Système endocrinien

800 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à cinq gavages, subir dix-huit prélèvements sanguins et cinq mises à jeun, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent des mélanges d'antibiotiques pendant quelques jours à deux mois, pour que leur flore intestinale soit détruite, puis passent jusqu'à quatre tests métaboliques comportant chacun six heures de jeûne et quatre prises de sang. Le porteur écrit que ce protocole produit "a priori peu d'effets indésirables", tout en listant déshydratation, perte de poids et diarrhées. Toutes sont tuées pour que leurs cellules intestinales productrices d'hormones soient triées, au service d'une question posée en termes de santé humaine, l'obésité et les maladies inflammatoires de l'intestin.

Objectifs

Les intestins sont un organe majeur pour la santé car ils sont à l’interface entre alimentation, les bactéries intestinales et l’organisme. L’intestin permet notamment la digestion et l’absorption des aliments, tout en faisant barrière aux microbes et aux toxines. L’intestin produit également des hormones qui régulent les fonctions de différents organes, modulant ainsi par exemple le comportement alimentaire, la régulation énergétique ou les fonctions intestinales (transit intestinal, digestion…) elles-mêmes. Ces hormones sont produites par des cellules intestinales spécifiques, appelées cellules entéroendocrines (EECs). Ces cellules libèrent les hormones en réponse à des modifications de leur environnement. Des modifications des fonctions intestinales et notamment des hormones intestinales sont associées à différentes maladies telles l’obésité ou des maladies digestives. Ces maladies sont également associées à une modification des bactéries intestinales. Il a été montré que la déplétion complète du microbiote intestinal induit une modification importante des EECs et une augmentation des niveaux circulant de certaines hormones. Notre travail de recherche vise à mieux caractériser comment les bactéries de l’intestin influent sur les hormones intestinales et les cellules qui les produisent. Dans ce projet, nous modulerons le microbiote intestinal par l’action d’antibiotiques, mesurerons le niveau des hormones et analyserons précisément ces cellules grâce à l’utilisation de souris exprimant une fluorescence associée à ces cellules et permettant de les isoler. Nous chercherons notamment à identifier quelles sont les bactéries ou leurs produits responsables des modifications observées des EECs, ainsi qu’aux conséquences fonctionnelles des niveaux élevés de certaines hormones intestinales.

Bénéfices attendus

Le rôle de l’intestin et en particulier des hormones intestinales pour la santé de l’homme apparait comme étant très important, en particulier dans l’obésité ou les maladies inflammatoires de l’intestin, qui touchent plus de 650 millions d’individus à travers le monde. Un lien entre microbes et les cellules produisant les hormones intestinales a déjà été établi. Cette étude nous permettra d’identifier plus précisément comment certains produits microbiens ou certaines bactéries modulent les fonctions des EECs et quelles sont les conséquences sur la physiologie de l’hôte. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant de trier cette population cellulaire rare, et mesurerons les niveaux d’hormones après différentes stimulations. Cela nous permettra d’identifier comment ces cellules sont régulées dans différents contextes microbiens et d’en déduire les produits microbiens qui régulent ces cellules. Compte tenu des fonctions importantes de ces hormones pour la santé, ce projet permettra de proposer de nouvelles voies modulant leurs niveaux et ainsi agir sur les fonctions quelles régulent, notamment dans le cas de maladies où ces fonctions sont altérées.

Procédures

Les 800 animaux recevront des mélanges d’antibiotiques dans leur eau de boisson pendant quelques jours à deux mois. Toutes les expérimentations seront réalisées sur animaux vigiles. Les animaux seront pesés deux fois par semaine, et leur consommation alimentaire mesurée en parallèle. Au maximum quatre tests métaboliques seront réalisés sur tous les animaux. Chaque test comporte une phase de jeûne (6h), quatre prélèvements sanguins au maximum, et un gavage ou une injection d’un stimulus d’intérêt Certains animaux recevront une injection préalable à l’administration du stimulus. La durée d’un test métabolique n’excède pas deux heures entre la première prise de sang et la dernière et chaque prélèvement de sang en lui-même n’excède pas trente secondes. Un gavage supplémentaire au moment de la mise à mort (entre 10 minutes et une heure avant l’euthanasie) sera également réalisé sur des animaux mis à jeun pendant 2 à 6 heures pour la mesure du transit intestinal. Des prélèvements de sang seront réalisés lors de la mise à mort, avant le gavage et au moment de la mise à mort. Lors des mesures de transit, certains animaux recevront également une injection préalable pour étudier le rôle des hormones. Au total, les 800 animaux pourront recevoir jusqu’à 5 gavages, être prélevés pour leur sang 18 fois et mis à jeun 5 fois, en recevant les traitements antibiotiques pendant un maximum de deux mois.

