Système endocrinien
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Évaluation de nouveaux radiotraceurs ou candidats-médicaments pour l’ischémie périphérique.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Anesthésiées pour une chirurgie de quarante minutes qui interrompt la circulation dans l'artère fémorale d'une patte, 1 380 souris passent ensuite par cinq à six imageries laser doppler et cinq imageries isotopiques pouvant durer deux heures, étalées sur 21 jours. Une partie reçoit en plus des injections abdominales ou des gavages, jusqu'à deux fois par jour pendant trois semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur énumère les atteintes possibles : douleur, œdème douloureux du membre, infections, incapacité à se servir de la patte, irritations de l'œsophage liées au gavage. Celles qui vont au bout sont tuées pour prélever leurs tissus, et 88 souris qui n'auront pas perdu la vascularisation de leur patte pourront être réutilisées dans un autre projet.
Objectifs
La maladie artérielle périphérique (MAP) se définit comme un blocage partiel ou total d’une artère causé par une accumulation de lipides dans la paroi des vaisseaux artériels se situant en périphérie de l’aorte. Elle est généralement provoquée par un durcissement des artères (athérosclérose). La MAP représente un problème majeur de santé publique dans les pays développés. Malgré les progrès réalisés dans la prévention des facteurs de risque (tabac, diabète, obésité…) et dans les techniques interventionnelles et chirurgicales (pontage, stents…) pour améliorer la perfusion des membres inférieurs, une partie importante des patients atteints sont considérés comme « non répondeurs » pour la revascularisation et ont un pronostic particulièrement défavorable avec des taux élevés de mortalité et d’amputation des membres. En conséquence, l’identification de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter cette complication invalidante est d’un intérêt critique. Le but de ce projet est d’évaluer soit de nouveaux radiotraceurs qui permettraient un meilleur suivi ou détection des processus de réperfusion (recrutement des petits vaisceaux autour ou créations de nouveaux vaisseaux permettant la revascularisation du membre inférieur), soit d’évaluer l’efficacité de nouveaux candidats-médicaments sur un modèle murin d’ischémie de la patte par arrêt de la circulation dans l'artère fémorale de la patte.
Bénéfices attendus
Le diagnostic et le traitement précoces, ainsi qu’un suivi rigoureux, contribuent à améliorer la qualité de vie des patients en réduisant les symptômes associés et en augmentant l’efficacité des traitements. L’utilisation de nouveaux traceurs permet de détecter le site d’ischémie et facilite la prise en charge rapide des traitements, en augmentant les chances de bon pronostic des patients. Les traceurs développés grâce à la recherche en imagerie médicale offrent une précision supérieure dans la détection du site ischémique. Cela permet aux médecins de cibler plus précisément les zones affectées, réduisant ainsi les dommages aux tissus sains environnants.
Procédures
Les animaux auront : une chirurgie (1 fois, durée 40 minutes max, sous anesthésie générale), des imageries laser doppler (5 à 6 fois sur 21 jours, durée :5 min ; sous anesthésie général), des imageries isotopiques (5 fois sur 21 jours, durée maximum 2h ; sous anesthésie). Une partie des animaux auront également des injections de médicaments soit par injections abdominal soit par gavage (maximum 2 fois pas jours pendant 21 jours , durée en moyenne 1 à 2 minutes, sur animal vigile en contention) et certain auront des prélèvements sanguins au niveau de la queue (2 fois maximum, sous anesthésie, 2min).
Impact sur les animaux
Pendant les procédures décrites dans cette saisine, les animaux sont passibles d’expérimenter ce qui suit : • Douleur et inconfort : la chirurgie pourra provoquer une douleur due au manque d'oxygène et de nutriments dans les tissus affectés. Cela peut aussi entraîner une diminution de l'appétit chez l'animal, conduisant à une perte de poids et à une augmentation du stress. Les traitements réalisés sur les animaux vigiles peuvent entrainer un stress dû aux contentions répétées de l’animal ainsi que des irritations de l’œsophage et des problèmes de déglutition dans les cas des gavages. Les traitements répétés par injections peuvent entrainer des petites plaies cutanées. • Problèmes circulatoires et œdème : le manque de circulation peut entraîner une accumulation de liquide dans les tissus, provoquant un gonflement douloureux et une altération de la fonction des membres affectés. • Infections : en raison de la chirurgie, les tissus ischémiques sont plus sujets aux infections en raison de la réduction de l'apport sanguin et de la réponse immunitaire locale ; ça peut entrainer aussi une dégradation de la peau et du pelage dans le cas des infections cutanées. • Difficulté de locomotion : les animaux dont la patte n'est plus correctement vascularisé peuvent présenter une difficulté ou une incapacité à utiliser leur patte. Cela peut réduire leur capacité à se déplacer librement ou à chercher de la nourriture. • Les anesthésies gazeuses répétées peuvent entrainer des difficultés respiratoires lors de l’anesthésie, ainsi que des difficultés d’endormissement et de réveille au cours du temps.
Devenir
Tous les animaux qui iront au bout des procédures seront mis à mort de afin de récupérer les tissus d'intérêts et de pouvoir compléter l’études avec des expérimentations ex vivo et in vitro. Les animaux qui n'auront pas développé de perte de la vascularisation de la patte et qui seront sortis du projet en bonne santé pourront être réutilisé dans un autre projet.
Remplacement
Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent l’utilisation de modèle complexe. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative in vitro ou in sillico qui permet d'avoir une vision complète des grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’Homme. L’ensemble des candidats radiotraceur et des candidats médicament, qui seront testés dans ce projet, auront été préalablement évalués pas des études in vitro pour leur ciblage spécifique et leur efficacité.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé aux maximums tout en assurant des résultats statistiquement exploitables, nous avons calculé les effectifs à l’aide d'un logiciel de statistique G*Power. Pour l’évaluation de nouveaux traceur radioactif, le marquage spécifique dans la patte avec le blocage artériel sera comparé avec la patte en controlatérale (saine), chaque animal sera donc son propre contrôle. Pour la partie sur le développement de nouveaux candidat médicament, nous réaliseront sur 5 groupes distincts une série de 5 mesures répétées sur les mêmes animaux grâce aux imageries in vivo permettant de visualiser les traceur radioactif et permettant de faire des études longitudinales. Nous analyserons les données à l'aide de tests statistiques multiparamétriques.
Raffinement
Les chirurgies, les injections par voie veineuse et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal et un réveil rapide. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées, en plus de l’anesthésie générale, d’une analgésie locale et générale par injection sous cutanée de morphinique . Pendant une heure après la chirurgie, une surveillance accrue des animaux sera mise en place, pour éviter toutes complications post- opératoires. L’accès à la nourriture et à l’eau ne sera permis qu’une fois que l’animal sera parfaitement réveillé pour éviter les problèmes de fausse route. Les périodes de traitements sur animaux vigiles seront précédées d’une semaine d’habituation à la contention pour diminuer le stress lors des expérimentations. Les gavages se feront avec sonde de nutrition vétérinaire adaptée aux souris. L’embout est arrondi pour ne pas endommager les parois de l’œsophage et de l’estomac et l’on attend que la souris avale le bout de la sonde (sans forcer) pour éviter les fausses routes. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour les prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieure à 20 % du poids initial, l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance inutile. Les conditions d’hébergement classiques ; animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et à l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12 h ; seront enrichies en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de bâtons ou boules en bois pour faire les dents, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypie.
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. Le modèle d'ischémie des membres inférieurs chez la souris est bien documenté et a fait l'objet de plusieurs publications dans notre équipe. Notre modèle d’ischémie des membres inférieurs se fait chez le jeune adulte. Les animaux arriveront dans l’animalerie à 6 semaines (poids compris entre 25 et 35 g en fonction du sexe) et la chirurgie sera faite dans leur 8e semaine (poids compris entre 27 et 40 g). À la fin du protocole, les souris devraient peser entre 28 et 45 g.
Effets des perturbateurs endocriniens dans la (re)myélinisation du nerf optique chez le têtard de Xenopus Laevis transgénique.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
16 800 têtards de xénopes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit 240 individus par molécule testée pour trente-cinq molécules. Ils baignent dans une eau contenant les perturbateurs endocriniens pendant trois jours ou jusqu'à trente jours, après dix jours d'exposition au métronidazole en incubateur opaque pour une partie d'entre eux, et sont anesthésiés jusqu'à quatre fois pour le comptage des cellules du nerf optique. Le porteur estime la mortalité liée à l'exposition à 10 % sur trois jours et 20 % sur un mois, à quoi s'ajoutent 10 % de morts prématurées pendant le développement. Il retient le xénope entre autres parce que l'espèce "génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d'animaux".
Objectifs
Au cours de ces 40 dernières années, des milliers de produits chimiques ont été introduits dans notre environnement. Connues sous le nom de perturbateurs endocriniens (PE), ces molécules ont des effets néfastes sur la santé en agissant sur le système endocrinien, en mimant l’action physiologique des hormones. Les PE agissent sur certaines hormones, qui agissent sur des cellules présentes dans le cerveau. En sachant que l’exposition chimique influence, dans le cerveau en développement et chez l’adulte, le destin des cellules, nous pensons que les PE auraient un impact sur des cellules spécifiques appelées les oligodendrocytes, qui forment une gaine isolante autour des axones (prolongement des cellules nerveuses) appelée la myéline. Ces cellules sont impliquées dans des mécanismes de myélinisation (processus de formation de la myéline) et remyélinisation (régénération de la myéline). L’objectif de notre projet est donc d’évaluer chez le têtard de Xenopus Laevis les effets des perturbateurs endocriniens sur la myélinisation et la remyélinisation et ainsi vérifier s’il existe une corrélation avec certaines maladies comme la sclérose en plaque, dont les cas ont augmenté depuis l’apparition de ces molécules.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre les effets des substances identifiées comme ayant des propriétés perturbatrices sur le système endocrinien, et les conséquences qu’elles peuvent avoir sur la myéline (membrane qui protège les axones de nos neurones) dans différentes conditions. Premièrement, étudier les effets des perturbateurs endocriniens dans un contexte de myélinisation (processus de la formation de la myéline), permettrait de comprendre quelles molécules impactent ce processus et de voir s’il existe une corrélation avec les troubles neurodéveloppementaux observés chez les enfants ayant été exposés à ces molécules. Ensuite, étudier les effets des perturbateurs endocriniens dans un contexte de remyélinisation (processus de régénération de la myéline) permettraient dans le cas de maladies démyélinisantes comme la sclérose en plaque (où la myéline est détériorée, SEP), de comprendre s’il existe une corrélation entre l’augmentation du nombre de cas de SEP et celle de l’utilisation des PE. De plus, notre implication dans un projet international permet de répondre aux besoins réglementaires, scientifiques et sociétaux pour une meilleure évaluation des dangers et des risques chimiques des substances identifiées comme PE.
Procédures
Afin de procéder à un comptage des cellules d'intérêt dans les nerfs optiques, les animaux seront anesthésiés au maximum 4 fois pour une durée de 15 minutes maximum avec un minimum de 3 jours entre chaque anesthésie. Une partie des têtards sont mis en contact avec une molécule permettant de mettre en place le modèle pendant 10 jours, dans leur eau de balnéation. Puis ils seront exposés pendant 3 jours aux perturbateurs endocriniens pour étudier leur effet. Une autre partie des têtards sera mise en contact direct avec les perturbateurs endocriniens pendant 30 jours maximum pour étudier leur impact sur le développement. Les perturbateurs endocriniens sont aussi préparés dans l’eau de balnéation des têtards. Tous les têtards sont euthanasiés en fin de procédure par une méthode règlementaire pour la réalisation d’analyses sur leurs tissus.
Impact sur les animaux
L’anesthésie est maintenue durant toute la procédure pour ne pas engendrer de stress chez l’animal, mais peut entrainer des risques cardio-respiratoires. Malgré le soin que nous portons au choix de la dose des molécules, d’après la littérature et les tests in vitro, il arrive que certaines concentrations de perturbateurs endocriniens testées soient toxiques et entrainent la mort des têtards. Nous estimons cette perte liée à l’exposition aux perturbateurs endocriniens à 10 pour cent pour 3 jours et 20 pour cent pour 1 mois d’exposition. Une mort prématurée des têtards est possible pendant le développement, nous estimons cette perte à 10 pour cent, ainsi que suite à l’exposition au métronidazole, que nous estimons à 10 pour cent. Lors des différentes procédures, les animaux sont délicatement attrapés avec une pipette. Cette manipulation induit un léger stress. Lors des tests comportementaux, les têtards sont amenés dans la pièce agréée dans leur bac ce qui peut provoquer un léger stress chez nos animaux lors du déplacement (bacs sur un chariot).
