Système endocrinien
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Rôle d’un traitement aux glucocorticoïdes dans la régénération musculaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Modifiées pour que le récepteur des glucocorticoïdes puisse être désactivé dans leurs cellules souches musculaires, 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le génotypage passe par un tatouage au doigt ou l'amputation de la première phalange, sur des souriceaux de 7 à 10 jours. Suivent cinq injections de tamoxifène, une injection de cardiotoxine qui lèse le muscle, puis selon les groupes de la dexaméthasone en intrapéritonéal ou un gavage quotidien de prednisone pendant deux fois sept jours, le porteur précisant qu'aucune anesthésie ni aucun analgésique n'est prévu. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses moléculaires et histologiques, celles qui perdent plus de 20 % de leur poids en une semaine étant sorties de l'étude et tuées.
Objectifs
Les muscles représentent plus de 40 % de la masse corporelle et permettent le maintien de la posture et le déplacement. Suite à une lésion, le muscle squelettique adulte est capable de se régénérer à partir des cellules satellites, des cellules souches localisées à la périphérie des fibres musculaires. Ce processus prend environ un mois à l'issue duquel les muscles sont régénérés et le pool de cellules satellites disponible pour une éventuelle nouvelle lésion est rétabli. Bien que les cellules satellites possèdent un grand potentiel en médecine régénérative, les mécanismes régulant leur prolifération et leur différentiation sont encore mal caractérisés. Les glucocorticoïdes, comme la prednisone, sont des anti-inflammatoires prescrits dans le cas de maladies chroniques telles que l’asthme ou l’arthrite rhumatoïde. Cependant, des traitements prolongés avec ces composés peuvent induire une perte de la masse musculaire, posant un sévère problème clinique, en particulier chez les personnes âgées. Les glucocorticoïdes exercent leurs actions via leur récepteur, le récepteur des glucocorticoïdes (GR), qui va contrôler l’expression de gènes cibles. Des études in vitro montrent que les glucocorticoïdes promeuvent la différenciation cellulaire. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la régénération musculaire en jouant sur la différenciation des cellules satellites. Pour ce faire, nous invaliderons sélectivement GR dans les cellules satellites avant d'induire une lésion à la cardiotoxine, et nous déterminerons si un traitement avec un agoniste du récepteur des glucocorticoïdes permet une amélioration ou au contraire une aggravation des dommages musculaires.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ces procédures permettra de déterminer le potentiel thérapeutique des glucocorticoïdes dans le processus de régénération musculaire.
Procédures
Les animaux issus des croisements sont identifiés par tatouage au doigt ou amputation de la première phalange. Cette procédure est réalisée entre 7 et 10 jours après la naissance. L'ensemble des animaux subiront 5 injections au tamoxifène pour induire la mutation par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec / souris), ainsi qu'une injection de cardiotoxine pour induire une lésion musculaire (30 sec / souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre l'impact d'un traitement aigü aux glucocorticoïdes dans la régénération musculaire sera en plus injecté une seule fois par jour pendant 3 jours à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 3 qui nous permettra de comprendre l'impact d'un traitement chronique aux glucocorticoïdes dans la régénération musculaire sera quant à lui traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 2 fois 7 jours.
Impact sur les animaux
L’injection de tamoxifène peut très rarement causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. L'injection de cardiotoxine engendrera une douleur au niveau du muscle lésé. Le gavage peut conduire à des fausses routes et les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de 20% du poids du muscle. Dans les deux cas, les animaux seront sortis de l'étude et mis à mort. La phalangectomie effectuée pour le génotypage peut engendrer une douleur légère et de courte durée.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer le potentiel thérapeutique des molécules identifiées dans des systèmes cellulaires, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans la régénération fibrillaire. Ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence. En effet, l'histologie des muscles de la souris et la cinétique de régénération sont similaires à celles de l'Homme. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production de larges cohortes, contribuant à la production de résultats significatifs.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle CreERT2 et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'extraction d'ARN et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux. De plus, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test de Student ou d'une ANOVA au risque de se tromper de 5%.
Raffinement
Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène, de cardiotoxine et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage et son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L’injection de dexaméthasone et le gavage à la prednisone ne sont en général pas problématiques pour l'animal. Néanmoins, s’ils sont mal effectués et entrainent des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Le risque de fausse route au moment du gavage sera également pris en compte. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.
Choix des espèces
Afin de déterminer le potentiel thérapeutique des molécules identifiées dans des systèmes cellulaires, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans la régénération fibrillaire. Ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. Le projet s’intéresse au rôle de GR dans la régénération musculaire de l’organisme adulte. Les animaux seront donc traités au tamoxifène entre 7 et 11 semaines afin d'effectuer les expériences sur des animaux adultes. Ils seront ensuite analysés un mois ou un an après afin de déterminer le rôle des glucocorticoïdes chez les souris jeunes et âgées.
