (chez les souris témoins également) et les différents traitements commenceront 5 semaines après, soit à l’âge de 12 semaines. Ce temps de latence de 5 semaines permet une disparition complète des modifications du métabolisme induits par la molécule injectée. Afin de conserver les mêmes conditions expérimentales dans toute notre étude, les animaux n’ayant pas besoin de cette injection pour activer la production intestinale de glucose seront étudiés au même âge, soit 12 semaines. Par ailleurs, les résultats décrit dans la littérature ne proviennent que de souris mâles. Notre objectif est d’approfondir ces résultats mais également d’étudier si nous observons les mêmes résultats chez les femelles. Nous utiliserons donc à la fois des souris mâles et femelles.

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune enchaînant plusieurs protocoles métaboliques pour limiter les effectifs. Le régime riche en graisses démarre à cinq semaines et dure douze semaines, avec deux prises de sang, un test de tolérance au glucose de deux heures ponctué de sept mesures de glycémie, un test d'insuline d'une heure, quatre jours d'injections quotidiennes d'habituation avant l'administration de l'hormone de la faim, puis une injection de leptine. Un jeûne de vingt-quatre heures précède le test de réalimentation, jeûne que le porteur déclare sans danger, et les souris isolées en cage individuelle disposent de parois transparentes pour voir leurs congénères. Le cerveau est prélevé après une perfusion intracardiaque, au bénéfice d'une hypothèse sur le rôle d'une protéine kinase dans la régulation de l'appétit, dont les retombées annoncées contre l'obésité et le diabète restent au conditionnel.

Objectifs

Le maintien de la balance énergétique dépend de l'équilibre entre les apports et les dépenses énergétiques. Il existe des systèmes de régulation de la prise alimentaire qui permettent un équilibre entre les apports énergétiques, les dépenses et le maintien du poids corporel autour d'une constante. Une dérégulation du système peut conduire à l'obésité et aux maladies métaboliques qui lui sont fortement associées comme le diabète. Au laboratoire, nous étudions le développement de l'obésité et ses altérations métaboliques induits par le stress cellulaire. Nous avons ainsi mis en évidence une protéine qui compromet la fonction des cellules pancréatiques mais qui induit également l'obésité et la résistance à l'insuline. Cet effet est très probablement dû à une diminution de la prise de poids dans des conditions hypercaloriques. De manière intéressante, cette protéine n'est pas induite dans les tissus périphériques (foie, pancréas, tissue adipeux) mais elle est fortement exprimée dans le cerveau, y compris dans l'hypothalamus, le centre de régulation de l'appétit. Ainsi, notre objectif est de déterminer le rôle particulier de de cette protéine dans la régulation de la balance énergétique par le système nerveux central. Dans le cadre de ce projet, nous étudierons un modèle de souris dans lequel le gène codant pour cette protéine est invalidé dans tous les tissus de l'animal. Si nous observons un rôle de cette protéine dans le contrôle de la balance énergétique nous affinerons alors notre étude en invalidant cette protéine spécifiquement dans les neurones responsables de la régulation de l'appétit et de la satiété.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de Diabète de type 2 en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés ne cesse d'augmenter et la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète est déjà présent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du Diabète de type 2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Notre étude se concentre sur un rôle potentiel d'une protéine kinase dans la régulation neuronale de la prise alimentaire. Cette étude est pertinente et innovante pour plusieurs raisons. Cette protéine joue un rôle essentiel dans la sécrétion d'insuline et mais sa fonction dans l'homéostasie énergétique reste inconnue. Comme le contrôle de la prise alimentaire est très complexe, les expériences suggérées sont conçues pour explorer davantage sa fonction dans la prise alimentaire et le gain de poids. Cette étude nous permettra de déterminer si cette protéine kinase est une nouvelle cible thérapeutique dans l’obésité.

