Système endocrinien

Deux injections intraveineuses à sept jours d'intervalle, huit mesures de pression artérielle de dix minutes, six gouttes de sang prélevées, un capteur de télémétrie implanté sous la peau en vingt minutes, une fibrillation atriale déclenchée, une analyse de composition corporelle, deux prélèvements de tissus sur animal vivant. 288 souris Swiss vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, 72 d'entre elles vivant seules en cage depuis l'implantation du capteur jusqu'à la fin de l'étude, soit vingt et un jours. Le porteur leur injecte des vésicules extracellulaires prélevées chez des patients diabétiques, pour voir si elles provoquent chez l'animal la résistance à l'insuline qu'elles provoquent en culture cellulaire. Toutes sont tuées pour prélever des tissus.

Objectifs

Les patients souffrant d’obésité sont confrontés à un risque plus accru de développer des maladies cardiovasculaires et le diabète de type 2. Ce risque est d’autant plus élevé que la majorité de ces patients développent une résistance à l’insuline, une hormone qui permet l’absorption et le stockage du glucose dans les organes tels que le foie, le tissu adipeux et le muscle squelettique. Outre le développement du diabète de type 2, la résistance à l’insuline est, à long terme, responsable de plusieurs complications métaboliques telles qu’une dyslipidémie, une athérosclérose ou une hypertension artérielle. La résistance à l’insuline étant un état pathologique silencieux, il devient nécessaire de développer de nouveaux outils de diagnostic de l’apparition de la résistance à l’insuline chez les patients obèses. Dans ce contexte, nous nous intéressons aux vésicules extracellulaires (VEs) libérées par les cellules de l’organisme. Ces VEs, impliquées dans la communication entre les cellules, sont considérées comme de nouveaux biomarqueurs de différentes maladies. Des travaux préalablement réalisés in vitro au sein de notre laboratoire ont démontré que les VEs circulantes de patients diabétiques induisent une résistance à l’insuline dans les cellules du foie et du tissu adipeux par des mécanismes bien distincts, ainsi qu’une accumulation de graisse. Ces effets ne sont pas observés avec les VEs circulantes de sujets sans diabète. La question posée ici est de vérifier si les VEs de patients diabétiques induisent également la résistance à l’insuline in vivo. L’objectif de ce projet est d’évaluer l‘implication des VEs de patients non diabétiques ou diabétiques, dans le développement in vivo du diabète chez la souris et les mécanismes mis en jeu.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les VEs participent aux altérations métaboliques associées au diabète. A long terme, ces résultats permettront de développer de nouveaux outils de diagnostic de l’apparition de la résistance à l’insuline chez les patients obèses et d’aborder de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives du diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires associées.

Procédures

SEPT INTERVENTIONS : (i) Injections intraveineuses : 2 injections (une injection tous les 7 jours dans toutes les procédures), durée de chaque injection < 5 min. (ii) Mesure pression artérielle : 8 mesures (8 jours), durée : 10 min/mesure (iii) Prélèvement de sang : 6 prélèvements d’une goutte de sang par souris à la fin du régime, durée de chaque prélèvement < 1 min. (iv) Implantation sous-cutanée : 1 implantation/animal, durée 20 min (v) Induction d’une fibrillation atriale : une fois, durée 20 min/animal. (vi) Analyse composition corporelle : une fois, durée 20 min/animal. (vii) Prélèvement tissulaire sur animal vivant : deux fois, durée 10 min/animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris seront les suivants : 1) Stress associé aux manipulations (échographie, IRM, prise de la pression artérielle sur animal éveillé, prise de poids, prise de la température avec une caméra thermographique, et injection de vésicules extracellulaires). Concerne tous les animaux ; 2) Stress et douleur (prise en charge avec une analgésie) associés à la chirurgie après l’implantation du capteur pour la télémétrie (concerne 72 animaux) ; 3) Douleur (prise en charge avec une analgésie) associés au prélèvement des tissus concerne 72 souris ; 4) Stress associé à l’isolement des souris après l’implantation du capteur pour la télémétrie et jusqu’à la fin de la procédure (concerne 72 animaux).

Devenir

Tous les animaux utilisés seront euthanasiés pour prélever des tissues qui permettront compléter les objectives initiales de l’étude.