Impact sur les animaux

Ce protocole produit a priori peu d’effets indésirables sur les animaux : la consommation des antibiotiques dans l’eau de boisson a déjà été pratiquée à de nombreuses reprises sans impact sur la santé et le comportement des animaux. Les effets indésirables des antibiotiques peuvent être une déshydratation, une perte de poids ou l’apparition de diarrhées. Les injections, gavages et prélèvement de sang peuvent induire une légère douleur et un stress du fait de la contention. Les jeûnes peuvent conduire à une perte de poids réduite, rattrapée les jours suivants. Les stimuli administrés n’ont pas d’effet indésirable connu chez les animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récolter leurs tissus pour l’isolement des cellules produisant les hormones intestinales par tri cellulaire. Les fonctions des cellules pourront alors être analysées par différentes techniques

Remplacement

L’utilisation de souris pour cette expérimentation est nécessaire par l’impossibilité d’étudier in vitro ou de modéliser l’interaction entre les bactéries et l’intestin du fait de l’absence de modèles pour cultiver un microbiote complexe en contact direct avec un épithélium intestinal dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’étudier l’ensemble des EECs.

Réduction

Dans ce projet, nous utiliserons des groupes de 8 animaux de même sexe. Ce nombre a été évalué comme suffisant par l’analyse statistique des variations de chaque variable au sein d’un groupe lors de projets précédents La rareté des cellules entéroendocrines nécessitant l’utilisation de tissus entiers pour chaque application. Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles car l’effet sexe est inconnu. Des analyses statistiques permettront d’étudier l’effet sexe sur la déplétion du microbiote.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, d'un abri en propylène rouge, et d’un support suspendu et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et seront hébergés à plusieurs par cage pour éviter l'isolement. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Une grille de décision (points limites) est établie.Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux. Les animaux seront habitués à être manipulés avant et pendant toute la durée de l’expérimentation afin de diminuer leur stress lors de la contention et les prélèvements.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont issues d’une lignée génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente dans toutes les cellules entéroendocrines. Cette lignée est un modèle particulièrement utile pour l’étude des cellules entéroendocrines, permettant de les trier ou de les distinguer facilement lors de l’analyse des tissus. L’étude portant sur les cellules entéroendocrines matures, des souris adultes (8 à 12 semaines au démarrage du protocole) seront utilisées. Les hormones intestinales et le système digestif de la souris étant très proche de celui de l’Humain, l’utilisation du modèle souris apporte des connaissances généralisables pour la santé humaine.

Pour vérifier si l'obésité se transmet à la descendance par les ARN des spermatozoïdes, des ARN prélevés chez des hommes obèses sont microinjectés dans des œufs fécondés de souris, et la descendance est laissée grossir. 744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À quatre mois elles subissent un test de tolérance au glucose, à quatre mois et demi un test de sensibilité à l'insuline, avec des prises de sang à la queue toutes les quinze minutes la première heure puis toutes les demi-heures. Une souris qui perd 10 % de son poids deux semaines de suite est tuée, et les autres le sont à cinq mois et demi pour prélever reins, tissus adipeux, cœur, pancréas, prostate, cerveau et foie.

Objectifs

L'obésité pose aujourd'hui un grave problème de santé publique. Bien que cette pathologie soit étroitement associée à une mauvaise hygiène de vie, de plus en plus de données épidémiologiques et expérimentales convergent vers la même idée : nos gènes se « souviennent » de l’hygiène de vie de nos parents ou en d’autres termes un phénotype nouvellement acquis ici l’obésité peut être transmis à la descendance via la lignée germinale paternelle et/ou maternelle. Ce type d’hérédité non darwinienne est un processus nouveau mettant en jeu des mécanismes dits « épigénétiques » qui font appel à des modifications qui ne sont pas codées par la séquence nucléotidique du gène. Contrairement aux modifications génétiques, les modifications épigénétiques induites par l’environnement sont instables et ne persistent que pendant 2 ou 3 générations. Les mécanismes moléculaires impliqués dans ce type d’hérédité sont encore très mal connus. On sait néanmoins que les petits ARNs présents dans le spermatozoïde de souris rendues obèses par une alimentation riche en graisse et en sucre sont les vecteurs de cette hérédité. L'objectif principal de notre projet est de valider le rôle des ARN des spermatozoïdes dans l’hérédité épigénétique de l’obésité chez l'homme. Pour cela, des ARN de spermatozoïdes d’hommes obèses et d’hommes non-obèses seront microinjectés dans des œufs fécondés de souris. Les caractères obèse et diabétique seront analysés sur les animaux obtenus. La présente demande correspond à l’analyse phénotypique des animaux obtenus après microinjection et de leurs descendants.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider le rôle des ARN de spermatozoïdes comme vecteurs de l'information épigénétique de l'obésité et du diabète chez l'homme. Sur le plan fondamental, ce projet conduira à mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l’hérédité de l’obésité et du diabète chez l’homme. Sur le plan clinique, cette compréhension est une étape importante pour sinon stopper au moins ralentir l’épidémie mondiale de l’obésité. Cela conduira à identifier les parents, ici les pères, susceptibles de transmettre cette maladie à leurs descendants. Dans un premier temps, ce projet apportera des arguments aux cliniciens pour intégrer les parents et les descendants de parents obèses dans des programmes de prévention. Dans un deuxième temps, ce projet permettra de valider une méthode pour enlever ces marques épigénétiques délétères (marques non stables) soit via des voies interventionnelles (amaigrissement) soit par des voies moléculaires (éliminant des molécules inductrices).