Devenir
Afin d’étudier les différents mécanismes impliqués suite à l’exposition aux perturbateurs endocriniens testés, il est ensuite nécessaire d’euthanasier les têtards pour faire des études immuno-histologiques plus poussées sur leurs tissus pour compléter les observations faîtes du vivant de l’animal.
Remplacement
Les perturbateurs endocriniens sont connus pour avoir un effet toxique sur les cellules en culture, ce qui explique pourquoi ce modèle ne peut pas être utilisé dans notre cas. L ’intérêt est de comprendre les effets des perturbateurs endocriniens au sein d’un organisme vivant, et d’étudier leurs impacts sur le comportement et les processus physiologiques. Le recours à des têtards, qui ont un système nerveux comparable (présence et importance de la myéline dans le fonctionnement) à ce qui est retrouvé chez l’Homme, peut permettre une première démonstration de l’action d’une molécule in vivo, ce que les modèles cités précédemment ne permettent pas. Le choix de l’utilisation du modèle Xenopus Laevis repose donc sur les arguments suivants : -Il s’agit d’un modèle animal, donc un modèle intégré contrairement à des modèles ex vivo et in vitro -La transparence du têtard permet de visualiser tout le système nerveux central, ce qui permet un suivi in vivo et longitudinal sans euthanasie à des temps donnés pour prélever des échantillons -Le Xénope est une espèce qui génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d’animaux pour leur interprétation -Enfin, il existe une grande conservation des protéines de la myéline inter-espèces (amphibiens versus Mammifères) pour transposer nos observations sur cette espèce à l’Homme.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, ce sont les mêmes têtards qui sont utilisés pour compter le nombre de cellules qui nous intéressent dans le nerf optique qui seront soumis au test visuel. La transparence des têtards de Xénope permet de suivre in vivo la progression des expériences grâce à l’observation au macroscope, et ainsi d’éviter des suivis histologiques tout au long du protocole nécessitant l’euthanasie des têtards. Nous estimons qu’il faudra environ 240 têtards par molécule, en sachant qu’une molécule est testée deux fois à 7 concentrations différentes, en comparaison avec un groupe contrôle, ce qui fait un total de 8 groupes, avec 15 têtards par condition, donc 240 têtards au total. Le nombre de 15 têtards par groupe prend en compte la mortalité spontanée des têtards liée au développement et celle liée à l’exposition aux molécules (molécule qui permet la mise en place du modèle et celles à évaluer). 35 molécules sont à tester suivant ce modèle, soit au total environ 8 400 têtards pour la myélinisation, et 8400 pour la remyélinisation, ce qui fait un nombre total de têtards de 16 800 têtards pour ce projet.
Raffinement
Au cours de leur développement, les têtards sont placés dans un bac de 4L d’eau adaptée à leur physiologie (moitié eau dure, moitié eau osmosée) à 23degrès Celsius avec une pompe pour oxygéner l’eau. L’eau est renouvelée de façon hebdomadaire pour maintenir un volume suffisant et réduire l’accumulation des déchets (un changement d’eau trop fréquent entraine un stress avec une perte de nos têtards). Les têtards sont observés quotidiennement, et ceux qui présentent des anomalies (déformations, retard de développement, troubles de la nage…) sont euthanasiés, les cadavres liés aux problèmes de développement et les déchets liés au surplus de nourriture sont retirés de l’eau quotidiennement pour maintenir de bonnes conditions environnementales. De plus, des bûches flottantes artificielles sont placées dans les bacs, ce qui permet de complexifier leur milieu (enrichissements). Enfin, nous utilisons une alimentation, majoritairement composée de végétaux et d’algues, adaptée à leur développement. La profondeur de l'anesthésie est surveillée et est adaptée à nos besoins pour garantir une immobilisation et limiter le stress des animaux. Pour optimiser le réveil et la bonne récupération des animaux, nous favorisons une oxygénation de l'eau avec un bulleur et réintégrons les têtards auprès de leurs congénères pour limiter le stress Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Pour les manipulations la préhension des animaux est faite délicatement avec une pipette, Pour le comportement, les têtards sont amenés dans leur bac jusqu’à la pièce dédiée, et attrapés par une pipette pour les placer dans une large boite de Pétri avec leur milieu de nage pour limiter le stress. Les têtards sont isolés très peu de temps (5 min) avant d’être replacés dans leur bac d’origine avec leurs congénères. Durant l’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle), les têtards sont placés dans un incubateur opaque. Cette absence de cycle jour et nuit ne semble pas leur être préjudiciable vue que cette espèce a une préférence naturelle pour les zones peu éclairées. Afin de déterminer les concentrations optimales non toxiques lors du passage au modèle animal, les effets des perturbateurs endocriniens sont d’abord étudiés, sur des tranches de cervelet de souris.
Choix des espèces
La transparence des têtards facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction car étude longitudinale), de plus la grande homologie des protéines de la myéline des Xénopes avec celle des mammifères justifie l’utilisation de ce modèle. Les têtards sont utilisés entre 3 jours (stade 21) et 1 mois (stade 50) post-fertilisation. A cette période de développement, on peut facilement observer la dynamique de la mort et de la réapparition des cellules d’intérêt (oligodendrocytes in vivo) et sans recours à l’euthanasie des animaux.
Régulation des interactions Hôte-Microbiote et impact en santé inflammatoire et métabolique.
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, 9 960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier les liens entre microbiote intestinal et maladies inflammatoires chroniques. Les actes décrits se limitent à des prises de sang sans anesthésie, uniques ou répétées sur deux heures, et à quatre gavages au plus. Le porteur annonce pourtant que certaines approches provoqueront une inflammation intestinale chronique ou un cancer colorectal, et une prise de masse grasse chez certaines souris, puis écrit : "Aucun stress ni comportement anormal n'est anticipé." Il affirme que le recours à la souris est "indispensable", sans préciser comment ces maladies sont déclenchées, quels facteurs alimentaires sont testés, ni combien de souris subissent chaque approche.
Objectifs
Ces expérimentations ont pour objectif d’évaluer les facteurs environnementaux régulant le microbiote intestinal, ainsi que de caractériser les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal peut conduire au développement de maladies inflammatoires chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal est régulé, et l’importance de ce dernier dans les maladies inflammatoires
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvement de sangs de 5 à 10µL par prélèvement sur animaux vigiles. Les animaux subiront 4 prélèvements uniques de sang pour une durée inférieure à 1 minute Les animaux subiront 3 prélèvements multiples de sang sur une durée de 2h, chacun de ces prélèvements multiples seront séparés d’au moins une semaine Les animaux subiront un maximum de 4 gavage oral d’un volume maximal de 200microL ? Ces gavages seront séparés d’au moins une semaine entre eux. Les animaux subiront un prélèvement unique de sang en fin de protocole
Impact sur les animaux
Certaines approches induiront une inflammation intestinale chronique et/ou un cancer colorectal chez les animaux. De plus, certains animaux développeront des dérégulations métaboliques, caractérisées notamment par une augmentation de la masse grasse. Les facteurs alimentaires étudiés, via leurs effets sur le microbiote intestinal, pourront favoriser la dysbiose intestinale de manière à promouvoir une inflammation intestinale chronique et/ou certaines dérégulations métaboliques légères. Aucun stress ni comportement anormal n’est anticipé. Ces nuisances attendues sont de sévérité modérée. Un stress et une potentielle douleur peuvent être liés aux prélèvements sanguins.
Devenir
A l’issue de toutes les procédures proposées, les animaux seront mis à mort afin de collecter les organes nécessaires à des analyses approfondies dans le but de répondre aux objectifs du projet.
Remplacement
Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment intestin/microbiote en lien avec le développement de pathologies inflammatoires chroniques.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 15 souris par condition et par sexe était nécessaire être utilisé afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les tests statistiques envisagés dans le cadre de ce projet l’ont été après avis recueilli auprès des biostatisticiens.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, un suivi étroit des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. Des points limites spécifiques et précoces sont définis pour chaque protocole. Dès l’apparition d’un signe clinique, différentes méthodes de raffinement seront appliquées pour éviter ou minimiser l’inconfort ou la douleur : utilisation de gel de réhydratation, réhydratation sous-cutanée, renforcement de l’enrichissement.
Choix des espèces
L’exploration de l’interaction du système immunitaire avec le microbiote nécessite un modèle flexible qui permette de manipuler chacun de ces domaines, de tester les causalités et de mesurer les paramètres moléculaires et cellulaires. En ce sens, le modèle souris est le plus adapté, car les outils permettant de manipuler et d’analyser le système immunitaire chez la souris sont les mieux développés parmi les mammifères. De plus, les connaissances acquises chez la souris permettent un transfert chez l’homme, du moins conceptuellement, et bien souvent en l’état. Les souris utilisées seront âgées de 3-8 semaines d’âge lors du démarrage des différentes procédures. Le microbiote intestinal se met en place dès les périodes précoces de la vie, et il est nécessaire pour nous d’utiliser de jeunes animaux afin d’étudier les facteurs environnementaux impactant la mise en place du microbiote.
Santé du juvénile de bar exposé à un scénario de réchauffement climatique d’acidification et de désoxygénation- etablissement n°1
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Jusqu'à 90 % de mortalité dans les bassins lors des épreuves infectieuses : 3 400 bars juvéniles vont être utilisés, dont 1 606 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les survivants étant tous tués pour analyses immunologiques. Pendant dix-huit mois, ils vivent dans une eau réchauffée puis acidifiée, appauvrie en oxygène à 60 % pendant trois semaines, avec une ration limitée à 60 % de ce qui est distribué en aquaculture. Chacun est pêché, sédaté, anesthésié, marqué par une puce implantée dans le muscle, pesé chaque mois et transféré entre bassins. L'infection expérimentale, bactérienne puis virale, provoque déformations de l'œil, lésions cutanées, nage anormale et léthargie, sur des poissons pesant trois grammes au départ, choisis à l'âge où les bars sauvages rejoignent les nourriceries côtières.
Objectifs
Plus de la moitié des espèces connues de poissons vivent en zone côtière ou estuarienne. Les nourriceries en milieu côtier dont dépendent l’accomplissement du cycle de vie et le renouvellement des populations sont, de ce fait, considérées comme des habitats essentiels. De plus, l'élevage des poissons s'effectue également principalement en zone côtière. Or, il est bien établi que les zones côtières et estuariennes sont les plus vulnérables face aux pressions combinées du changement climatique et notamment au réchauffement, à l'acidification et aux épisodes de désoxygénation des océans. Ainsi, la santé des poissons (sauvages ou d'élevage) présents dans ces zones, et notamment leurs capacités à croitre et à se défendre contre les pathologies dépendront de leur capacité à faire face à la combinaison de ces contraintes environnementales en milieu côtier. Les questions abordées dans le projet sont : 1) L’exposition à long terme de juvéniles de bar à des conditions environnementales (température, acidification, oxygénation) prédites à l’horizon 2100 va-t-elle modifier des paramètres physiologiques associés à la santé du poisson ? et 2) ces effets vont-ils modifier leurs performances de croissance, de survie, leur maturation sexuelle et leur résistance à une exposition à des pathogènes ? Ce projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs (EU) qui coupleront leurs expertises.
Bénéfices attendus
A court terme, les différentes analyses de performances et les caractérisations physiologiques réalisées au cours des différentes phases d’exposition donneront une vision globale de la capacité des poissons à faire face à une combinaison de facteurs environnementaux. A moyen terme, les données générées contribueront à déterminer des marqueurs d’exposition à ces différents facteurs environnementaux. Plus globalement, ce projet s’inscrit dans la volonté de mieux comprendre et prédire les interactions des poissons pêchés ou élevés avec leur environnement dans l’écosystème côtier et ainsi élaborer des politiques solides en matière de gestion des pêches et de l’aquaculture dans un contexte de changement global.