Remplacement

Il n’existe aucun moyen de remplacer de telles études qui englobent l’ensemble de l’organisme dans sa réponse physiopathologique, et seule l’expérimentation animale permet un suivi complet des altérations métaboliques et cardiovasculaires associées au diabète, comme la résistance à l'insuline.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé pour chaque expérience en fonction des données de la littérature, de notre expérience avec ces modèles maitrisés au laboratoire depuis plusieurs années et à l’aide d'un logiciel statistique. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons un même animal pour plusieurs mesures.

Raffinement

Pour favoriser la sociabilisation des animaux, nous mettrons au maximum 4 animaux par cage. Les animaux concernés par l’analyse des paramètres cardiaques par télémétrie seront placés dans des cages individuelles à partir de l’implantation du capteur télémétrique et seront maintenues dans ces conditions nécessaires pour permettre l’analyse individuelle dans les plateformes d’enregistrement jusqu’à la fin de l'étude, c’est-à-dire 21 jours. Pendant cette période, l’isolement des animaux sera compensé par de l’enrichissement. Ainsi, dans la cage, les animaux auront à disposition des cabanes pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture. La mise en place de pointes limites adaptées aux différentes manipulations décrites dans chaque procédure permettra d’assurer que les animaux soient dans les meilleures conditions pendant la durée de l’étude.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie pour cette étude est la souris Swiss. Comme en témoignent les résultats publiés par notre laboratoire, ces souris sont un bon modèle pour l’étude des maladies métaboliques et cardiovasculaires. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, pour lequel les animaux sont considérés comme jeunes adultes. A partir des 8 semaines d’âge, les rongeurs montrent une fonction métabolique du glucose optimale pour évaluer une possible altération avec le traitement de l’étude. En effet, le déclin de la fonction métabolique est décrit à partir de 10 semaines d’âge chez la souris.

148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection dans la veine de la queue et une sonde de température implantée sous la peau, 48 subissent une prise de sang sous anesthésie et 133 une prise de sang terminale. Le traitement doit déclencher une inflammation générale et de la fièvre, pour tester si des dérivés d'hormones sexuelles provoquent les crises de la fièvre méditerranéenne familiale, dont les mécanismes restent inconnus. Le porteur écrit que l'analyse in vivo est "indispensable" et que la réponse aux hormones sexuelles n'est modélisable ni en culture cellulaire ni en organoïde, d'où son intérêt pour un "organisme entier".

Objectifs

La pyrine est un composant de l’immunité. Des mutations sur la protéine pyrine causent des maladies inflammatoires, dont la fièvre méditerranéenne familiale. La fièvre Méditerranéenne familiale se caractérise par des épisodes qui se répètent dans le temps de douleur abdominale intense liée à des phénomènes d’inflammation. A ce jour, les mécanismes responsables de ces flambées inflammatoires chez les patients demeurent inconnus. Certaines hormones sexuelles seraient capables de déclencher les crises inflammatoires. Le but de ce projet est de tester cette hypothèse dans un modèle murin où l'inflammation sera suivie dans le temps.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont à la fois scientifiques (progrès des connaissances sur l’activation et la régulation de l'immunité) et cliniques (thérapies pour lutter contre les flambées inflammatoires des patients).

Procédures

Tous les animaux du projet subiront une injection intraveineuse, qui durera 30 secondes dans la veine de la queue et une injection sous-cutanée, qui durera 30 secondes d'une sonde de température. 48 animaux subiront une prise de sang sous anesthésie, l'intervention durera 2minutes environ. 133 animaux subiront une prise de sang terminale sous anesthésie sans réveil, l'intervention durera 5minutes environ.

Impact sur les animaux

Les gestes techniques prévus dans les procédures (injections intraveineuses ponctuelles ; prélèvements de sang sous anesthésie ; mesure de poids, pose de sonde de température) sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. Les traitements sont susceptibles d’entrainer des effets secondaires (baisse de température, anesthésie) et une inflammation systémique qui se traduit par de la fièvre.

