Système endocrinien
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Etude des effets du récépteur aux oestrogènes ERa membranaire dans les effets métaboliques et prolifératifs des oestrogènes
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Une souris qui montre des signes comportementaux de douleur importante est mise à mort. 672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 576 d'entre elles et léger pour 96. L'ablation des ovaires ou des testicules puis la pose d'un implant hormonal sous la peau concernent 576 souris, et 480 subissent sept prélèvements de sang à la queue à quinze minutes d'intervalle, à deux reprises. Le porteur affirme qu'il n'existe "aucune stratégie de remplacement" pour étudier l'action d'un récepteur aux œstrogènes sur le métabolisme et la prolifération cellulaire.
Objectifs
Les œstrogènes, et principalement le 17β-estradiol (E2), jouent un rôle crucial dans la physiologie de la reproduction. Leur administration après la ménopause confère aussi des bénéfices fonctionnels (symptômes du climatère), osseuse, cardiovasculaire et métabolique. Cependant, les effets des œstrogènes sur d’autres tissus (foie, sein) s’avèrent néfastes et une optimisation du Traitement Hormonal de la ménopause (HT) reste un enjeu majeur pour la santé de la femme. Le récepteur aux œstrogènes alpha (ERa), le principal récepteur des œstrogènes chez les mammifères, a des actions nucléaires et membranaires mais le rôle des actions membranaires restent inconnu dans la protection métabolique et les effets prolifératifs des oestrogènes. Ce projet a donc pour objectifs : 1) d'analyser les effets métaboliques des effets membrnaires de ERa ; 2) étudier le rôle des effets membranaires de ERa dans la prolifération utérine et mammaire. De plus, sachant qu'il existe deux mutants des effets membranaires de ERa présentant des phénotypes différents selon la dose d'oestrogènes utilisés, il est nécessaire de comparer ces deux mutants, ainsi que de tester différentes dose d'oestrogènes représentant les différentes doses physiologiques retrouvées au cours du cycle oestral.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de déterminer le rôle des effets membranaires de ERa dans la prolifération et la protection métabolique oestrogeno-dépendante, ce qui pourrait avoir un impact thérapeutique significatif dans le traitement de la ménopause. En effet, cette signalisation oestrogénique représente un levier thérapeutique relevant pour limiter, prévenir et/ou traiter les dysfonctions métaboliques ainsi que le développement de certains cancers hormono-dépendants chez les femmes menopausées. Ainsi le bénéfice attendu de ce projet est d'améliorer le rapport bénéfice/risque du Traitement Hormonal de la ménopause.
Procédures
Certains animaux seront soumis à des interventions de classes légère à modérée: - Chirurgie de classe modérée : ovariectomie (incision de la peau et du péritoine) (10 à 20min) = 576 animaux -Chirurgie de classe modérée : pose de pellet hormonal en sous cutanée (incision de la peau) (5 à 10min) = 576 animaux - Prélèvements d’une goutte de sang à la veine caudale (test de tolérance au glucose et à l'insuline réalisé à une semaine d'intervalle ): 7 gouttes de sang seront prélevées par procédure à 15 min d'intervalle = 480 animaux
Impact sur les animaux
Les expérimentations réalisées dans ce projet sont peu invasives indolores (pesée, régime riche en lipides) ou de classe légère et modérée (jeûne, ovariectomie, orchidectomie, pose de pellet). Elles peuvent être associées aux nuisances suivantes : - Le régime riche en lipides peut induire une prise de poids pouvant gêner les déplacements. - Les prélèvement à la veine caudale peut générer du stress et une douleur légère. - La mise à jeun de 6h peut entrainer du stress. - L’ovariectomie, l’orchidectomie et la pose de pellet ont pour effet attendu une douleur modérée liée aux effets de la chirurgie soulagée par des analgésiques et un stress modéré lié aux manipulations. Pour réduire le stress des animaux lié aux manipulations, toute manipulation sera réalisée dans un environnement calme, et par un manipulateur qualifié pour limiter la durée de chaque manipulation. La douleur ou l’inconfort de l’animal sera évalué : si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un morphinique sera administré à visée antalgique. Enfin, si des signes comportementaux indiquent une douleur ou un inconfort important, la souris sera mise à mort.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes et réaliser des analyses moléculaires.
Remplacement
Les effets multiples des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques des oestrogènes. Alors qu'une approche in vitro est utilisée pour définir les mécanismes moléculaires de ces signalisations, l'étude des effets physio(patho)logiques des oestrogènes ne peut pas être modéliser in vitro. Ainsi il n'y a donc aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles pour l'étude des traitements oestrogéniques car cette partie du projet rentre dans le cadre de la mise au point d’un traitement de la ménopause et s’applique donc uniquement au sexe féminin. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs e. Les études statistiques antérieures ont montré que des groupes de 12 animaux étaient requis pour obtenir une distribution normale des mesures sur des paramètres physiologiques.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton, sizzlenest, battons et balle de boie) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie sont adaptées. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis (décrits dans chaque procédure) sont quotidiennement surveillés permettant de mettre en application l'arbre décissionnel pouvant aboutir aux critères d'arrêt des souffrances. Cette décision sera prise par la personne en charge de la mise en oeuvre générale du projet dans l’EU et de sa conformité à l’autorisation de projet, en concertation avec la personne en charge du bien-être animal dans l’EU.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel a été générée l’invalidation génique du récepteur aux oestrogènes. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée après 8 semaines.
Propriétés antioxidantes et origines des macrophages des îlots pancréatiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
3 166 souris vont être utilisées, dont 40 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, les autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Régime riche en graisses pendant quatre ou douze semaines, jeûnes de six à seize heures, gavage, injections par quatre voies différentes, jusqu'à douze piqûres à la queue pour prélever une goutte de sang. L'injection d'insuline peut provoquer une perte de connaissance et des convulsions, celle de streptozotocine un diabète, et l'ensemble sert à comprendre le rôle des macrophages présents dans les îlots pancréatiques. Le porteur écrit avoir "besoin d'analyser l'organisme en entier" et conclut que les modèles animaux sont "indispensables", sur un projet dont la rubrique réduction tient en une phrase sans aucun chiffre.
Objectifs
Dans le pancréas, les îlots de Langherans sont centraux dans la régulation de la glycémie (taux de glucose dans le sang). Ces micro-organes ont pour fonction de produire les hormones permettant de réguler la glycémie, notamment l’insuline. Des cellules immunitaires sont également présentes dans les îlots et semblent contribuer au bon fonctionnement des cellules. Ces cellules possèdent d’importantes capacités antioxydantes qui pourraient réguler le fonctionnement des cellules des îlots. Dans ce projet, nous proposons donc d’étudier le rôle de ces propriétés antioxydantes dans les îlots pancréatiques en physiologie et lors de stress métabolique induite par un régime riche en graisses ou chimiquement. D’autres part, l’origine de ces cellules immunitaires n’est pas encore connue, nous allons donc explorer comment ces cellules s’accumulent dans les îlots pancréatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en lumière des données fondamentales sur l'origine et le rôle des propriétés antioxydantes des macrophages résidant dans les îlots pancréatiques à l'homéostasie ou lors du dévelopment de complications métaboliques liées à l'obésité.
Procédures
1 régime riche en graisses pendant 4 ou 12 semaines, 1 à 2 mises à jeun (6 ou 16h), 1 injection intra-péritonéale (20s), 1 gavage (20s), 1 injection sous-cutanée (20s), 1 injection intra-veineuse (30s), 1 anesthésie gazeuse (10min), 1 chirurgie terminale sans réveil, 5 à 12 prélèvements d’une goutte de sang à la queue (3s), 3 prélèvements de 25 uL de sang à la queue (30s).
Impact sur les animaux
• Injection ip : douleur modérée et localisée de courte durée • Injection sous-cutanée et rétro-orbitale: douleur modérée et localisée de courte durée (sous anesthésie) • Régime riche en graisse: prise de poids et diminution de la mobilité • Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim • Gavage : contention soutenue et introduction de la sonde • Injection d’insuline : baisse de la glycémie pouvant entrainer une perte de connaissance et des convulsions • Injection de streptozotocine : augmentation de la glycémie pouvant entraîner un diabète avec une polyurie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses.