Procédures

2 prélèvements sanguins (2 minutes) au début et à la fin du régime standard ou riche en gras (aux âges de 5,17 semaines) seront réalisés. Pour le test de tolérance au glucose, la durée de la procédure est de 2 heures. Un bolus de glucose est injecté par voie intrapéritonale (15 secondes). La glycémie sera évaluée (10 secondes) aux temps 0', 15', 30', 45', 60', 90', 120'. Pour le test de sensibilité à l'insuline, la durée de la procédure est de 1 heure. Une injection intrapéritonéale (15 secondes) d'insuline est effectuée. La glycémie sera évaluée (10 secondes) aux temps 0', 15', 30', 45', 60'. Concernant le test de sensibilité à l'hormone de la faim, les animaux reçoivent une injection intrapéritonéale (15 secondes) de liquide physiologique chaque jour pendant 4 jours (habituation). La prise alimentaire est mesurée en réponse à un bolus d'hormone de la faim (15 secondes). Pour le test de sensibilité à l'hormone de la satiété, les animaux reçoivent une première injection de liquide physiologique (15 secondes) puis le 2ème jour les souris reçoivent un bolus de leptine (15 secondes) afin de mesurer la réponse alimentaire. À la fin du phénotypage métabolique, les animaux préalablement anesthésiés sont perfusés en intracardiaque.

Impact sur les animaux

La procédure pour tester la sensibilité à l'hormone de la faim et l'hormone de la satiété nécessitent l'injection quotidienne de liquide physiologique afin d'habituer les souris avant le jour du test. Le test de réalimentation après un jeûne prolongé nécéssite une mise à jeun des souris pendant 24H. Cette durée de jeûne ne met pas en danger l'animal. Une diète riche en gras pour créer un environnement obésogène sera mise en place, ce qui peut créer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire et la mesure de la dépense énergétique nécessitent que les souris soient individualisées dans les cages. Ces cages individuelles sont transparentes afin que les animaux puissent se voir entre eux, mais aussi se sentir et s'entendre mutuellement. Le test de sensibilité à l'hormone hypoglycémiante peut provoquer une hypoglycémie chez la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

Toutes nos données publiées convergent vers une fonction de cette protéine kinase dans l'homéostasie énergétique. Pour tester nos hypothèses, nous avons maintenant besoin de la souris. En effet, la régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 380 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées avec les mêmes cohortes de souris. Les différences de paramètres métaboliques attendues peuvent être modérées. Pour toutes cette raisons, le nombre d'animaux a éte déterminé en prenant en compte ces difficultés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant l'isolement de certains animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Pour étudier le métabolisme, la souris est le modèle animal de référence. L’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifées dans lesquelle le gène codant pour la protéine d'intérêt est invalidé. Les animaux seront soumis à une diète riche graisse dès l'âge de 5 semaines et pour une durée de 12 semaines, âge auquel les strucutres cérébrales sont développées et fonctionnelles mais surtout âge auquel le régime riche en graisse est le plus efficace. Le phénotypage métabolique se terminera à l'âge de 23 semaines.

Comparer la qualité des sources de protéines végétales et animales passe ici par la privation alimentaire, et 720 rats en croissance vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat est isolé en cage individuelle pendant toute la période expérimentale, placé deux fois vingt-quatre heures en cage métabolique et deux fois trois jours en cage de calorimétrie, radiographié deux fois sous anesthésie gazeuse et soumis à deux prélèvements sanguins de 500 microlitres à la queue. Une injection de valine marquée précède la mise à mort de trente minutes, le temps de mesurer la synthèse protéique. Le porteur affirme que la mesure des effets d'un régime pauvre en acides aminés sur la croissance "empêche le remplacement" par des modèles cellulaires, et présente l'isolement comme atténué par le fait que les rats entendent et sentent leurs congénères.