Devenir

Procédure 1 : réutilisation des animaux lors de la procédure 2. Procédure 2 : Euthanasie des animaux pour réaliser une deuxième prise de sang (terminale) chez les même animaux (réduction du nombre d’animaux utilisés) Procédure 3 : euthanasie des animaux (prise de sang terminale)

Remplacement

L’analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet (suite aux tests déjà réalisés in vitro) et pour s’assurer d’une potentielle pertinence clinique. La réponse physiologique aux hormones sexuelles n’est pas modélisable in vitro, ni dans de systèmes plus évolués tels que les cultures tridimensionnelles ou organoïdes. D’où l’intérêt de travailler sur un organisme entier, sur lequel il est possible d’étudier la réponse inflammatoire globale de l'organisme.

Réduction

De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet (mesures corporelles et exploitations post-mortem). De plus, l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec des « essais pilotes » déterminants. Une réutilisation des animaux est prévue suite à la première procédure pour réduire le nombre d'animaux du projet. Le nombre d'animaux est calculé au minimum en fonction des résultats attendus et des tests statistiques qui seront appliqués.

Raffinement

Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Habituation des souris à la contention (i.e. la manipulation de souris) (une fois par jour, une semaine avant le début de l’expérience) pour minimiser l'angoisse des souris lors de l'expérience . 2) Anesthésie gazeuse pour chaque acte potentiellement douloureux pour la souris 3) Utilisation d'implants avec une transmission du signal pour prendre la température à distance sans introduction anale répétée 4) Minimisation de la fréquence de manipulation 5) Les animaux dont la température diminue seront placés dans des cages sur portoirs chauffants. Les doses de traitement et la fréquence d’administration des molécules résultent de plusieurs retours d’expériences bibliographiques.

Choix des espèces

Il est nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo), avec un fonctionnement immunitaire et hormonal reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain (vertébré Mammifère). La souris en est un modèle idéal du fait des outils disponibles pour suivre l'inflammation et de la possibilité de manipulation génétique qui permet de mieux comprendre les mécanismes. Les expériences débuteront à l’âge de 6-8 semaines ce qui correspond à des souris avec un système immunitaire mature. L’âge des animaux sera de 8-10 semaines maximum en fin de procédure expérimentale.

Trente semaines de gavages quotidiens et d'injections dans l'abdomen deux fois par semaine, huit prélèvements sanguins par animal : 12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties sur cinq établissements. S'y ajoutent la pose chirurgicale d'implants d'œstrogène, une injection de cellules tumorales humaines, une ligature vasculaire et une biopsie de la queue au sixième jour de vie. Le porteur indique que le gavage comporte un risque de perforation de l'œsophage et de passage du liquide dans les poumons, et que les tumeurs devenues volumineuses provoquent des douleurs et des difficultés à s'alimenter. Les souris des procédures d'expérimentation sont tuées pour exploration anatomique, celles de l'élevage restent en vie pour l'accouplement, à l'exception des mâles immunodéficients.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

Cinq injections en cinq jours, une castration chirurgicale trois mois plus tard, puis des prises de sang répétées de mois en mois : 300 souris mâles suivent ce protocole dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées deux mois après le début des expériences pour prélever leurs organes. Des lésions prostatiques leur sont d'abord provoquées par inactivation génique, avant de comparer trois régimes alimentaires dont une alimentation cétogène. Le porteur indique que les mesures de glycémie créent un inconfort et que la présence de sang dans la cage peut déclencher des comportements agressifs entre congénères, tout en affirmant n'avoir observé aucun inconfort majeur lors du suivi des lésions. L'allongement de la durée de vie des patients atteints d'un cancer de la prostate résistant à la castration reste annoncé au conditionnel.

Objectifs

L’objectif du projet de recherche translationnelle est d'explorer le rôle spécifique de l'alimentation, en particulier la restriction en glucides, dans la croissance des tumeurs des cancers résistants à l'hormonothérapie. En mettant l'accent sur la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents, nous aspirons à identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour surmonter la résistance à l'hormonothérapie, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour le traitement du cancer de la prostate.

Bénéfices attendus

Ce projet explore l'impact positif attendu de l'alimentation cétogène sur la progression tumorale et la résistance à la castration dans un modèle murin de cancer de la prostate. En s'appuyant sur les observations antérieures qui ont démontré les avantages de l'alimentation cétogène dans le cancer mammaire, et en dévoilant les mécanismes sousjacents, cette étude pourrait potentiellement ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques pour le traitement de cette forme agressive de cancer de la prostate, et allonger la durée de vie des patients.

