Système endocrinien

Trois séances de contention sous lumière vive par jour, trente minutes chacune, six jours de suite pendant la gestation, voilà ce que subissent une partie des 1 442 souris de ce projet, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent des pansements posés sur le dos sous anesthésie deux fois par semaine pendant trois semaines et des injections intrapéritonéales aux jours embryonnaires 7,5 et 10,5. Le porteur écrit que le modèle murin reste un "élément clé et incontournable" pour étudier l'effet du stress prénatal sur l'inflammation de la peau, faute de modèle cellulaire équivalent. Les mâles reproducteurs seront transférés à d'autres équipes, les femelles gestantes tuées à E18.5 ou après le sevrage, et les fœtus prélevés puis tués pour analyse.

Objectifs

Influencés par une variété de facteurs environnementaux, les maladies allergiques connaissent une augmentation constante de leur prévalence à l'échelle mondiale, tant dans les pays développés que dans les pays en voie de développement. D'une façon intéressante, ces maladies sont souvent déclenchées ou aggravées par le stress chronique, bien que les données biologiques expliquant ces phénomènes restent largement incomplètes. Notre projet a donc pour objectif d'examiner l'effet du stress sur la susceptibilité à développer une inflammation allergique, et le cas échéant, de dévoiler les mécanismes moléculaires responsables de cet effet. En effet, la période prénatale est une période critique durant laquelle tous les systèmes physiologiques, y compris les systèmes nerveux et immunitaire, développent leurs fonctions spécifiques et apprennent à s'adapter aux éventuels stimuli déclencheurs. Nous avons récemment mis en évidence l'existence de ce qu'on appelle 'unités sensorielles' dans la peau, formées par les mastocytes (cellules immunitaires spécialisées) et les neurones sensoriels (responsables de la détection de stimuli sensoriels), qui contribuent au développement de l'inflammation allergique de la peau. Nous éméttons donc l'hypothèse que le stress, plus particulièrement le stress prénatal, pourrait contribuer au développement de l'inflammation de la peau de la descendance in utero, en perturbant, au moins en partie, les phénotypes des mastocytes et des neurones sensoriels, et donc les unités fonctionnelles neuro-immunes cutanées associées.

Bénéfices attendus

Le présent projet aborde une question clé en explorant le rôle de l'exposition du fœtus au stress prénatal et ses conséquences sur la susceptibilité à développer une inflammation après la naissance. Il permettra de dévoiler, pour la première fois, les mécanismes biologiques sous-jacents activés par l'exposition au stress. Cela apportera des informations inestimables sur d'éventuels événements indésirables prénataux associés au développement des caractéristiques classiques de l'eczema pédiatrique, donnant lieu à des publications de haut niveau, protégées par des brevets découvertes et, surtout, de nouvelles options thérapeutiques/préventives potentielles pour les troubles allergiques.

Procédures

- Procédures 1/3: Les souris seront mises en stress de contention sous une lumière vive, 3 fois par jour durant 30 minutes, sur 6 jours consécutifs. Nombre de souris: 140 (P1)+162 (P3) = 302 - Procédure 2: Un pansement imbibé d'une solution physiologique sera déposé sur le dos des souris, sous anésthésie, 2 fois par semaine (lundi et mercredi, 3-5min par souris), pour une durée de 3 semaines (3 cycles au total). Nombre de souris: 504 - Procédure 4: Les souris seront injectées au jour embryonnaire 7.5 ou E10.5 en intra-péritonéal (~1min/souris). Nombre de souris: 360 - Procédure 5: Les souris seront injectées en intra-péritonéal avant chaque session de stress (~1min/souris), voir trois fois par jour, sur 6 jours consécutifs. La génération F1 sera patchée (3-5min par souris). Nombre de souris: 276