Objectifs

La qualité de l’apport alimentaire en protéines des régimes alimentaires dépend de leur capacité à satisfaire les besoins en acides aminés (AA) indispensables (AAI) tout au long des cycles de vie. C’est une question majeure de sécurité nutritionnelle, principalement dans les pays en voie de développement, où l’apport protéique total est modéré, voire bas. Plus généralement, la connaissance de la qualité de l’apport alimentaire en protéine est primordiale pour comparer les différentes sources de protéines, notamment dans le cadre des discussions sur le rééquilibrage des sources alimentaires végétales et animales, et la recherche de sources alternatives de protéines. La composition en AAI est variable selon les sources protéiques. En effet, les protéines d'origines animales ont un profil homogène et équilibré en AAI, alors que les protéines de céréales et les protéines de légumineuses (comme le gluten) sont déficientes en certains AAI. Les profils de référence de besoin en AAI, utilisés pour l’évaluation de la qualité protéique, initialement déterminés à partir de données de bilan azoté, ont été révisés à la hausse (Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO)/Organisation mondiale de la santé (OMS),2007) sur la base de nouvelles méthodes, rendant plus sélectifs les critères de qualité des protéines. Cependant, ces valeurs révisées restent discutées. Ainsi, lors de son rapport sur le besoin en protéines et AA en nutrition humaine, le comité (FAO/OMS) a conclu qu’aucune méthode actuelle d’estimation du besoin en AAI n’est entièrement fiable et qu'iI est donc primordial de proposer de nouvelles approches complémentaires pour préciser les valeurs des besoins et d’évaluer le statut nutritionnel protéique des différentes populations. Pour cela, la FAO a recommandé le recours à l’usage d’outils tels que la métabolomique (ensemble des métabolites), qui a notamment été appliquée avec succès pour estimer le besoin en d’autres micronutriments. L’objectif de ce projet est d’identifier les variations des profils du métabolome urinaire et plasmatique comme biomarqueurs spécifiques de la déficience en AAI et à évaluer l’efficacité de la supplémentation pour valider les biomarqueurs identifiés. Ce projet fait suite à deux projets précédents pour lesquels nous avons identifié et validé des biomarqueurs urinaires pour trois des neuf AAI. Ce projet se déroulera sur 2 sites, dont une plateforme pour évaluer leur dépense énergétique et la composition corporelle.

Bénéfices attendus

L’identification et la validation de biomarqueurs du statut en AAI permettra, à terme, de mieux définir les besoins en acides aminés indispensables. Cela servira à affiner les politiques nutritionnelles et à mieux évaluer la qualité des sources protéiques. De plus, cette étude nous renseignera sur les effets d’une supplémentation en ces acides aminés indispensables après une phase de déficience. Ces effets n’étant que peu rapportés dans la littérature, ces informations seront très utiles, notamment pour l’étude de la sous-nutrition chez l’enfant avec retard de croissance.

Procédures

Durant la période expérimentale , les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire. Les animaux seront placés deux fois pendant la période expérimentale en cages métaboliques pendant 24h pour collecter les féces et les urines, et deux fois en cage de calorimétrie pendant 3 jours pour la mesure de dépense énergétique. La densité minérale osseuse et la longueur du tibia seront analysés par radiographie deux fois au cours de l'expérience après anesthésie gazeuse (anesthésie à l'isoflurane 2% pendant 10-15min). Deux prélèvements sanguins seront effectués au niveau de la veine de la queue de 500μl chacun .A la fin de l'expérimentation, les animaux seront mis à mort et une injection de valine 13C sera réalisée 30 minutes avant l’euthanasie (150μmol/100g poids corporel), dans le but de mesurer la synthèse protéique.

Impact sur les animaux

Durant la période expérimentale, les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire et de leur dépense énergétique (cages de calorimétrie indirecte), ainsi que la collecte des urines et fécès (cages métaboliques), ce qui peut engendre un stress modéré dû à l’isolement des animaux. Les animaux seront transportés à la plateforme 3 jours avant d'effectuer les mesures, afin d’évaluer leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte et leur composition corporelle. La plateforme se situe à plusieurs km de l’unité de rechercheset le transport des animaux sera réalisée en voiture ce qui peut engendrer un stress modéré. Aussi, les prélèvements sanguins lors de la procédure 2 sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré. Une injection sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. L’anesthésie gazeuse permettra de réduire la douleur engendrée par l’injection.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser des analyses sur différents tissus cibles.