Procédures

Les souris subiront 5 injections sur 5 jours sur animal vigile sous contention (20 secondes de contention par injection), puis une intervention chirurgicale, sous anesthésie,3 mois plus tard durant environ 30 minutes. 6 prises de sang par test seront effectuées sur l'animal vigile pour quelques gouttes de sang (1 minutes maximum par prélèvement) à un intervalle de 1mois (3 tests sont prévus au total). 2 prélèvements sanguins de 5µL/g de souris vigile seront effectués, durant 1 minute au maximum.

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements sanguins seront réalisés par des personnes agréées et compétentes, mais dans de rares cas peuvent conduite à une infection de la zone d'administration. L'orchidectomie (anesthésie et geste chirurgical) est une opération rapide qui est bien maitrisée au laboratoire. Après l'inactivation des gènes, l'évolution des lésions prostatiques sera monitorée mais d'après nos expériences, aucun inconfort majeur n'a été observé. Les mesures de glycémie peuvent entrainer un inconfort chez l'animal. La présence de sang dans la cage peut générer un comportement agressif.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les organes et de les analyser.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique et la complexité cellulaires associées à la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité souligne l'importance d'expérimentations in vivo pour élucider ce phénomène et identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Les avancées notables en oncologie ont mis en lumière l'importance cruciale du microenvironnement tumoral dans le développement du cancer, avec ses interactions complexes impliquant le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. Ces mécanismes régulateurs et interactions cellulaires ne peuvent être pleinement compris qu'au sein d'un organisme vivant. Actuellement, l'évaluation des avantages potentiels d'une stratégie alimentaire in vitro demeure impossible, et il est impraticable pour les patients d'évaluer les bienfaits des régimes alimentaires en dehors de tout traitement conventionnel. Les progrès significatifs en oncologie ont largement découlé de l'utilisation de modèles animaux, soulignant leur importance. Les souris, partageant les mêmes protéines que l'homme, simplifient la génération des mutations couramment observées dans le cancer de la prostate humain. Ces similitudes permettront une étude approfondie de l'évolution des lésions prostatiques, favorisant ainsi le développement de traitement précoce. Un suivi bibliographique attentif évitera la redondance avec des travaux existants.

Réduction

Afin de différencier les rôles de différentes alimentations pouvant favoriser ou retarder le développement du cancer de la prostate, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 300 animaux. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions. Afin d'obtenir des résultats significatifs, de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués et en raison de l'hétérogénéité des souris, nous étudierons 2 lignées de souris, une qui développe un cancer, souris dites « d’étude » et une qui n’en développe pas, souris dites « contrôles », il nous faut utiliser 40 souris par groupe pour les souris d’études (20 pour les analyses histologiques et 20 pour l'analyse moléculaire) ainsi que 10 souris par groupe pour les souris contrôle (5 pour les analyses histologiques et 5 pour l'analyse moléculaire). Nous avons 3 types d'alimentations, 2 procédures chirurgicales. En conclusion, il nous faudra 50*3*2 souris soit 300 souris afin de confirmer le ralentissement de la croissance tumorale avec l’alimentation cétogène. Nous comparerons l’effet de la castration par rapport au groupe contrôle ainsi que le changement alimentaire par rapport à l’alimentation standard. Nous utiliserons, dans une première analyse, des paramètres quantitatifs (expression de gènes, nombre de cellules positives pour certains marqueurs histologiques, poids des tumeurs, poids des animaux) et également qualitatifs (expression ou non d'un marqueur au niveau histologique). Si la normalité le permet, nous analyserons les données plus finement en utilisant un test statistique.