Remplacement
Afin d'étudier les réponses du système immunitaire inné à des régimes alimentaires spéciaux (mimants les maladies induites par l'obésité), nous avons besoin d'analyser l'organisme en entier, reflétant ainsi les intéractions cellulaires et inter-organes. En effet, les régimes alimentaires vont provoquer des altérations au niveaux du tissu adipeux, du foie, du muscle et du pancréas. Nous ne pouvons pas donc étudier ces effets in vitro, les modèles animaux sont donc indispensables.
Réduction
Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales pour leur bien-être. De plus, lorsque cela est necessaire, nous avons prévu de recourir à des anethésies gazeuses ou avons mis en place des points limites adaptés.
Choix des espèces
La souris est le modèle de référence dans l’étude de l’obésité et du diabète. En effet, les gènes impliqués dans cette condition (dont les gènes de l’inflammation chronique) jusqu’à présent identifiés chez l’Homme sont conservés chez la souris. De nombreux outils sont disponibles sur le modèle murin et notamment la possibilité d’invalider un gène d'intérêt. Ce système permet, de façon très efficace, de cibler uniquement certains types cellulaires ou encore certain tissu. Dans notre projet, c'est la compilation de ces données issues des trois modèles de souris transgénique qui permettra une bonne compréhension des mécanismes mis en jeu en physiologie et au cours de l'obésité. Nous étudierons les souris au stade adulte. En effet, les souris seront étudiées à partir de 8 semaines, ce qui correspond à la maturité sexuelle des souris soit la stabilisation des hormones et de la différence entre les mâles et les femelles que nous explorerons dans cette étude. De plus à cet âge la maturation du système gastro-intestinal en lien avec le système immunitaire, largement étudié dans ce projet, a déjà eu lieu. Exceptionnellement, nous étudierons le nombre des cellules immunitaires dans les îlots pancréatiques en fonction de l'âge soit à 2, 4, 6, 8, 12, 24 et 48 semaines.
Étude de nouvelles cibles thérapeutiques dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin dans des modèles murins
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Colite provoquée par un produit dans l'eau de boisson, par sensibilisation de la peau suivie d'une administration rectale, ou par injections répétées pendant douze semaines : 6 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement d'organes entiers. Certaines lignées ont un système immunitaire déficient, ce qui les rend plus sensibles aux infections. La douleur liée à l'inflammation intestinale est estimée "légère à modérée au maximum", dans un texte qui décrit par ailleurs un risque de péritonite lié à la répétition des injections abdominales. Le porteur indique recourir en première intention aux organoïdes et aux systèmes d'intestin artificiel, puis conclut qu'un modèle animal est "totalement indispensable".
Objectifs
Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) sont caractérisées par une inflammation intestinale inappropriée. Elles représentent un fardeau majeur pour les populations occidentalisées. En effet, leur incidence et prévalence ont augmenté de façon spectaculaire au cours des dernières décennies. Les thérapies actuelles ne sont que partiellement efficaces et principalement basés sur des immunosuppresseurs (médicaments affaiblissant le système immunitaire). Celles-ci sont associés à des effets secondaires, notamment des infections et des cancers. Il est donc urgent de mieux comprendre leur origine et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons observé chez les patients atteint de MICI, une altération dans l’une des voies métaboliques qui est directement corrélé à l’inflammation. L'hypothèse principale du projet est de caractériser l'effet de cette enzyme dans les MICI afin de pouvoir développer l’enzyme humaine comme un candidat thérapeutique. Ces résultats ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements pour les MICI.
Bénéfices attendus
Ce projet représente un programme de recherche complet et ciblé sur le métabolisme dans le contexte de la santé et des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). En France, les MICI concernent aujourd’hui près de 300 000 personnes (données 2021). L'approche que nous proposons est complètement nouvelle et basée sur des découvertes concernant le rôle des certains métabolites dans les processus inflammatoires. Notre approche est basée sur la modulation de certaines voies métaboliques, perturbées dans les maladies inflammatoires, afin de restaurer la production normale de métabolites anti-inflammatoires tout en diminuant la production de métabolites pro-inflammatoires. Ce projet multidisciplinaire intègre plusieurs facettes de l'immunité et métabolisme. Les études décrites dans le projet devraient améliorer notre compréhension des mécanismes délétères impliqués dans les MICI tout en identifiant une nouvelle stratégie thérapeutique utilisable chez les patients.
Procédures
Certains modèles subiront un traitement préalable pour induire le modèle transgénique à raison d’une injection intrapéritonéale quotidienne sur animal vigile (moins de 10 secondes) pendant 5 jours consécutifs. Certains modèles animaux utilisés dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Par la suite, nous mettrons en œuvre les différents modèles de colites mimant les aspects des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Les souris pourront être suivre au choix selon les groupes et questions scientifiques : i) Une colite induite par traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) par jour pendant 7 jours à 12 jours. ii) Une colite induite par sensibilisation de la peau sous anesthésie (5 minutes) suivi d’une administration rectale sous anesthésie (5 minutes) et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) ou un gavage intragastrique (moins de 10 secondes) pendant 3 jours. iii) Une colite induite une injection intrapéritonéale de cellules (moins de 10 secondes) et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) au maximum une fois par jour pendant un maximum de 12 semaines. Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraiches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état métabolique des souris, les animaux subiront un prélèvent de sang de faible volume sur animal vigile par simple contention par une personne formé avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.
Impact sur les animaux
Le projet comprend différentes techniques d’administrations (gavages, injections intra-péritonéales) pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. La répétition des injections au niveau abdominal peut entrainer un risque de péritonite (très rare). Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraiches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient induire de nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons également des prélèvements sanguins de faible volume pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus. Dans ces modèles la douleur imposée aux animaux est liée à l’inflammation intestinale qui n'entraîne pas la mort de l'animal. On peut estimer que son intensité sera légère à modérée au maximum. Pour l’un des modèles de colite, une anesthésie est nécessaire et pourrait induire dans de rare cas, une mauvaise réaction (stress thermique, difficulté respiratoire, arrêt cardio-respiratoire). De plus, certains modèles utilisés dans le projet disposent d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensible aux infections
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.
Remplacement
Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèle non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. A l’heure actuelle il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu, un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.
Réduction
Ce projet impliquera donc un maximum de 6840 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux à trois fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Néanmoins nous ne répéterons l’expérience que si les résultats vont dans le sens de l’hypothèse de travail et que la puissance statistique n’est pas encore atteinte.
Raffinement
permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. De plus, les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.
Choix des espèces
Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris non transgéniques mais également des lignées murines simples, doubles et triples transgéniques (toutes sur le même fond génétique). Justification des stades : Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 6 et 12 semaines de vie. Cet âge est couramment utilisé dans la littérature pour les modèles de colites. Justification du sexe : Nous utiliserons des mâles et femelles selon les productions en interne car nous étudierons les deux sexes qui sont relevant pour la pathologie en question.
IODEM : Impact Synergique de la Carence Iodée et des Perturbateurs Endocriniens sur le Développement Neurocognitif de la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Exposées à un mélange de quinze perturbateurs endocriniens et à une carence en iode avant l'accouplement, pendant la gestation puis pendant l'allaitement, 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les mères subissent une ponction sanguine rétro-orbitaire sur animal vigile, geste dont le porteur reconnaît le risque de douleur, d'infection et de saignement. Les 192 souriceaux nés de ces couples sont exposés par le lait maternel, puis tués à trois semaines ou à deux mois pour prélèvement des tissus. Trois tests comportementaux sont annoncés pour évaluer l'odorat, la mémoire et le stress, décrits seulement comme reposant sur l'exploration spontanée, sans qu'aucun ne soit nommé.