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à 3 séries de prélèvements. A l'âge de 4 mois, les souris subissent un test de tolérance au glucose (Test GTT) et à l'âge de 4mois 1/2 un test pour mesurer leur sensibiltié à l'insuline (test ITT). Pour ces 2 tests, du sang sera prélevé au niveau de la queue . La glycémie est vérifiée toutes 15min la 1ère heure et toutes les 30 min la 2ème heure. A l'âge de 5 mois, les souris seront mises à mort et un prélèvement de sang sera effectué.

Impact sur les animaux

A notre connaissance, les animaux obtenues après microinjection d'ARN de spermatozoïdes ne développent pas de pathologies graves. Même si elles peuvent devenir obèses et diabétiques, la sévérité de ces pathologies reste modérée. L' Injection Intrapéritonéale de Glucose ou d'Insuline et le prélèvement à la queue, associés aux tests GTT et ITT, induisent une douleur légère de courte durée. Le prélèvement de sang en fin de procédure induit également une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale. Cela nous permettra de prélever plusieurs tissus (reins, tissus adipeux, coeur, pancreas, prostate, cerveau, foie). Certains seront directement congelés pour des analyses moléculaires et d'autres seront fixés pour analyses histologiques. Ce matériel biologique nous est indispensable pour réaliser les analyses moléculaires nécessaires à la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l'hérédité épigénétique de l'obésité et du diabète.

Remplacement

Notre travail porte sur la transmission paternelle de caractères nouvellement acquis chez les mammifères et plus spécifiquement l'hérédité. L’hérédité épigénétique a été étudiée sur plusieurs modèles animaux vertébrés ou non-vertébrés. En utilisant des vers, il a été ainsi montré que les ARN étaient un vecteur de l’hérédité épigénétique pour des caractères sensorielles. Le rôle des ARN des spermatozoïdes comme vecteurs connus de cette hérédité a été montré chez la souris car il n’est pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou des modèles animaux non vertébrés pour étudier le rôle des ARN dans l’hérédité épigénétique de l’obésité. C'est pourquoi nous devons utiliser ce modèle expérimental animal pour valider l'hypothèse selon laquelle les ARN des spermatozoïdes sont des vecteurs de l'hérédité chez l'homme. Seul le modèle murin peut permettre de récapituler toutes les étapes de développement embryonnaire d’un organisme multicellulaire de mammifère. A l’heure actuelle, ce type de différenciation ne peut pas être réalisé in vitro. C’est pour cela que ce modèle a été utilisé jusqu’à présent et a permis démontrer que les ARN de spermatozoïdes de souris étaient un vecteur de l’hérédité épigénétique de l’obésité. Pour savoir si cela reste vrai chez l’homme, seul ce modèle expérimental est disponible. C’est pourquoi nous avons choisi de l’utiliser. Nous avons utilisé comme approches alternatives le vers pour étudier les mécanismes moléculaires de l’hérédité épigénétique. Néanmoins même si grâce à cette approche, nous avons pu identifier des mécanismes moléculaires associés, nous ne pouvons définir si ces mécanismes sont identiques dans des modèles animaux expérimentaux comme la souris et si ces mécanismes épigénétiques s’appliquent pour des maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète de type II. Néanmoins les différences spécifiques entre les espèces et les tissus peuvent limiter la généralisation des résultats obtenus à partir de ce modèle non vertébré. Par conséquent, il est nécessaire d'utiliser ce modèle animal vertébré, la souris, pour obtenir une vision plus complète de la complexité de l'hérédité épigénétique de l'obésité et valider l'hypothèse selon laquelle les ARN des spermatozoïdes sont des vecteurs de l'hérédité chez l'homme.

Réduction

Avant ces expériences, nous avons utilisé, parallèlement à notre modèle murin et en collaboration, un modèle non-vertébré, Caenorhabditis elegans, un petit ver transparent et non parasitaire. Ce modèle nous a permis d’étudier certains aspects des mécanismes moléculaires de cette hérédité sans avoir recours au modèle animal vertébré. D’autre part afin de calculer la taille de l’échantillon nécessaire, nous avons réalisé un calcul de puissance basé sur nos précédentes expériences, test qui permet de minimiser le nombre d’échantillons et donc d'animaux nécessaires pour valider ou non notre hypothèse de départ. Enfin, grâce à nos analyses du transcriptome d'hommes obèses, nous avons sélectionné les hommes où les variations transcriptomiques étaient les plus fortes. Ce sont ces préparations qui seront utilisées dans ces expériences pour maximiser les potentiels effets des ARN sur la descendance.