Raffinement

L'expertise du laboratoire dans l'étude de l'évolution des lésions précancéreuses prostatiques permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et avec des points critiques étroitement surveillés. Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement. Les souris seront soumises à une anesthésie générale. En post-opératoire, une analgésie systématique sera administrée. Un suivi attentif de la zone d'incision sera effectué, comprenant la surveillance des points de suture, la palpation abdominale et l'inspection à la recherche de signes d'infection locale. En cas de manifestations douloureuses, l'administration d'analgésique pourra être répétée jusqu'à trois fois par jour. Si un point limite est atteint, la mise à mort de l'animal sera réalisée. Pour préserver le bien-être social des animaux, des groupes de deux ou trois seront maintenus et les souris seront réintroduites dans leur cage respective avec leurs partenaires préalables, évitant ainsi toute situation d'isolement. De plus, une séparation entre les animaux castrés et ceux soumis à la procédure contrôle sera mise en place, afin de minimiser les risques de comportements dominants.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin récapitule de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. Ces souris nous permettront d’étudier l’évolution des lésions de cancer de la prostate (CaP) afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris auront le même fond génétique enrichi. Les souris mâles (étude du cancer de la prostate) utilisés seront adultes. A l'âge de 8 à 12 semaines (jeunes mâles pubères), nous induirons le développement de tumeurs. Puis, 3 mois plus tard (soit vers les 5 mois de la souris correspondant à un adulte), nous débutons les expériences (castration et changement alimentaire) avec les différents groupes expérimentaux. Nous mettrons à mort 2 mois après le début des expériences.

1 136 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et, selon les protocoles, chacune peut recevoir une tumeur, deux administrations orales de matières fécales de souris, jusqu'à quatre traitements d'immunothérapie et une prise de sang par semaine. Certaines procédures ajoutent une chirurgie de cinq minutes sous anesthésie générale pour injecter un traceur qui suit la migration des cellules. Toutes les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour l'analyse de leurs organes. L'équipe cherche à comprendre pourquoi une transplantation de microbiote fécal réussit ou échoue à lever la résistance des patients aux immunothérapies contre le cancer, avec un bénéfice renvoyé à plus tard, mieux choisir donneurs et patients, quand la douleur liée à la tumeur et une possible perte de poids sont prévues pour les souris.

Objectifs

Des précédentes études ont montré l'impact de la composition du microbiote intestinal (MI) sur la réponse immunitaire et la réponse aux traitements par immunothérapies contre le cancer. Il a d’abord été montré que la prise d’antibiotiques (ATB), en créant une dysbiose intestinale, est associée à une diminution de l’efficacité de ces immunothérapies dans de nombreux types de cancers. Puis, des compositions spécifiques du microbiote intestinale ont été mises en évidence comme étant associées à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies. Ensuite, des travaux sur des modèles de souris ont permis de démontrer que la transplantation de microbiote fécal (TMF) à partir de selles de patients répondeurs ou résistants aux immunothérapies conduisait à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies chez ces souris, respectivement. Finalement, la transplantation de microbiote fécal chez les patients parait être une approche efficace pour contourner la résistance aux immunothérapies induite par une dysbiose intestinale. Malgré des résultats prometteurs en clinique, il est nécessaire de comprendre les mécanismes qui expliquent la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. L'objectif principal de ce projet est de décrire les effets de la transplantation de microbiote fécal sur le système immunitaire et son implication dans la réponse antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de comprendre les mécanismes expliquant la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. Cela permettra par la suite de mieux sélectionner les donneurs pour la transplantation, ainsi que de mieux sélectionner les patients pouvant recevoir la transplantation de microbiote fécal. De plus, ce projet apportera plus de compréhension sur les liens existants entre le microbiote intestinale, le cancer et la réponse aux immunothérapies. Enfin, par la compréhension des ces mécanismes, les patients ayant une dysbiose intestinale et résistants aux immunothérapies pourront bénéficier d'une tranplantation de microbiote fécal afin de contourner cette résistance.