Objectifs
Ce projet vise à étudier les effets à court et à long termes sur les molécules, les cellules et le comportement de l'exposition à un mélange de 15 perturbateurs endocriniens (PE) pendant la gestation en situation de carence iodée. Ces perturbateurs sont connus pour affecter les voies thyroïdiennes (essentielles au bon développement et fonctionnement du cerveau) et le développement neurologique du fœtus, surtout lorsqu'ils sont combinés à une légère carence en iode. Même si de l’iode est ajouté au sel depuis les années 70 pour combattre la carence en iode, celle-ci reste fréquente en Europe pendant la grossesse. L’objectif de ce projet est de recréer en laboratoire deux conditions environnementales courantes chez les femmes enceintes en Europe aujourd'hui : l'exposition de couples reproducteurs à un mélange de perturbateurs endocriniens et une carence modérée en iode. Pour ce faire, dans la procédure 1 nous validerons une méthode pour créer une carence en iode modérée chez des souris adultes (n=36) en 2 semaines. Dans la procédure 2, nous allons exposer des souris adultes mâles (n=20) et femelles (n=48) à un mélange de 15 perturbateurs endocriniens souvent retrouvés dans le liquide amniotique des femmes enceintes, en présence ou en l'absence d'une carence modérée en iode. Cela nous permettra d'étudier les effets à court et long terme sur les souriceaux exposés dès leur développement embryonnaire jusqu'à leur sevrage (via le lait des mères) dans la procédure 3. On aura quatre groupes d’exposition : contrôle (sans carence iodée ni PE), carence en iode modérée seule, mélange de PE seul et effet combinée de la carence en iode et du mélange de PE. Pendant la période de traitement, nous prévoyons de mesurer les niveaux d'hormones thyroïdiennes et d'iode. De plus, nous effectuerons des tests comportementaux sur la progéniture pour évaluer les effets du traitement (2 mois post natal) sur leurs fonctions cognitives (odorat, mémoire et stress). Nous prévoyons également de collecter les organes qui pourraient être affectés par le traitement, tels que le cerveau et la thyroïde, afin d'analyser le développement des cellules du cerveau et l'expression de certains gènes d'intérêt. Le nombre d’animaux dans la procédure 3 s’élève ainsi à 192 (48 souris/group = 12 femelles et 12 mâles dans deux âges : 3 semaines et 2 mois). Au total, 296 souris seront donc utilisées dans ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet a un double bénéfice attendu : d’une part, celui de caractériser les effets d’un facteur aggravant (carence iodée modérée) dans un contexte d’exposition à des perturbateurs endocriniens pendant la gestation et d’autre part de renforcer les données scientifiques sur les effets néfastes des polluants ayant des propriétés de perturbateurs endocriniens/thyroïdiens sur la santé. L’expérimentation sur un modèle mammifère permettra de proposer un modèle au plus proche de la gestation humaine et de faire progresser les connaissances sur l’impact de 2 facteurs présents de façon habituelle dans la vie des femmes enceintes en Europe : carence modérée en iode d’une part et exposition aux perturbateurs endocriniens de l’autre. Cela permettra de renforcer les politiques de prévention des troubles du neurodéveloppement actuellement en augmentation de façon préoccupante en accompagnant les femmes enceintes afin d’éviter toute carence iodée pendant la grossesse et en particulier la phase précoce, et les aider à limiter leur exposition aux perturbateurs endocriniens.
Procédures
Une fois pendant la gestation, chez les mères, une ponction sanguine sera effectuée après anesthésie locale par gel, afin de doser les taux de hormones thyroïdiennes et d’iode et évaluer l’effet des traitements. La procédure de prélèvement dure environ 1 minute par souris. Les reproducteurs seront exposés 2 semaines avant accouplement, pendant accouplement et pour les femelles pendant la gestation (3 semaines) et lactation (3 semaines) Trois tests du comportement, qui se basent sur l’exploration spontanée des souris, sont envisagés dans ce projet. La durée des tests sont 5 min, 1h, quatre fois 8 min et trois fois 10 min pour une souris, un test du comportement par jour pendant cinq jours. Les souris issues des reproducteurs traités seront euthanasiées à la fin de l'expérience pour la collection de tissus à l’âge de 21 jours et 2 mois.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins en rétro-orbital causent un risque de douleur, infection et saignement. En plus, les animaux risquent être stressés car prélèvements sont faits sur animale vigile. Les tests de comportement peuvent également causer de stress aux souris.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour la collection des tissus, ils ne peuvent donc pas être utilisés pour une autre étude expérimentale.
Remplacement
Pour comprendre les troubles du développement du cerveau et de la thyroïde pendant la grossesse et l'enfance, nous devons utiliser des modèles animaux dans notre recherche. Ces modèles nous aident à étudier comment différents facteurs, comme les hormones thyroïdiennes, l'iode et les produits chimiques perturbateurs endocriniens, affectent le développement du cerveau. Le développement du cerveau est très complexe et dépend de nombreux facteurs. Il est difficile de reproduire cette complexité en laboratoire, car il y a de nombreuses cellules et de processus impliqués. De plus, certains produits chimiques perturbateurs endocriniens peuvent agir comme des hormones et avoir des effets similaires, donc nous devons étudier ces effets dans un organisme complet pour les comprendre pleinement. Il est également important de tenir compte du sexe des animaux dans nos expériences, car nous savons que les réponses aux perturbateurs endocriniens peuvent varier selon le sexe. Nous devons donc analyser les résultats en fonction du sexe pour chaque expérience que nous menons.
Réduction
Le projet impliquera un total de 296 animaux : 36 animaux (6 femelles et 6 mâles par groupe) pour établir la carence d’iode modérée, 68 pour les animaux reproducteurs (48 femelles et 20 mâles) afin de produire 192 souriceaux répartis entre 4 groupes expérimentaux (48 souriceaux /groupe, 2 sexes, 2 âges = 3 semaines et 2 mois) : contrôle, carence modérée en iode seule, mélange de PE seul et effet combiné de la carence en iode et le mélange de PE. Les effets hormonaux varient dans les 2 sexes, raison pour laquelle il est nécessaire d’étudier autant de mâles que de femelles. De plus, compte tenu de la variabilité individuelle, un nombre d’animaux plus faible ne permettrait pas de déterminer avec précision si le traitement a eu l’effet escompté et serait donc dommageable dans l'exploitation de nos données.
Raffinement
Pour garantir le bien-être des animaux tout au long de notre étude, nous avons mis en place des procédures qui limitent la douleur et le stress. Les conditions de vie des animaux respectent les réglementations, avec accès à de la nourriture et de l'eau à volonté. Nous enrichissons leur environnement avec du coton et des nids en carton, car nous évitons l'utilisation de matériaux plastiques en raison de notre recherche sur les perturbateurs endocriniens. Nous surveillons attentivement les signes de détresse chez les animaux, tels que la prostration, la diminution de la consommation alimentaire, les comportements inhabituels comme l'irritation ou l'agitation. Si un animal montre des signes de détresse significatifs, il sera retiré de l'étude et éventuellement euthanasié pour éviter toute souffrance inutile. Nous veillons également à enrichir l'environnement des animaux avec des matériaux à ronger pour les aider à exprimer leur comportement naturel. En résumé, notre priorité est le bien-être des animaux tout au long de notre étude, et nous prenons des mesures pour garantir leur confort et leur santé.
Choix des espèces
Le modèle biologique choisi est la souris (Mus musculus). La souris est l’espèce animale la plus étudiée en expérimentation animale. Les connaissances accumulées par la communauté scientifique ont ainsi permis d’identifier de nombreux mécanismes physiologiques et comportementaux impliqués dans le fonctionnement des voies thyroïdiennes et de leur potentielle perturbation suite à une exposition à un mélange de substances chimiques perturbateurs endocriniens ou bien à une carence iodée. Tous les protocoles utilisés dans ce projet de recherche ont été optimisés et validés pour la souris, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. Les expériences porteront sur des souris adultes âgées de 3 mois afin de simuler la situation de carence iodée et l’exposition au mélange de 15 perturbateurs endocriniens. Les couples reproducteurs seront ainsi exposés 15 jours avant l’accouplement, puis les femelles gestantes seront exposées pendant la gestation et la lactation. Les effets des traitements sur la descendance, exposée de façon indirecte via la mère, seront évalués à court terme à 21 jours de vie ou à long terme à l’âge de 2 mois.
Voies de synthèse d’un agent majeur du métabolisme énergétique, le nicotinamide adenine dinucléotide (NAD), au cours de l’insuffisance rénale : modulation et interventions thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Un rein retiré et le pédicule vasculaire de l'autre serré par un clamp, ou les deux pédicules bloqués pendant vingt-cinq minutes : 590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. S'y ajoutent une perfusion intraveineuse de cinq heures sous anesthésie pour une partie des animaux, des prélèvements d'urine répétés par massage abdominal et une mesure de filtration rénale demandant deux anesthésies séparées de deux heures. L'insuffisance rénale ainsi provoquée entraîne douleur, perte de poids et déshydratation, atteintes que le porteur décrit comme impossibles à éviter complètement puisque l'induction de la maladie est "absolument indispensable" au projet. Sur le remplacement, il indique que les organoïdes de rein existants n'ont pas de vascularisation et ne permettent donc pas de mesurer une fonction rénale.