Remplacement

La nécessité de mesurer les conséquences de l'ingestion d’un régime à faible teneur en AAI sur le comportement alimentaire et les paramètres de la croissance (gain de poids et composition corporelle) empêche le remplacement de l'expérimentation animale par des modèles cellulaires ou moléculaires. Les résultats de ce projet permettront de mettre en place une étude clinique chez l’enfant dénutri. Ainsi, les objectifs de ce projet ne peuvent être atteints sans avoir recours à l’animal, le rat étant un modèle pour l'humain, en particulier pour la nutrition.

Réduction

A partir des données issues d’une étude précédente, nous avons déterminé qu’un effectif de 10 rats par groupe est le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garder une puissance statistique satisfaisante. Cette étude inclue 6 lots, correspondant à chaque AAI à étudier. L’expérimentation comprendra 80 animaux pour chaque AAI étudié.

Raffinement

Le projet impose l'hébergement des rats en cages individuelles (répondant aux normes en vigueur) pour la mesure précise de la consommation alimentaire. Les rats demeurent dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils continuent à échanger par vocalises, et ils les voient et les sentent, ce qui modère l’impact de l’isolement. De plus, les cages seront enrichies au moyen de différents objets (tunnel, d’une tasse renversée, …) . De plus, un enrichissement social est prévu : les animaux seront placés en cages collective tous les jours pendant 2 h (durant les mesures de poids corporel et de gaspillage alimentaire). Les prises de sang sont réalisées par un expérimentateur expérimenté pour cet acte technique. Des aiguilles spécifiques permettant un écoulement plus efficace du sang en sortie d’aiguille sont utilisées, ce qui permet de limiter la durée et le stress engendré par les prises de sang. Les animaux seront transportés à la plateforme en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : Les animaux seront regroupés en fonction des régimes en cages collectives de transport avec de l’eau en gelée et de la nourriture à disposition. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Comme l’humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus, l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’homme, le porc ou le rat pour étudier la qualité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Nous utiliserons ainsi des rats en croissance comme modèle de l'enfant en croissance.

840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune maintenue sept, huit, seize ou vingt-quatre semaines sous un régime enrichi en graisse, en cholestérol ou en fructose destiné à lui faire développer une obésité, une résistance à l'insuline, une stéatose du foie et une athérosclérose. Les femelles gestantes sont isolées cinq jours avant la mise bas et soumises au même régime, ce qui expose aussi les fœtus. Après une mise à jeun et deux tests métaboliques, les souris sont anesthésiées puis tuées pour le prélèvement de sang et d'organes. Ce projet pilote sert à choisir la lignée et le régime des études à venir, et le porteur annonce qu'il réduira le nombre d'animaux, sans qu'aucun calcul d'effectif ne soit donné pour ces 840 souris.

Objectifs

Ce projet est une étude pilote qui a pour objectifs de : 1) Déterminer le modèle murin génétiquement modifié le plus adapté dans le cadre de projets de recherche étudiant l’impact de l’altération du métabolisme des lipides dans les maladies cardio-métaboliques associées à l’obésité : athérosclérose, troubles du rythme cardiaque, maladies du foie non alcoolique (stéatose, stéatohépatite et fibrose hépatique), résistance à l’insuline et diabète. En effet, les souris non génétiquement modifiées soumises à un régime riche en graisse ou en cholestérol ne développent pas l’ensemble du spectre des maladies observées chez l’Homme de manière spontanée. Pour cela il est nécessaire d’utiliser des souris dont le métabolisme des lipoprotéines, les transporteurs circulants de lipides, a été modifié pour se rapprocher de celui trouvé chez l’Homme. Cette étude pilote a pour but de valider quelle serait la meilleure lignée à utiliser pour permettre de répondre aux questions scientifiques du projet. 2) Déterminer le régime optimum qui permettrait d’étudier les différents aspects des maladies cardio-métaboliques associées à l’obésité pour ces modèles. Ceci permettra de valider le choix de la lignée à utiliser, mais également de faciliter les échanges de données et donc de diminuer le nombre total d’animaux requis pour les différents aspects du projet..