Évaluation dans le modèle souris de l’efficacité de la thérapie génique AAV pour traiter la forme infantile de la maladie de Pompe
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Injectés une seule fois dans le cerveau à la naissance, sous hypothermie provoquée sur une plaque métallique refroidie, les souriceaux d'une lignée modèle de la maladie de Pompe sont ensuite saignés une fois par mois pendant un, trois ou dix-huit mois. Leur force musculaire est évaluée jusqu'à quatre fois sur dix-huit mois, pendant que la myopathie s'installe : dos arqué, écartement des membres postérieurs, dandinement à la marche. 660 souris vont être utilisées, 525 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 135 d'un niveau léger. Toutes sont tuées à la fin, leurs tissus prélevés pour mesurer le sucre accumulé et l'expression de l'enzyme manquante, chez les traitées comme chez les non traitées.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer un médicament pour traiter la forme infantile de la maladie de Pompe. Cette maladie rare d’origine génétique touche les muscles qui permettent le mouvement (en premier lieu les muscles des hanches et des cuisses), les muscles respiratoires et cardiaques ainsi que le système nerveux. Elle toucherait entre 5 000 et 10 000 personnes dans le monde. D’après le registre français de la maladie de Pompe, il y aurait autour de 200 personnes atteintes en France. À l'origine de cette maladie, une enzyme déficiente, appelée alpha-glucosidase acide (GAA), qui ne joue pas son rôle et provoque l'accumulation pathologique de sucre dans les cellules et leur déterioration progressive. Il existe plusieurs formes de maladie de Pompe selon l’âge d’apparition des symptômes: la forme infantile de la maladie de Pompe est la plus sévère. S'ils ne sont pas traités, les bébés, atteints d’une forte faiblesse musculaire dès la naissance, meurent généralement aucours de leur première année. Un traitement, qui consiste en une injection toutes les deux semaines d'une enzyme de synthèse, est actuellement disponible mais il ne soigne pas la maladie, il ralentit son développement. De plus, son efficacité est réduite au cours du temps et une partie des patients développent une forte réaction immunitaire. Avec ce traitement, la durée de vie des malades est d'environ 7 ans. C’est pourquoi il est plus que nécessaire de développer des nouveaux médicaments plus efficaces. Pour cela, la thérapie génique est un outil prometteur. Pour traiter efficacement ces nouveau-nés, nous devons corriger les organes affectés par l'accumulation du sucre (les différents muscles, le cerveau, la moelle épinière). Notre projet vise à développer des outils de thérapie génique efficaces pour cibler et corriger ces tissus et valider leur potentiel thérapeutique sur un modèle animal de le maladie de Pompe, ici il s'agit de la souris Pompe.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à proposer une alternative thérapeutique efficace à long-terme pour corriger les muscles et le système nerveux dans la maladie de Pompe. La thérapie génique consiste à corriger le défaut génétique et de traiter la maladie en une seule et unique injection. Un traitement efficace permettra de limiter l’accumulation du sucre dans les muscles et dans le sytème nerveux, et ainsi empêcher le développement de la myoptahie et prévenir l’apparition des symptômes neurologiques et cognitifs. Nos travaux sont des preuves de concept qui visent à être traduites en clinique dans un futur proche.
Procédures
Des nuisances seront liées (i) à l'injection des traitements experimentaux : stress lié à la manipulation, douleur de la piqure (une seule injection, environ 100 µL de produit); (ii) aux prélèvements de sang : stress lié à la manipulation, douleur de la piqure (prélèvement 1x par mois pendant 1, 3 ou 18 mois, de 50-100 µL); (iii) aux évaluations de la force musculaire : stress lié à la manipulation (maximum 4x sur 18 mois, environ 1 minute par test); (iv) liées à l'euthanasie : stress lié à la manipulation (x1). Chaque geste (injections, prélèvements, etc.) durera moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Des stress liés à la manipulation et à l’injection/prélèvements sont attendu sur les souris. Sur les souris malades, des effets indésirables liés à la progression de la maladie chez les souris agées de plus de 8 mois (légère cambrure de la colonne vertébrale, léger écartement des membres postérieurs, dandinement lors de la marche (début à l’âge de 8-9 mois), dos arqué, fréquent écartement des membres postérieurs (apparition à l’âge de 9-11 mois). À noter que l’injection du traitement devrait empêcher l’apparition de ces symptômes et maintenir la force musculaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, par une méthode réglementaire, à la fin des études. Des prélèvements de différents tissus seront réalisés afin de mesurer le niveau d'expression de notre protéine GAA ainsi que le niveau d’évolution de la maladie (baisse de sucre dans les tissus (muscles, cerveau, etc.) des souris traitées comparé aux souris non traitées).
Remplacement
Le modèle animal ne peut pas être substitué car nous avons besoin d'un organisme vivant entier pour étudier certains paramètres physiopathologiques: la correction des symptomes principaux (normalisation de la taille du coeur, réduction de taux de sucre dans l'ensemble des organes, restauration de la force musculaire), les réactions immunitaires, le passage du produit thérapeutique vers le cerveau, etc.
Réduction
Les candidats médicaments que nous testerons ont été préalablement validés sur modèles cellulaires. Le nombre d’animaux utilisé sera le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientiquement et statistiquement fiables. Pour le garantir, nous avons utilisés une approche statistique. Le résultats de ces calculs ont montré que 5 ou 6 souris/groupe, selon les procédures et le paramètre biologique mesuré pour répondre à la problématique posée, doivent être utilisés dans le projet.
Raffinement
Une période d'acclimatation d’environ une semaine avant inclusion en PE, sera réalisé afin que les souris s'adaptent à leur nouvel environnement. Pour les PE sur souris non sevrées, les mères gestantes seront transférées en zone d'expérimentation, afin qu'elles s'adaptent aux nouvelles conditions avant la naissance des petits. Le nombre de males par cage sera limité à 5 souris afin de limiter les bagarres, et potentielles blessures. Si toutefois des bagarres sont constatées, les males agressifs seront séparés. Les prélèvements de sang seront réalisés au niveau de la veine mandibulaire sur des souris préalablement anesthésiées à l'isoflurane. La douleur générée par l’injection intracérébroventriculaire à la naissance sera prévenue par l’induction d’hypothermie (forme d’anesthésie appropriée pour des petits animaux jusqu’à l’âge de 5 jours et lors d'une procédure chirurgicale inférieure à 5 minutes). Ces expérimentations ne dépasseront pas le degré de douleur modéré. Une plaque d'aluminium sera refroidie en la plaçant sur de la glace. Un chiffon sec sera disposé sur la plaque, les souris seront placées dessus environ 5 minutes. Les souris seront gardées sur un coussin chauffant avant et après l’injection. L’euthanasie sera réalisée, par dislocation cervicale, sur souris préalablement anesthésiées à l'isoflurane. Le sacrifice sera précédé d’une injection par voie intrapéritonéale de deux anesthésiques (5 ml/kg de poids) la kétamine et la xylazine. Points limites du modèle : les souris Gaa développent une myopathie progressive. Ces signes d'atteinte musculaire sont observés généralement à partir de 6 mois. Nous attribuons un score de signes cliniques basé sur la littérature : Degré 1 : légère cambrure convexe de la colonne vertébrale, léger écartement des membres postérieurs, dandinement lors de la marche (vers 8 mois). Degré 2 : Dos arqué, légère atrophie des muscles du dos, fréquent écartement des membres postérieurs (vers 9 mois). Dès l'apparition des symptômes de degré 1, des actions seront mise en place afin de limiter des efforts musculaires (alimentation au sol). Une pesée sera réalisée 1x par semaine et si une perte de poids de plus de 10 % est constatée, du DietGel sera ajouté dans la cage. Si la perte de poids persiste et devient trop importante (>20 %), la souris sera euthanasiée. Si une souris développe des symptômes de degrés 2, elle sera euthanasiée.