Objectifs
L'insuffisance rénale aiguë correspond à un déclin soudain de la fonction rénale, survenant chez 10% des patients hospitalisés et 50% des patients en réanimation. Un épisode d'insuffisance rénale aiguë est un facteur de risque pour le développement d'une maladie rénale chronique, qui représente un fardeau majeur pour les soins de santé. Il n’existe actuellement aucun traitement de l'insuffisance rénale aiguë. La production d'énergie par les cellules rénales est fortement perturbée pendant une insuffisance rénale aiguë. Des études ont notamment décrit un blocage de la synthèse de NAD (Nicotinamide Adénine Dinucléotide) à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l'alimentation. La supplémentation en vitamine B3 permet de restaurer la production de NAD et de limiter les conséquences d'une insuffisance rénale aiguë. Ces résultats sont très prometteurs mais, avant une application en clinique, il reste beaucoup de questions, qui constituent nos objectifs : - existe-t-il une corrélation entre la sévérité de l'insuffisance rénale aiguë et l'atteinte de la synthèse de NAD ?. - quelle est l'évolution de la synthèse de NAD après insuffisance rénale aiguë ? Les résultats publiés ne portent que sur la phase aiguë, précoce. Il faut maintenant compléter ces études en caractérisant l'évolution de cette synthèse la phase de récupération et la phase de transition vers la maladie rénale chronique. - la vitamine B3 est-elle bénéfique lorsqu'elle est administrée après la survenue de l'insuffisance rénale aiguë ? Les études publiées ont uniquement rapporté le bénéfice d'une administration commencée avant l'insuffisance rénale aiguë . Il faut maintenant déterminer si la vitamine B3 est efficace après la survenue de l'insuffisance rénale aiguë. Au cours de ce projet, nous caractériserons également l'évolution du rapport de deux molécules impliquées dans la synthèse de NAD, à savoir le rapport quinolinate/tryptophane. Ce rapport varie très tôt pendant l'insuffisance rénale aiguë, beaucoup plus tôt que les tests utilisés actuellement pour diagnostiquer une insuffisance rénale aiguë. La caractérisation de son évolution pendant les différentes étapes menant de l'insuffisance rénale aiguë à la maladie rénale chronique nous permettra de déterminer si ce rapport peut avoir un intérêt diagnostique et pronostique.
Bénéfices attendus
Il n'existe actuellement aucun traitement spécifique de l'insuffisance rénale aigue. L'administration de vitamine B3 est particulièrement prometteuse. Le projet décrit ici doit nous permettre de définir quand doit être administré ce traitement dans le contexte de l'insuffisance rénale aiguë et de sa transition vers la maladie rénale chronique. Le deuxième objectif du travail est la caractérisation d'un outil (le rapport quinolinate/tryptophane) diagnostique et/ou pronostique précoce de l'insuffisance rénale aiguë et de sa transition vers la maladie rénale chronique, qui manque aujourd'hui. Cet outil pourrait également permettre de déterminer le moment et le temps pendant lequel il faut administrer la vitamine B3. Ensemble, ces deux aspects du projet permettront de limiter l'administration de vitamine B3 à la période strictement nécessaire, réduisant ainsi non seulement le risque d'effets secondaires connus, comme la toxicité vis-à-vis du foie, mais également les effets nocifs potentiels sur le rein d'une activation à long terme de la production de NAD (Nicotinamide Adénine Dinucléotide) dans la phase de réparation après insuffisance rénale aigue ou lors de la transition vers la maladie rénale chronique.
Procédures
(1) Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à exciser le rein droit et à poser un clamp autour du pédicule vasculaire rénal gauche Cette chirurgie dure entre 20 et 30 minutes. (2) Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à clamper les deux pédicules vasculaires rénaux pendant 25 minutes. Ce protocole dure 45 minutes (exposition puis pose des clamps sur les pédicules, ischémie et sutures). (3) Une partie des animaux sera soumise à la mesure du débit de filtration glomérulaire qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter par voie intra-veineuse le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure 5 minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire 2h plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que 2 minutes. (4) Tous les animaux recevront au moins une injection intrapéritonéale. Cette procédure, effectuée sur animal vigile, dure moins d'une minute. (5) Une partie des animaux sera soumise à une perfusion intra-veineuse pendant 5h sous anesthésie gazeuse. (6) Des prélèvements de 50 microlitres d'urine seront effectués avant la chirurgie et à plusieurs temps après la chirurgie (miction spontanée ou léger massage abdominal). La durée de cette procédure, effectuée sur animal vigile, est de 1-2 minutes. Tous les animaux y seront soumis. (7) Tous les animaux seront soumis prélèvement sanguin effectué sous anesthésie suivi de l’euthanasie des animaux par une méthode réglementaire. Toutes les procédures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale associée à une analgésie. Un traitement analgésique sera également appliqué toutes les 6-8h après chirurgie pendant 48 heures.
Impact sur les animaux
La chirurgie et l'induction d'une insuffisance rénale aigue provoquent une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : (1) douleur provoquée par la procédure chirurgicale nécessaire pour la néphrectomie et la pose du clamp vasculaire (ouverture des plans cutané et musculaire, sutures); (2) complications liées à l'anesthésie (détresse respiratoire, stress thermique); (3) altération de l'état général : perte de poids, déshydratation; (4) stress induit par les manipulations quotidiennes. Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Elles ne peuvent pas être complètement évitées car l'induction d'une insuffisance rénale est absolument indispensable pour le projet.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Des prélèvements et analyses sont en effet nécessaires post-mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Le rein est un organe complexe, composé de plusieurs types de cellules chargés chacun d'une mission spécifique, qu'il est actuellement difficile de reconstituer en dehors d'un organisme vivant. Si des équipes ont décrit la génération d'organoïdes ("organes dans une boîte") rénaux, elles n'ont pour l'instant pas réussi à mettre en place un système de vascularisation, indispensable pour reproduire fidèlement la situation de l'organisme. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet thérapeutique de la vitamine B3 est l'amélioration de la fonction rénale, qui ne peut pas être mesurée sur un organe sans circulation sanguine. Enfin, le foie joue un rôle crucial dans la synthèse et le métabolisme du NAD (Nicotinamide Adénine Dinucléotide), une des sources d'énergie que nous étudions. Il est donc essentiel pour notre étude que l'interaction entre le foie et le rein soit présente.
Réduction
Le nombre total d'animaux que nous prévoyons d'utiliser est 590. Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité qui existe entre individu dans les deux modèles d'insuffisance rénale aigue que nous utilisons. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques appropriés pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux) et de morceaux de bois à ronger, dans toutes les cages. Si une agressivité est observée, des abris seront placés dans la cage. Des points limites ont été définis. Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée régulière pendant toute la durée du protocole.
Choix des espèces
L'étude d'un modèle expérimental de mammifère est indispensable puisque le but de notre travail est de pouvoir transposer un jour le résultat de nos études à la clinique humaine. Nous avons choisi la souris car nous maîtrisons parfaitement les protocoles expérimentaux dans cette espèce. Les procédures seront menées chez des souris mâles et femelles de 9-10 semaines, c'est-à-dire des animaux adultes. L'insuffisance rénale aigue touche en effet majoritairement des adultes.
Evaluation de l’effet d’une supplémentation alimentaire en poudre de fruits ou de légumineuses sur le métabolisme, l’inflammation et la résistance à l’insuline dans le modèle d’obésité induite par l’alimentation chez la souris mâle.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Nourries douze semaines avec un régime riche en graisse additionné de poudre de baies de goji ou de lentilles, 72 souris mâles subissent une prise de sang sous contention à la sixième semaine, un test de tolérance à l'insuline à la neuvième, un gavage de glucose à la dixième et un gavage de mesure de perméabilité intestinale à la onzième. Trois recueils de fèces les isolent chacun une trentaine de minutes, les tests de tolérance deux heures. Le porteur reconnaît un stress social lié à ces isolements et des douleurs possibles lors des prises de sang, du marquage, du gavage et de l'injection intrapéritonéale, puis écrit qu'aucune analgésie n'est prévue dans ce protocole. Toutes sont tuées pour prélever les tissus et mesurer l'effet de la supplémentation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré.