Impact sur les animaux

Dans le projet proposé, les souris subiront des procédures de classe modérée qui pourraient avoir des effets indésirables ou des nuisances. Les principales nuisances attendues sur les animaux incluent: (1) comportements anormaux liés au stress comme la prostration, isolement, absence de nettoyage (bien que nous n’ayons pas observé de nuisance qui perturberait le comportement soit de la souris stressée, soit de la descendance dans les expériences que nous avons déjà faites en accord avec le protocole éthique précédent utilisant ce modèle); (2) Irritation cutanée due à l'application du patch: l'application de patch peut causer une légère gêne cutanée, une irritation temporaire sur la zone d'application et une légère inflammation; (3) Les injections pourraient causer une douleur passagère au site d'injection et un stress modéré due à la manipulation répétée. Ces effets indésirables vont être soigneusement surveillés et gérés pour minimiser l'impact sur le bien-être des animaux, en appliquant les mesures de raffinement appropriées décrites dans la section 5.10.3.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure correspondante: - Les souris mâles utilisées pour les accouplements seront séparées et proposées à la communauté scientifique. - Les souris femelles utilisées pour les accouplements et subissant le stress seront euthanasiées ou bien au jour embryonnaire E18.5 ou bien après le sevrage (semaine 3). - Les souris de la descendance seront euthanasiées à E18.5 ou à la semaine 8 avant toute intervention ou après le patch.

Remplacement

Ce projet vise à identifier les mécanismes biologiques, induits par l'exposition au stress durant la gestation. Il n'existe à ce jour aucun modèle cellulaire qui peut substituer l'usage d'animaux pour investiguer cela. La substitution également par l'humain n'est pas évidente, étant donné que le niveau de stress est relatif à chaque personne (ce qui sera source de variabilité pour notre étude), et l'accès à des échantillons de foetus ou de mamans durant la gestation/ou atteints d'éczema n'est pas toujours possible. Le modèle murin est donc un élément clé et incontournable pour étudier l'effet du stress prénatal sur le dialogue entre neurone sensoriel et mastocyte dans le cadre de l'inflammation de la peau.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans le modèle de stress prénatal et de patch de peau (protocoles éthiques obtenus précedemment) et la présence de data préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne (12 femelles par groupe, par génotype, réparties entre controle et stress). Ce nombre pourra éventuellement varier à la hausse ou à la baisse (+/- 3 animaux par groupe) en fonction des résultats expérimentaux obtenus avec chaque génotype analysé pour chacun des modèles étudiés. Ces femelles seront accouplées avec 8 mâles aux génotypes correspondants, pour un rapport 2mâles x 3femelles. Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et de l'expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées.

Raffinement

Jusqu'à présent, le taux de mortalité issu des expériences proposées n'atteint pas les 0.1%. Quant au modèle de patch ou de stress, aucun taux de mortalité n'a été détecté jusqu'à présent. D'autre part, lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera monitoré régulièrement. Nous analyserons les paramètres suivants : poids, température, signes extérieurs de stress tels que le comportement de prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Si nécessaire, des antalgiques seront administrés (surtout si des effets indésirables liés au patch surviendront bien qu'aucune manipulation précédente n'a impliqué cela). Si lors d’une procédure expérimentale nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine, ou bien des signes de baisse de température (isolement, mouvement moindre, confirmée par la prise de la tempéraure corporelle et détéction d'une baisse de 3° par rapport à la température d’origine), les animaux seront euthanasiés. Ces cas de figure n’ont encore pas été présentés lors des procédures employées dans d’autres protocoles éthiques déjà validés. Enfin, nous utiliserons des techniques de préhension adaptée (main en coupe ou igloo) aux souriceaux afin d'éviter un stress supplémentaire et maintenir le bien-être des souris. Les injections seront aussi réalisées par un personnel compétent pour éviter la douleur des souris. Les souris mâles mis en accouplement seront réutilisés par d’autres expérimentateurs.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines, surtout l'inflammation de la peau (taux de similarité important). En effet, l’élevage de souris est très productif et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués transgéniques, qui dans notre cas, permettront l'étude du rôle des mastocytes et des neurones sensoriels, et l'effet du stress sur ces cellules. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sont déjà disponibles dans le laboratoire. L'utilisation de méthodes alternatives (ex. avoir recours à des biopsies humaines, etc. sera d'un grand intêret mais cependant limite le projet, étant donné que les niveaux de stress sont relatifs à la personne en question, ce qui apportera une variabilité dans nos analyses. Trois stades/périodes de développement seront d'intêret durant notre projet: 1- Jour embryonnaire E13 à E18: cette période de gestation sera la période durant laquelle les sessions de stress seront conduites. Non seulement cette période est celle décrite pour le modèle, mais elle correspond également à la période de développement des cellules d'intêret, y compris les neurones et les mastocytes. 2-Jour embryonnaire E18.5: les souris gestantes seront euthanasiées et les foetus prélévés, euthanasiés et analysés pour les études à l'état basal. Ce stade représente le dernier jour du protocole de stress ainsi qu'un time-point où les neurones et les cellules immunitaires sont déjà présents dans la peau des souris. 3- Semaine 8: les souris de la génération F1 seront patchées à l'âge de 8 à 12 semaines car elles présentent un système immunitaire mature à ce stade. Le modèle de patch dure 3 semaines, les souris seront euthanasiées à la fin du modèle.