Raffinement

Dans un souci de Raffinement, voici les dispositions que nous mettrons en place pour minimiser les souffrances éventuelles et le stress qui pourraient être générées par nos expériences : • Nous nous attendons à ce que nos souris deviennent obèses. Pour éviter de les séparer lorsqu’elles vieillissent (et ainsi de respecter le maximum de souris autorisées par cage) et de les stresser inutilement (en évitant de perturber la dominance déjà établie), les souris seront regroupées par 4 dans une cage dès leur arrivée à l’animalerie. Ces animaux seront observés hebdomadairement pour pouvoir détecter d’éventuels problèmes. Si un de nos animaux est gravement blessé (bagarre ou autres), et/ou perd 10% de son poids pendant 2 semaines consécutives, cet animal sera mis à mort et répertorié. • Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test GTT et ITT et limite ainsi les manipulations des animaux. • Toutes les souris seront manipulées au moins une fois par semaine • Les souris seront identifiées par punch à leur arrivée. Cette identification est définitive et ne peut pas induire d’infection. D’autre part, elle permet une identification rapide des souris lors des tests GTT et ITT et limite ainsi les manipulations des animaux. • Afin de limiter le stress lors des tests GTT et ITT, chaque souris sera identifiée par 0, 1, 2 ou 3 traits au feutre au niveau de la queue pour accélérer leur identification (feutre inodore spécial et non toxique). Le premier test (GTT) sera réalisé lorsque la souris sera âgée de 4 mois, le second test (ITT) sera réalisé une à deux semaines après. Lors des tests de GTT et ITT, la glycémie sera vérifiée toutes les 15 min (1ère heure) toutes les 30 min (2ème heure) pendant une période de 2 heures. Si lors des tests ITT, la glycémie est faible (

Choix des espèces

Notre projet porte sur la transmission paternelle de caractères nouvellement acquis sur un mammifère. Nous avons choisi d’utiliser la souris car la technique de micro-injection d’ARN dans les œufs fécondés est solidement établie dans cette espèce ce qui n’est pas le cas chez le rat seul autre modèle expérimental de mammifère largement utilisé pour étudier l’obésité et le diabète. D’autre part, au cas où nous voudrions poursuivre ce projet en étudiant l’impact de gènes spécifiques dans ce mode d’hérédité, nous pourrions utiliser ou générer des souris génétiquement modifiées invalidées pour le gène d’intérêt. Les pesées seront réalisées une fois par semaine de l’âge de 1 à 5 mois 1/2. Cela nous permettra de suivre le possible développement de l’obésité. Les tests GTT et ITT seront effectués à l'âge de 4 mois et 4mois 1⁄2 respectivement. En effet, nos résultats ainsi que ceux publiés par d'autres groupes montrent que la micro-injection d'ARNs spermatiques dérivant de souris obèses induit le diabète seulement chez les animaux adultes. Les prélèvements de sang terminal et d’organes et tissus (reins, tissus adipeux, coeur, pancreas, prostate, cerveau, foie) seront réalisés à l’âge de 5 mois 1/2. La mise à mort aura lieu 2 semaines après le dernier test pour que les souris récupèrent d’un éventuel stress et que les analyses moléculaires ne soient pas altérées.

Vingt rats subissent l'ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes sous anesthésie, dix un simulacre d'opération, puis tous sont transportés trois heures par la route jusqu'au site d'expérimentation. 30 rats vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent l'implantation d'une minipompe sous la peau, cinq séjours de deux jours en cage à métabolisme, quinze injections dans l'abdomen et cinq ponctions de la veine de la queue, pour savoir si des excès de calcium répétés abîment le rein. Le porteur énumère lui-même les atteintes attendues, douleur opératoire, hémorragie, infection de plaie, hypocalcémie, insuffisance thyroïdienne, angoisse en cage à métabolisme et douleur à chaque piqûre.