Procédures

Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation d'une tumeur (une fois, d'une durée d'1 minute), l'administration orale de matières fécales murines (2 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie (4 fois maximum, durée 1 minute), l'injection au niveau de la queue (une fois, durée 1 minute, anesthésie locale). De plus, il est prévu pour certaines procédures d'utiliser un traceur pour suivre la migration cellulaire, nécessitant une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale, d'une durée de 5 minutes (une fois). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, au maximum 1 fois par semaine (durée 5 minutes). Les injections seront réalisées sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures une douleur et une gêne modérée liée à l'implantation d'une tumeur, un inconfort lié à l'administration de matières fécales par voie orale au moment de l'administration, ainsi qu'une potentielle perte de poids liée à la tumeur, aux traitements et à l'administration des matières fécales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure, afin de prélever les organes pour analyser les tissus, les cellules, doser des protéines ou de l'ADN.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles, dont certaines dites "GO-NO-GO", et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. Notre critère de jugement principal est le suivi de la croissance tumorale. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière quotidienne permettra le suivi clinique de la souris ainsi que de son comportement, permettant l’éventuelle mise en place de mesures d'analgésie. Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale. Les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières. Les points limites précoces seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique et l'immunotlogie sont proches de celle de l’Homme et bien connues. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des bactéries et de la transplantation de microbiote fécal sur l’immunité et la réponse antitumorale. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cette âge là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune devant prendre jusqu'à 60 % de son poids sous régime riche en gras et passer cinq heures exposée au froid. S'y ajoutent une prise de sang à la veine mandibulaire, cinq micro-prélèvements en deux heures par incision du bout de la queue, trois injections intrapéritonéales et une séance d'imagerie TEP-scanner sous anesthésie profonde. L'enjeu déclaré tient à une seule protéine, dont l'absence semble protéger les mâles de la prise de poids, et dont le porteur veut savoir si elle protège aussi les femelles. Il conclut que le métabolisme énergétique dépendant de plusieurs organes, il a "besoin de l'organisme entier".

Objectifs

Nous avions montré que l’absence de la protéine X chez la souris modifie le volume du tissu adipeux de la moelle au cours de la maturation squelettique et dans un modèle d’ostéoporose induite. Ces résultats nous ont conduit à étudier le rôle de cette protéine dans la régulation des tissus adipeux périphériques. Ces tissus adipeux jouent un rôle important dans la régulation du métabolisme énergétique grâce à leur fonction de sécrétion d'hormones, leur fonction de stockage des lipides dans les adipocytes blancs et leur capacité à dissiper l’énergie sous forme de chaleur. La régulation de la température par l'organisme est une fonction vitale qui permet de stabiliser la température corporelle et de lutter contre l’accumulation de masse grasse. Nos travaux récents indiquent que les masses de tissus adipeux sont inférieures en absence de la protéine X. Nos résultats préliminaires obtenus chez les mâles soumis à un régime riche en gras indiquent que les mâles dépourvus de cete protéine résistent à la prise de poids. Pour aller plus loin dans la compréhension des mécanismes d’action de cette protéine dans la régulation du métabolisme énergétique, nous allons poursuivre l’analyse du rôle métabolique de cette protéine chez les souris mâles et femelles, en répondant aux questions suivantes : - les femelles n'exprimant pas cette protéine sont-elles résistantes à la prise de poids sous régime riche en gras ? - la faible quantité de tissus adipeux et la résistance à la prise de poids sous régime riche en gras des souris dépourvues de la protéine X sont-elles dues à une augmentation de l’activité de régulation de la température par les cellules des tissus adipeux ?

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier les mécanismes d’action de la protéine X comme nouveau régulateur de l’activité thermogénique des tissus adipeux. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de certaines maladies métaboliques, telle que l’obésité

Procédures

- pesée des animaux 1x/semaine - un prélèvement de 50µl de sang à la veine mandibulaire – deux injections IP à une semaine d’intervalle - 5 micro-prélèvements sur une durée de 2h - 5h de présence dans un environnement froid – une injection IP (100µl) – une séance d’imagerie TEP/CT sous anesthésie profonde (durée : 10 minutes de TEP, 15 secondes de CT)

Impact sur les animaux

Ce protocole conduira à une prise de poids (maximum 50-60%) et à l’apparition d’une glycémie un peu plus élevée qu’en condition standard mais sans atteindre l’état de diabète (170-200mg/dl versus 140mg/dl). Un stress modéré est attendu lors des injections IP et de la pesée des animaux. Un stress modéré est attendu lors des micro prélèvements sanguins - une douleur légère et de courte durée lors de la petite incision de l’extrémité de la queue. L’exposition au froid induira une baisse transitoire de la température corporelle

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour effectuer des prélèvements d'organes (mesure du poids des organes, analyses histomorphométriques et analyses moléculaires)

Remplacement

Le projet concerne l'analyse des effets de l’absence d'une protéine sur la régulation du métabolisme énergétique dans des conditions standard ou dans un modèle d’obésité induite. Le métabolisme énergétique est sous le contrôle de plusieurs organes (tissus adipeux, muscle squelettique, foie, cerveau), nous avons donc besoin de l’organisme entier pour répondre à la question posée.