512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et celles qui portent un cathéter jugulaire voient leur glycémie mesurée quinze fois en deux heures, avec huit prélèvements de sang. La queue est coupée au ciseau pour ces prélèvements, geste dont le porteur écrit qu'il entraîne une douleur. La moitié des souris reçoit pendant deux à quatre mois un régime hypercalorique qui les rend prédiabétiques, certaines subissent la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire sous quarante-cinq minutes d'anesthésie générale, d'autres une inoculation par voie rectale que le porteur reconnaît pouvoir les blesser. Le bénéfice avancé tient en une phrase, la mise au point de traitements antidiabétiques à base de probiotiques, quand l'expérimentation court sur cinq ans.

Objectifs

De nombreuses bactéries vivent dans le tube digestif et composent ce que l’on appelle le microbiote intestinal. Ces bactéries produisent des petites molécules (les bactériocines) qui agissent comme des antibiotiques, et permettent aux bactéries qui les produisent de se défendre contre des bactéries dangereuses ou nocives. Nous avons sélectionné une bactériocine, produite naturellement dans l’intestin, qui pourrait avoir un effet bénéfique sur le microbiote intestinal et protéger du diabète de type 2. Nos résultats précédents nous ont permis de montrer que cette bactériocine est en partie dégradée dans les intestins ce qui diminue son efficacité. L’objectif de ce projet est de mettre au point une nouvelle formulation afin de protéger notre molécule lors d'un traitement par voie orale (le plus couramment utilisé chez l'Homme). Pour cela nous utiliserons deux approches : la première sera d’utiliser des nanoparticules, d’origine naturelle, pour entourer notre molécule et ainsi la protéger quand elle sera dans le tube digestif. Une seconde approche consistera à enrichir le microbiote intestinal de nos souris avec les bactéries qui produisent naturellement notre molécule. Nous utiliserons des souris pré-diabétiques et des souris diabétiques. Au cours de cette étude, qui durera 5 ans, nous utiliserons 512 animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de mettre au point de nouveaux traitements antidiabétiques d'origine naturelle à base de probiotiques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1. La moitié des animaux sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 2 à 4 mois, ainsi ces animaux deviendront prédiabétiques. 2. Les animaux seront opérés pour placer un cathéter dans la veine jugulaire. Ils seront opérés une fois, la chirurgie sous anesthésie générale dure 45 minutes. 3. Les animaux non opérés passeront deux scanners, à 7 jours d'intervalle, pendant lesquels ils seront immobilisés pendant 3 minutes. Ensuite ils seront utilisés pour faire des tests : deux fois pendant deux heures, à 7 jours d’intervalle. Ils seront gavés avec du glucose puis pendant 2 heures nous mesurerons leur glycémie 6 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 4 fois). Les animaux seront libres de leurs mouvements. Les animaux opérés suivrons un autre test : ils seront libres de leurs mouvements et porteront un collier. Pendant 2 heures nous mesurerons leur glycémie 15 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 8 fois). Il n’y aura qu’un seul test.

Impact sur les animaux

#1. Régime hypercalorique : Après 2 mois de régime hypercalorique les animaux ont un surpoids et présentent les premiers signes d'apparition du diabète de type 2 (intolérance au glucose et résistance à l'insuline). Concernant les souris diabétiques, la maladie entraîne une polyurie et une prise hydrique augmentée. #2. Traitement antibiotique : ce traitement peut entraîner des diarrhées et une éventuelle déshydratation. #3. Inoculation : L’inoculation par voie orale peut stresser les animaux. L'inoculation par voie rectale, pourrait blesser les animaux. #4. Test de tolérance au glucose et à l'insuline : Le gavage, l’injection intra-péritonéale et les prélèvements sanguins peuvent stresser les animaux. La queue des animaux sera coupée au ciseau, cela entraine une douleur. #5. Pose d’un cathéter dans la veine jugulaire : Plusieurs effets indésirables sont possibles. Des souris peuvent mal supporter l'anesthésie. La chirurgie peut entrainer des douleurs et des problèmes de récupération. #6. Mesure du renouvellement du glucose : le risque est de créer une hypoglycémie lors du test, si les niveaux de perfusion d’insuline et de glucose ne sont pas optimaux. #7. Ponction intra-cardiaque : L’animal sera stressé par l’injection sous-cutanée d’analgésiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car nous avons besoin de prélever leurs organes pour les analyser ultérieurement.