Procédures
De 3 à 5 mois, 50 poissons par bassin et par mois, aléatoirement pêchés, seront pesés (sous anesthésie, durée de la pesée par poisson: 1 minute). A partir du cinquième mois, tous les poissons (n=3400) seront pesés mensuellement après avoir été marqués individuellement par injection d'une puce électronique intramusculaire (sous anesthésie). Ces interventions nécessiteront la pêche des poissons. Afin de limiter le stress lié à la manipulation, les poissons pêchés seront sédatés dans leur bac puis anesthésiés. L'intervention de micro-injection n'excèdera pas 5 minutes (pêche, anesthésie, et injection comprises). La durée par poisson d'une intervention de pesée n'excèdera pas non plus 5 minutes. Des transferts entre bassins seront également effectués au cours du projet. Ces transferts se feront sous anesthésie en utilisant des bacs de transferts transitoires opaques et oxygénés. Les étapes de transfert n'excèderont pas 15 minutes. Les conditions de température et d'acidification, prises indépendamment les unes des autres ou en interaction représentent une nuisance légère durant les 15 premiers mois. A 16 mois, la moitié des poissons survivants (non mis à mort pour analyse post mortem) seront placés en niveau d'oxygénation de l'eau à 60% pendant 3 semaines. Nous supposons, sur la base d'études précédentes, que cette exposition représente une nuisance légère dans le contexte de l'élevage (absence de prédation; autres facteurs environnementaux contrôlés). Tous les éléments décrits précédemment seront réalisés dans l’EU n°1. Au début du 18ème mois, l'exposition expérimentale à des pathogènes, nécessaire pour évaluer le statut immunitaire des poissons, constitue une nuisance sévère. L'exposition durera entre 2 et 6 semaines. L’EU n°1 aura en charge un pathogène bactérien et l’EU n°2, vers qui sera transférée une partie des animaux, une bactérie et un virus. Les animaux seront alimentés pendant toute la durée du projet avec un aliment commercial d'élevage et seront rationnés au niveau alimentaire à 60% de ce qui est distribué en aquaculture afin de mieux calquer les réalités écologiques. Ce rationnement ne représente pas une nuisance car il permet aux poissons de croitre à un rythme moindre comparé aux conditions aquacoles standards où l'on vise à diminuer les durées d'élevage.
Impact sur les animaux
Un stress léger pourra intervenir lors de la manipulation des poissons pour estimer la prise de poids mensuelle. A raison d'1mn de stress par poisson pour chaque pesée, la durée de ce stress léger est estimée à 16 mn sur l'ensemble du projet ( x 16 mesures biométriques). Un stress léger pourra aussi intervenir lors du transfert des poissons dans les différents bassins ; au début de l’expérimentation et au cours des étapes d’hypoxie et des épreuves infectieuses avec les différents pathogènes. Pour les transferts intra-structure, la durée du transfert sous anesthésie n'excédera pas 5 minutes. Les lots de poissons qui seront exposés aux prétests et challenges avec les pathogènes viraux et de type vibrio seront transférés au sein du site, dans une structure située à 200 mètres. Le transfert durera 15 minutes et se fera sous anesthésie. Du fait de l' anesthésie, le stress associé aux transferts est léger; de plus, les caractéristiques physicochimiques (températures, pH, salinité) de l'eau des bacs avant et après transferts seront identiques. Les poissons seront alimentés 24h après transfert, délai nécessaire pour leur acclimatation à leur nouveau bassin. Les changements des caractéristiques physicochimiques de l'eau des bassins ne pourront s'effectuer que 48h après transfert. Les conditions abiotiques (température, pH, niveau d’oxygénation) prises indépendamment les unes des autres constituent des stress légers (18 mois) pour les facteurs température et pH ou modérés (3 semaines) pour l'hypoxie modérée. La contrainte hypoxique peut se traduire par une diminution de l’activité de nage des poissons traduisant une dépression métabolique. La durée de l’hypoxie (3 semaines) limite toutefois le risque de forte sévérité ; la mortalité devant être évitée lors de cette étape d’hypoxie, dans le cas contraire, le niveau d’hypoxie pourra être adapté. Un stress léger interviendra au moment des prises de sang (1mn par poisson). Les épreuves infectieuses virale et bactérienne constituent des stress très sévères puisqu’ils induisent l’apparition de signes cliniques (déformation de l'oeil, changement de couleur de robe, lésions cutanées, nage anormale, léthargie, déséquilibre, anorexie) et une mortalité sur les poissons (% de mortalité variable dans les bassins en fonction de la résistance des poissons mais pouvant aller jusqu’à 90%).
Devenir
A l'issue des challenges aux pathogènes, tous les poissons survivants seront mis à mort pour prélèvement et analyse de paramètres immunologiques
Remplacement
Cette étude vise à étudier l'effet de facteurs environnementaux (température, pH, oxygénation) sur l’état de santé du poisson. La caractérisation de ces effets se fait à l'échelle de l'organisme entier. Les méthodes de substitution telles que la culture cellulaire par exemple ne permettent pas de répondre à un questionnement physiologique dépendant de réponses complexes de différents tissus. Le maximum d’analyses sera réalisé au niveau de prélèvements sanguins, ce qui permettra dans le futur de trouver des marqueurs de l’état de santé du poisson. Les épreuves infectieuses sont à ce jour la seule possibilité d’évaluer et de prédire les capacités de résistance des poissons face à des agents pathogènes prévalents dans le milieu environnant (contexte écologique et aquacole); cette capacité de résistance dépend de nombreux facteurs, en particulier de différentes composantes du système immunitaire dans divers organes mais également (par exemple) du statut énergétique du poisson ou encore de son microbiote. Les données obtenues au cours du projet pourront permettre de développer dans le futur des marqueurs (au niveau sanguin et tissulaire) prédictifs des capacités de résistance des poissons face aux pathogènes.
Réduction
Le bar européen juvénile est un animal vivant en groupe et le nombre d'animaux par bac répond tout d'abord à cette contrainte. Le nombre de poissons tient donc compte de la densité minimale d’animaux requise pour permettre aux animaux d’exprimer les meilleurs répertoires physiologiques et comportementaux possibles, et permet donc de répondre à leur bien-être. De plus, le nombre de poissons a été réduit à son minimum et défini en fonction du nombre nécessaire pour réaliser la cinétique de prélèvements (à 6, 9 et 18 mois post-éclosion) ainsi que les épreuves infectieuses expérimentales. Ce nombre tient également compte des taux de mortalités communément observés au cours des 18 premiers mois de vie juvénile. Le nombre de prélèvements prévus a été déterminé en fonction du seuil de la pertinence scientifique et statistique. De même, le nombre de poissons prévus pour les épreuves infectieuses permet de réaliser une analyse statistique de résistance.
Raffinement
Pour la phase 2, les mesures de raffinement viseront à assurer des conditions optimales d’hébergement, à savoir, un volume d'eau adapté en circuit ouvert avec une oxygénation suffisante en fonction de la biomasse, un rythme jour/nuit naturel, la présence de suffisamment de congénères pour exprimer un répertoire comportemental riche, une distribution d’aliment adaptée. Une importance particulière sera donnée à l’observation des animaux, 1 fois/jour minimum (plus pour suivre l'évolution de poissons présentant des signes de stress). Les infections expérimentales bactériennes ou virales peuvent provoquer une mort rapide sans qu'il soit possible d'observer des symptômes cliniques. Toutefois, pour éviter toute souffrance, les animaux présentant un comportement de nage anormal marqué avec des périodes sur le flanc / sur le ventre et/ou des signes de détresse respiratoire avancée et/ou des hémorragies faciales / au niveau des flancs et/ou des signes nerveux seront mis à mort de manière compassionnelle avec une surdose d’anesthésique.
Choix des espèces
Le bar est une espèce de poisson marin d'intérêts halieutique, aquacole et écologique. La communauté scientifique s'intéresse à mieux prédire l'impact du changement global sur cette espèce. Les poissons sont des juvéniles (non matures sexuellement). Agés d’environ 3 mois, ils pèseront en moyenne 3 grammes au début de l’expérimentation. Ce stade de développement est particulièrement pertinent pour notre étude puisque c'est à ce stade de vie que les poissons regagnent les nourriceries côtières dans la nature et qu’ils sont donc plus exposés aux contraintes environnementales associées au changement global.
Impact du rythme circadien et des régimes alimentaires sur la susceptibilité à l’infection bactérienne
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une perte de poids de plus de 20 % ou un score de souffrance cumulé de 5 déclenche la mise à mort immédiate. 2 880 souris vont être utilisées, 1 440 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 440 un niveau sévère, toutes tuées pour prélèvements. Elles reçoivent des régimes riches en gras ou en sucre pendant huit semaines, subissent des gavages, des prélèvements fécaux hebdomadaires, des prises de sang répétées jusqu'à huit fois en deux heures, puis une infection par Salmonella Typhimurium. Le porteur précise qu'aucun analgésique ni antalgique ne pourra leur être administré, les anti-inflammatoires et les opiacés modifiant la réponse infectieuse qu'il cherche à mesurer.
Objectifs
Le rythme circadien, influencé par la photosensibilité et le comportement alimentaire, joue un rôle régulateur dans divers processus physiologiques, notamment au niveau intestinal. La barrière intestinale peut être fortement perturbée les régimes riches en graisses ou en sucres qui sont connus pour perturber l'horloge biologique. Il s'en suit une réaction en chaine qui conditionne la susceptibilité post-prandiale aux maladies infectieuses comme cela est observée chez les patients atteints d'obésité. En particulier, des études viennent de mettre en évidence que ces alimentations (dé)favorisent la colonisation par certaines bactéries commensales ayant la capacité de moduler la surveillance immunitaire et la résistance à la colonisation par des pathogènes. Dans ce contexte, un intérêt tout particulier de notre étude réside résolument dans notre capacité à documenter dans le détail la réponse anti-infectieuse post-prandiale en réponse à ces alimentations riches en graisses ou en sucres qui favorisent l'obésité. Nos résultats pourraient ainsi ouvrir aujourd'hui des pistes d'intérêt pour la recherche sur les graves complications du surpoids et de l'obésité.
Bénéfices attendus
L’utilisation d'agent infectieux permettra d’élucider les mécanismes favorisant ou limitant le pronostique de l’infection à Salmonella Typhimurium, en réponse à un régime hypercalorique. Cela permettra à plus long terme de proposer de meilleures approches thérapeutiques aux patients atteints de plusieurs comorbidité comme l’obésité.
Procédures
Prélèvements fécaux : sur animaux vigiles, ramassage dans la cage d’une durée 1 à 2 min par souris, de manière hebdomadaire. Prélèvements sanguins pour test glycémies et insulinémies : sur animal vigile, prise de sang d’une durée de 10 à 30 secondes, 8 mesures par test étalé sur 2h, 2 fois au cours de la vie de l’animal (1 de chaque). Prélèvements sanguins pour suivi métabolique : sur animal anesthésié, prise de sang unique d’une durée de 30 secondes, de manière hebdomadaire, pendant 8 semaines. Procédure de gavage pour colonisation microbienne et test de perméabilité intestinale : sur animaux vigiles maintenu par contention afin de ne pas les blesser et ajuster le geste de gavage à leur déglutition/respiration et à tout signe potentiel de douleur. Le gavage dure 4-5 secondes environ. 1 fois durant la vie de l'animal, 2 fois si greffe fécale en plus.
Impact sur les animaux
A) Les régimes riches en gras et/ou sucres sont susceptibles d’entraîner une prise de poids, affectant la mobilité. Mesures envisagées : Un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (moustaches, museau, yeux, pelage), une pesée des animaux hebdomadaires et avec un suivi de la consommation de nourriture et d'eau et de signe clinique mesurable (respiration, amorphe, diarrhée) seront effectués. En cas d’accès réduit à l’eau et à la nourriture, des biberons d’eau et des croquettes seront mis à dispositions à hauteur de souris. Il est à noter qu’aucune obésité morbide n’est attendu dans ce protocole. B) Les injections et prélèvements sanguins peuvent être douloureux. Mesures envisagées : Des seringues d’injection avec des gauges les plus élevés seront utilisées pour limiter la douleur. Les prélèvements seront espacés d’une semaine pour cicatrisation. Les cicatrices seront désinfectées. C) Les manipulations répétées peuvent induire du stress. Mesures envisagées : Les animaux seront manipulés par les mêmes expérimentateurs (formés et 2 max) quelques jours avant l’expérimentation pour adaptation et à heure régulière tout au long de l’expérience. Un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (moustaches, museau, yeux, pelage) et de signe clinique mesurable (respiration, amorphe, diarrhée) seront également effectués. D) Les effets de l’infection à Salmonella Typhimurium, comme la perte de poids et les modifications des selles et un risque de mortalité, peuvent être observés. Mesures envisagées : Les animaux seront observés quotidiennement par les expérimentateurs. Afin de limiter la souffrance des animaux, une grille de notation avec un score a été établie. Un score cumulé de 5 ou plus ou une perte de poids de plus de 20% entraînera l’euthanasie immédiate des animaux.