Objectifs

L’hypoparathyroïdie est une maladie endocrine rare et complexe, caractérisée par une concentration basse ou indétectable d’hormone parathyroïdienne (PTH) entrainant une hypocalcémie et une hyperphosphatémie lorsqu’elle n’est pas traitée. Le traitement conventionnel est une association de métabolite de la vitamine D et de sels de calcium. Un effet secondaire habituel de ce traitement est une hypercalciurie ainsi que des épisodes d’hypercalcémie. Les 2 sont dus à une augmentation de l’absorption intestinale de calcium et à une diminution de la réabsorption tubulaire rénale de calcium, due à l’absence de PTH. L’hypoparathyroïdie et/ou le traitement conventionnel sont associés à une augmentation de la morbidité rénale, sous forme d’une lithiase rénale et/ou d’un néphrocalcinose et/ou d’une insuffisance rénale. Selon les séries, la prévalence de l’insuffisance rénale s’étend de 14 à 41 pour cent, dans tous les cas beaucoup plus élevée que dans la population générale. Epidémiologiquement, le risque d’insuffisance rénale est associé au nombre d’évènements hypercalcémiques et à la durée de la maladie. L'objectif du projet est de déterminer expérimentalement s'il existe un lien de causalité entre la survenue d'épisodes répétés d'hypercalcémie et la survenue d'une insuffisance rénale, et, si oui, d'en déterminer le mécanisme.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif principal de déterminer l'éventuel lien de causalité entre épisodes répétés d'hypercalcémie, induite par un surdosage thérapeutique (fréquent en médecine humaine) et la survenue d'une dégradation de la fonction renale, une des principales morbidités observées au cours du suivi des patient.es avec hypoparathyroïdie. La démonstration du lien de causalité aurait 2 conséquences -

Procédures

Voici la liste des interventions réalisées chez les animaux. Une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes (ou un simulacre) est réalisée, sous anesthésie générale et analgésie (30 minutes, 1 fois). Les animaux sont transporté du site d'élevage (où a lieu la chirurgie) au site d'expérimentation, par transport routier agréé (3 heures, 1 fois). Un traitement par hormone thyroïdienne dans l'eau de boisson est apporté aux animaux ayant subi une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes pendant 71 jours. Une minipompe sous cutanée est implantée sous anesthésie générale et analgésie (5 minutes, 1 fois). Les animaux subissent une acclimatation à l'hébergement en cage à métabolisme pour habituation (animal vigile, 3 jours, 1 fois). Dix animaux reçoivent un régime riche en calcium (animal vigile, 3 jours, 5 fois). Les animaux reçoivent une injection intrapéritonéale quotidienne (animal vigile (1 minute par injection), 3 jours de suite, 5 fois). Les animaux sont hébergés en cage à métabolisme pour recueil d’urine (animal vigile, 2 jours, 5 fois). Un prélèvement sanguin par ponction de la veine de la queue est réalisé chez les animaux (animal vigile, 1 minute, 5 fois); le volume prélevé est conforme aux recommandations. Une euthanasie est pratiquée chez les animaux sous anesthésie générale et analgésie par une méthode réglementaire (10 minutes, 1 fois).

Impact sur les animaux

Tous les animaux subissent une chirurgie cervicale : il s’agit d’une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes (thyroparathyroïdectomie) chez 20 d’entre eux et d’un simulacre chez 10 d’entre eux. La plaie opératoire peut être à l’origine de douleurs ou d’inconfort, la thyroparathyroïdectomie cause une hypocalcémie et une insuffisance thyroïdienne. La chirurgie peut être cause d’hémorragie et d’infection de plaie. Tous les animaux sont transportés du site de l’éleveur au site d’expérimentation par transport routier, ce qui peut induire un stress. Les animaux de tous les groupes subissent une chirurgie sous anesthésie pour implantation de la pompe sous-cutanée : la plaie opératoire peut être à l’origine de douleurs ou d’inconfort. Par ailleurs, la chirurgie peut être cause d’hémorragie et d’infection de plaie. Tous les animaux sont hébergés périodiquement en cage à métabolisme : cet hébergement peut être à l’origine d’une perte de poids transitoire, toujours inférieure dans notre expérience à 10 pour cent du poids initial, d’angoisse et d’intolérance à l'hébergement en cage à métabolisme. Des injections intrapéritonéales de calcitriol ou de placebo, et d’anesthésiques sont réalisées chez les animaux, causant une douleur au point d'injection. Des ponctions veineuses sont réalisées de manière itérative chez tous les animaux : ces ponctions causent une douleur et peuvent causer une hémorragie.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés selon une méthode réglementaire, avant le prélèvement de tissus pour analyse moléculaires (ARNm et protéines)

Remplacement

La complexité des mécanismes contrôlant la valeur de calcium dans le sang et la fonction rénale est telle que le remplacement n'est pas possible puisqu'il s'agit d'étudier les conséquences des épisodes d'hypercalcémie sur un organisme entier, avec toute sa complexité et ses capacités d'adaptation. Il n'y a pas d'alternative à cette étude, les modèles cellulaires existant ne permettant pas de rendre compte de la complexité du fonctionnement de l'organisme intact.

Réduction

Trente (30) animaux seront utilisés dans cette étude. Le nombre d’animaux par groupe est déterminé de façon à assurer des observations fiables et utilisables. Les mesures réalisées dans la domaine de l'homéostasie tiennent compte de l'état de l'art de manière à avoir la meilleure performance des mesures réalisées et réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été calculé en tenant compte de la variabilité des paramètres d’intérêt en fonction des conditions expérimentales; les nombres d'animaux nécessaires ont été déterminés en s’appuyant sur un calcul de puissance ; les comparaisons des résultats entre les groupes se feront grâce à des tests statistiques validés.