Remplacement

Notre projet correspond à un travail de phase préclinique visant à tester l'effet anti-diabétique d'une nouvelle molécule. C'est donc un passage obligé vers la clinique et l'Homme. Il n'existe pas actuellement de modèle in vitro permettant de reproduire la complexité d'un organisme vivant.

Réduction

Nous limiterons le nombre d’animaux par groupe à n=6 pour les tests métaboliques et n= 8 quand il y a des chirurgies, de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents. Toute fois nous devrons réaliser deux séries pour les tests métaboliques afin de s'assurer de la reproductibilité de nos résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur est prévue avant, pendant, et après l’opération. L’ensemble des procédures de ce projet visent à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Pour cela des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'Homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie; et sont souvent utilisées comme modèles de pathologies humaines, comme l'obésité et le diabète de type 2. De plus, nous voulons tester l'effet de notre molécule sur un modèle animal, dans la perspective de la tester ensuite dans une phase clinique humaine. Tous les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines car nous souhaitons étudier la physiologie adulte.

Une glycémie au-dessus de 500 ou en dessous de 65 mg/dl fait tuer la souris, comme le cumul de plus de trois signes de douleur relevés dans la grille du porteur. 3 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour examen du pancréas. Elles reçoivent des injections répétées, des piqûres à la queue pour suivre leur glycémie, et un test final après cinq heures de jeûne avec six prélèvements sanguins successifs. Six âges sont étudiés, du quatorzième jour après la fécondation à huit mois, et le porteur écrit avoir calculé un effectif "aussi faible que possible" par des tests statistiques dont il ne donne aucun détail.

Objectifs

Le diabète résulte de la destruction des cellules fabricant l'insuline dont le rôle est de diminuer le taux de sucre sanguin. Cela conduit une augmentation du taux de sucre sanguin qui peut avoir de graves conséquences. Les traitement actuels consistent en l'injection d'insuline mais le maintien du taux de sucre sanguin n'est pas optimal. Il faut donc développer de meilleurs thérapies. Dans ce but, nous avons identifié des composés chimiques qui induisent la régénération des cellules productrices d'insuline, ce qui est d'intérêt pour les patients diabétiques. Cependant, ces résultats obtenus sur cellules doivent être validés sur l'animal.

Bénéfices attendus

Ce projet se propose de déterminer si ces composés pourraient induire une augmentation du nombre de cellules beta pancréatiques quand administrés à des animaux. Il est clair qu'une telle approche représenterait un bénéfice d'importance pour les personnes atteintes de diabète.

Procédures

Les animaux recevront des injections (chaque injection durant une dizaine de secondes). Des prélèvements sont prévus pour suivre le taux de sucre sanguin des animaux (1 goutte de sang). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures du taux de sucre sanguin) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer un diabète très modéré (légère hyperglycémie). La source principale de nuisance est reliée aux piqures des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour examen des organes et du pancréas en particulier.

Remplacement

Le diabète est une maladie ayand plusieurs orgines (génétiques mais aussi environementales). Son apparition et sa gravité résultent donc de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible (calculé grâce à des tests statistiques) mais permettant l’obtention de résultats exploitables sans besoin de répétition des expériences.

Raffinement

Durant toute la procédure, les animaux seront suivis afin d’évaluer d’éventuelles souffrances. L'expérience serait immédiatement arrétée en cas de souffrance mesurée comme suit: -Déplacement difficile -Diminution du comportement exploratoire Posture inhabituelle (dos vouté, prostration) -Agressivité -Amaigrissement > 10% du poids initial -Aspect du poil (piqué, hérissé, mal entretenu) -Déshydratation -Agressivité à la manipulation - Glycémie: >500 ou

Choix des espèces

Ce projet a pour but de déterminer les effets des nos composés dans un système biologique intégré. La souris correspond au meilleur compromis pour suivre sur le long terme l'action de ces molécules. En effet, la souris est très proche de l’homme pour ce qui est des mécanismes de régulation de la glycémie/du nombre de cellules beta pancréatiques. 6 âges seront évalués : 14 jours suivant la fertilisation, le jour de la naissance, 1 mois après naissance, 2 mois après naissance, 4 mois après naissance, 8 mois après naissance. Ces âges furent sélectionnés afin de représenter les différentes périodes de la vie : embryonnaire, jeunes, matures, âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter nos observations dans ces animaux.