Devenir
Euthanasie des animaux nécessaires aux prélèvements et aux analyses
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour étudier le rythme circadien et son impact sur l’homéostasie des tissus et la flore intestinale. En effet, les relations entre l’apport alimentaire, le microbiote, la réponse immunitaire anti-infectieuse sont autant de facteurs s’adaptant aux différents moments de la journée, ne peuvent pas être reproduites dans d’autres systèmes tels que la culture in vitro ou ex vivo de cellules ou même d’organoïdes.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux avec une puissance statistique suffisante, des lots de 8 souris seront utilisés avec une charge infectieuse préalablement établie. Ce nombre est justifié sur la base d’expériences préliminaires montrant la variabilité inter-individuelle qui influence notamment la puissance des tests statistiques de comparaisons inter-groupes. Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront surveillés quotidiennement par des personnes formées avec un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (changement de comportement et perte de réponse comportementale au stimulus externe), de la nourriture et d'eau et de signe clinique mesurable (respiration...) sera réalisé. En parallèle, l’apparence physique externe de l’animal sera observée afin de déceler des signes de diarrhée, ainsi qu'un éventuel changement de comportement et perte de réponse comportementale au stimulus externe.
Raffinement
Les souris seront manipulées par des personnes formées (au maximum deux), notamment quelques jours précédant l’expérimentation, afin qu’elles s’habituent à l’expérimentateur et ainsi de réduire le stress. Les manipulations se feront à la même heure chaque jour, ceci afin d’établir une habitude pour les animaux. La manipulation des animaux se fera dans une salle de manipulation séparée de la salle d’hébergement. Les animaux seront hébergés au sein de la plateforme d’expérimentation et de haute technologie animale ou par défaut dans un des isolateurs de l’Institut Pasteur de Lille (eau et aliment standard ad libitum (ou restreint le jour ou la nuit selon les protocoles), cycle jour/nuit 12h/12h, 23 °C). Les animaux sont individualisés avec une boucle d’oreille par le fournisseur, et maintenus dans des cages de 4 à 5 individus, en portoirs ventilés (Etiquetage informatisé des cages individuelles). Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront observés quotidiennement à la recherche de signes classiques de souffrance par des personnes formées, avec un suivi de l’apparence physique externe de l’animal (moustaches, museau, yeux, pelage seront surveillés), d’un changement de comportement (perte de réponse comportementale au stimulus externe), une pesée des animaux et avec un suivi (en début et fin de journée) de la consommation de nourriture et d'eau et de signe clinique mesurable (respiration, amorphe, diarrhée, automutilation). Si une détérioration de l’état d’un animal est observée, une grille de notation sera réalisée. Si une perte de poids supérieure à 20 % survenait, les souris en souffrance seraient immédiatement mises à mort. Il est à noter qu’il ne pourra pas être utilisé d’analgésique ou d'antalgique, car ces traitements interfèrent avec la réponse inflammatoire intestinale et anti-infectieuse. En effet, les molécules anti-inflammatoires non stéroïdiens et les opiacés modifient la susceptibilité aux infections.
Choix des espèces
L'infection par les pathogènes murins que nous utilisons est permise en ayant recours au modèle animal ‘souris’ sous fond C57BL6/J. Nous utilisons cette espèce ainsi que ce fond génétique car les modèles KO que nous possédons sont sous fond C57BL6J. Les procédures commenceront entre 6 et 12 semaines d'âge des souris pour permettre à la composition du microbiote intestinal de se stabiliser et au système immunitaire d’être à maturité.. Les protocoles d'infection peuvent durer jusqu'à 3 semaines. L’induction de l’obésité par le régime durent jusqu’à 8 semaines.
Nouvelle approche thérapeutique par des nanoparticules siRNA-squaléne pour le traitement des neuropathies diabétiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Sept tests locomoteurs avant traitement, sept après, cinq injections intraveineuses sous anesthésie brève : 1 080 souris rendues diabétiques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées ensuite pour des analyses biochimiques et histologiques. Le traitement testé, des nanoparticules d'ARN interférents, cible les neuropathies diabétiques, complication invalidante qui n'a aujourd'hui aucun traitement efficace. Les souris du groupe diabète de type 2 sont génétiquement modifiées pour développer la maladie et le porteur les décrit comme sévèrement atteintes à 22 semaines, avec des troubles locomoteurs. Celles du groupe type 1 reçoivent une injection qui déclenche la maladie en sept à dix jours. Chaque test locomoteur est pourtant présenté comme n'engendrant aucun désagrément, alors que le projet entier relève d'un niveau de souffrance sévère.
Objectifs
Les neuropathies périphériques diabétiques sont une complication grave et invalidante du diabète, causant des dommages aux nerfs, ralentissant la transmission des signaux nerveux et provoquant une douleur excessive. Les patients risquent davantage d'avoir des ulcères du pied et des amputations. Il n'existe actuellement aucun traitement efficace. Cette étude cherche à développer une nouvelle thérapie qui réduit les niveaux d’expression de certaines protéines et molécules nuisibles en utilisant des petites molécules d'ARN appelées ARN interférents (siRNA). Les effets de cette réduction sur le comportement, les tissus et les cellules seront analysés chez des modèles murins diabétiques, avec l'espoir de trouver un nouveau traitement pour améliorer la vie des patients atteints de neuropathies diabétiques.
Bénéfices attendus
Par ce projet, nous espérons faire émerger de nouvelles pistes pour le traitement des neuropathies diabétiques dans le cadre d’un diabète de type 1 ou 2.
Procédures
Les injections seront administrées par voie intravéneuse en cinq fois : 2 fois par semaine pendant 2 semaines, et une dernière fois la dernière semaine. Chaque injection dure quelques secondes et sera réalisée sous anesthésie brève. Pour tester l'efficacité du traitement, les animaux seront soumis avant tout traitement et à la fin du traitement à sept tests locomoteurs. Chaque test dure moins d'une minute et n’engendre aucun désagrément pour l’animal. Les souris subiront 1 test locomoteur par jour. La vitesse de conduction neuronale sera réalisée avant et après traitement sous anesthésie gazeuse. L'enregistrement dure moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les souris diabétiques auront tendance à uriner beaucoup plus que leurs congénères. La cage sera beaucoup plus vite souillée et nécessitera un changement plus fréquent. Les souris atteintes de diabète de type 2 sont génétiquement modifiées pour être atteintes par la pathologie. Leurs premiers symptômes se déclarent à partir de 8 semaines, et sont sévèrement atteintes à 22 semaines ; engendrant des troubles locomoteurs. Les souris atteintes de diabète de type 1 reçoivent des injections intraveineuses d’une substance qui induit la pathologie. Leurs premiers symptômes se déclarent à partir de 7 à 10 jours après l’injection de la substance induisant le diabète. Ces souris développeront également une neuropathie progressive menant à des troubles locomoteurs. En ce qui concerne notre traitement, et en se basant sur nos expériences précédentes aucun effet indésirable n'a été souligné sur les animaux.
Devenir
Toutes les souris (1080) seront mises à mort pour les études biochimiques, histologiques, et histochimiques.
Remplacement
Les neuropathies diabétiques induisent un processus de démyélinisation complexe qui nécessite l’intervention de multiples acteurs cellulaires. Il en est de même pour le processus de myélinisation qui se mettra en place si notre traitement fonctionne comme attendu. Les procédures que nous souhaitons mener ne peuvent donc être modélisées in vitro.
Réduction
Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux nécessaire pour atteindre la puissance statistique suffisante pour l'analyse des altérations comportementales induites par la perturbation puis la réparation du système sensori-moteur. Nous soumettrons les données à un test statistique et comparerons les groupes d'animaux entre-eux.
Raffinement
Un suivi particulier du bien-être des animaux présentant un phénotype dommageable sera mis en place et une grille spécifique de prise en charge de la douleur sera utilisée pour définir des points limites adaptés au phénotype observé. Une prise en charge spécifique de la douleur due à la mesure de la vitesse de conduction nerveuse sera mise en place, basée sur l'injection en sous-cutanée puis l'inhalation de produits anesthésiques.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères au système métabolique et physiologique suffisamment proche de celui de l’Homme pour servir à la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques visant la gaine de myéline périphérique. Les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’efficacité du traitement sont très bien adaptées chez la souris. L’analyse comportementale ainsi que les techniques biochimiques et histologiques envisagées pour étudier le statut myélinique nous permettront d’apporter des réponses claires quant à l’effet du traitement aux siRNA contre les DPN (diabetic peripheral neuropathy en anglais ou neuropathie diabétique périphérique). De plus, l’étude du traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth par l’injection de NPs siRNA-squalène avait été menée sur des souris. Nous pourrons comparer nos résultats à ceux de cette étude pour mesurer l’efficacité de notre traitement. Pour le traitement du début de la neuropathie induite par le diabète de type 2 (DT2), les animaux de la seront utilisés à partir de 10 semaines soit 2 semaines après l’apparition du DT2. Ils devraient présenter un début de neuropathie. Pour le traitement du début de la neuropathie avancée induite par le DT2, les animaux seront utilisés à partir de 22 semaines car il est connu que la neuropathie sera à un stade avancé. Enfin, pour le traitement préventif de la neuropathie induite par le DT2, les animaux seront utilisés dès l’âge de 8 semaines, un âge où toutes les souris présenteront un DT2 mais pour lequel il n’y aura pas encore d’atteinte des nerfs périphériques. Pour le traitement des différents stades de la neuropathie (début, avancé, et préventif) induite par le diabète de type 1 (DT1), les animaux seront utilisés à l’âge de 8 semaines car il est connu que le processus de myélinisation des nerfs est parfaitement achevé à cet âge.
Etude du métabolisme d’un acide aminé, le tryptophane, par microdialyse cérébrale dans un modèle de syndrome de l’intestin irritable post-infectieux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Infectées par gavage avec un milliard de bactéries, puis trépanées pour recevoir un guide de microdialyse cimenté dans le crâne, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Chacune est manipulée 46 fois sur quatre mois, en plus des pesées quotidiennes, et subit deux fois par semaine pendant trois mois une perfusion cérébrale de deux heures, éveillée. L'objectif déclaré consiste à relier un dérèglement du métabolisme du tryptophane à l'hypersensibilité colique et aux troubles anxieux du syndrome de l'intestin irritable, pour identifier de futures cibles pharmacologiques. Le guide qui dépasse de cinq millimètres du crâne est décrit comme une "légère gêne" pouvant occasionner des grattages, alors que le même texte annonce une hypersensibilité colique et un comportement anxieux installés jusqu'à la fin des expériences.
Objectifs
L’hypersensibilité colique et les douleurs abdominales sont les principaux symptômes du syndrôme de l'intestin irritable (SII) mais s’accompagnent très fréquemment de comorbidités psychologiques. La prise en charge de ces symptômes en clinique est actuellement limitée. En effet, le manque d’efficacité des traitements disponibles rend le développement de nouveaux outils pharmacologiques nécessaire. Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes de ces symptômes afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, puis de tester de nouveaux médicaments agissant sur ces nouvelles cibles. La complexité de cette pathologie faisant intervenir plusieurs organes rend impossible l’utilisation in vitro d’un modèle cellulaire. Ainsi, afin de tester de nouvelles molécules dans des conditions mimant ces pathologies, il est indispensable de développer un modèle animal présentant des origines communes à ce qui est observé chez le patient et permettant donc de reproduire ces pathologies douloureuses. Le protocole s’orientera sur les mécanismes centraux impliqués dans l’initiation, le développement et le maintien d’une hypersensibilité viscérale d’origine colique (HSVC) ainsi que des comorbidités psychologiques (anxiété, dépression, troubles de la cognition) sur des modèles animaux de syndrome de l’intestin irritable post-infectieux (SII-PI). En effet, parmi les différents facteurs étiologiques suspectés dans la physiopathologie de ces atteintes intestinales, il a été observé, chez des patients présentant de sévères douleurs abdominales, des facteurs communs tels qu’un dérèglement du métabolisme du tryptophane pouvant être l’origine d’une HSVC ainsi que de comorbidités psychologiques. L’objectif de ce projet sera donc de clarifier le lien entre un désordre du métabolisme du tryptophane et le développement d’une HSVC et des comorbidités psychologiques afin de proposer de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement des symptômes.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes associés au SII afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettrait d’envisager une étude clinique. L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au SII et, in fine, à soulager les patients SII douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs et des comorbidités psychologiques chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.