Raffinement

Toutes les procédures le nécessitant seront réalisées sous anesthésie. Par procédure le nécessitant, est définie toute procédure générant une douleur ou une souffrance supérieure à une piqure transcutanée par une aiguille. L’anesthésie est encadrée par une analgésie lors de l’implantation des pompes ; après la chirurgie, l’analgésie est maintenue systématiquement pendant 48 heures. Dans la mesure du possible, en fonction des contraintes des procédures, les animaux bénéficient d’un environnement enrichi (l’environnement est enrichi par des tunnels en carton et/ou des abris en plastique, et des boules de ouate) et leur souffrance est prise en compte et atténuée au maximum. Lorsqu'un hébergement en cage à métabolisme est nécessaire, les animaux sont préalablement acclimatés à cet environnement, et la durée d'hébergement est réduite au strict nécessaire. Des soins peuvent être mis en place en fonction des signes de souffrance observées (soins médicamenteux, raffinement des conditions d’hébergements, et des techniques de chirurgie etc…). Des points limites ont été définis et les animaux font l'objet d'une surveillance au cours des différentes procédures exposées dans la demande

Choix des espèces

L'espèce étudiée est le rat chez qui l’homéostasie du calcium est proche de celle de l’humain et chez qui la thyroparathyroïdectomie est techniquement réalisable. La stade de développement est celui du jeune adulte, ce qui correspond à l’âge auquel sont souvent réalisées les thyroparathyroïdectomies chez l’humain.

30 porcs en croissance vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 18 tués à l'issue et 12 renvoyés en élevage jusqu'à l'abattoir. Douze d'entre eux passent une heure sous anesthésie générale pour recevoir deux cathéters dans la veine jugulaire et un capteur de température dans un muscle, puis vivent quatre semaines en loge individuelle, alors que le porc vit normalement en groupe. Ils subissent 78 prélèvements de sang, soit 6 % de leur volume circulant, et une exposition à la chaleur dont le porteur écrit qu'elle peut provoquer une hyperthermie grave au-delà de 41,5 °C. L'ensemble sert à valider des capteurs présentés comme une alternative aux prises de sang, le porteur qualifiant cette étape d'"indispensable" pour raffiner les pratiques d'élevage face aux canicules.

Objectifs

Le projet vise à décrire et comprendre la complexité des mécanismes d’adaptation individuelle du porc en croissance face à un stress thermique qui simule ce qui se passe au cours d’une vague de chaleur estivale. Les constantes physiologiques d'un animal sont dépendantes de mécanismes de régulation interne qui permettent aux cellules de l'organisme d'utiliser les éléments apportés par l'alimentation et la boisson tout en maintenant les équilibres hydriques et électrolytiques dans une gamme permettant aux cellules et aux organes de fonctionner correctement. Les éléments qui jouent un rôle important dans ces régulations sont notamment le glucose (sous l'action de l'insuline) et les cations comme le sodium. Le glucose est l'un des principaux nutriments énergétiques apportés par l'aliment sous forme d’amidon puis libéré des tissus où il est stocké transitoirement sous forme de glycogène entre les repas. Le sodium est un élément important pour équilibrer l'eau dans les cellules (équilibre osmotique) et permettre le fonctionnement des muscles ; une variation de sa concentration peut traduire un trouble de l'hydratation (suite à l'élévation de la température ou à une hyperglycémie marquée par exemple). Or l'amplitude de variations des paramètres physiologiques et la latence avant le retour à l'équilibre sont très différentes d'un individu à l'autre, en fonction de sa capacité à s'adapter ou non à une modification de son environnement (type d'aliment, stress thermique, etc...). Il s’agit ainsi de mettre en relation des données fournies à haute fréquence de mesures par de nouveaux capteurs biologiques avec les variations de plusieurs paramètres sanguins mesurés par des prélèvements sériés pour évaluer la synchronisation des différents évènements métaboliques et physiologiques durant les cycles jour et nuit. La signification biologique des variations sera interprétée en relation avec le type de modifications de la température ambiante (thermoneutralité ou température élevée) et de la prise alimentaire (fréquences des repas, quantité ingérée), et au regard de données comportementales mesurées chez les mêmes animaux (vidéos de l’activité physique et d’abreuvement, accéléromètres embarqués sur les animaux, paramètres de visites aux automates d'alimentation, prélèvements ponctuels de salive pour mesurer le niveau de stress).