Choix des espèces
Le model souris de la maladie de Pompe est un excellent moyen de déterminer l’efficacité thérapeutique d'un produit puisqu'il présente des symptomes proches de ceux observés chez l’homme : même défaut enzymatique, accumulation de sucre dans les muscles, coeur et système nerveux, diminution de la force musculaire et peut développer une réaction immunitaire. La litterature démontre qu’il est possible de corriger ses symptômes par thérapie génique, mais de nombreuses optimisations sont nécessaires pour traiter les plus jeunes individus. C'est pourquoi dans ce projet nous testerons nos candidats thérapeutiques chez des souris adultes et chez des souriceaux (entre 0 jours et 20 jours).
Rôle de l’inflammation dans la modulation de la synthèse locale de glucocorticoïdes chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
58 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée chez elles par traitement, avec inflammation de l'intestin et perte de poids possibles, et chacune subit cinq injections intrapéritonéales et six pesées. Le porteur indique que les données obtenues hors de l'animal ne suffisent pas, faute d'y retrouver le système immunitaire et les facteurs circulants. Le bénéfice annoncé se limite à identifier "potentiellement" des cibles thérapeutiques pour les troubles digestifs liés au stress.
Objectifs
Le système nerveux entérique (SNE) régule la motricité digestive et les fonctions de la barrière épithélio-intestinale. Il est admis que le stress altère l’axe cerveau-intestin et contribue à un large éventail de troubles gastro-intestinaux, incluant le syndrome de l’intestin irritable. La survenue d’évènements stressants ou traumatisants affecte les fonctions digestives, qui en pratique se manifestent par des flatulences, des douleurs abdominales, plus ou moins associées à une accélération ou à une diminution de la vidange gastrique. La réponse biologique au stress implique l’activation de l’axe hypothalamo-hypophysaire-surrénalien, initiant une sécrétion de glucocorticoïdes. Bien que la synthèse de glucocorticoïdes ait lieu principalement au niveau des glandes surrénales, il a été décrit de nombreux autres sites de production, associés à une action locale des glucocorticoïdes via le récepteur aux glucocorticoïdes. Dans l’intestin, le système nerveux exprime le récepteur des glucocorticoïdes ainsi que l’enzyme responsable de leurs synthèses. Une étude préliminaire in vitro de notre équipe de recherche a permis de mettre en évidence une synthèse de corticostérone par le système nerveux entérique et une augmentation de la synthèse de corticostérone en conditions inflammatoires. De plus, des modifications de l’expression de protéines impliquées dans l’activité neuronale ont également été mises en évidence en conditions inflammatoires et lorsqu’on bloque l’effet des glucocorticoïdes. L’objectif de ce projet est d’étudier comment l’inflammation module le système nerveux entérique in vivo, et si les conséquences fonctionnelles de l’inflammation passent par l’action des glucocorticoïdes.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre les mécanismes de la synthèse locale des glucocorticoïdes au niveau de l’intestin afin de pouvoir potentiellement identifier des cibles thérapeutiques pour améliorer les troubles digestifs intestinaux liés au stress et à l’inflammation.
Procédures
Pesée quotidienne des animaux – 10 sec sur la balance – 6 au total Contention + injection intrapéritonéale – 30 sec – 5 au total
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent avoir une inflammation des intestins à l’issue du traitement et cela peut générer une perte de poids. Ils peuvent également avoir peur au moment des injections intrapéritonéales.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus d’intérêt (tube digestif) pour analyser les échantillons ex vivo.
Remplacement
Les données préliminaires obtenues dans un modèle ex vivo ne sont malheureusement pas suffisantes pour extrapoler les résultats obtenus à un individu entier. Plusieurs acteurs comme le système immunitaire et la présence de facteurs circulants sont absents de nos modèles ex vivo. C’est pourquoi il n’est pas possible de remplacer ce modèle d’induction de colite aigüe par un modèle ex vivo ou in vitro.
Réduction
Nous avons calculé le nombre d’animaux minimum nous permettant d’obtenir des résultats statistiquement interprétables (n=9 pour une augmentation de 40 % de la production de corticostérone). Pour s’assurer de la réussite de ce projet, nous avons prévu un lot d’animaux « pilote » de 10 souris qui permettra de valider les expérimentations in vitro sur les échantillons issus de nos animaux. Comme une partie des animaux va recevoir une injection intrapéritonéale d’antagoniste et que ce type d’injection peut rater malgré un personnel compétent, nous avons prévu un lot supplémentaire (n=3 par groupe) qui sera réalisé seulement si certains animaux doivent être exclus. L’utilisation d’un tel nombre (58 au total) devrait nous éviter de devoir répéter l’expérience.
Raffinement
Les souris seront au maximum 5 par cages et de l’enrichissement (frisottis, tubes) sera placé dans les cages leur permettant de déchiqueter, de jouer et de se cacher. Elles seront également surveillées quotidiennement à l’animalerie avant et pendant la procédure expérimentale, y compris le week-end. Les souris seront habituées à la présence de l’utilisateur grâce à une manipulation régulière pour limiter le stress lors des expérimentations. Nous avons également défini des points limites à nos expérimentations pour évaluer le bien-être de nos animaux et prendre en charge la douleur si elle a lieu.