Marqués à l'élastomère sous anesthésie à la base de la nageoire dorsale, 360 alevins de saumon atlantique sont répartis dans douze sections d'un chenal, la moitié subissant pendant un mois un débit d'étiage abaissé de 25 à 10 litres par seconde. Ils sont ensuite capturés à la pêche à l'électricité, puis enfermés seuls quatre heures en chambre respirométrique, dont une heure pendant laquelle l'oxygène de l'eau baisse jusqu'aux premiers signes d'agitation. 60 autres alevins sont tués dès le début de l'expérience pour servir de témoins, ce qui porte à 420 le nombre de saumons utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués, le porteur indiquant que le sang, le muscle et le foie ne peuvent être prélevés sur des animaux vivants.

Objectifs

L'objectif du projet est de déterminer si en cas d'étiage sévère, l'utilisation de refuges par les saumons juvéniles atténue les effets négatifs de la baisse de débit sur leur croissance et leur survie. Les étiages réduisent la surface d'habitat disponible pour les organismes aquatiques, et altèrent la qualité physico-chimique des cours d'eau. A court terme, l'ajustement comportemental (par exemple l'utilisation de refuges comme des zones profondes) pousse les individus des zones les plus défavorables vers des habitats plus cléments. A plus long terme, si la survie des individus dépend de leurs caractères physiologiques (comme le métabolisme de repos) et que ces caractères sont héréditaires, la sélection naturelle conduira à l'adaptation Darwinienne des populations au fil des générations. Pour atteindre cet objectif scientifique, nous travaillerons avec 420 saumons juvéniles (7 mois post-fécondation) obtenus auprès d'une pisciculture élevant des alevins à partir de géniteurs sauvages pour le renforcement des populations naturelles. Le principe général de l'expérience est de répartir 360 de ces alevins dans 12 sections d'un chenal expérimental où la disposition des cailloux et le débit d'eau seront manipulés, de sorte qu'après un mois d'habituation à un débit normal (25 l/s) la moitié des alevins seront exposés pendant un mois supplémentaire à un débit normal (25 l/s) et l'autre moitié subiront un débit d'étiage (10 l/s), et pour chaque modalité de débit, la moitié des alevins auront accès à des zones refuges creusées dans le substrat. Les poissons placés dans le chenal seront préalablement mesurés puis marqués individuellement sous anesthésie afin d'évaluer leur survie, leur croissance et leur comportement dans le chenal (surveillance vidéo). Outre l'effet potentiel des conditions environnementales, la croissance, la survie et le comportement individuel pourront être liés au métabolisme de base ou à la capacité à supporter l'hypoxie. Ces caractéristiques seront mesurées par des tests respirométriques, lors desquels la consommation d'oxygène et la réaction comportementale face à des concentrations faibles seront mesurées sur des individus maintenus seuls dans une enceinte close pendant environ 4 heures, après quoi les individus seront anesthésiés et euthanasiés pour évaluer leur réponse cellulaire au stress hypoxique. 60 alevins témoins subiront ce test dès leur sortie de la pisciculture.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent les connaissances sur l'écologie et l'évolution des juvéniles de saumon atlantique soumis aux étiages sévères. Le saumon atlantique est une espèce dont les populations naturelles présentent de forts enjeux culturels, écologiques et économiques, et les connaissances sur leurs capacités d'adaptation au changement climatique sont cruciales pour leur conservation. L'expérience quantifiera 1) l'effet négatif d'un étiage sévère (baisse drastique du débit du cours d'eau) sur la survie et la croissance des alevins, 2) la sélectivité de cet effet vis-à-vis de différentes caractéristiques individuelles (consommation d'oxygène, concentration de globules rouges...), 3) l'atténuation des effets négatifs des étiages grâce à l'utilisation de zones profondes comme refuges, 4) l'atténuation par les refuges de l'effet sélectif des étiages sur les caractéristiques individuelles. Outre leur intérêt fondamental, ces résultats informeront des modèles prédictifs simulant l'évolution démographique et génétique de populations de saumons, selon différents scénarios de changement climatique (sévérité des étiages) et de gestion de l'habitat fluvial (conservation/restauration de refuges).