Réduction

D’après nos travaux antérieurs et nos analyses statistiques, n=12 animaux par groupe est le nombre suffisant pour observer une différence significative. Deux situations peuvent se présenter : 1/ les femelles mutantes sont résistantes à la prise de poids sous régime riche en gras. Elles seront alors soumises à ce même régime à thermoneutralité pour vérifier si ce phénotype de résistance dépend du processus qui contrôle la température corporelle; 2/ les femelles mutantes se comportent comme les souris contrôles (gain de poids sous régime riche en gras). Le protocole s'arrêtera à cette étape (le nombre de souris total pour cette procédure sera alors réduit de 48 animaux).

Raffinement

Pour la mesure de poids hebdomadaire, les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue. Ce geste limite le stress des animaux. L'hébergement à thermoneutralité aura deux effets possibles : 1/ la résistance à la prise de poids est la même que celle observée à température ambiante dès les 8 premières semaines sous régime riche en gras ou 2/ les souris mutantes perdent leur capacité à résister au régime riche en gras. Dans le cas n°1, nous arrêterons le protocole après 8 semaines de régime puisque nous pourrons conclure sur les effets de la mise à thermoneutralité. La procédure sera donc réduite à 8 semaines au total. Dans le cas numéro 2, nous poursuivrons le protocole pour vérifier si la résistance apparait plus tardivement (maximum 14 semaines de régime riche en gras). Nous avons pris en compte le bien-être animal, un examen régulier permettra de prévenir les risques de stress et de souffrances. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant les analgésiques adaptés à notre procédure. Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate). Nous identifions deux types de points limites. Les points limites généraux applicables à toutes nos expériences utilisant des souris et les points limites spécifiques à la procédure (prises de poids maximales attendues sous régime riche en gras de 50% à 60%). Cette prise de poids peut amener à une légère réduction de la mobilité non dommageable. Pour les tests de tolérance à l’insuline, nous utilisons une dose faible, mais si une souris présente une réponse trop marquée, celle-ci sera euthanasiée.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques comme l’obésité. Le modèle murin est utilisé de longue date pour comprendre les mécanismes physiopathologiques des maladies métaboliques. Ce projet est la poursuite de la caractérisation phénotypique de souris invalidées pour le gène X qui nous a permis de mettre en évidence, pour la première fois, un rôle potentiel de la protéine X dans la régulation du métabolisme énergétique (résultats non publiés). Sans ce modèle, cette nouvelle fonction n’aurait pas pu être découverte. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte de 8 semaines, âge auquel le métabolisme énergétique est stable.

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est rendue obèse et diabétique par trois mois de régime hypercalorique, puis reçoit sept prélèvements sanguins par la queue coupée aux ciseaux, une mini-pompe osmotique implantée sous la peau, trente injections sur dix semaines et, pour certaines, un cathéter posé dans la veine jugulaire au cours d'une chirurgie de 45 minutes. Cinq jours d'isolement en cage servent à mesurer la prise alimentaire, avec le stress et la perte de poids que le porteur en attend. Il conclut que seul un "modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l'animal entier" permet de comprendre l'effet du peptide testé sur l'obésité et le diabète.

Objectifs

Ce projet permettra d'étudier la régulation de l’expression d'une séléno protéine au niveau de l'hypothalamus. Cette protéine anti-oxydante pourrait jouer un rôle dans le maintien de l’homéostasie énergétique, un défaut de son activité pourrait contribuer au développement de l’obésité et ses comorbidités, notamment le diabète de type 2. Ce projet permettra également de tester les effets d'un nouveau peptide thérapeutique, capable de mimer l'activité de la séléno protéine, pour le traitement de l’obésité et du diabète de type 2. Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de ces pathologies.