Choix des espèces
La colite expérimentale provoquée par le traitement chez les rongeurs est un modèle reconnu d’affections inflammatoires chroniques humaines. La souris représente un très bon modèle d’étude (plus petit) et est plus adapté à nos besoins qu’un modèle rat et nous permettra de faire un parallèle avec l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines) puisque ce projet s’intéresse à la régulation de la production de glucocorticoïdes à l’âge adulte.
Etude de l’effet de biopeptides lors de la perte de poids chez le chat en surpoids
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Mettre des chats en restriction calorique pour tester une poudre de biopeptides tirée de l'hydrolyse de protéines sanguines : seize chats en surpoids vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit quatre sédations avec prise de sang et voit sa ration réduite pendant toute l'étude, le porteur reconnaissant que la restriction calorique peut les rendre plus agités. Aucun remplacement n'est envisagé, le chat en surpoids étant la cible commerciale des biopeptides, et le porteur affirmant qu'il est "nécessaire" de tester sur "l'animal entier". Les seize chats sont gardés vivants et doivent être réintégrés dans un autre protocole de test d'aliment une fois leur poids optimal retrouvé.
Objectifs
L'objectif du projet est d'évaluer l'efficacité de biopeptides, issus de l'hydrolyse de protéines sanguines, chez le chat en surpoids : 1) vitesse de la perte de poids par rapport à l'effet du peptide contrôle, 2) effet sur la triglycéridémie, 3) effet sur des hormones du métabolisme lipidique (leptine, insuline, adiponectine) afin de mieux comprendre leur mode d'action.
Bénéfices attendus
Les biopeptides devraient permettre une perte de poids plus efficace chez le chat en surpoids ainsi qu'une baisse de la triglycéridémie par action sur le métabolisme lipidique.
Procédures
Quatre sédations et prises de sang sur une courte durée, moins d'1h.
Impact sur les animaux
L'ajout de la poudre de biopeptides sur les croquettes pourrait avoir un goût ou une odeur non appréciés par les animaux. Toutefois les quantités étant tellement faibles, cette nuissance sera très limitée. Une prise de poids excessive est une réelle nuisance vis-à-vis de tous les désordres associés (problème de diabète, problème articulaire, problème urinaire), c'est la raison pour laquelle, la prise de poids sera contrôlée et limitée. La restriction calorique pourrait avoir un impact sur le stress des animaux, les rendant moins sereins et plus agités. Cependant, la restriction sera faible, le suivi individualisé et la distribution de la ration en deux fois pourrait être un moyen de limiter ce stress.
Devenir
Les animaux pourront être réintégrés à un projet dont la demande d'autorisation est encore en cours (test d'aliment) ou intégrés dans un nouveau projet car ils auront retrouvé leur poids optimal. Les analyses sanguines classiques de biochimie et d'hématologie confirmeront également la bonne santé des animaux.
Remplacement
Aucun remplacement n'est envisageable dans la mesure où le chat en surpoids est l'animal cible des biopeptides testés et qu’il est nécessaire de tester sur l’animal entier pour nous permettre d’explorer le mode d’action chez cette espèce.
Réduction
Une simulation à l'aide d'un logiciel de statistiques a établi que le nombre minimum d'animaux par groupe permettant d'obtenir des différences significatives était de 8. Un t-test apparié ou un test de Wilcoxon sera utilisé pour analyser les données selon qu'elles suivent une loi normale ou non.
Raffinement
Les pièces de vie des chats sont enrichies par des paniers avec des couvertures, des griffoirs muraux, la présence de petits jeux (du type billes à grelots et balle de ping pong), plusieurs étagères et des recoins spécialement aménagés pour que les animaux puissent se cacher. La sédation lors des prises de sang permet de supprimer le stress pouvant être ressenti par l'animal lors du prélèvement. Un suivi quotidien du comportement des animaux (consommation alimentaire et comportement général) ainsi qu'un suivi hebdomadaire du poids des chats sera réalisé afin de mettre en place, si besoin était, des mesures adéquates (modification de la quantité de la ration, augmentation du contact avec les personnels animaliers) pour maintenir un bien-être optimal des animaux durant toute l'étude. Un animal qui consommerait moins de la moitié de sa ration durant 5 jours serait exclu de l'étude, tout comme un animal qui resterait prostré et montrerait des signes de détresse.
Choix des espèces
Le chat est l'espèce cible des biopeptides testés. Lers animaux seront des adultes de 3-4 ans, un âge particulièrement intéressant car la prise en charge du surpoids doit être réalisée le plus tôt possible sans attendre que les répercussions de celle-ci telles que le diabète, les troubles urinaires ou les problèmes articulaires soient déjà en place.
Etude du rôle du récepteur des oestrogènes ERa dans la cellule endothéliale lymphatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système urogénital
260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, un même animal pouvant enchaîner des injections intrapéritonéales répétées, l'ablation de ses ovaires, la pose d'un implant hormonal, douze semaines de régime obésogène, un jeûne, puis un gavage avant sa mise à mort. 160 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 100 un niveau léger. Le porteur range dans les actes "peu invasifs, indolores" la pesée et le régime riche en lipides, classe la biopsie d'oreille en douleur légère de courte durée, et signale que l'isolement des mâles après accouplement engendre un stress. L'objectif est de comprendre le rôle du récepteur des œstrogènes dans les vaisseaux lymphatiques, et les retombées avancées sur l'infertilité et l'obésité sont formulées comme des pistes, quand les ovariectomies et les gavages, eux, sont programmés.
Objectifs
Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Une dysfonction de ce système aboutit à la formation de lymphoedème, à une accumulation massive de fluide et de tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoedèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes concernant le rôle du système lymphatique dans le système reproductif (utérus, ovaires..) pour comprendre les problèmes d'infertilité. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le rôle du système lymphatique dans l'obésité, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.