Procédures
Les groupes "infectés" seront infectés une fois par un gavage de 0,2ml de suspension de bactérie dans du PBS à une concentration de 10E9 bactéries/souris. Les groupes "non-infectés" seront traités une fois par un gavage de 0,2mL de PBS pour ne pas induire un biais. Un prélèvement de fèces sera effectué à J3, 7, 10 et 16 post infection sur chaque souris pour évaluer l’état de colonisation du tractus digestif nécessitant une contention de 5 minutes maximum. Les souris recevront un traitement par gavage oral deux fois par jour à base de métabolites dérivés du métabolisme du tryptophane entre J16 et J23. Chaque gavage prendra au maximum 30 secondes. A la suite de la période post-infectieuse (J16) les animaux subiront une procédure chirurgicale prenant une heure environ permettant l’implantation du guide de microdialyse au niveau cérébral. Après 48h de récupération suite à la chirurgie, les animaux subiront des perfusions de liquide céphalorachidien artificiel d’environ 2h à travers une sonde de microdialyse permettant de récupérer 200µL de liquide céphalorachidien sur animaux vigiles de façon bihebdomadaire sur une période pouvant s’étendre jusqu’à 3 mois. De plus, les animaux seront pesés quotidiennement pour vérifier leur bien-être. Au total, les animaux seront manipulés 46 fois en plus des pesées quotidiennes sur une période de 4 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux seront pris en en contention lors de l’infection à J0 et lors de la récupération de fèces à J3, J7, J10 et J16 induisant un stress léger. L’infection par C. rodentium induira des symptômes associés au syndrome de l’intestin irritable post-infectieux tels qu’une hypersensibilité colique et un comportement anxieux en phase post-infectieuse et jusqu’à la fin des expérimentations. L’administration d’un traitement curatif par gavage intragastrique deux fois par jour sur 8 jours lors de la phase post-infectieuse nécessitera une contention quotidienne rapide des animaux. Pour la chirurgie stéréotaxique, les animaux seront pris en contention pour être anesthésiés par injection sous-cutanée de kétamine/xylazine, plus un mélange de lidocaine et buvipacaine en analgésique. Le crâne des animaux sera percé permettant l’implantation du guide en conditions stériles, la zone sera refermée par un ciment dentaire laissant dépasser le guide. Celui-ci dépasse d’environ 5mm du crâne des animaux et pourrait donc occasionner une légère gêne et des grattages. A la suite, les animaux seront stabulés individuellement permettant leur récupération optimale et minimisant le risque de déplacer le guide. Une douleur au niveau du site chirurgical pourra être observée chez les animaux mais ce phénomène sera étroitement surveillé et la douleur sera traitée par des injections de lidocaïne et buvipacaine pendant 2 jours minimum après la chirurgie. Si un animal montre des signes d’infection post opératoire, il sera traité ou retiré de l’expérimentation. Pour la microdialyse, les animaux seront habitués 30min dans des cages de microdialyse, permettant leur libre déplacement, équipé d’eau et de nourriture à volonté, ensuite, les animaux seront rapidement anesthésiés par anesthésie gazeuse pour l’introduction de la sonde de microdialyse au travers du guide implanté, habitués à nouveau 30min puis perfusés (2h environ). A la fin, une nouvelle anesthésie gazeuse aura lieu pour retirer la sonde de microdialyse du guide et les animaux seront remis dans leur cage d’origine. Cette perfusion de microdialyse sera répétée de façon bihebdomadaire sur une période de 3 mois pouvant entrainer un stress lié à la manipulation. Durant la phase infectieuse et suivant la chirurgie, une perte de poids (maximum 5% du poids initial) pourra être observée chez certains animaux. Un suivi quotidien du poids et de l'état général des animaux sera effectué.
Devenir
A l'issu de la procédures, les animaux seront mises à mort afin de réaliser des prélèvements d'organes.
Remplacement
Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de C. rodentium sur les variations du métabolisme du tryptophane au niveau cérébral. De plus, une étude comparant des données de métabolomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec C. rodentium. Ce type d’étude n’est concevable que chez l’animal. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Ce nombre d'animaux a été determiné par une approche statistique.
Raffinement
Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (week-end et jours fériés compris) voir deux ou trois fois par jour si l’état le nécessite par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. La douleur sera abrégée sans délai via l’administration d’antalgique dérivé de la morphine, ou si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20% sur 3 jours, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Les personnes qui manipuleront et observeront les souris sont expérimentées. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à l’espèce et qui respectent leur bien-être : densité animale, température, hygrométrie contrôlées, présence d’enrichissement, eau et nourriture à volonté. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs et aux manipulations.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par sa pertinence pour l’étude des pathologies intestinales in vivo ainsi que par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. De plus, la spécificité d’espèce de la souche bactérienne pathogène utilisée rend ce modèle encore plus approprié. Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (4-5 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.
Etude de l’effet préventif de la néoglucogenèse intestinale sur la plasticité neuronale de l’hypothalamus et le statut métabolique et énergétique chez la descendance née de mères avec un régime alimentaire déséquilibré. 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Les 64 mères nourries au régime hypercalorique sont tuées dès leurs petits sevrés, leur état prédiabétique rendant leur maintien en vie, écrit le porteur, non souhaitable. Ce second volet du même projet mobilise les mêmes 464 souris, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré, 96 reproducteurs étant gardés pour produire d'autres animaux transgéniques. Les mesures faites ici portent sur la composition corporelle sous contention et sur 48 heures en cage individuelle pour la dépense énergétique, après des prises de sang à la queue et des injections de glucose ou d'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement ne peut être employée, seule l'étude chez "l'animal entier" donnant accès à la complexité des mécanismes en jeu.
Objectifs
L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante qui ne peut être attribuée uniquement aux modifications individuelles du régime. Un développement anormal des régions du cerveau impliquées dans la régulation du poids, pourrait participer à l’apparition de ces pathologies. Le développement de ces régions prend place en période périnatale et est affecté par un environnement maternel obèse et/ou diabétique. Chez la souris, un régime maternel hypercalorique induit chez les descendants des altérations du développement du cerveau et du métabolisme énergétique. La production intestinale de glucose est capable de transmettre des signaux au cerveau en réponse à l’alimentation. La production intestinale de glucose est fortement induite dans les dix premiers jours suivants la naissance, puis décroit progressivement jusqu’au sevrage. La production intestinale de glucose pourrait donc moduler le développement du cerveau spécifiquement dans cette période. Chez l’adulte, l’activation de la production intestinale de glucose a des effets anti-diabète et anti-obésité. Notre hypothèse est qu’une activation de la production intestinale de glucose en période périnatale chez des souris nées de mères nourries avec un régime hypercalorique permettrait de contrecarrer les effets délétères de ce régime sur le métabolisme et le développement du cerveau. Pour vérifier cette hypothèse, nous comparerons les effets d’une activation de la production intestinale de glucose en période périnatale chez des petits nés de mères nourries en régime normal ou hypercalorique sur : 1/ le développement du cerveau, 2/ leur métabolisme à l’âge adulte. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU 1/2 et EU 2/2).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre les effets de programmation d’un régime maternel hypercalorique (induisant une légère résistance à l’insuline) sur le développement cérébral et sur le métabolisme de la descendance mâle et femelle et de déterminer si l’activation de la production intestinale de glucose peut être une cible nutritionnelle préventive efficace pour éviter et/ou limiter ces effets négatifs.
Procédures
176 souris mères subiront 5 prélèvements de sang à la queue pendant la période d’accouplement, de gestation et de lactation (de 30 secondes chacun) après 2h de jeûne. 48 souris mères subiront deux injections (une injection de glucose et une injection d’insuline, espacées d’une semaine) lors des tests servant à l’analyse métabolique. Après chaque injection, les souris auront 7 prélèvements d’une goutte de sang (durée de 3 secondes chacun) et un prélèvement de quelques dizaines de microlitres (30 secondes). Les tests seront réalisés à l’EU 1/2. Une mesure de la composition corporelle des 48 mères sera réalisée chez l’animal éveillé par un analyseur dédié. La mesure n’engendre pas de souffrance particulière, elle est rapide (2 minutes) et non invasive. La mesure de la dépense énergétique se fait, de manière non-invasive et sur 48 heures (mesure des échanges gazeux, de la prise alimentaire et hydrique et de l’activité spontanée). Ce suivi des mères depuis la période d’accouplement et jusqu’au sevrage permettra de caractériser leurs statuts hormonal et métabolique. Ces 2 mesures seront réalisées à l’EU 2/2. 256 souriceaux descendants subiront une biopsie de l’extrémité de la queue (inférieure à 1mm) à l’aide de ciseaux de microchirurgie, par un technicien expérimenté afin d’établir le génotype de l’animal (EU1/2). Parmi ces derniers, 64 souris subiront une chirurgie terminale suite à une injection d’analgésique et d’anesthésique (10 secondes chacune) afin de prélever les organes. Cette procédure servira aux analyses au niveau du cerveau (EU1/2). Les autres descendants (192 animaux) subiront 3 prélèvements de sang à la queue (30 secondes chacun) à 3, 5 et 11 semaines d’âge qui permettront le dosage des hormones régulant le taux de glucose sanguin et l’appétit (EU1/2). Ces animaux subiront 4 tests pour l’analyse de leur métabolisme glucidique qui évolue avec l’âge : 2 tests à 7 semaines d’âge puis 2 tests à 14 semaines. Les 2 tests, espacés d’une semaine sur les mêmes animaux, nécessitent deux injections. Après chaque injection, les souris auront 7 prélèvements d’une goutte de sang (3 secondes chacun) et un prélèvement plus important (30 secondes). De plus, dans des conditions identiques aux mères, leur métabolisme énergétique sera étudié par une mesure de composition corporelle chez l’animal éveillé (par un analyseur dédié sans engendrer de souffrance particulière, temps moyen de 2 minutes) et par la mesure de la dépense énergétique sur 48 heures (EU2/2).
Impact sur les animaux
Le régime hypercalorique entraine une prise de poids et une résistance à l’insuline (caractéristique d’un état prédiabétique) au bout de 8 semaines mais ne provoque pas de diabète avant 16 semaines. Les mères ainsi que les descendants qui subiront l’analyse métabolique recevront, lors de deux tests, une injection (soit de glucose ou d’insuline) réalisée par notre personnel qualifié, ce qui assurer la réussite de l’injection et limite les irritations. L’injection d’insuline est susceptible de causer une hypoglycémie. La mesure de la composition corporelle est réalisée sous contention et engendre donc un léger stress. La mesure de la dépense énergétique se fait dans des cages individuelles pendant 48 heures, ce qui peut engendrer un stress. Les nouveau-nés subiront une très petite biopsie du bout de la queue (moins de 1 mm) pour déterminer le génotype, qui sera réalisée entre 5 et 7 jours, en même temps que l’identification par tatouage de la première phalange, ce qui peut engendrer une légère douleur.
Devenir
Les 64 souriceaux seront mis à mort afin d’analyser le développement du cerveau. 48 mères et 192 descendants adultes (240 animaux en total) seront mis à mort afin de collecter les organes tels que le foie, les intestins et les reins permettant l’analyse en biologie moléculaire de la production de glucose par ces 3 organes. Les 96 animaux replacés (64 mères et 32 pères sous régime standard) serviront à produire d’autres animaux transgéniques pour l’établissement utilisateur EU 1/2. Les 64 mères ayant reçu un hypercalorique pendant 8 à 12 semaines développent un léger état prédiabétique qui peut s’aggraver à long terme. Leur maintien en vie dans ces conditions n’est donc pas souhaitable. Elles seront mises à mort une fois que leurs petits seront sevrés.