Objectifs
L’objectif du projet est de mieux comprendre l’impact des conditions de production et des traitements post-récolte sur la qualité nutritionnelle des fruits ou des légumineuses et les conséquences que cela va engendrer en terme de santé métabolique chez la souris. Plusieurs travaux rapportent un effet protecteur des fruits ou des légumineuses vis-à-vis de l’homéostasie glucidique qui semble en partie lié aux polysaccharides, et est très probablement imputable à un effet sur le microbiote. Pour évaluer les effets santé des fruits ou légumineuses et l'impact des conditions de cultures et de traitements post-récolte, nous comparerons des baies de goji cultivées en plein champ ou en serre (effet des condition de productions), consommées fraiches ou séchées (effet du traitement post-récolte). L'effet des conditions de cultures sera également étudié sur des lentilles (légumineuses) cultivées soit en sol riche en bactéries soit en sol pauvre (effet des conditions de culture). Les différentes modalités de fruits ou légumineuses seront lyophilisés puis administrés à des souris males durant 12 semaines, dans le cadre d'une alimentation riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9eme semaine et un test de tolérance au glucose à la 10eme semaine. Les fèces seront également récoltés et le microbiote des animaux sera analysé. Les données obtenues permettront d'avancer dans la connaissance et l'objectivation de la contruction de la qualité nutritionnelle des productions végétales et de leurs effets sur la santé métabolique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’impact des conditions de culture (plein champ vs serre, et impact du microbiote du sol) et des traitements post-récolte (frais vs séchés) sur la baie de goji et la lentille et leurs effets sur la santé métabolique des souris et de leur microbiote. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer et de mieux caractériser les effets santé de ces aliment dans le cadre de pratiques agricoles plus responsables.
Procédures
Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude et après 6 semaines (2 au total). Pour ce faire les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en 9ième et 10ième semaine. Ces tests necéssitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage dans le cas du test de tolérence au glucose, et une injection intrapéritonéale lors du test de tolerance à l'insuline. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en hébergement individuel des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur glycémie. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé en semaine 11. Ce test nécessitera une mise en contention d'une minute pour réaliser le gavage avec la solution permettant d'évaluer la perméabilité intestinale. Durant le protocole, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.
Impact sur les animaux
Stress social lié à l'hébergement individuel de l'animal de ses congénères lors du test de tolérance à l'insuline, du test de tolérance au gloucose et du recueil de fecès. Douleurs possibles lors des prises de sang, pour l'identification des animaux, lors du gavage et lors de l'injection intrapéritonéale. Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles.
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de baie de goji ou de lentilles.
Remplacement
L’étude d’une supplémentation en poudre de baie de goji ou de lentilles sur la santé métabolique et le microbiote ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Il n'existe pas de modèle alternatif à l'heure actuelle permettant d'étudier ces paramètres in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux (9 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test statistique, notamment en ce qui concerne la prise de poids. Deux protocoles indépendants ont été regroupés en un meme protocole afin de limiter le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à rétablissement. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arret. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.
Choix des espèces
Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.
Mise au point d’un modèle murin pour l’analyse de la survenue et/ou la progression des cancers germino-testiculaires.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Les souris mâles de ce projet sont génétiquement modifiées pour développer un cancer du testicule dans 75 % des cas. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le seul acte que le porteur décrit est le prélèvement de deux phalanges au maximum à sept jours, pour l'identification et le génotypage, et il annonce comme nuisances la tumeur elle-même, une gêne au déplacement quand elle se développe au niveau du scrotum, une baisse d'activité. Les animaux surnuméraires et ceux dont le génotype ne sert pas au projet sont tués, les autres le sont en fin de procédure pour le prélèvement d'organes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’analyser la survenue et/ou la progression des cancers germino-testiculaires et la sensibilité aux traitements par chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Le cancer du testicule (CT) est le plus fréquemment diagnostiqué chez l'homme jeune (15-35 ans). Son incidence n'a cessé d'augmenter dans les pays industrialisés depuis plusieurs décennies. L'étiologie des CT est peu connue. L'identification d'acteurs impliqués dans la prédisposition et la survenue de ces cancers permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Ceci est d'autant plus important que 10% des malades décèdent des suites de leur cancer. L'étude de la physiologie des cellules germinales est fondamentale, puisqu'elles sont à l'origine de la majorité (95%) des CT. Des études récentes ont démontré les rôles des signalisations des xénobiotiques dans la régulation de la physiologie testiculaire et notamment celle des cellules germinales. L’objectif de ce projet est d’analyser l’implication de ces signalisations cellulaires dans la survenue et/ou la progression des cancers germino-testiculaires.
Procédures
Sur ces animaux, il y aura 1 prélèvement à 7 jours de deux phalanges maximum par souris pour la numérotation et le génotypage.
Impact sur les animaux
Seulement les animaux obtenus des croisements avec la lignée exprimant la recombinase Cre développeront des tumeurs. Les nuissances et effets indésirables attendus seront d'une part développement de la tumeur, ce qui au niveau du scrotum pourrait entrainer une gêne pour le déplacement de la souis, aussi nous abserverons les troubles au niveau de son activité (hypoactivité).
Devenir
Les animaux surnumérères et de génotypes sans intérêt pour le projet seront mis à morts. De même à la fin de la procédure, les animaux d'intérêt seront mis à morts pour les prélèvements d'organes.
Remplacement
Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible car aucune approche ne permettrait d'analyser les mécanismes de l'étiologie la tumorigenèse testiculaire avec une origine potentiellement au cours de la vie empbryonnaire et un développement de la patholgie et période postnatale.
Réduction
Nous réduirons au maximum le nombre de souris utilisées et présentant des attente délétère grâce à l'utilisation du système de ciblage tissulaire de l'altération génétique dans le tissus d'intérêt. Le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence l'effet des altérations génétiques dans la survenue des tumeurs germinales du testicule. Avec une incidence attendue selon la litérrature de 75%; nous utiliserons 20 animaux par groupe et par âge afin d’obtenir des résultats valides pour définir les différences entre les différents génotypes.
Raffinement
Le raffinement reposera sur la surveillance quotidienne des animaux effectuée par du personnel qualifié (expérimentateurs et personnel animalier). De plus, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (5 au maximum) dans des cages de tailles conformes à la législation en fonction du nombre de souris, avec un enrichissement (tunnel en carton et maisons à souris) des cages. De plus, nous avons défini un arbre décisionnel (annexe) avec des critères adaptés d'arrêt de l'expérimentation en cas de souffrance de l'animal. Si un animal devait présenter des signes de douleur, l’animal sera isolé et un analgésique sera administré à des intervalles qui seront définis avec le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris mâles modifiés génétiquement et qui développent dans 75% des cas un cancer germino- testiculaire. il s'agit d'un des rares modèles permettant de développer ce type de pathologie avec un incidence suffisante pour réaliser des études moléculaires et physiologiques donnant des résultats fiables.
Etude du comportement alimentaire chez des souris atteintes de glycogénose de type Ia: EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Cinq injections sous-cutanées en cinq jours déclenchent chez ces souris une maladie hépatique rare, la glycogénose de type Ia, avant leur transport vers un second établissement où elles passent quatre jours isolées dans des cages qui enregistrent chaque accès à la mangeoire. 23 souris sont concernées, 12 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 11 un niveau léger. Le porteur qualifie cet isolement de "léger stress" et écrit qu'aucune souris ne sera mise à jeun, tout en indiquant que ces animaux peuvent tomber en hypoglycémie, se prostrer, voir leur température chuter et en mourir, ce qu'il a observé chez moins de 2 % de l'élevage. Aucune n'est tuée à l'issue : toutes sont gardées en vie et pourront servir à un autre projet si le vétérinaire juge la gravité réellement subie inférieure ou égale au niveau modéré.
Objectifs
La glycogénose de type Ia (GSDIa) est une maladie métabolique rare due à l’absence de production de sucre (glucose) par l’organisme. Cette fonction est essentielle pour maintenir les taux de sucre dans le sang (glycémie) constante en dehors des repas. Contrairement aux diabétiques, les patients atteints de GSDIa développent des hypoglycémies sévères. Une baisse du taux de sucres dans le sang conduit à un mal-être important, qui peut conduire au coma, et à la mort en quelques minutes. Ainsi, les patients doivent manger régulièrement (toutes les 3h environ), y compris la nuit. Ces perturbations du rythme biologique ont un fort impact sur l’ensemble de fonctions physiologiques. Ainsi, la prise de nourriture à un temps inapproprié par rapport au cycle biologique, par exemple durant la période de sommeil, entraine un dérèglement de certaines réactions biologiques, en particulier dans le foie. Des résultats préliminaires obtenus dans un modèle de souris atteintes de GSDIa montrent des dérégulations dans le foie des souris, qui pourraient être entrainées par une modification du rythme biologique. L’objectif de ce projet est d’étudier la prise alimentaire et la structuration des repas de souris atteintes de GSDIa sur une période de 3 jours, avec un accès continu à la nourriture. Le projet se déroulera dans deux établissements différents, l’un produira les souris et l’autre sera chargé de l’étude du comportement alimentaire.