Procédures
Les animaux seront soumis à différents types d'interventions: - Biopsie d'oreille pour identification et génotypage des bébés nés (quelques secondes)- Injections intrapéritonéales (2 à 3 secondes), gavage ( 5 secondes) - Ovariectomie (20 minutes de chirurgie sous plaque chauffante) et pose de pellet ( 10 minutes sur plaque chauffante) - Mise sous régime obésitogène ( 12 semaines) - Mise à jeun ( 2 heures) - Le même animal peut subir des injections intra-péritonéales répétées à un jour d'intervalle , suivie d'une ovariectomie et de la pose du pellet, puis mis sous régime obésitogène, avant de subir un gavage avant euthanasie . Il peut aussi subir un prélévement sanguin, mais cela sera fait sous anesthésie avant euthanasie.
Impact sur les animaux
Les expérimentations réalisées dans ce projet sont peu invasives, indolores (pesée, régime riche en lipides) ou de douleur légère de courte durée (biopsie d'oreille par poinçon), de classe légère et modérée (biopsie de queue, jeûne, ovariectomie, pose de pellet). Elles peuvent être associées aux nuisances suivantes : - Régime riche en lipides peut induire une prise de poids pouvant gêner les déplacements - Mise à jeun peut entrainer du stress - Ovariectomie/pose de pellet peut générer une douleur due à la chirurgie mais qui sera traitée par un analgésique et pris en compte par une surveillance accrue. - Isolement des mâles après accouplement va aussi engendrer un stress chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de récupérer les différents tissus notamment les tissus adipeux, la peau, l'utérus, la glande mammaire qui permettront d'étudier le rôle d'ERa dans le système vasculaire lymphatique.
Remplacement
Les effets pléiotropes des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. D’autre part, l'étude de la fertilité impliquant la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De même, la prise de poids et la réponse à un régime obésitogène d'un point de vue physiologique est difficile à modéliser dans sa globalité car elle fait intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité des femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème et le lipoedème qui touche une majorité de femmes. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cages de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis (décrits dans chaque procédure) sont quotidiennement surveillés permettant de mettre en application l'arbre décissionnel pouvant aboutir aux critères d'arrêt des souffrances. Cette décision sera prise par la personne en charge de la mise en oeuvre générale du projet dans l’EU et de sa conformité à l’autorisation de projet, en concertation avec la personne en charge du bien-être animal dans l’EU.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la lactation, et de la prise de poids en réponse à un régime obésitogène. De plus, c'est le modèle qui permet d'étudier spécifiquement une invalidation génique de notre protéine d'intérêt de manière tissu-spécifique (système CRE-LOX).
Évaluation des effets prébiotiques et anti-diabétiques de tisanes à base de plantes médicinales réunionnaises chez un modèle de souris obèse
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Nourries pendant douze semaines avec un régime riche en graisses jusqu'à peser environ le double d'une souris témoin, mises à jeun six heures une fois par mois, gavées de boissons trois fois par semaine pendant six semaines, 64 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une goutte de sang est prélevée à leur queue tous les quinze jours pendant trois mois pour mesurer leur glycémie. Le porteur reconnaît que l'obésité induite réduit leur mobilité, peut dégrader leur toilettage jusqu'à l'alopécie et provoquer une polyurie, et prévoit de changer leur litière deux fois par semaine à cause des souillures. Toutes sont tuées par ponction cardiaque pour prélever le maximum de sang et neuf tissus, dont le cœur, le foie, le cerveau et le contenu du cæcum, l'objet du projet étant de tester l'effet prébiotique de tisanes de plantes médicinales réunionnaises.
Objectifs
Le projet vise à évaluer les effets prébiotiques et anti-diabétiques de tisanes riches en polyphénols de plantes médicinales réunionnaises chez un modèle de souris obèse. Ce projet s’insère dans un programme de recherche visant à développer des thérapies innovantes contre l’obésité et l’état diabétique associé qui sont des problèmes de santé publique majeurs dans le Monde. En effet, l’accumulation de graisses causant l’obésité engendre des désordres métaboliques et inflammatoires conduisant à une résistance à l’insuline et au diabète de type 2. L’obésité s’accompagne également d’une dérégulation des communautés bactériennes du microbiote intestinal, appelée dysbiose, et d’une perméabilité de la barrière intestinale. Il en résulte une translocation dans le sang de composés bactériens comme des endotoxines de type lipopolysaccharides (LPS) et des métabolites comme la triméthylamine métabolisée en oxyde de triméthylamine (TMAO) par le foie. Ces métabolites d’origine bactérienne atteignent des organes métaboliquement actifs tel que le tissu graisseux et aggravent l'inflammation, la résistance à l'insuline et l’état diabétique au cours de l’obésité. Des études montrent que la réduction de la dérégulation du microbiote intestinal par des agents prébiotiques naturels comme les fibres et les polyphénols végétaux, diminue le risque de complications de l’obésité. En effet, les prébiotiques sont des composés utilisés comme substrats nutritifs par des communautés bactériennes spécifiques et sont en faveur de leur croissance. Notre hypothèse de recherche est que les polyphénols contenus dans des tisanes, servent de substrats aux bactéries intestinales et protègent contre la dérégulation du microbiote intestinal liée à l’obésité. Pour vérifier cette hypothèse, notre projet a pour but d’évaluer pour la première fois la capacité de tisanes riches en polyphénols issues de deux plantes médicinales réunionnaises à exercer une action prébiotique sur les bactéries intestinales chez un modèle de souris obèses. De plus, le projet vise à déterminer l’impact des tisanes riches en polyphénols sur la production de métabolites bactériens de type LPS et TMAO, pour limiter le développement de l’état inflammatoire et diabétique des souris obèses.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : - d’ordre scientifique et médical : la preuve du lien entre les métabolites bactériens et les désordres métaboliques et inflammatoires au cours de l’obésité contribuera à l’apport de nouvelles connaissances sur le rôle de la dysbiose du microbiote intestinal comme facteur de risque et cible thérapeutique potentielle. De nouvelles perspectives thérapeutiques utilisant des prébiotiques pourront être développées pour la prise en charge de patients en situation d’obésité et à risque diabétique. - d’ordre biotechnologique : la preuve de l'efficacité de thérapies riches en polyphénols de plantes médicinales visant à améliorer la composition du microbiote intestinal, à moduler la production de métabolites bactériens atteignant les tissus métaboliquement actifs et à réduire les troubles métaboliques comme le diabète au cours de l'obésité permettra de valoriser le potentiel nutrition-santé de ces molécules naturelles issues de la biodiversité végétale.