Remplacement
La production intestinale de glucose contrôle le cerveau via un relais nerveux. La détection, la transmission et l’intégration de ce signal sont réalisées par les connections nerveuses entre l’intestin et le cerveau. Ce projet nécessite de conserver ces communications inter-organes et sera donc réalisé in vivo dans des modèles de souris transgéniques surexprimant la production intestinale de glucose.
Réduction
Le nombre maximal d’animaux utilisés a été estimé à 464 souris sur une période de 5 ans. Le nombre de mères nécessaires par groupe a été calculé au plus juste afin d’optimiser les naissances, particulièrement pour obtenir une production suffisante à la formation de groupes bénéficiant d’un environnement maternel homogène, condition nécessaire pour les études de l’environnement périnatal. Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept : Soit au maximum 12 souris par groupe. Notre personnel qualifié, permet de standardiser nos expérimentations afin de diminuer les sources extérieures de variabilité. A la fin de chaque procédure, des analyses statistiques adéquates seront réalisées. Si aucune différence n’est observée entre les individus mâles et femelles, les données seront regroupées pour augmenter le nombre d’échantillons. Dans un objectif de réduction du nombre de femelles reproductrices, à 3 jours, les portées seront équilibrées à 6 ou 7 petits. Les petits excédents par mère seront « adoptés » par les mères ayant un nombre inférieur. Les souriceaux obtenus en surplus de la quantité requise pour les procédures de ce projet seront élevés dans l’établissement utilisateur et utilisés dans des protocoles expérimentaux ultérieurs. Enfin, cette étude sera réalisée chez des descendants défiés ou non à un régime hypercalorique à l’âge adulte. La réalisation du dernier lot du projet est conditionnée aux résultats des lots précédents et ne sera peut-être pas effectuée.
Raffinement
Les souris sont hébergées par groupes, en milieu enrichi (frisottis, maison en carton, coton). Elles sont surveillées quotidiennement, et pesées au moins 2 fois par semaine. Dans le cas de toute modification physique ou comportementale, la surveillance sera accentuée. Si l’animal ne parvient pas à se rétablir, la mise à mort est envisagée pour raison éthique. Pour raffiner les reproductions et les adoptions croisées, les femelles seront synchronisées pour leur reproduction, en ajoutant de la litière de mâle souillée dans leurs cages, avant le démarrage des accouplements. Lors des prélèvements de sang à la queue, l’incision du bout de la queue n’est réalisée qu’une seule fois après application d’un analgésique local. Lors de la prise de sang, l’animal est libre de ses mouvements sur la grille de la cage et n’a pas besoin d’être maintenu. Les souris seront transportées dans des cages de transport, placées dans un double sac fermé permettant de conserver le confinement et en véhicule climatisé, de l’établissement ½ vers l’établissement 2/2. La mesure de composition corporelle sera réalisée chez l’animal éveillé. A l’issue de la mesure, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine. La mesure de la composition corporelle est réalisée sous contention et engendre donc un léger stress. Pour éviter que celui-ci perturbe la mesure de dépense énergétique, un délai de 24h sera laissé avant son évaluation. Le système utilisé permet une mesure non-invasive des échanges gazeux respiratoires, de la prise alimentaire et hydrique et de l’activité spontanée des animaux. Afin d’habituer les souris aux conditions de mesure, elles seront placées dans les cages individuelles 24h en conservant une partie de leur litière et l’enrichissement utilisé dans leur cage d’hébergement. A la fin de la période d’enregistrement, les souris seront remises dans leur cage d’origine avec un enrichissement renforcé. Le stress de l’isolement semble très modéré car au vu des protocoles réalisés sur la plateforme, les animaux remis dans leur cage d’origine après les mesures ne présentent pas de troubles de comportement (bagarre, isolement).
Choix des espèces
Le rôle de la production endogène de glucose par le foie et l’intestin sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. De plus, seule une étude chez l’animal entier incluant la complexité des mécanismes physiologiques mis en jeu lors du développement de maladies métaboliques, peut permettre d’atteindre l’objectif de ce projet. Aucune méthode de remplacement ne peut donc être employée. Dans ce projet, nous étudierons l’impact de la production intestinale du glucose sur le développement cérébral qui prend place pendant les trois semaines qui suivent la naissance. Nous utiliserons donc des animaux au stade précoce (21 jours après la naissance). La résistance à l’insuline se développe avec l’âge chez les souris. Il est donc nécessaire d’avoir une analyse des paramètres biologiques des individus à plusieurs stades de la vie. Nous analyserons ces 2 paramètres à 7 semaines (période de puberté) ainsi qu’à 14 semaines d’âge (stade adulte). Dans ce projet, nous étudierons l’impact de la PIG sur le développement cérébral qui prend place en période périnatale chez des descendants de mères ayant un régime alimentaire déséquilibré. Les circuits alimentaires hypothalamiques continuent à se développer pendant la période postnatale chez les rongeurs. Les altérations qui prennent place durant cette période sont toujours visibles chez l’adulte. Nous utiliserons donc des animaux au stade précoce post-natal (21 jours après la naissance). La résistance à l’insuline se développe avec l’âge chez les souris C57BL6J. Il est donc nécessaire d’avoir une analyse des paramètres glycémiques et énergétiques des individus à plusieurs stades de la vie. Nous analyserons ces 2 paramètres à 7 semaines (période de puberté) ainsi qu’à 14 semaines d’âge (stade adulte).
Modèle nutritionnel de calculs biliaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime enrichi en cholestérol et en acide biliaire pour provoquer des calculs biliaires, elles reçoivent les composés testés une à deux fois par jour, par la bouche, sous la peau, dans l'abdomen ou dans la veine sous anesthésie, subissent huit prises de sang, parfois après quatre heures de jeûne, et passent 20 heures isolées sur grille en cage à métabolisme après 4, 8, 12 et 16 semaines de traitement. Le porteur reconnaît que la répétition des traitements "génère un stress chronique", pour des études qui doivent "valider ou non" des candidats contre les calculs et leurs complications au foie et à l'intestin. Une partie des souris porte une mutation, Mdr2 ko +/-, qui les prive d'un transporteur de phospholipides, et il dit la choisir pour "exacerber l'effet du régime lithogénique" et étudier des stades "plus avancés et plus sévères de la maladie".
Objectifs
La formation de calculs biliaires peut entrainer des dysfonctions biliaires, hépatiques et intestinales importantes, notamment une cholestase menant à une cholangite sclérosante et une inflammation sévère du foie qui peut elle-même entrainer un hépatocarcinome ou autrement appelé cancer du foie. Le but de ce projet est de modéliser ces dysfonctions en provoquant la formation de calculs biliaires et ainsi pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de valider ou non des traitements limitants le développement de calculs biliaires et donc l’apparition des complications hépatiques et intestinales associées.
Procédures
Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile. 8 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 4h maximum avant le prélèvement. Après 4, 8, 12 et 16 semaines de traitement, nous mesurerons divers paramètres urinaires et fécaux (récolte pendant 20h par l’intermédiaire de cages à métabolisme).
Impact sur les animaux
1) La mise sous régime lithogénique, enrichi en cholestérol et en acide biliaire, va accentuer la formation de calculs biliaires, notamment chez les souris Mdr2 ko +/-. 2)Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3) Les mises à jeun (4h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress. 4)Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 20h.
Devenir
Tous les animaux (1800 souris) seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno-marquages et expression de gènes, paramètres métaboliques...)
Remplacement
Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développés pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions associées à la formation de calculs biliaires notamment au niveau du foie et de l’intestin ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.
Réduction
Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. Une analyse statistique permettra d'utiliser le nombre minimal d'animaux tout en assurant la robustesse des résultats.
Raffinement
Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux. L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une rougeur ou plaies cutanées, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront.
Choix des espèces
La souris wild-type développe des calculs biliaires sous régime lithogénique entrainant des complications hépatiques et intestinales de façon modérée. La souris Mdr2 ko +/- (FVB.129P2-Abcb4tm1Bor/J heterozygous) est une souris génétiquement modifiée. Elle est dépourvue de transporteurs de phospholipides, ce qui engendre une accumulation de phospholipides dans le foie et une accumulation d’acides biliaires dans la circulation sanguine et dans la bile. En utilisant ce modèle génétiquement modifié et prône à développer des calculs biliaires, cela nous permet d’exacerber l’effet du régime lithogénique et donc d’étudier des stades plus avancés et plus sévères de la maladie. Les animaux sont mis sous régime à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à l’âge de maturité sexuelle.
Etude de l’effet préventif de la néoglucogenèse intestinale sur la plasticité neuronale de l’hypothalamus et le statut métabolique et énergétique chez la descendance née de mères avec un régime alimentaire déséquilibré. 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
464 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré, 304 tuées pour prélever cerveau, foie, intestins et reins, 96 gardées vivantes pour produire d'autres souris transgéniques. 176 mères subissent cinq prises de sang à la queue après deux heures de jeûne, 48 d'entre elles deux injections de glucose et d'insuline suivies chacune de huit prélèvements, puis 48 heures en cage individuelle pour mesurer leur dépense énergétique. 256 souriceaux subissent une biopsie de la queue et un tatouage de la première phalange entre cinq et sept jours, et 64 d'entre eux une chirurgie terminale. Le porteur affirme que seule une étude chez "l'animal entier" permet d'atteindre l'objectif et qu'aucune méthode de remplacement ne peut être employée, dans un projet dont le premier acte consiste à rendre des mères prédiabétiques par un régime hypercalorique.
Objectifs
L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante qui ne peut être attribuée uniquement aux modifications individuelles du régime. Un développement anormal des régions du cerveau impliquées dans la régulation du poids, pourrait participer à l’apparition de ces pathologies. Le développement de ces régions prend place en période périnatale et est affecté par un environnement maternel obèse et/ou diabétique. Chez la souris, un régime maternel hypercalorique induit chez les descendants des altérations du développement du cerveau et du métabolisme énergétique. La production intestinale de glucose est capable de transmettre des signaux au cerveau en réponse à l’alimentation. La production intestinale de glucose est fortement induite dans les dix premiers jours suivants la naissance, puis décroit progressivement jusqu’au sevrage. La production intestinale de glucose pourrait donc moduler le développement du cerveau spécifiquement dans cette période. Chez l’adulte, l’activation de la production intestinale de glucose a des effets anti-diabète et anti-obésité. Notre hypothèse est qu’une activation de la production intestinale de glucose en période périnatale chez des souris nées de mères nourries avec un régime hypercalorique permettrait de contrecarrer les effets délétères de ce régime sur le métabolisme et le développement du cerveau. Pour vérifier cette hypothèse, nous comparerons les effets d’une activation de la production intestinale de glucose en période périnatale chez des petits nés de mères nourries en régime normal ou hypercalorique sur : 1/ le développement du cerveau, 2/ leur métabolisme à l’âge adulte. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU 1/2 et EU 2/2).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre les effets de programmation d’un régime maternel hypercalorique (induisant une légère résistance à l’insuline) sur le développement cérébral et sur le métabolisme de la descendance mâle et femelle et de déterminer si l’activation de la production intestinale de glucose peut être une cible nutritionnelle préventive efficace pour éviter et/ou limiter ces effets négatifs.