Bénéfices attendus

Ce projet pilote permettra de sélectionner l’association régime/ génotype la plus adaptée pour répondre à différents objectifs scientifiques. Il permettra d’harmoniser les régimes et le modèle murin et de réduire le nombre d’animaux in fine. A plus long terme, le projet d’étude qui pourra être lancé permettra d’étudier les mécanismes associés à l’émergence de l’athérosclérose liés aux troubles métaboliques. De plus, ce projet permettra également de conforter l’hypothèse d’une programmation périnatale du développement de l’athérosclérose à l’âge adulte. L’ensemble de ces données permettra d’identifier et de stratifier des populations humaines potentiellement à risque et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux impliqués dans ce projet (cohorte adulte et cohorte « développement » avec femelles gestantes et allaitantes) seront mis sous un régime riche en graisse et ou en fructose, et ou en cholestérol pour des durées variables (7, 8, 16 ou 24 semaines). La cohorte de souris adulte sera soumise à un prélèvement faible de sang sous anesthésie (moins de 10 min) avant la mise sous régime riche. Après le régime riche en graisse, les souris seront mises à jeun et rapidement évaluées sur le plan métabolique (moins de 2 h), incluant un faible prélèvement de sang afin de mesurer le sucre dans le sang suite à une administration de glucose ou d’insuline. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet.

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes de la cohorte « développement » seront en hébergement individuel pendant 5 jours avant la mise-bas afin de préparer leur nid et assurer une alimentation comparable de leurs souriceaux, ce qui diminuera leurs interactions sociales pendant cette période. Elles seront exposées à un régime riche en graisse plus ou moins cholestérol plus ou moins fructose, ce qui pourrait générer un inconfort pour elles et le développement des fœtus. A partir de 8 semaines, les souris de la cohorte adulte seront exposées à des régimes riches en graisse plus ou moins cholestérol et plus ou moins fructose ou saccharose pendant 8,16 ou 24 semaines afin d’induire une obésité et les désordres métaboliques associés : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, etc. Ceci pourrait induire un inconfort. De plus, les souris seront soumises à deux tests d’évaluation du métabolisme qui inclus une mise à jeun et de très petits volumes de prélèvement de sang.

Devenir

Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins, sans induire plus d’inconforts aux animaux.

Remplacement

Le dialogue inter-organes (cœur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (macrophages/hépatocytes ou adipocytes) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires ou organotypiques. Ainsi l’impact global d’un stress lipidique induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, il faut prendre en considération le concept que l’altération d’une fonction cellulaire (par exemple des macrophages) dans un environnement tissulaire spécifique peut avoir un écho profond dans des tissus/organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués.

Réduction

Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre de lignées potentiellement intéressantes pour le projet à 2 lignées qui seront testées en séquentielle, la seconde n’étant produite qu’en cas d’échec avec la 1ère. De même, le choix préalable des régimes a pu être réduit au maximum afin d’induire les altérations cardio-métaboliques souhaitées tout en évitant les biais. La sensibilité à l’émergence des maladies métaboliques présente une différence sexuelle importante. Il convient donc de caractériser finement les animaux des deux sexes ainsi que les mécanismes impliqués, en accord avec les recommandations des sociétés savantes internationales et des comités éditoriaux des journaux scientifiques .