Bénéfices attendus
L’étude des paramètres des repas (fréquence-quantité) devrait permettre de confirmer que les souris atteintes de GSDIa mangent régulièrement, tout au long de la journée et de la nuit, afin de limiter le développement d’hypoglycémie. Ces données seront utiles pour expliquer les origines des perturbations de l’horloge biologique observées au niveau du foie.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, une biopsie de tissu sera prélevée pour caractériser leurs gènes. Pour obtenir les souris atteintes de glycogénose de type 1a, les souris transgéniques sélectionnées et leur souris contrôles (souris saines) subiront une injection d’un produit chimique par voie sous-cutanée pendant 5 jours de suite à l’âge de 8 semaines dans le premier établissement utilisateur. Après transfert par un transporteur agréé dans le deuxième établissement, ces souris seront ensuite isolées pendant 4 jours afin d’étudier leur comportement grâce à des cages détectant quand la souris accède à la mangeoire ou au biberon. L’appareillage permet aussi de déterminer la quantité de nourriture et le volume d’eau ingérés sur 24h. Afin de limiter le stress induit par l’isolement des souris, une période d’acclimatation progressive (isolement d’une demi-journée, puis 2 demi-journées, avec remise avec leurs congénères entre chaque période, et enfin 24h) à leur nouvel environnement sera programmée sur les 3 jours précédents les enregistrements de prises alimentaires. Les animaux seront ensuite regroupés dans leur cage d’origine en fin de procédure. Les souris pourront être utilisés dans un autre projet, après validation du niveau de sévérité de l’ensemble de la procédure subi par chaque animal par le vétérinaire désigné du deuxième établissement.
Impact sur les animaux
Les souris subiront une série d’injections de 5 injections par voie sous-cutanée qui peuvent entrainer une légère douleur liée à la piqure. Ce projet concerne une pathologie caractérisée par le développement d’hypoglycémies lors de jeûnes courts (entre les repas), et par des atteintes hépatiques menant à long terme au développement de tumeurs du foie. En ciblant la pathologie dans le foie par transgenèse, le modèle de souris atteintes de GSDIa utilisé dans cette étude reproduit toute la pathologie hépatique observée chez l’homme et est viable. Cependant, ces souris peuvent développer des hypoglycémies si elles ne s’alimentent pas régulièrement, car elles ne peuvent pas utiliser leur stock de sucres accumulé dans le foie. Les hypoglycémies entrainent un mal-être, observé par la prostration des animaux, une baisse de la température corporelle, et possiblement le décès de l’animal (qui a été observé dans moins de 2% des souris de l’élevage grâce à une observation renforcée des animaux). Les souris développent aussi des tumeurs hépatiques autour de 12-15 mois ce qui ne constituera pas un point limite dans ce projet puisque les procédures seront limitées à 6 mois. Enfin, les souris seront isolées physiquement afin de mesurer leur prise alimentaire et leur rythme de prise de nourriture. Cet isolement sera limité à 4 jours. Il peut entrainer un léger stress chez l’animal.
Devenir
A l’issu du projet, l’avis du responsable du suivi du bien-être animal sera demandé pour chaque animal afin d’évaluer la gravité réelle subie au cours du projet. Les souris transgéniques et leurs contrôles (souris saines) seront gardées en vie et pourront être utilisées pour un autre projet si leur état de santé le permet, et si la gravité réelle subie par l’animal est classée au maximum en niveau modérée. Les souris supplémentaires de l’élevage (mâles ou femelles) pourront être utilisées dans un autre projet ou pour la reproduction.
Remplacement
L’étude du comportement alimentaire des souris atteintes de glycogénose de type Ia nécessite de travailler sur les animaux vivants. Ce modèle animal reproduit toute la pathologie hépatique de cette maladie rare, y compris les modifications de l’horloge biologique liées probablement aux adaptations des prises alimentaires des souris régulièrement nuit et jour afin d’éviter le développement d’hypoglycémie.
Réduction
Afin de pouvoir réaliser une analyse statistique, le nombre d’animaux a été limité à 11 souris par groupe (avec une souris supplémentaire pour les souris atteintes de glycogénose en cas de décès d’un congénère), soit au total 23 animaux, sur une période de 2 ans. Ce nombre a été calculé pour obtenir une puissance d’étude élevée et tenir compte de la variabilité inter-individus. Les résultats des 2 groupes de souris étudiés seront comparés par un test statistique. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en expérimentation animale, ces souris ne seront pas mises à mort et seront utilisés pour un autre projet.
Raffinement
Afin d’éviter la mort précoce des animaux atteints de GSDIa, la pathologie a été induite uniquement dans le foie et à l’âge adulte ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies chez les souris nourries et de passer la période néonatale sans phénotype dommageable (pas de retard de croissance). Pour éviter les réactions inflammatoires liées à l’injection du produit chimique utilisé pour générer les souris transgéniques, les traitements seront réalisés par injections sous-cutanées. La connaissance de ce modèle animal a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie et en limitant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes accessibles directement dans la cage) et au biberon. L’état de bien-être sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (état du pelage, mouvements/posture de la souris, morsures...) et du comportement des animaux pour détecter tout mal -être occasionné par une hypoglycémie (fiche de suivi des animaux fournie aux zootechniciens). En cas d’hypoglycémie, la souris sera systématiquement injectée avec une solution de sucre et une partie de sa cage sera placée sur une plaque chauffante afin de maintenir sa température corporelle. Dans ce projet, aucune souris ne sera mise à jeun. A leur arrivée dans le deuxième établissement, les souris seront hébergées pendant une période de 15j au minimum afin de s’acclimater à leur nouvel environnement. L’enrichissement sera conservé tout au long de l’étude. Les souris seront ensuite hébergées progressivement dans les cages d’enregistrement de la prise alimentaire pour les habituer à l’isolement. Un suivi du poids sera effectué quotidiennement lors de l’isolement de l’animal. Pour réduire le stress de l’isolement, les cages sont transparentes et sans couvercle permettant aux souris un contact visuel et par l’odorat. L’enrichissement et la litière de la cage d’origine seront conservés lors de l’isolement. Des céréales (type Kellogg’s) seront proposées aux souris à la fin de chaque période d’isolement comme récompense. En cas de petites plaies, une crème à base de teintures mères et d’huiles essentielles qui apaise et cicatrise sera systématiquement appliquée par les zootechniciens en charge du suivi du bien-être animal.
Choix des espèces
Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production de sucre par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Les expériences seront donc réalisées avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme et qui reproduisent toute la pathologie hépatique observée chez les patients. Pour cela, un modèle de souris reproduisant la pathologie hépatique de la glycogénose de type Ia a été obtenu par transgenèse en ciblant uniquement la perte de production de sucre par le foie. Ce modèle murin est unique et viable. En effet, l’élevage des deux autres modèles d’animaux atteints de glycogénose de type Ia (souris et chien qui présentent une perte totale de la production de sucre par l’organisme est très complexes car la plupart des animaux meurt avant le sevrage. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 6 semaines et 6 mois.
Evaluation du rôle précoce de CaMK1D in vivo au cours de la neuroinflammation induite par l’obésité
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus, 768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 240 d'entre elles reçoivent de trois jours à quatre semaines un régime enrichi en graisses destiné à les faire grossir, 160 subissent deux prélèvements sanguins à la mâchoire, d'autres passent vingt-quatre heures à jeun avant un test de réalimentation. La mesure des paramètres métaboliques impose d'isoler des souris pendant quatre semaines, un enfermement que le porteur range parmi les sources d'inconfort. Sur le remplacement, il affirme avoir déjà obtenu la preuve de concept in vitro et écrit avoir "maintenant besoin de la souris", la régulation de l'énergie mobilisant selon lui plusieurs organes à la fois.