Procédures
176 souris mères subiront 5 prélèvements de sang à la queue pendant la période d’accouplement, de gestation et de lactation (de 30 secondes chacun) après 2h de jeûne. 48 souris mères subiront deux injections (une injection de glucose et une injection d’insuline, espacées d’une semaine) lors des tests servant à l’analyse métabolique. Après chaque injection, les souris auront 7 prélèvements d’une goutte de sang (durée de 3 secondes chacun) et un prélèvement de quelques dizaines de microlitres (30 secondes). Les tests seront réalisés à l’EU 1/2. Une mesure de la composition corporelle des 48 mères sera réalisée chez l’animal éveillé par un analyseur dédié. La mesure n’engendre pas de souffrance particulière, elle est rapide (2 minutes) et non invasive. La mesure de la dépense énergétique se fait, de manière non-invasive et sur 48 heures (mesure des échanges gazeux, de la prise alimentaire et hydrique et de l’activité spontanée). Ce suivi des mères depuis la période d’accouplement et jusqu’au sevrage permettra de caractériser leurs statuts hormonal et métabolique. Ces 2 mesures seront réalisées à l’EU 2/2. 256 souriceaux descendants subiront une biopsie de l’extrémité de la queue (inférieure à 1mm) à l’aide de ciseaux de microchirurgie, par un technicien expérimenté afin d’établir le génotype de l’animal (EU1/2). Parmi ces derniers, 64 souris subiront une chirurgie terminale suite à une injection d’analgésique et d’anesthésique (10 secondes chacune) afin de prélever les organes. Cette procédure servira aux analyses au niveau du cerveau (EU1/2). Les autres descendants (192 animaux) subiront 3 prélèvements de sang à la queue (30 secondes chacun) à 3, 5 et 11 semaines d’âge qui permettront le dosage des hormones régulant le taux de glucose sanguin et l’appétit (EU1/2). Ces animaux subiront 4 tests pour l’analyse de leur métabolisme glucidique qui évolue avec l’âge : 2 tests à 7 semaines d’âge puis 2 tests à 14 semaines. Les 2 tests, espacés d’une semaine sur les mêmes animaux, nécessitent deux injections. Après chaque injection, les souris auront 7 prélèvements d’une goutte de sang (3 secondes chacun) et un prélèvement plus important (30 secondes). De plus, dans des conditions identiques aux mères, leur métabolisme énergétique sera étudié par une mesure de composition corporelle chez l’animal éveillé (par un analyseur dédié sans engendrer de souffrance particulière, temps moyen de 2 minutes) et par la mesure de la dépense énergétique sur 48 heures (EU2/2).
Impact sur les animaux
Le régime hypercalorique entraine une prise de poids et une résistance à l’insuline (caractéristique d’un état prédiabétique) au bout de 8 semaines mais ne provoque pas de diabète avant 16 semaines. Les mères ainsi que les descendants qui subiront l’analyse métabolique recevront, lors de deux tests, une injection (soit de glucose ou d’insuline) réalisée par notre personnel qualifié, ce qui assurer la réussite de l’injection et limite les irritations. L’injection d’insuline est susceptible de causer une hypoglycémie. La mesure de la composition corporelle est réalisée sous contention et engendre donc un léger stress. La mesure de la dépense énergétique se fait dans des cages individuelles pendant 48 heures, ce qui peut engendrer un stress. Les nouveau-nés subiront une très petite biopsie du bout de la queue (moins de 1 mm) pour déterminer le génotype, qui sera réalisée entre 5 et 7 jours, en même temps que l’identification par tatouage de la première phalange, ce qui peut engendrer une légère douleur.
Devenir
Les 64 souriceaux seront mis à mort afin d’analyser le développement du cerveau. 48 mères et 192 descendants adultes (240 animaux en total) seront mis à mort afin de collecter les organes tels que le foie, les intestins et les reins permettant l’analyse en biologie moléculaire de la production de glucose par ces 3 organes. Les 96 animaux replacés (64 mères et 32 pères sous régime standard) serviront à produire d’autres animaux transgéniques pour l’établissement utilisateur EU 1/2. Les 64 mères ayant reçu un hypercalorique pendant 8 à 12 semaines développent un léger état prédiabétique qui peut s’aggraver à long terme. Leur maintien en vie dans ces conditions n’est donc pas souhaitable. Elles seront mises à mort une fois que leurs petits seront sevrés.
Remplacement
La production intestinale de glucose contrôle le cerveau via un relais nerveux. La détection, la transmission et l’intégration de ce signal sont réalisées par les connections nerveuses entre l’intestin et le cerveau. Ce projet nécessite de conserver ces communications inter-organes et sera donc réalisé in vivo dans des modèles de souris transgéniques surexprimant la production intestinale de glucose.
Réduction
Le nombre maximal d’animaux utilisés a été estimé à 464 souris sur une période de 5 ans. Le nombre de mères nécessaires par groupe a été calculé au plus juste afin d’optimiser les naissances, particulièrement pour obtenir une production suffisante à la formation de groupes bénéficiant d’un environnement maternel homogène, condition nécessaire pour les études de l’environnement périnatal. Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept : Soit au maximum 12 souris par groupe. Notre personnel qualifié, permet de standardiser nos expérimentations afin de diminuer les sources extérieures de variabilité. A la fin de chaque procédure, des analyses statistiques adéquates seront réalisées. Si aucune différence n’est observée entre les individus mâles et femelles, les données seront regroupées pour augmenter le nombre d’échantillons. Dans un objectif de réduction du nombre de femelles reproductrices, à 3 jours, les portées seront équilibrées à 6 ou 7 petits. Les petits excédents par mère seront « adoptés » par les mères ayant un nombre inférieur. Les souriceaux obtenus en surplus de la quantité requise pour les procédures de ce projet seront élevés dans l’établissement utilisateur et utilisés dans des protocoles expérimentaux ultérieurs. Enfin, cette étude sera réalisée chez des descendants défiés ou non à un régime hypercalorique à l’âge adulte. La réalisation du dernier lot du projet est conditionnée aux résultats des lots précédents et ne sera peut-être pas effectuée.
Raffinement
Les souris sont hébergées par groupes, en milieu enrichi (frisottis, maison en carton, coton). Elles sont surveillées quotidiennement, et pesées au moins 2 fois par semaine. Dans le cas de toute modification physique ou comportementale, la surveillance sera accentuée. Si l’animal ne parvient pas à se rétablir, la mise à mort est envisagée pour raison éthique. Pour raffiner les reproductions et les adoptions croisées, les femelles seront synchronisées pour leur reproduction, en ajoutant de la litière de mâle souillée dans leurs cages, avant le démarrage des accouplements. Lors des prélèvements de sang à la queue, l’incision du bout de la queue n’est réalisée qu’une seule fois après application d’un analgésique local. Lors de la prise de sang, l’animal est libre de ses mouvements sur la grille de la cage et n’a pas besoin d’être maintenu. Les souris seront transportées dans des cages de transport, placées dans un double sac fermé permettant de conserver le confinement et en véhicule climatisé, de l’établissement 1/2 vers l’établissement 2/2. La mesure de composition corporelle sera réalisée chez l’animal éveillé. A l’issue de la mesure, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine. La mesure de la composition corporelle est réalisée sous contention et engendre donc un léger stress. Pour éviter que celui-ci perturbe la mesure de dépense énergétique, un délai de 24h sera laissé avant son évaluation. Le système utilisé permet une mesure non-invasive des échanges gazeux respiratoires, de la prise alimentaire et hydrique et de l’activité spontanée des animaux. Afin d’habituer les souris aux conditions de mesure, elles seront placées dans les cages individuelles 24h en conservant une partie de leur litière et l’enrichissement utilisé dans leur cage d’hébergement. A la fin de la période d’enregistrement, les souris seront remises dans leur cage d’origine avec un enrichissement renforcé. Le stress de l’isolement semble très modéré car au vu des protocoles réalisés sur la plateforme, les animaux remis dans leur cage d’origine après les mesures ne présentent pas de troubles de comportement (bagarre, isolement).
Choix des espèces
Le rôle de la production endogène de glucose par le foie et l’intestin sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. De plus, seule une étude chez l’animal entier incluant la complexité des mécanismes physiologiques mis en jeu lors du développement de maladies métaboliques, peut permettre d’atteindre l’objectif de ce projet. Aucune méthode de remplacement ne peut donc être employée. Dans ce projet, nous étudierons l’impact de la production intestinale du glucose sur le développement cérébral qui prend place pendant les trois semaines qui suivent la naissance. Nous utiliserons donc des animaux au stade précoce (21 jours après la naissance). La résistance à l’insuline se développe avec l’âge chez les souris. Il est donc nécessaire d’avoir une analyse des paramètres biologiques des individus à plusieurs stades de la vie. Nous analyserons ces 2 paramètres à 7 semaines (période de puberté) ainsi qu’à 14 semaines d’âge (stade adulte).
Étude du rôle d’une hormone du foie dans les différences entre les sexes en réponse à la malnutrition chez la souris juvénile
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Toutes tuées pour prélever leurs organes, 80 souris juvéniles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quarante d'entre elles reçoivent pendant cinq semaines un régime pauvre en protéines qui reproduit la malnutrition infantile. Chaque souris subit une biopsie du bout de la queue, cinq anesthésies pour la mesure de taille, un jeûne de six heures suivi d'un gavage de glucose, puis dix prélèvements de sang à la queue après incision et deux ponctions de 50 microlitres dans la veine sous-mandibulaire. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un "organisme dans son entier" en contexte de malnutrition, et conclut à la "nécessité" de l'expérimentation animale.
Objectifs
La malnutrition infantile est un problème majeur à travers le monde. Elle entraîne un retard de croissance, ainsi qu’un métabolisme altéré (problèmes de glycémie et de production d'insuline par exemple) chez les enfants. Des études récentes ont suggéré que la réponse à la malnutrition infantile pourrait être différente en fonction du sexe, les garçons étant plus susceptibles d'être malnutris que les filles. En accord avec cela, des études précédentes ont permis de montrer qu’un régime alimentaire mimant la malnutrition impactait différemment les souris juvéniles mâles et femelles. De plus, une hormone produite par le foie en réponse à un manque de protéines dans l’alimentation est différemment affectée par la malnutrition chez les mâles et les femelles juvéniles. Cela incite donc à comprendre plus précisément les mécanismes liés à ces différences entre les sexes dans la réponse à la malnutrition juvénile, et en particulier à explorer le rôle potentiel de cette hormone. En combinant l’utilisation de souris ne produisant pas cette hormone avec un modèle de régime alimentaire faible en protéines et induisant une malnutrition, l’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de cette hormone dans la réponse différentielle des mâles et des femelles à la malnutrition juvénile.
Bénéfices attendus
Les altérations physiologiques induites pas la malnutrition dans un contexte juvénile sont encore mal connues, de même que les différences entre les sexes dans ce contexte. Ce projet permettra d’élucider le rôle d’une hormone produite par le foie dans les adaptations physiologiques à la malnutrition juvénile, ainsi que dans la réponse différentielle entre les sexes. Cela permettra de comprendre comment optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition juvénile, et notamment d’adapter le traitement en fonction du sexe.
Procédures
8 lots de 10 souris seront utilisés dans cette procédure. 4 lots seront nourris avec un régime contrôle et 4 lots de souris seront soumis à un régime nutritionnel pauvre en protéines, mimant la malnutrition infantile, pendant 5 semaines. Tous les lots de souris seront mesurés chaque semaine sous anesthésie générale pendant 3 minutes puis pesés (< 1 min) pendant 5 semaines. Pour faire des analyses génétiques, toutes les souris auront un prélèvement d’une biopsie au bout de la queue sous anesthésie (3 minutes d’anesthésie, moins de 5 secondes de prélèvement). Dans le cadre d’un test métabolique, toutes les souris seront mises à jeun pendant 6 heures puis gavées avec du glucose, suite à une contention (environ 10 secondes). Elles auront ensuite une incision à la queue (environ 1 seconde) puis subiront 7 prélèvements à la queue d’environ 3 µL de sang (environ 5 secondes par prélèvement) et trois prélèvements additionnels à la queue d’environ 20 µL par prélèvement pour mesurer le taux d’insuline (environ 1 minute). A deux autres moments de la procédure, toutes les souris auront un prélèvement de 50 µL de sang en veine sous-mandibulaire sous anesthésie (3 minutes d’anesthésie, 30 secondes de prélèvement).
Impact sur les animaux
La biopsie du bout de la queue pour l’analyse génétique induira une douleur ainsi qu’un léger stress. La mesure de la taille des animaux (une fois par semaine pendant 5 semaines) n’induira qu’un léger stress lors de l’induction de l’anesthésie. Les pesées et la caractérisation de la maturation sexuelle induiront un léger stress associé à la contention de l’animal. Le jeûne de 6 heures induit un stress léger sur la souris. Le test de tolérance au glucose induira un stress modéré lié à la contention et au gavage des souris, ainsi qu'une douleur liée à l'incision d’un bout de queue d’environ 1 mm et au prélèvement de gouttes de sang au niveau de la queue. Le gavage des animaux ne devrait entraîner qu’un léger stress lié à la contention et un inconfort lors du gavage, ainsi que la possibilité d’irritation ou de fausse route. Les deux prélèvements de sang en veine sous-mandibulaire sous anesthésie générale induiront un stress modéré ainsi qu’une douleur.
Devenir
L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt.