Bénéfices attendus

L'obésité et le diabète de type 2 connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans de sorte que la pandémie actuellement observée au niveau mondial constitue un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que l’hypothalamus de sujets obèses est soumis à un stress oxydatif et inflammatoire permanent, suggérant que des facteurs de contrôle de ce stress pourraient être impliqués dans l’homéostasie énergétique et constituer des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l’obésité associée au diabète de type 2. Le peptide que nous allons tester présente plusieurs avantages qui peuvent en faire un outil thérapeutique très intéressant pour combattre l'obésité et le diabète de type 2 qui lui est associé. En effet, ce peptide atteind le cerveau et pénètre dans les cellules pour réduire le stress oxydant en général. Il peut agir aussi bien au niveau central que dans des tissus périphériques impliqués dans le contrôle du métabolisme énergétique. Les études intégrées que nous projetons de réaliser requièrent des analyses in vivo qui pourront déboucher sur des applications chez des patients atteints d'obésité et de diabète de type 2.

Procédures

Une partie des souris sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 3 mois, ainsi ces animaux deviendront obèses et diabétiques. Des prélévements de sang seront effectués à partir de la queue des animaux qui resteront libres de leurs mouvements (7 prélèvements par animal, chacun des prélévements prendra moins d'une minute). L'implantation de mini-pompes osmotiques sous la peau des animaux, afin de délivrer un composé en permanence, sera effectuée sur souris anesthésiées et toutes les précautions d'usage seront suivies pour minimiser la douleur. Au total, l'intervention durera 10 min par souris. Les mini-pompes osmotiques sont implantées pour des traitements d'un mois. Les traitements par injection (3 par semaine) dureront 10 semaines. Certains animaux seront opérés pour placer un cathéter dans la veine jugulaire. Ils seront opérés une fois, la chirurgie sous anesthésie générale dure 45 minutes. Après 1 semaine de repos ces animaux suivront un autre test : ils seront libres de leurs mouvements et porteront un collier. Pendant 2 heures nous mesurerons leur glycémie 16 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 7 fois). Il n’y aura qu’un seul test de ce type pour ces animaux.

Impact sur les animaux

#1. Régime hypercalorique : Après 2 mois de régime hypercalorique les animaux ont un surpoids et présentent les premiers signes d'apparition du diabète de type 2. #2. Tests effectués sur les animaux : le gavage, l’injection intra-péritonéale et les prélèvements sanguins peuvent stresser les animaux. La queue des animaux sera coupée au ciseau, cela entraine une douleur. #3. Mesure de la prise alimentaire : les animaux seront isolés 5 jours, cela entrainera un stress et une possible perte de poids. #4. Pose d’un cathéter dans la veine jugulaire : plusieurs effets indésirables sont possibles. Des souris peuvent mal supporter l'anesthésie. La chirurgie peut entrainer des douleurs et des problèmes de récupération. #5. Mesure du renouvellement du glucose : le risque est de créer une hypoglycémie lors du test, si les niveaux de perfusion d’insuline et de glucose ne sont pas optimaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car nous avons besoin de prélever leurs organes pour les analyser ultérieurement.

Remplacement

Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, les effets du peptide thérapeutique dans la dérégulation de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité, associée au diabète de type 2, et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme.

Réduction

En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les processus physiologiques étudiés seront analysés sur des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. L’effectif des groupes d’animaux pourra être diminué à 10 lors des études concernant la régulation de la protéine, tout en conservant des données statistiquement fiables. De plus, les procédures, n’impliquant pas d’effet néfaste à long terme, pourront être menées successivement sur les mêmes animaux intercalées avec des périodes de repos au cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués. Au cours de ce projet, plusieurs peptides seront examinés d'abord in vitro dans des cultures de neurones. Ils seront sélectionnés pour leur capacité neuro-protectrices, les plus prometteurs seront étudiés chez la souris obèse. Cette approche réduira sigificativement le nombre d'animaux qui seront utilisés.

Raffinement

L’ensemble des actes pouvant entraîner une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale selon la méthode la plus adaptée) afin d’en minimiser l’impact au maximum. De plus, les animaux recevront un traitement analgésique pour prévenir la douleur. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par le personnel de l'animalerie. Au cours des expérimentations, une observation continue des animaux nous permettra d’arrêter le protocole en cas de souffrance.

Choix des espèces

Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'Homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie; et sont souvent utilisées comme modèles de pathologies humaines, comme l'obésité et le diabète de type 2. De plus, nous voulons tester l'effet d'un peptide thérapeutique sur un modèle animal, dans la perspective de le tester ensuite dans une phase clinique humaine. Au cours de cette étude, la physiologie adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.