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les animaux seront manipulés avec douceur, par du personnel formés et compétents, qui sera vigilant en cas de réaction comportementale excessive, ou de mal-être. Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. L’enrichissement des cages sera renforcé pour les femelles gestantes et allaitantes qui seront en hébergement individuel avec leurs petits, avec minimum de la frisure de papier kraft et un bâton à ronger.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet est de valider les conditions nutritionnelles qui permettent de programmer le développement d’une athérosclérose suite à une exposition périnatale. L’étude chez l’adulte permettra de d’associer le développement de maladies cardiovasculaires au régime alimentaire périnatale, mais sans éliminer l’impact du vieillissement. L’étude chez les souriceaux âgés de 10 jours quand ceux-ci sont strictement nourris au lait maternel permettra d’estimer si ce lien existe dès ce stade précoce, et ainsi de valider l’hypothèse d’une transmission maternelle. Ceci a également une importance pour la santé humaine car des hausses sensibles de la pression artérielle ont été observées chez des pré-adolescents avec un historique fœtal (retard de croissance, prématurité).

Toutes opérées sous anesthésie pour recevoir des vecteurs viraux dans le cerveau et y implanter une fibre optique, 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit jusqu'à deux injections intrapéritonéales par jour pendant cinq jours, un régime riche en gras et en sucre pendant un à deux mois, un jeûne de cinq heures, puis sept prélèvements sanguins en deux heures. Le porteur reconnaît que la chirurgie peut provoquer des douleurs après l'opération malgré l'analgésie, et que le port de la fibre optique gêne les déplacements. L'objet reste la compréhension du rôle des astrocytes de l'hypothalamus dans le métabolisme énergétique, le porteur espérant seulement que manipuler ces cellules permettrait un jour de contrôler certaines maladies métaboliques.

Objectifs

Le maintien de l'équilibre énergétique est essentiel pour la santé. Le dysfonctionnement de ce processus conduit à une variété de maladies métaboliques pour le cerveau et le corps. Particulièrement, l'hypothalamus dans le cerveau représente un centre de signalisation pour la régulation du métabolisme énergétique du corps. Comprendre les mécanismes sous-jacents à la signalisation cellulaire dans l'hypothalamus dans le contexte du métabolisme énergétique, est la base pour contrôler les maladies métaboliques. L'objectif de ce projet est d'utiliser des modèles de souris pour comprendre le rôle des astrocytes hypothalamiques dans le contrôle du métabolisme énergétique du corps, via l'angle des interactions entre astrocytes et neurones.

Bénéfices attendus

Comprendre la participation des astrocytes dans le métabolisme énergétique fera progresser nos connaissances sur la façon dont le cerveau régule l'énergie du corps. De plus, ce projet découvrira également de nouvelles voies moléculaires qui pourraient être poentiellement ciblées pour améliorer les syndromes métaboliques. En particulier, nous espérons qu’en manipulant directement ces cellules, nous pourrions contrôler certaines maladies métaboliques.

Procédures

1) L'injection intrapéritonéale d'un médicament chimique sur une partie des animaux vigiles (10 secondes, au maximum 2 fois par jour pendant cinq jours); 2) Procédure chirurgicale effectuée sous anesthésie générale/locale et analgésie pré et post-opératoire sur tous les animaux (30 min chaque); 3) Expériences in vivo sur une partie des animaux: les souris qui se déplacent librement portent une fibre optique légère pendant 15-20 min pour chaque enregistrement. 4) Alimentation riche en sucre et gras: pour étudier l'adaptation métabolique, les souris reçoivent un régime riche en gras et sucre pendant 1 à 2 mois sur une partie des animaux. 5) mise à jeun: une partie des souris qui subissent des tests de métabolisme sont à jeun pendant 5 heures. 6) Tests métaboliques impliquant une administration (1 gavage ou 1 injection unique) puis 7 prélèvements de faible volume sur une durée de 2h pour une partie des animaux. 7) Euthanasie d'une partie des souris pour prélèvement sous anesthésie et analgésie, durée 20 minutes.