Remplacement
Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires et à l’invalidation d’un gène, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition et pour l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Chaque groupe expérimental contient 10 animaux. Des tests statistiques seront utilisés. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Les mères, qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie et pourront être réutilisées.
Raffinement
La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine. Les animaux seront suivis du lundi au dimanche, du lundi au vendredi par les expérimentateurs habituels, et les week-ends par une astreinte formée et expérimentée. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Des points limites suffisamment prédictifs seront établis pour anticiper tout stress et toute souffrance animale. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental, et le test de tolérance au glucose oral ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. L’invalidation du gène étudié dans le foie a été décrit dans la littérature et n’entraîne pas de modification du bien-être animal (phénotype non délétère).
Choix des espèces
La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de sa physiologie, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin d’étudier l’effet d’une hormone dans une étude nutritionnelle. * L'objectif du projet est d'étudier les effets d’une invalidation d’un gène sur le métabolisme et la puberté pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé pour la croissance, la maturation sexuelle et la maturation métabolique.
Effets systémiques de l’infection broncho-pulmonaire chronique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Infectées par instillation directe dans la trachée sous anesthésie, 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles passent ensuite neuf à dix-sept fois en tube de contention pour une mesure de composition corporelle, et quatre à neuf tests de tolérance au glucose, chacun précédé de cinq heures sans nourriture et suivi de sept prélèvements de sang à la queue. L'objectif est de mesurer ce qu'une infection bronchique chronique de trente à quatre-vingt-dix jours fait aux os, aux muscles et au métabolisme du glucose. Le porteur écrit que la perte de poids n'excède jamais 5 % et que les souris reprennent une activité normale en deux jours, tout en indiquant que l'infection peut se compliquer du décès de l'animal dans moins de 5 % des cas.
Objectifs
Notre projet a pour but d’étudier les effets de l’infection bronchique chronique au niveau extra-pulmonaire. Les infections pulmonaires chroniques sont une complication fréquente des maladies bronchiques chroniques et ont un lourd impact pronostic. Elles sont responsables d’un déclin plus rapide et plus marqué de la fonction respiratoire et d’une augmentation du nombre d’exacerbations respiratoires (aggravation aigue de la maladie chronique). De plus, les maladies respiratoires chroniques s'accompagnent souvent de comorbidités ou de manifestations extra-respiratoires telles que l'ostéoporose, la perte de muscles, la dénutrition, le diabète, et les maladies cardiovasculaires. Le rôle de l’infection pulmonaire chronique dans la survenue de ces manifestations extra-respiratoires n’est à ce jour pas connu et n’a jamais fait l’objet d’études spécifiques dans le cadre de modèles animaux. Le modèle murin d’infection bronchopulmonaire chronique développé dans notre laboratoire est particulièrement adapté à la réalisation d'études longitudinales. L’objectif de ce projet est donc d’étudier les effets de l'infection bronchique chronique sur la composition corporelle et musculaire, l'architecture osseuse, l'inflammation sanguine, et le métabolisme du glucose.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à faire progresser les connaissances scientifiques afin de générer des bénéfices substantiels en santé humaine. Les infections pulmonaires chroniques, complications fréquentes des maladies bronchiques chroniques, ont un lourd impact sur la santé des patients et sont souvent associées à des comorbidités graves comme l'ostéoporose, la sarcopénie, la dénutrition, le diabète et les maladies cardiovasculaires. Cependant, le lien entre ces manifestations extra-respiratoires et les infections pulmonaires chroniques demeure largement inexploité scientifiquement, notamment dans les modèles animaux. Les bénéfices attendus de cette recherche sont multiples. Premièrement, elle permettra d'élucider les mécanismes reliant les infections bronchiques chroniques aux anomalies musculo-squelettiques et métaboliques, ainsi qu'à l'inflammation systémique. Ces connaissances pourraient conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter ou prévenir ces complications chez les patients atteints de maladies bronchiques chroniques. Une meilleure compréhension de l'interaction entre l'infection chronique et le métabolisme du glucose pourrait offrir des pistes pour des interventions visant à réduire le risque de diabète chez ces patients. Deuxièmement, cette étude pourrait modifier les pratiques cliniques en améliorant le suivi et la prise en charge des patients. L'identification de biomarqueurs spécifiques d'inflammation systémique et d'infection chronique permettrait une meilleure surveillance de la progression de la maladie et d'ajuster les traitements en conséquence, ralentissant ainsi la progression des comorbidités et améliorant la qualité de vie des patients. Enfin, ce projet a le potentiel d'enrichir la littérature scientifique en fournissant des données précises et inédites sur les effets systémiques des infections pulmonaires chroniques. En résumé, ce projet permettra d'approfondir notre compréhension des infections pulmonaires chroniques et de leurs effets systémiques, tout en fournissant des bases solides pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes, avec des bénéfices à long terme pour les patients et le système de santé.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions. Tout d'abord, ils seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) puis infectés par vvoie intra-trachéale directe. Cette intervention sera réalisée une fois pour chaque animal et devrait durer quelques minutes (anesthésie + infection). Des mesures de la composition corporelle des souris seront réalisées de manière répétée tout au long de l'étude (9, 13 ou 17 mesures selon le temps d’infection qui sera de 30, 60 ou 90 jours). Cette procédure implique la pesée des souris suivie d'une analyse par scanner à résonance magnétique nucléaire pour évaluer la masse grasse et la masse maigre de chaque animal. Le scan se fait en contention dans un tube adapté pour les rongeurs pendant 3 minutes (animal vigile). Enfin, seront effectués des tests métaboliques tels que l'IPGTT (test de tolérance au glucose intrapéritonéal). Pour évaluer les profils glycémique et insulinémique après une charge en glucose (IPGTT), les souris subiront une restriction alimentaire de 5 heures (de 9h à 14h), puis recevront du glucose en fonction de leur poids. Les mesures de glycémie seront prises à t=0’, 5’, 10’, 15’, 30’, 60’ et 120’ (prélèvement sanguin de 5 microlitres). Des prélèvements sanguins (environ 40 microlitres) seront effectués à t=0’, 15’, 30’ et 60’ pour doser l’insuline. La glycémie est mesurée en premier pour éviter tout impact de stress sur la valeur initiale. Durant tout le test, les animaux ont accès uniquement à l’eau, et la nourriture leur est remise à la fin du test. Les animaux sont laissés au repos pendant au moins une semaine entre chaque test. Ce test sera réalisé 4, 6 ou 9 fois sur chaque animal selon le temps d’infection (30, 60 ou 90 jours). Enfin, au terme de l'infection, les animaux seront mis à mort selon un protocole établi, impliquant une injection intrapéritonéale de d'anesthésiques et d'analgésiques.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux dans le cadre de ce projet sont : 1° Stress et inconfort liés aux manipulations : Les animaux seront soumis à des mesures régulières de poids et de composition corporelle, ainsi qu'à des prélèvements sanguins, ce qui peut causer du stress et de l'inconfort. 2° L'infection bronchique peut causer un stress initial (manipulation, anesthésie) et des difficultés respiratoires temporaires (résolutives en moins de 30 minutes suivant l'instillation généralement). Dans de rares cas (
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort au terme des différents temps expérimentaux.
Remplacement
Dans le domaine de la recherche en santé respiratoire, les alternatives non animales les plus fréquemment utilisées sont les modèles in vitro (cultures cellulaires) et les organoïdes. Ces méthodes présentent cependant des limitations significatives lorsqu’il s’agit d’étudier des systèmes complexes comme par exemple les réponses physiopathologiques mises en jeu au niveau systémique en réponse à une infection pulmonaire chronique. En effet, les modèles in vitro et les organoïdes ne permettent pas de reproduire de manière fidèle les interactions entre différents systèmes corporels ni de simuler l'inflammation systémique et les réponses immunitaires globales de l'organisme. Par conséquent, l'utilisation d'animaux vivants, en l'occurrence des modèles murins d'infection bronchopulmonaire chronique, est essentielle pour atteindre les objectifs de ce projet. Les souris offrent un modèle biologique pertinent en raison de leurs similarités physiologiques et immunologiques avec les humains, ce qui permet une évaluation détaillée et intégrée des effets systémiques des infections chroniques. Cela inclut l'étude des interactions entre l'infection pulmonaire et les réponses musculo-squelettiques, métaboliques et inflammatoires à l'échelle de l'organisme entier. En utilisant des modèles murins, nous pourrons obtenir des données précises et transposables, cruciales pour comprendre les mécanismes physiopathologiques et développer des stratégies thérapeutiques efficaces pour les patients. Enfin, les règles de l’éthique médicale ne nous permettent pas de réaliser ces études sur l’homme.
Réduction
Grâce à nos expériences passées sur des modèles animaux similaires, nous avons déterminé qu'un groupe de 8 animaux est généralement suffisant pour obtenir des résultats statistiques robustes. Toutefois, en raison de la variabilité inhérente à la qualité des instillations et du risque de décès par insuffisance respiratoire aiguë lors de ces procédures, nous avons décidé d'augmenter la taille des groupes à 10 souris. Cette approche a été validée par des études antérieures. Les autres mesures prises pour appliquer le principe de réduction ont été les suivantes : 1. Optimisation des techniques d’instillation : Nous avons raffiné et standardisé nos techniques d’instillation endotrachéale pour maximiser la consistance et minimiser les pertes animales. Une formation rigoureuse et continue des opérateurs est mise en place pour garantir la qualité des procédures. 2. Optimisation et maximisation du nombre et des types de prélèvement afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires aux différentes analyses du projet. 3. Analyse en temps réel : L’utilisation d’analyses statistiques en temps réel permettra d'arrêter l’expérience dès que les données suffisantes auront été recueillies, évitant l’utilisation de plus d'animaux que nécessaire. Analyses statistiques : • Études de survie : Les courbes de Kaplan-Meier seront utilisées pour analyser la survie des animaux, permettant une visualisation claire des différences potentielles entre les groupes. • Données quantitatives : Les données seront initialement analysées à l’aide du test de Kruskal-Wallis, qui est adapté aux échantillons non paramétriques et permet de détecter les différences globales entre les groupes. • Comparaisons multiples : Si le test de Kruskal-Wallis révèle une différence significative, des comparaisons multiples seront effectuées à l’aide du test de Dunns, pour identifier spécifiquement quelles paires de groupes diffèrent.
Raffinement
Toutes les procédures invasives seront effectuées par un expérimentateur entraîné. L’instillation des billes se fera sous anesthésie générale. Nous prévoyons une surveillance clinique quotidienne des animaux dans les 5 jours suivant l'instillation. Un score de douleur et de confort respiratoire sera établi en observant quotidiennement le comportement des animaux. Si nécessaire une analgésie sera mise en place ou si ce score est considéré comme trop important, l’animal sera mis à mort. Les souris seront hébergées à 5 par cages au maximum et du matériel d’enrichissement (nidification, jeux…) sera mis à disposition dans les cages. Elles bénéficieront d’une période d’adaptation minimale de 7 jours entre leur arrivée dans l’animalerie et le début des expérimentations. Tout animal présentant des signes de détresse respiratoire ou moribond sera mis à mort.
Choix des espèces
L'utilisation des souris dans ce projet présente plusieurs avantages significatifs. Leur petite taille facilite leur hébergement en animalerie, permettant de maintenir un grand nombre d'animaux dans un espace réduit tout en assurant leur bien-être. Les manipulations, y compris l'anesthésie, sont relativement simples à mettre en œuvre, ce qui minimise la souffrance et l'inconfort des animaux tout au long des procédures expérimentales. La physiopathologie de l'infection broncho-pulmonaire chronique chez la souris est remarquablement similaire à celle observée chez l'homme. Cette similitude permet une transposition pertinente des résultats aux conditions humaines, ce qui est crucial pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. De plus, notre modèle d’infection broncho-pulmonaire chronique chez la souris a été validé par la communauté scientifique, en particulier dans le cadre de la recherche sur la mucoviscidose (Martin et al., European Respiratory Journal, 2011). L'utilisation continue de ce modèle nous permettra de fournir des données novatrices sur les infections respiratoires chroniques et leurs effets systémiques. En résumé, les souris représentent un modèle idéal pour notre étude en raison de leur gestion pratique, de la simplicité des procédures expérimentales, et de leur pertinence biologique pour comprendre les mécanismes des infections broncho-pulmonaires chroniques et leurs comorbidités associées.