Procédures
Les nuisances prévues sont associées à 4 types d'interventions chez les animaux : 1- Prélèvement d’une goutte de sang au niveau de l’une des veines latérales de la queue pour la mesure de la glycémie (durée 1 min, 1 fois tous les 15 jours pendant 3 mois, 8-10 µL). 2- Gavage de boissons (durée 2 min, 3 fois par semaine pendant 1,5 mois). 3- Gavage d’une solution de glucose pour le test de tolérance au glucose (durée 2 min, 1 fois par mois pendant 3 mois). 4- Ponction cardiaque terminale sous anesthésie générale (euthanasie, durée 2 min).
Impact sur les animaux
Le régime riche en graisses provoque une augmentation du poids/état d’obésité des souris générant des contraintes physiques (mobilité réduite/inactivité, diminution possible de toilettage/alopécie, modification des fécès, polyurie) voire psychologiques (stress/angoisse), engendrant une augmentation de la souillure des litières. Pour détecter ces possibles effets indésirables et garantir au mieux le bien-être des animaux, un suivi quotidien du comportement des animaux, et de leur poids et de leur prise alimentaire toutes les semaines sera effectué. Le test oral de tolérance au glucose réalisé une fois par mois va induire un stress vu que les souris seront mises à jeun pendant 6 h pour évaluer l’hyperglycémie provoquée. Les mesures de glycémie seront réalisées grâce à un glucomètre à partir d’une goutte de sang prélevée par ponction au niveau d’une des veines latérales de la queue, après application sur la queue d’une crème analgésique. Pour limiter le stress et la douleur, les manipulations seront réalisées par un personnel habilité et dûment expérimenté. L’étape de gavage des boissons prévue 3 jours par semaine pendant 6 semaines peut aussi induire un état de stress chez les animaux. Pour limiter ce stress, les manipulations seront réalisées par le même personnel habilité et expérimenté. Un suivi quotidien du comportement des animaux et une mesure de leur poids et de leur prise alimentaire toutes les semaines permettront de détecter des possibles effets indésirables afin de garantir au mieux le bien-être des animaux.
Devenir
A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer chez les animaux un volume de sang maximal ainsi que différents tissus (tissu adipeux sous-cutané et épididymal, foie, coeur, crosse aortique, cerveau, caecum et contenu cécal) qui sont requis pour réaliser des dosages de marqueurs métaboliques et inflammatoires circulants permettant de caractériser l’état diabétique des souris.
Remplacement
Au laboratoire, nous développons des études mécanistiques sur modèles in vitro de cellules graisseuses, sur lesquelles des composés bactériens et polyphénols végétaux sont testés. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de mimer la complexité de l’organisme vivant, avec les échanges inter-organes impliqués dans le métabolisme énergétique comme entre l’intestin, le tissu graisseux et le foie, ni de mesurer la bioaccessibilité tissulaire des métabolites bactériens et des polyphénols en condition d’obésité. Il est aussi question d’évaluer l’impact du régime obésogène associé aux boissons à potentiel prébiotique sur la composition du microbiote intestinal et l’état inflammatoire des souris en situation d’obésité. Seul un modèle animal permet de reproduire ces conditions physiopathologiques liant dysbiose du microbiote intestinal, obésité et complications métaboliques et inflammatoires. L’utilisation d’animaux vivants permet d’évaluer l’efficacité de la stratégie nutritionnelle envisagée à base de molécules prébiotiques et anti-diabétiques, car celles-ci nécessitent un métabolisme dans le tractus digestif par les bactéries puis une absorption intestinale pour un impact sur les échanges métaboliques inter-organes intestin-foie-tissu graisseux impliqués dans la pathologie de l’obésité et l’état diabétique qu’elle engendre. Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour tester notre hypothèse de recherche selon laquelle les polyphénols de tisanes issues de plantes médicinales pourraient exercer des effets prébiotiques et anti-diabétiques dans le contexte de l’obésité.
Réduction
Au laboratoire, nous disposons uniquement de souris transgéniques ne permettant pas la réutilisation d’animaux. Les expériences seront conçues en utilisant le moins d’animaux possible, tout en permettant de réaliser des études statistiques exploitables. Une approche statistique a permis de déterminer qu’il faut au moins 8 souris par groupe pour atteindre des résultats significatifs. Pour comparer les effets du régime alimentaire standard et du régime riche en graisses, supplémenté ou pas par une des deux tisanes ou par des fibres alimentaires, le projet impliquera 8 groupes de 8 souris, soit un total de 64 souris. Cet effectif prend aussi en compte les études précédentes du laboratoire ayant mesuré la variabilité des expérimentations visées et établi le nombre d’animaux nécessaire pour atteindre une puissance statistique permettant de valider l’hypothèse de recherche testée.