Procédures

Les animaux seront soumis initialement à un marquage individuel par injection d'élastomère à la base de la nageoire dorsale. Le marquage, réalisé sous anesthésie une fois par individu en quelques secondes tiendra tout au long de l'expérience, soit environ 3 mois. Lors de l'expérimentation qui durera 3 mois environ, la moitié des individus seront soumis à un étiage, c'est à dire une réduction forte du débit d'eau. Ce stress induit par l'étiage correspond à des situations rencontrées par les poissons en milieu naturel. Après la période dans le chenal expérimental, les poissons seront collectés une fois par pêche à l'électricité. La mesure du métabolisme sera effectuée en chambre respirométrique, une seule fois par individu, pendant environ 4 heures. Lors de ce test, chaque individu est placé seul dans une enceinte close où la concentration d'oxygène est mesurée en continu. Après 3 heures d'acclimatation à l'enceinte, pendant lesquelles la concentration d'oxygène est maintenue à un niveau maximal par un flux d'eau venant de l'extérieur de l'enceinte, le flux d'eau exogène est coupé de manière à ce que le poisson consomme l'oxygène dissout dans l'eau pendant environ une heure, jusqu'à ce que l'individu montre des premiers signes d'agitation indiquant un stress hypoxique, après quoi la concentration d'oxygène retrouve son niveau maximal. Les prélèvements de tissus seront réalisés sur des individus euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles pour les animaux concernent le stress induit par l'étiage simulé dans la rivière expérimentale, en limitant le volume d'habitat disponible, et éventuellement la physico-chimie de l'eau (température, oxygène). Il pourra se manifester par une croissance réduite, voire une surmortalité, comme c'est le cas en milieu naturel. Le confinement dans la chambre respirométrique et la diminution progressive de la concentration d'oxygène pendant le test pourront stresser les individus, qui seront retirés à l'apparition de signes comportementaux d'inconfort, anesthésiés et euthanasiés.

Devenir

Tous les individus (420) seront euthanasiés à l'issue de la procédure, car le phénotypage nécessite des prélèvements de tissus (sang, muscle, foie) qui ne peuvent être effectués sur des animaux vivants. Ces prélèvements sont cruciaux car ils permettront d'accéder à des caractéristiques physiologiques affectant potentiellement la survie et la croissance en situation d'étiage.

Remplacement

Les effets testés concernent les individus vivants, et impliquent leurs interactions. Il est donc nécessaire de travailler sur des organismes entiers, maintenus en groupes. En lien avec des stratégies de gestion des populations de saumons, espèce à intérêt culturel, écologique et économique, le projet nécessite de travailler sur cette espèce car les résultats obtenus avec d'autres espèces (invertébrés par exemple) ne seraient pas transposables. Néanmoins, pour limiter l'impact sur les populations naturelles sans compromettre l'objectif scientifique de l'étude, les poissons utilisés proviendront d'une pisciculture produisant à partir de géniteurs sauvages de grands nombre d'alevins à des fins de soutien de populations naturelles.

Réduction

Le plan expérimental consiste en un plan croisé entre 2 modalités d'étiage (avec/sans) et 2 modalités de refuges (avec/sans), dans lesquelles seront placés des individus ayant chacun leurs caractéristiques comme la longueur initiale (mesurée en début d'expérience) ou des traits physiologiques comme le métabolisme (mesurés en fin d'expérience). La survie et la croissance étant notoirement affectées par les interactions interindividuelles, trois groupes de chacune des modalités environnementales seront constitués pour obtenir une réplication, avec 30 individus par groupe, soit 360 individus. Pour étudier la plasticité en réponse aux étiages, les phénotypes doivent être mesurés avant et après l'expérience, mais certains nécessitant l'euthanasie, un lot de 60 individus seront euthanasiés et phénotypés en début d'expérience pour servir de témoins. L'effectif total retenu (420 individus) est nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante étant donné le nombre de variables à tester et leurs interactions.

Raffinement

L'expérience aura lieu dans un chenal expérimental conçu pour la reproduction et la croissance des salmonidés. Chaque groupe de 30 individus sera maintenu dans un bief de 10m de long sur 2.8m de large, soit une densité de 1 individu/m2, similaire à celle observée en milieu naturel. Le chenal est alimenté par l'eau d'un ruisseau, et présente donc la même qualité physico-chimique et la même densité en ressources alimentaires que le ruisseau. Le fond du chenal est tapissé de substrat propice à la croissance des alevins de saumon (cailloux+gravier). Le chenal est couvert par un filet anti-oiseaux pour empêcher la prédation, et bordé par un brise-vue pour limiter le stress causé par la circulation des observateurs. L'étiage qui sera simulé causera certes un stress induit par l'expérimentation, mais similaire à ce que les poissons peuvent rencontrer en milieu naturel (le risque de prédation en moins). Le marquage et la biométrie seront effectués sous anesthésie, par une équipe expérimentée, selon une procédure ne durant pas plus de 5 minutes entre le début de l'anesthésie et le réveil. Lors du test de respirométrie, leur comportement et leur consommation d'oxygène seront suivis en continu, de manière à interrrompre le test au moment où la concentration en oxygène atteindra le seuil où les individus adopteront un comportement agité, traduisant un stress aigu.