Impact sur les animaux

1) L’administration d’une hormone pour induire le modèle génétiquement modifié peut entrainer des irritations, un stress et une douleur de courte durée au site d'injection. 2) Une intervention chirurgicale sera effectuée pour délivrer des gènes portés par des vecteurs viraux et implanter un système de fibre optique. Cette chirurgie pourra entrainer des douleurs en post-opératoire malgré la prise en charge analgésique. 3) le port d'une fibre optique peut légèrement influencer la liberté de mouvement des souris; 4) Au cours des tests métaboliques, les animaux seront mis à jeun pendant cinq heures, ils pourront donc ressentir une sensation de faim durant une courte période. Une solution de glucose sera administrée par injection intrapéritonéale ou oralement : un stress lors de la contention et une légère douleur peut être ressentie au point d'injection ou lors de l'introduction de la canule de gavage dans la cavité buccale. 5) Des prélèvements sanguins de faible volume seront effectués pour mesurer la glycémie, une légère douleur peut être ressentie lors du prélèvement de sang. 6) Lors des procédures mentionnées, il existe un risque d'infection au niveau des sites d'injection (par exemple, par la voie sous-cutanée ou intrapéritonéale) et de prélèvement, des risques liés à l'anesthésie, à la chirurgie et à un régime alimentaire riche en graisse.

Devenir

Les souris seront euthanasiées. En effet, les tissus prélevés pour les analyses biochimiques et immunohistochimiques (analyse de la pathologie, de l'inflammation, changements dans chaque type de cellule) et pour les études moléculaires et génomiques nécessitent l’euthanasie de l’animal.

Remplacement

Dans le présent projet, le remplacement des modèles animaux par des approches in vitro ne permet pas l’étude de l'effet des astrocytes sur le métabolisme du corps. En outre, il est connu que les astrocytes in vitro ont des caractéristiques biologiques différentes de leurs états in vivo, ce qui rend indispensable l'utilisation de modèles animaux pour comprendre l'interaction complexe avec les neurones dans l'environnement natif.

Réduction

L'estimation du nombre d’animaux et les tests statistiques utilisés sont basés sur les études standards dans le domaine du métabolisme. Nous avons minimisé le nombre d'animaux, à un niveau qui permet d'être sûr de répondre aux questions scientifiques proposées de ce projet, et prend également en compte les échecs occasionnels lors des procédures expérimentales. La quantification statistique de nos données a besoin d'au moins 20 animaux par groupe et par condition. De plus, il faut prendre en compte le risque chirurgical en ajoutant 5 souris par lot, ce qui conduit à un nombre total de 300. C’est le nombre permettant d'atteindre des résultats scientifiquement solides statistiquement.

Raffinement

Tout au long du projet, les animaux seront hébergés avec un cycle jour/nuit adapté et avec la boisson et la nourriture ad libitum. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien par une personne professionnelle, en complément de celle des expérimentateurs. L’anxiété des animaux sera réduite par un maintien en groupe social et par une manipulation régulière de la part de l'expérimentateur. Par ailleurs, les souris seront placées dans des cages avec des enrichissements environnementaux, y compris rouleaux en carton, coton, bûchettes en bois, etc, afin de leur permettre de manifester leurs comportements naturels. Les signes d'anomalie seront renseignés comme l'aspect des souris, un comportement irrégulier, des blessures, ou perte de poids. En outre, une analgésie sera mise en place afin de réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Si les souris montrent une souffrance ou une douleur mise en évidence par une modification comportementale ou physique, une analgésie supplémentaire sera administrée. Les souris ayant atteint un point limite seront euthanasiées. Ces contrôles permettent d'identifier des animaux malades ou blessés et de prendre les mesures appropriées. L'ensemble du suivi se fait en coordination avec la SBEA (Structure chargée du Bien Etre des Animaux) et le vétérinaire référent.

Choix des espèces

Il s’agit ici d’études physiologiques et de comportement métabolique qui ne peuvent être reproduites par des systèmes, autres que celui de l’animal vivant. Les effets alimentaires et la régulation métabolique peuvent être étudiés avec pertinence chez la souris en comparaison avec l’homme. La souris permet aussi de manipuler certains gènes permettant d’accéder à la partie plus mécanistique des processus dans un environnement physiologique comparable à l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 2 mois) afin que les réseaux neuronaux et astrocytes soient bien établis et que les expériences ne soient pas perturbées par une plasticité neuronale ou le développement des astrocytes.