Objectifs
L'homéostasie énergétique se définit comme l'équilibre entre les entrées et les dépenses énergétiques. Les dépenses résultent principalement du métabolisme basal et de l’activité physique, tandis que les apports trouvent leur origine dans l’alimentation. Quand cet équilibre est rompu, le terrain est favorable à l’installation de maladies métaboliques telles que l’anorexie ou l’obésité. Récemment, nous avons mis en évidence le rôle neuronal d'une protéine dans la régulation de la balance énergétique. Nous avons récemment observé, chez la souris, qu'en invalidant cette protéine dans les cellules microgliales (cellules immunitaires du cerveau impliquées dans la neuroinflammation) les animaux soumis à un régime riche en graisse présentent une prise alimentaire et une prise de poids réduites. Or, ce régime alimentaire est bien connu pour induire une inflammation de bas grade qui contribue à l'obésité, établissant ainsi un lien entre notre protéine d'intérêt dans les cellules microgliales et l'obésité induite par un régime gras. Cependant ces observations ont été réalisées aprés plusieurs semaines de régime gras. Dans ce projet, nous voulons déterminer les mécanismes moléculaires précoces de la neuroinflammation induite par un régime gras conduisant à l'obésité.
Bénéfices attendus
Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les mécanismes responsables de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Cette étude servira à identifier les mécanismes moléculaires qui font le lien entre la suralimentation et la mise en place de l'obésité et, par conséquent, le développement du DT2. L'identification de ces mécanismes permettra de savoir si notre protéine d'intérêt constitue une cible thérapeutique pour prévenir le développement de l'obésité. En effet, les médicaments réduisant l'obésité sont particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique, notamment en combinaison avec des médicaments qui agissent pour restaurer la fonction des cellules sécretrices d'insuline. Ainsi, notre approche jettera les bases de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints de DT2.
Procédures
Des prélèvement sanguins seront réalisés sur 160 animaux vigiles. Ces animaux subiront un prélèvement temporo-mandibulaire (1min) à l'age de 9 semaines et un autre à l'âge de 15 semaines avant euthanasie. Au cours du test de tolérance au glucose, des gouttes de sang seront prélevées (6x10 secondes). 240 souris seront soumises à un régime enrichi en gras pendant 3 jours, 1 semaine ou 4 semaines, qui entrainera une prise de poids.
Impact sur les animaux
Le test de réalimentation après un jeûne prolongé nécéssite une mise à jeun des souris pendant 24H. Une diète riche en gras pour créer une environement obésogène sera mise en place chez les souris, ce qui peut créer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisées dans les cages. La tolérance au glucose nécessite l'injection d'un bolus de glucose qui peut entrainer un inconfort chez la souris. La détermination des paramètres métaboliques par calorimétrie indirecte nécessitent d'isoler les souris pendant 4 semaines.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus seront prélevés pour des études histologiques ou moléculaires
Remplacement
Toutes nos données in vitro convergent vers une fonction de notre gène d'intétêt dans la neuroinflammation induite par l'obésité. Nous avons apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Pour tester nos hypothèses, nous avons maintenant besoin de la souris. En effet, la régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.
Réduction
Nous utiliserons un total de 768 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris. L'invalidation du gène n'est pas fiable à 100%, pour cette raison, le nombre d'animaux a été déterminé en prennant en compte cette difficulté. Afin d’analyser les paramètres évalués (poids des souris, nourriture consommée) nous déterminerons les tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant L'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Un tube sera disposé dans la cage pour déplacer les animaux en limitant le stress dû à la préhension. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Pour étudier le métabolisme, la souris est le modèle animal de référence. L’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifées dans lesquelles le gène pour notre protéine d'intérêt est invalidé. Les animaux seront injectés avec du tamoxifène à l'age de 5 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 9 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale
étude du rôle de la fonction mitochondriale dans l’obésité et l’insulinorésistance chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Treize prélèvements de sang par microcoupure de la queue sur chaque animal, deux mises à jeun de seize puis six heures, un gavage et une injection intrapéritonéale. 1 688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récupérer les prélèvements, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. La lignée porte un phénotype dommageable, et les souris nourries au régime gras montent jusqu'à 45 grammes et deviennent moins actives, pour l'étude d'une protéine mitochondriale liée au diabète. Le porteur retient la souris parce que les gènes de l'obésité et du diabète sont conservés entre souris et humain, et parce que la proximité du centre d'explorations fonctionnelles facilite le travail.
Objectifs
Récemment, il a été établi que de petites structures présentes dans les cellules appelées mitochondries sont impliquées dans la mise en place et dans la progression du diabète. Nous avons identifié une molécule/protéine qui joue un rôle majeur dans le fonctionnement des mitochondries. Notre objectif est donc d'étudier comment cette molécule fonctionne et comment elle est affectée sous différents régimes alimentaires chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait définir une nouvelle cible thérapeutique dans l’obésité et les complications du diabète en ciblant ce gène cible ou son activité.
Procédures
- Injection intrapéritonéale, 10s, 1X par animal. - Mise à jeun, 16h, 1X par animal. - Mise à jeun, 6h, 1X par animal. - Gavage, 10s, 1X par animal. - Prélèvement de sang par microcoupure de la queue, 10s, 13X par animal.
Impact sur les animaux
•Elevage : La lignée murine utilisé dans ce projet est une lignée présentant un phénotype dommageable. •Régime riche en graisse : les animaux vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines (jusqu’à 45 grammes) et devenir un peu moins actifs. •Injection intrapéritonéale : Causant une douleur légère due à la piqûre. •Microcoupure à la queue : Causera une douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. •Mise à jeun : Les animaux n’auront plus accès à la nourriture, ils pourront subir une gêne due à la sensation de faim. •Gavage : stress dû à la contention et à la sonde de gavage.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.
Remplacement
Pour réaliser les tests nécessaires et les techniques que nous souhaitons mettre en œuvre dans ce projet, les modèles in vivo sont indispensables. Le choix de la cible de notre protéine d'intérêt a été déterminé partir d'observations sur des cohortes humaines et confirmé sur des cultures cellulaires. Cependant l'étude in vitro seule ne permet pas d'obtenir un modèle physiologique d'obésité. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour définir la réponse globale d’un animal à une situation physiopathologique. Les procédures expérimentales que nous souhaitons mettre en place ne peuvent donc pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. En plus, les gènes impliqués dans l’obésité et le diabète jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme.
Réduction
Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mis à mort, afin d'approfondir les études. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.
Raffinement
Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Les souris seront sous surveillance journalière de la part de l’équipe professionnelle de zootechnie et une grille de score adaptée à la procédure est en place.
Choix des espèces
La souris est un des modèles les plus appropriés pour l'étude de l'obésité et du diabète de type 2. Les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes qui n'impliquent pas l'utilisation d'animaux vivants. Les souris sont faciles à manipuler et la proximité du centre d’explorations fonctionnelles nous permet d'utiliser ce modèle dans des conditions d'élevage optimales. Les animaux seront mis à l'accouplement à partir de l'âge de 56 jours, qui correspond à l'âge de la maturité sexuelle. Les souris utilisées dans les procédures expérimentales seront âgées de 8 à 10 semaines au début du processus. Cet âge correspond à la maturité sexuelle des souris, donc à une stabilisation hormonale. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales sont de souris adultes.
Le rôle du transport et du métabolisme du fructose dans la sécrétion d’insuline
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour savoir si un transporteur du fructose intervient dans la sécrétion d'insuline, 192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le pancréas, l'intestin et le contenu du cæcum. Chaque animal subit trois gavages de glucose, trois coupures à l'extrémité de la queue et jusqu'à six prélèvements submandibulaires, entre six et dix-neuf semaines d'âge. Un jeûne de six heures précède chaque test de tolérance au glucose, dont le porteur écrit qu'il n'entraîne qu'une baisse modérée de la glycémie. Une perte de poids dépassant 20 %, un poil hérissé, une prostration ou une léthargie de plus de deux jours déclenchent l'arrêt du protocole et la mise à mort de l'animal.