Choix des espèces

Le saumon de l'Atlantique est une espèce d'eau froide dont la population étudiée est à la limite sud de l'aire de répartition. Connaître ses capacités d'adaptation au changement climatique est donc important pour sa conservation. En effet, cette espèce à forts enjeux économiques, écologiques et culturels est en régression dans son aire de répartition. C'est par ailleurs une espèce modèle en écologie évolutive, et l'interprétation des résultats obtenus dans ce projet bénéficiera de l'abondante bibliographie. C'est une espèce dont la reproduction artificielle est maitrisée, de sorte que les individus impliqués dans ce projet seront issus de pisciculture (alimentée par des géniteurs sauvages) et non prélevés dans le milieu naturel. Les animaux utilisés seront des alevins au stade 0+, environ quatre mois après leur émergence. C'est un stade auquel les alevins sont assez peu mobiles, donc potentiellement sensibles aux étiages et à la structure du microhabitat. Les résultats obtenus alimenteront un modèle de simulation paramétré pour cette espèce, utilisé pour prédire l'évolution démographique et phénotypique des populations soumises au changement climatique.

720 rats en croissance vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun passe la période expérimentale seul en cage, dont deux fois 24 heures en cage métabolique et deux fois trois jours en cage de calorimétrie, avec deux radiographies sous isoflurane, deux prises de sang de 500 microlitres à la queue et un transport en voiture jusqu'à une plateforme distante. Ils sont nourris de régimes volontairement déficients en acides aminés indispensables, pour chercher dans leurs urines et leur sang des marqueurs de cette carence. Le porteur affirme que mesurer la croissance et le comportement alimentaire "empêche" tout remplacement par des modèles cellulaires, et présente le rat comme un modèle de l'enfant dénutri.

Objectifs

La qualité de l’apport alimentaire en protéines des régimes alimentaires dépend de leur capacité à satisfaire les besoins en acides aminés (AA) indispensables (AAI) tout au long des cycles de vie. C’est une question majeure de sécurité nutritionnelle, principalement dans les pays en voie de développement, où l’apport protéique total est modéré, voire bas. Plus généralement, la connaissance de la qualité de l’apport alimentaire en protéine est primordiale pour comparer les différentes sources de protéines, notamment dans le cadre des discussions sur le rééquilibrage des sources alimentaires végétales et animales, et la recherche de sources alternatives de protéines. La composition en AAI est variable selon les sources protéiques. En effet, les protéines d'origines animales ont un profil homogène et équilibré en AAI, alors que les protéines de céréales et les protéines de légumineuses (comme le gluten) sont déficientes en certains AAI. Les profils de référence de besoin en AAI, utilisés pour l’évaluation de la qualité protéique, initialement déterminés à partir de données de bilan azoté, ont été révisés à la hausse (Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO)/Organisation mondiale de la santé (OMS),2007) sur la base de nouvelles méthodes, rendant plus sélectifs les critères de qualité des protéines. Cependant, ces valeurs révisées restent discutées. Ainsi, lors de son rapport sur le besoin en protéines et AA en nutrition humaine, le comité (FAO/OMS) a conclu qu’aucune méthode actuelle d’estimation du besoin en AAI n’est entièrement fiable et qu'iI est donc primordial de proposer de nouvelles approches complémentaires pour préciser les valeurs des besoins et d’évaluer le statut nutritionnel protéique des différentes populations. Pour cela, la FAO a recommandé le recours à l’usage d’outils tels que la métabolomique (ensemble des métabolites), qui a notamment été appliquée avec succès pour estimer le besoin en d’autres micronutriments. L’objectif de ce projet est d’identifier les variations des profils du métabolome urinaire et plasmatique comme biomarqueurs spécifiques de la déficience en AAI et à évaluer l’efficacité de la supplémentation pour valider les biomarqueurs identifiés. Ce projet fait suite à deux projets précédents pour lesquels nous avons identifié et validé des biomarqueurs urinaires pour trois des neuf AAI. Ce projet se déroulera sur 2 sites, dont une plateforme pour évaluer leur dépense énergétique et la composition corporelle.