Raffinement
Les souris seront placées dans des conditions optimales, au nombre de 4 par cage maximum, et l’atmosphère contrôlée en température, humidité, lumière, ambiance sonore. Les animaux bénéficieront d’un accès facilité à la nourriture et à l’eau, et d’un enrichissement de leur environnement pour favoriser leur comportement naturel et limiter leur stress et anxiété. Les animaux seront séparés en cas de bagarre ou de barbering important. Le change des litières sera effectué une fois par semaine et adapté à 2 fois par semaine pour les souris en situation d’obésité en cas de souillures plus fréquentes. Dans un objectif de respect du bien-être animal et de réduction de la douleur, les mesures seront prises telles qu’une habituation des souris par un personnel habilité et expérimenté ainsi que l’utilisation d’anesthésie générale par inhalation d’isoflurane 2% et d’administration de buprénorphine (0,05 mg/kg) lors des expérimentations. En cas d’atteinte d’un point limite strict, une mise à mort par dislocation cervicale sera effectuée.
Choix des espèces
La souris est un modèle largement utilisé pour les expérimentations in vivo. Les procédures, les manipulations, l’évaluation de la douleur ou de la souffrance sont par conséquent bien établies. Les souris C57BL/6 sont choisies car c’est un modèle sensible au développement de l’obésité et du diabète de type 2 induit par un régime riche en graisses. De plus, la littérature évoque chez ces souris la présence d’un microbiote intestinal et la production de métabolites bactériens comparables à ceux détectés chez l’homme, de par l’existence de principaux phyla bactériens (Actinobacteria, Bacteriodetes, Firmicutes, Proteobacteria) qui permettent d’évaluer la dysbiose du microbiote intestinal causé par le régime obésogène. Ce modèle animal est donc idéal pour la réalisation de notre projet et l’ensemble des procédures est maîtrisé sur ce modèle, notamment au laboratoire. Les 64 souris C57BL/6 utilisées seront des souris mâles (32) et femelles (32) âgés de 10 semaines au démarrage de l’étude qui durera ensuite 12 semaines. La pathologie de l’obésité et l’état diabétique qu’elle engendre touchent principalement les adultes, il est donc indispensable d’avoir des animaux de cet âge afin de donner une perspective thérapeutique à ce projet de recherche. Nos résultats antérieurs issus de projets similaires ont été obtenus à ces stades de développement des animaux, ce qui permet de réaliser des analyses comparatives dans le but de limiter le nombre d’animaux. Poids d’une souris nourrie avec un régime équilibré standard (ND) : environ 20-25 g. Poids d’une souris nourrie avec un régime riche en graisses (HFD) : environ 45-50 g.
Etude de la réversibilité de la réponse induite par des perturbateurs endocriniens à l’aide de poissons zèbres génétiquement modifiés
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Une lignée de poissons zèbres génétiquement modifiés, dont la fluorescence suit l'activité d'un gène du métabolisme intestinal, est mise au point pour évaluer les perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire, dans le cadre d'un projet européen. 700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leurs intestins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés à des substances entre 72 et 120 heures après la fécondation, ils passent cinq séances d'imagerie au microscope sans anesthésie, à 5, 7, 10, 15 et 20 jours, et sont suivis jusqu'à trois mois. Le porteur qualifie cette expérience d'"essentielle" à la caractérisation de la lignée et invoque l'"organisme entier" pour écarter les cellules en culture.
Objectifs
Dans le cadre de l’étude des perturbateurs endocriniens en lien avec les pathologies métaboliques telles que l’obésité, le diabète ou la stéatose, nous développons une lignée transgénique de poisson zèbre apte à rendre compte d’effets de substances au niveau du métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme. La quantification de la fluorescence dans cette lignée transgénique permet de suivre l'expression de notre gène d'intérêt et est réalisée après exposition d’embryons issus de cette lignée à des substances pendant 48h, de 72 heures post-fécondation (hpf) à 120hpf. Afin d’étudier la réversibilité de la réponse de ce modèle nous souhaitons poursuivre les mesures de fluorescence au microscope au-delà de 120hpf, jusqu’à 3 mois. Les animaux ne seront donc pas exposés aux substances passé 120hpf. L’utilisation de la lignée transgénique apportera des informations complémentaires sur les mécanismes d’action des substances sans augmenter le nombre de poissons nécessaires à la réalisation des essais pour l’identification des perturbateurs endocriniens. A terme, le modèle que nous développons permettra d’évaluer l’impact de perturbateurs endocriniens en ayant recours à des embryons âgés de moins de 120hpf et les données générées au cours de ce projet permettront le développement/l’amélioration de voies de toxicité impactant le métabolisme qui pourront être utilisées pour une meilleure évaluation des dangers et des risques des perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire.
Bénéfices attendus
L’étude la réversibilité de la réponse après exposition des embryons de poissons zèbres aux substances de 72hpf à 120hpf permettra d’approfondir notre connaissance des mécanismes régulant cette réponse. Nous pourrons ainsi analyser si l’expression de la fluorescence, induite ou inhibée à la suite de l’exposition aux substances, persiste ou au contraire revient à la normale alors que les poissons n’y sont plus exposés. Ainsi, la fluorescence étant relative à l’expression de notre gène d'intérêt, acteur clé du métabolisme intestinal chez le poisson zèbre, cette expérimentation permettra d’étudier les effets au long terme (jusqu’à 3 mois) sur ce métabolisme à la suite d’une exposition courte (48h) aux substances inductrices ou inhibitrices de de ce gène. Dans le cadre du développement d’un modèle de poisson zèbre apte à rendre compte des impacts des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme, l’étude de la réversibilité de la réponse aux substances a toute son importance. Ces données participeront à la caractérisation du modèle et de fait à l’élaboration d’un outil d’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme chez l’Homme, au cœur des objectifs du projet européen dans lequel s’inscrivent ces travaux.
Procédures
Les poissons zèbres seront soumis à des prises d'image en microscopie à fluorescence. Les animaux (5, 7, 10, 15 et 20 jours post fécondation) ne seront pas anesthésiés mais resteront dans de l'eau tout le temps de l'imagerie qui ne durera que 10 secondes environ. Chaque animal sera soumis à 5 imageries au cours de l'expérimentation.