Bénéfices attendus

Les connaissances acquises sont de nature à nous permettre de mieux comprendre la synchronisation des différents évènements métaboliques (concentrations circulantes des molécules) et physiologiques (température interne) au regard des réponses adaptatives, afin de raffiner les pratiques en amont pour minimiser les conséquences d'évènements dégradant le bien-être de l'animal. En outre, les variations des composantes physiologiques de l’adaptation de l’animal sont difficiles à évaluer à des échelles de temps rapprochées sans procédures invasives et contraignantes pour l'animal et exigeantes en main-d'œuvre pour les expérimentateurs. Valider la pertinence des mesures obtenues avec des capteurs métaboliques et physiologiques sur un éventail restreint de molécules cibles constitue une étape indispensable pour analyser les états physiologiques en réponse aux modifications de conditions environnementales ou de pratiques et les conséquences sur le bien-être animal, et en fournissant une alternative à la technique invasive de prélèvements sanguins qui fait actuellement référence chez le porc.

Procédures

* Opérations chirurgicales sous anesthésie générale (durée =1 heure) pour équiper les animaux de deux cathéters veineux et d'un capteur de température interne. Douze animaux sont concernés. * Tranquilisation à dose préanesthésique (durée = 15 min) pour la pose de capteurs physiologiques en intradermique. Dix-huit animaux sont concernés (12 animaux expérimentaux et 6 animaux utilisés dans des tests de design d'un des capteurs). * Prélèvements de sang en cinétique : 1/ après ingestion d'un repas (durée totale de 4 heures), nous allons réaliser une cinétique de prélèvements 2 fois pendant l'expérimentation. Pour chaque cinétique, 15 prélèvements de 2,5 mL seront effectués; et 2/ durant un nycthémère (24 h), nous allons réaliser une cinétique de prélèvements 2 fois durant l'expérimentation également. Pour chaque cinétique, 24 prélèvements de 2,5 mL seront effectués. Au toal, ces prélèvements de sang via un petit tuyau inséré dans la veine jugulaire, correspondent à 6 % du volume circulant prélevé sur chaque porc. Douze animaux déclarés dans la demande d'autorisation de projet sont concernés. * Prélèvements de salive : 2 prélèvements/jour 5 fois pendant l'essai à l'aide d'un tampon à mâcher (durée du prélèvement = 2 min). Douze animaux déclarés dans la demande d'autorisation de projet sont concernés.

Impact sur les animaux

Tous les porcs seront hébergés dans des loges individuelles durant 4 semaines, constituant une contrainte pour un animal vivant habituellement en groupe. Ce logement est strictement nécessaire pour obtenir un corpus de données individuelles (comportement alimentaire, prise de sang sériées, mesure en continue de la glycémie, etc..). L’implantation intramusculaire du capteur de mesure de la température interne et l’insertion de deux petits tuyaux souples (cathéters) dans la veine jugulaire s'effectuent sous anesthésie générale (mélange gazeux). Cette anesthésie et la phase de réveil constituent en soi une nuisance pour l’animal, de même que la phase de cicatrisation qui suit l’opération. Nous ne pouvons pas totalement exclure la survenue d’une infection locale liée à la présence et à l'utilisation du cathéter. La présence d'aiguilles sur les deux capteurs placés en intradermique (1 aiguille de 10 mm pour le capteur glycémique, plusieurs microaiguilles de 2 800 µm de hauteur et 600 µm de diamètre pour le capteur de conductimétrie) peuvent entraîner une gêne pour l’animal lors de ses mouvements. Les capteurs métaboliques sont sécurisés sur l’encolure de l’animal par une bande adhésive, ce qui peut entraîner une gêne. Les prélèvements de sang et de salive étant réalisés par du personnel compétent dans le cadre de procédures où les points limites sont définis et où des observations quotidiennes sont faîtes sur les animaux, nous ne nous attendons pas à des nuisances particulières liées aux prélèvements. Enfin, une nuisance attendue est liée à l’exposition des porcs à la chaleur, sans pouvoir totalement exclure la survenue d’une hyperthermie grave (>41,5°C pour la température interne).

Devenir

Les porcs (n=12) ayant subi une opération chirurgicale ne pourront pas être réintégrés dans le troupeau. Ils seront euthanasiés à la fin de l'expérience. Les porcs utilisés pour optimiser le design du capteur de conductimétrie (n=6) seront également euthanasiés pour pouvoir examiner l'état de leur derme après implantation du capteur. Les porcs non opérés (12 porcs) servent de témoins pour valider l’absence d’effets négatifs de l’opération sur le comportement; s'ils ne sont pas utilisés comme remplaçants d’un des animaux expérimentaux en cas d’atteinte d’un point limite, ils seront replacés dans un bâtiment d'élevage dédié, et conduits selon des pratiques d'élevage standards jusqu'au stade de commercialisation (environ 115 kg de poids vif). Il n'y a pas de réutilisation de ces animaux à des fins scientifiques..