Bénéfices attendus

L’identification et la validation de biomarqueurs du statut en AAI permettra, à terme, de mieux définir les besoins en acides aminés indispensables. Cela servira à affiner les politiques nutritionnelles et à mieux évaluer la qualité des sources protéiques. De plus, cette étude nous renseignera sur les effets d’une supplémentation en ces acides aminés indispensables après une phase de déficience. Ces effets n’étant que peu rapportés dans la littérature, ces informations seront très utiles, notamment pour l’étude de la sous-nutrition chez l’enfant avec retard de croissance.

Procédures

Durant la période expérimentale , les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire. Les animaux seront placés deux fois pendant la période expérimentale en cages métaboliques pendant 24h pour collecter les féces et les urines, et deux fois en cage de calorimétrie pendant 3 jours pour la mesure de dépense énergétique. La densité minérale osseuse et la longueur du tibia seront analysés par radiographie deux fois au cours de l'expérience après anesthésie gazeuse (anesthésie à l'isoflurane 2% pendant 10-15min). Deux prélèvements sanguins seront effectués au niveau de la veine de la queue de 500μl chacun .A la fin de l'expérimentation, les animaux seront mis à mort et une injection de valine 13C sera réalisée 30 minutes avant l’euthanasie (150μmol/100g poids corporel), dans le but de mesurer la synthèse protéique.

Impact sur les animaux

Durant la période expérimentale, les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire et de leur dépense énergétique (cages de calorimétrie indirecte), ainsi que la collecte des urines et fécès (cages métaboliques), ce qui peut engendre un stress modéré dû à l’isolement des animaux. Les animaux seront transportés à la plateforme 3 jours avant d'effectuer les mesures, afin d’évaluer leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte et leur composition corporelle. La plateforme se situe à plusieurs km de l’unité de rechercheset le transport des animaux sera réalisée en voiture ce qui peut engendrer un stress modéré. Aussi, les prélèvements sanguins lors de la procédure 2 sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré. Une injection sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. L’anesthésie gazeuse permettra de réduire la douleur engendrée par l’injection.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser des analyses sur différents tissus cibles.

Remplacement

La nécessité de mesurer les conséquences de l'ingestion d’un régime à faible teneur en AAI sur le comportement alimentaire et les paramètres de la croissance (gain de poids et composition corporelle) empêche le remplacement de l'expérimentation animale par des modèles cellulaires ou moléculaires. Les résultats de ce projet permettront de mettre en place une étude clinique chez l’enfant dénutri. Ainsi, les objectifs de ce projet ne peuvent être atteints sans avoir recours à l’animal, le rat étant un modèle pour l'humain, en particulier pour la nutrition.

Réduction

A partir des données issues d’une étude précédente, nous avons déterminé qu’un effectif de 10 rats par groupe est le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garder une puissance statistique satisfaisante. Cette étude inclue 6 lots, correspondant à chaque AAI à étudier. L’expérimentation comprendra 80 animaux pour chaque AAI étudié.

Raffinement

Le projet impose l'hébergement des rats en cages individuelles (répondant aux normes en vigueur) pour la mesure précise de la consommation alimentaire. Les rats demeurent dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils continuent à échanger par vocalises, et ils les voient et les sentent, ce qui modère l’impact de l’isolement. De plus, les cages seront enrichies au moyen de différents objets (tunnel, d’une tasse renversée, …) . De plus, un enrichissement social est prévu : les animaux seront placés en cages collective tous les jours pendant 2 h (durant les mesures de poids corporel et de gaspillage alimentaire). Les prises de sang sont réalisées par un expérimentateur expérimenté pour cet acte technique. Des aiguilles spécifiques permettant un écoulement plus efficace du sang en sortie d’aiguille sont utilisées, ce qui permet de limiter la durée et le stress engendré par les prises de sang. Les animaux seront transportés à la plateforme en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : Les animaux seront regroupés en fonction des régimes en cages collectives de transport avec de l’eau en gelée et de la nourriture à disposition. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Comme l’humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus, l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’homme, le porc ou le rat pour étudier la qualité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Nous utiliserons ainsi des rats en croissance comme modèle de l'enfant en croissance.