Objectifs
La sécrétion d’insuline est fortement stimulée par le glucose et pas du tout par le fructose lequel représente pourtant 50% des sucres consommés par notre alimentation. Le fructose est structurellement proche du glucose mais est transporté, notamment au niveau de l’intestin, par un transporteur spécifique qui ne transporte que le fructose. Ce transporteur est essentiellement présent dans l'intestin et n'a pas été décrit dans le pancréas. Pourtant chez les souris génétiquement modifiées chez qui ce transporteur n'est pas présent il y a une diminution des taux circulant d'insuline. La découverte d’une nouvelle d’une voie de régulation de la sécrétion d’insuline via ce transporteur semble très importante à caractériser et c'est le but du projet proposé. Ce travail vise à déterminer chez des souris mâles et femelles adultes à quel âge cette diminution des taux circulants d'insuline apparait et quels sont les mécanismes impliqués. Parmi ces derniers, le rôle du transport de fructose sera étudié ainsi que le rôle éventuellement du métabolisme du fructose à la fois dans le pancréas et dans l'intestin, grâce à des modèles de souris spécifiques.
Bénéfices attendus
Le phénotype observé chez les souris chez qui le transporteur du fructose n'est pas présent, à savoir une baisse drastique des taux circulants d’insuline, ressemble à ce qui est observé dans le diabète de type 1 chez l’humain. Le diabète de type 1 représente environ 10% des cas de diabètes en France et dans le monde. Depuis une vingtaine d’années, le nombre de personnes atteintes de diabète de type 1 ne cesse d’augmenter (+ 3 à 4% /an). Les raisons de ces évolutions sont inexpliquées à ce jour, mais certaines modifications de l’environnement et de leurs interactions avec le génome sont suspectées telles que les facteurs nutritionnels ou la modification de la flore intestinale. Bien que le fructose soit suspecté de conduire à la mise en place d’un diabète de type 2 (mise en place progressive de l’insulino-résistance) le rôle de son transporteur dans la sécrétion de l’insuline n’a jamais été étudié. Notre projet permettra possiblement d’identifier une nouvelle voie impliquée dans la régulation de la synthèse et ou la sécrétion de l’insuline.
Procédures
Les 192 animaux vigiles recevront au cours de la totalité de la procédure 3 gavages oraux de glucose (intervention d’une durée inférieure à 5 secondes), 3 petites coupures à l’extrémité de la queue (intervention d’une durée inférieure à 1 seconde) et ils auront au maximum 6 prélèvements submandibualires (intervention d’une durée inférieure à 20 secondes).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des gavages pour le test de tolérance au glucose (moins de 5 secondes), la contention permettant de limiter les fausses routes éventuelles, et lors de la contention pour le prélèvement de sang (moins de 20 secondes). Les animaux seront soumis à stress lors du passage de leur salle d’élevage à la salle d’expérimentation pour les OGTT. Les animaux seront soumis à une légère douleur de l’ordre de la piqure lors du prélèvement de sang. Les souris seront soumises à un jeun de 6h avant les tests de tolérance au glucose ce qui n’entraine qu’une diminution modérée de la glycémie et aucune hypoglycémie.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié afin de prélever certains tissus (pancréas, intestin et contenu de caecum)
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro ou ex vivo permettant de simuler les interactions inter-organes impliquées dans le contrôle de l’homéostasie glucidique d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des paramètres spécifiques à chaque souris (génétique, microbiote, alimentation) et biologiques obtenues à partir du sang (glycémie, insulinémie), des tissus producteurs d’hormones (pancréas) et intestinaux (tissus permettant de stimuler la sécrétion d’insuline via la production de molécules de type hormonales).
Réduction
Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives. De plus, nous avons fait le choix d’utiliser les mêmes groupes de souris ente 6 et 19 semaines et de n’effectuer les prélèvements finaux de tissus qu’à 19 semaines afin de réduire le nombre d’animaux. Des mâles et des femelles seront utilisés.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour leur nid, d’un bâton à ronger, d'un abri en propylène rouge et de deux hamacs (limitation des bagarres). Les animaux seront habitués à la contention avant le démarrage des gavages pour limier le stress lors de la procédure expérimentale. Les expérimentions étant effectuées dans une salle différente de la salle d’élevage les animaux seront habitués à la salle d’expérimentation 1h avant le début des procédures et maintenus dans leur cage d’élevage avec les mêmes congénères afin de réduire le stress. Les animaux seront surveillés visuellement 1 fois par semaine et leur poids mesuré 1 fois par semaine. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de deux jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limites entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie. Les souris seront à plusieurs par cage pour éviter l'isolement et réduire le stress.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal et surtout pour décrypter le mécanisme posé ici (rôle du transporteur et du métabolisme du fructose dans la sécrétion d’insuline) nous disposons de modèles génétiques originaux disponibles uniquement chez les souris. A 6 semaines les souris n'exprimant pas le transporteur de fructose étudié ont une insulinémie normale alors qu’elle est diminuée à 16 semaines. Afin de déterminer à quel âge l’la diminution de la synthése d’insuline se produit nous proposons de suivre les animaux ente 6 et 19 semaines d’âge.
Développement de modèles de souris pour l’étude de maladies neurologiques et cardiaques 1/3
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
4 420 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à six échocardiographies de vingt minutes sous anesthésie, six injections intrapéritonéales, six tests de force de préhension et six passages sur tapis roulant, plus une biopsie pour génotypage. Un quart des souriceaux d'une des lignées naît privé d'un gène nécessaire à la production d'énergie et meurt le premier jour de vie. Un quart de l'autre lignée développe une cardiomyopathie, avec perte de poids, mobilité réduite et posture anormale à partir de neuf semaines. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour analyse des tissus, le bénéfice annoncé se limitant à fournir des modèles et à comprendre des maladies qui restent incurables.
Objectifs
Les maladies dues à un défaut de production d’énergie, sont de maladies génétiques très rares et incurables. Ces maladies peuvent se manifester à tout âge et peuvent affecter plusieurs types d'organes en même temps. Les mutations du notre gènes d’intérêt n 1 et 2, codant des protéines essentielles pour la production d'énergie dans nos cellules, provoquent des maladies affectant le cerveau et le cœur. Comme ces maladies affectent les cellules qui ne se divisent pas, la culture cellulaire ne peut pas aider à comprendre comment le dysfonctionnement mitochondrial affecte le fonctionnement des organes affectés et le développement de la maladie. Ainsi, un modèle animal doit être utilisé pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces maladies. Nous avons décidé d'utiliser les souris comme modèle parce que les souris sont plus proches de l’humain et la physiologie mitochondriale chez l’homme et la souris sont très similaires. Nos objectifs sont les suivants : - Création et étude d'un modèle de souris pour l'étude du développement des maladies associées au gène d’intérêt 1 et 2. La création de ces deux modèles animaux et la compréhension du développement de la maladie mitochondriale sont des étapes nécessaires à la mise au point d'un traitement efficace.
Bénéfices attendus
Ce projet fournira des modèles murins pour les maladies mitochondriales et permettra de découvrir leurs mécanismes pathologiques. Ces deux points sont des étapes essentielles pour le développement d'un traitement pour ces maladies encore incurables.
Procédures
-échocardiographie (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -anesthésie gazeuse (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -injection intra-péritonéale (1 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -grip-test (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -treadmill (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris); biopsie pour génotypage: (1 min par souris; 1 fois par souris )
Impact sur les animaux
Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 1 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront une cardiomyopathie.. À partir de 9 semaines, ces souris peuvent commencer à perdre du poids et avoir une mobilité réduite avec une posture anormale. Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 2 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront maladie neurologique et meurent le premier jour de vie. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant le test comportementaux, pendant l’échocardiographie, pendant l’injection intra péritonéal et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour l'analyse moléculaire, histologique et biochimique des tissus.
Remplacement
L’objectif de notre projet est d’étudier la pathophysiologie des maladies mitochondriales. Pour cette raison l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. La préparation des cultures cellulaires primaires, pour l'étude du rôle moléculaire des protéines codées par notre gènes d’intérêt, aide à réduire le nombre d'animaux utilisés mais ils ne peuvent malheureusement pas remplacer l'utilisation du modèle animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies mitochondriales et sur de méthodes et analyses statistiques. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.Nous utiliserons des méthodes statistiques comme des tests t de Student et Anova en fonction des groupes d’animaux comparés.
Raffinement
Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiées tout en réduisant les vibrations et le bruit.
Choix des espèces
Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement proches des humains. La physiologie mitochondriale et la tissu-spécificité des fonctions mitochondriales chez l’homme et la souris sont très similaires. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge (nouveau-nés, souris juvéniles et juvéniles adultes). Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 3 semaines et plus.