Remplacement

Le porc est l'espèce cible de ce projet qui vise à étudier les mécanismes de régulation des constantes physiologiques face aux défis posés par des changements dans l'environnement et vis à vis de variations de son état de bien-être. Il n'est pas possible d'étudier les variations des paramètres métaboliques et physiologiques au regard des modifications comportementales, sans utiliser des porcs de génotype conventionnel (Large White x Landrace x Piétrain) utilisés actuellement dans les élevages commerciaux. Cela permettra ensuite d’objectiver les actions à mettre en place en élevage, et au bénéfice de la santé des porcs et de leur bien-être. L'utilisation d'animaux vivants est nécessaire pour rendre compte de processus biologiques extrêmement dynamiques et sujets à une large variabilité entre individus, face aux variations de la température ambiante. Le remplacement n’est pas possible car l’utilisation d’animaux est inhérente au type d’étude (stratégies individuelles d'adaptation des porcs aux impacts du changement climatique).

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum statistique en fonction des mesures effectuées. Chaque porc est son propre témoin durant les deux périodes expérimentales (thermoneutralité et chaleur), ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires (ANOVA intra-porc avec l'effet répété du temps pour comparer les valeurs à thermoneutralité ou en période de température chaude). Outre la bibliographie sur la variabilité des constantes physiologiques et métaboliques, un précédent projet sur la validation de capteurs glycémiques a permis de confirmer qu'un nombre de 10 à 12 porcs est optimal pour prendre en compte les échecs de fonctionnement du cathéter ou du capteur.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un suivi très proche par les techniciens en expérimentation animale formés à l'éthique. La surface des loges (2 m²) permet à l'animal d'avoir une activité minimale et les loges offrent la possibilité d'interactions entre porcs grâce à des ouvertures faites dans les séparations entre deux loges. Dans chaque loge, des jouets (toile, étoile...) et d'autres dispositifs d'enrichissement (ex. chaine) seront placés et régulièrement renouvelés afin de limiter l'ennui. Toute intervention potentiellement douloureuse ou stressante sera réalisée par du personnel habilité, formé et expérimenté et les animaux seront suivis de manière rapprochée dans les minutes et heures qui suivent l’intervention. L’utilisation d'un capteur de température placée en intramusculaire nous permet de limiter les interactions entre les expérimentateurs et les animaux et le stress engendré par la prise de température manuelle par thermomètre rectal, tout en améliorant la qualité de la mesure obtenue (fréquence et précision). Dans le cadre de prélèvements répétés de sang, le recours à un cathéter veineux permet de réduire significativement le niveau de stress de l’animal, comparativement à celui induit par un prélèvement de sang obtenu à l’aide une aiguille plantée dans la jugulaire et nécessitant la contention de l’animal par un dispositif de contention nasale. Les prélèvements de sang au cathéter jugulaire sont réduits au volume nécessaire pour les dosages de constantes métaboliques (2,5 mL/prélèvement) pour une cinétique avec 15 points de prélèvements après un repas test (1 point avant le repas, 14 points durant les 4 h qui suivent le repas). Durant le nycthémère complet, on prélèvera le même volume de 2,5 mL toutes les heures, soit 24 prélèvements. Ainsi, un volume total de 100 mL de sang sera prélevé la première semaine expérimentale et à nouveau 100 mL la deuxième semaine expérimentale. Cela correspond à environ 6% du volume sanguin total à l'issue de l'expérimentation, en considérant qu'il y a 65 mL de sang /kg de poids vif. L'utilisation de salivettes pour des prélèvements journaliers de salive pendant la période de stress thermique permet aussi de réduire le stress et la manipulation de l'animal grâce à une habituation au dispositif pendant la période d’adaptation. Les capteurs métaboliques ont pour objectif d'obtenir un grand nombre de données (toutes les 2 à 5 min) en continu pendant 5 jours mais sans avoir à manipuler l'animal.

Choix des espèces

- Le porc ne peut pas être remplacé par une espèce modèle compte tenu de la spécificité de ses réponses de thermorégulation (le porc ne possède pas de glandes sudoripares actives) face à un stress thermique. - Le porc est l'espèce cible du projet qui vise à trouver une méthode alternative pour étudier les évolutions des constantes physiologiques face aux défis posés par les modifications de son environnement ou les évolutions des pratiques d'élevage. Il n'est pas possible d'étudier les évolutions des taux sanguins de métabolites ou ions au bénéfice de la santé et du bien-être du porc en élevage, sans utiliser des porcs de génotype conventionnel. Les effets mesurés résultent de processus biologiques extrêmement dynamiques qui ne peuvent pas être reproduits sur des cellules en culture in vitro. Ces processus sont également sujets à de larges variations entre individus, nécessitant de les objectiver sur des sujets vigiles capables de se déplacer. - Nous avons choisi de travailler sur le porc en croissance car ce stade représente la plus grande partie des effectifs animaux au sein d'un élevage de porc et est connu pour être très sensible à la chaleur. Nous travaillerons sur des animaux avec un poids vif de 50-60 kg ce qui correspond au poids vif moyen des porcs en élevage commercial. Techniquement, le poids de 50-60 kg environ est idéal en termes de manipulation et de volume de sang disponible (prélèvements représentant au maximum 6% de son poids vif sur les 13 jours d'expérimentation).