Impact sur les animaux
L’exposition aux substances réalisée en début d’expérimentation (de 72hpf à 120hpf) aura un effet sur l'expression de notre gène d'intérêt (et probablement d'autres qui ne seront pas mesurés) sur le court terme et peut être le long-terme mais aucun effet toxique ou développemental n'est attendu aux concentrations sélectionnées. Les manipulations répétées tout au long de l’expérimentation (la prise d'image au microscope à fluorescence) pourraient entrainer un stress chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les intestins pour réaliser des mesures d'expression du gène d'intérêt à l'aide de techniques de biologie moléculaire.
Remplacement
L’étude de la réversibilité de la réponse dans le modèle poisson zèbre que nous développons ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants. En effet, cette expérimentation est essentielle à la caractérisation de ce modèle biologique, permettant de renseigner de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme à l’échelle de l’organisme entier, une problématique encore peu investiguée. Les modèles cellulaires ne permettent pas cette approche. Quant aux modèles mathématiques, s’agissant d’une problématique émergente, la modélisation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme est encore balbutiante. A terme, l’expérimentation menée ici permettra d’établir un modèle de poisson zèbre pertinent pour l’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme.
Réduction
L'utilisation d'animaux transgéniques pour le suivi des effets dans le temps des substances permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés en réutilisant les mêmes individus à chaque temps d'étude. Les effectifs ont été calculé en tenant compte de la variabilité de l'expression de notre gène d'intérêt et de la mortalité normale au cours du développement afin de pouvoir mettre en évidence des effets des substances de plus de 50% (test statistique).
Raffinement
Les animaux sont conservés dans un environnement controlé connus pour engendrer un minimum de stress (aquariums teintés en bleu si possible avec un fond en décors graviers, paramètres physico-chimiques de l'eau et photopériode contrôlés). Ils sont hébergés en groupe afin de respecter leur comportement grégaire et limiter l’anxiété que pourrait entrainer l’isolement, en gardant des populations faibles afin d’éviter les comportements agressifs. Les poissons sont également nourris en partie avec des artémies vivantes, leur permettant ainsi d’enrichir l’éventail de leurs comportements sociaux, notamment celui de la chasse. Tout au long des expérimentations, les animaux seront suivi avec une grille de bien-être adaptée à chaque stade de développement. L'ensemble de ces procédures est réalisé par des personnes formées et sensibilisées à l'évaluation de la souffrance animale.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est une des espèces recommandées pour la réalisation de tests réglementaires sur les perturbations endocriniennes. Sa petite taille permet des expositions dans de faibles volumes d’eau d’où une faible consommation de substances toxiques et une quantité de déchets générés moindre. Ces dernières années un nombre croissant de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés ont été développées et se sont avérées être des outils pertinents pour la détection des perturbateurs endocriniens tout en réduisant le nombre d'animaux.
Rôle d’un facteur de transcription dans la réponse à l’exercice physique et à un régime hyperglucidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Contraintes de courir sur un tapis roulant sous stimulations électriques, jusqu'à cinquante par séance, 90 souris subissent aussi un test de tolérance au glucose avec injection dans l'abdomen et scarification de la queue. 42 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 48 d'un niveau léger, et toutes sont tuées pour prélever six organes chacune. Le gène étudié n'est jamais nommé dans le résumé, désigné seulement comme un facteur de transcription induit par l'exercice et par le glucose. Le porteur qualifie la stimulation électrique de désagréable sans être douloureuse, et affirme que l'eau sucrée n'induit aucun stress, la stéatose hépatique qu'elle provoque étant selon lui asymptomatique.
Objectifs
La sédentarité est un facteur de risque pour de nombreuses pathologies, et l’activité physique s’impose de plus en plus comme un moyen de prévenir et/ou de contribuer à guérir des pathologies telles que les maladies métaboliques (diabète, stéatose hépatique non alcoolique ou ‘‘maladie du soda’’), et les cancers. Le muscle squelettique capte l'essentiel du glucose sanguin après un repas, c'est donc un organe clé dans le contrôle de l’homéostasie glucidique. Cette captation de glucose dépend du type de muscle (glycolytique ou oxydatif), elle est augmentée par l’exercice physique alors qu’elle est altérée dans le cas de maladies métaboliques comme diabète et l’obésité. Le projet de recherche a pour but de déterminer le rôle d’un gène induit par l’exercice physique et le glucose dans la performance physique, le métabolisme musculaire et l’homéostasie métabolique de l’organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet est pleinement justifié d'un point de vue scientifique et respecte la règle des 3R. Il a pour but d'étudier le rôle d'un gène dont l'expression varie au cours de la journée, dont l'expression est augmentée par l'exercice physique et par le glucose, et qui joue un rôle dans le métabolisme glucidique et lipidique et dans la physiologie du muscle squelettique. Ce projet devrait permettre d’évaluer le rôle de ce gène musculaire dans la performance physique en fonction du temps de la journée, et d’identifier les gènes régulés par l’augmentation de l’expression de ce gène, soit lors de l’exercice physique, soit lors d'un régime sucré dans différents muscles glycolytiques et/ou oxydatifs. La physiologie musculaire jouant un rôle important dans l'homéostasie métabolique systémique, ce projet permettra également de déterminer le rôle de ce gène musculaire dans la régulation de la glycémie., Sur la base des résultats obtenus, nous pourrons étendre le projet à l’étude des voies de régulation et des processus métaboliques les plus affectés par la délétion de ce gène dans le muscle squelettique.
Procédures
Pour le test de performance physique, les souris reçoivent des stimulations électriques de l'intensité la plus faible. Pour le test de tolérance au glucose, durée 2h, chaque souris subit une injection intrapéritonéale de glucose au début du test et une seule scarification à la queue pour prélever une goutte de sang.
Impact sur les animaux
Il y a peu d’effets indésirables concernant le test de performance physique car il sera effectué pendant la phase active nocturne des souris. L'intensité de la stimulation électrique utilisée pour contraindre les souris à courir est la plus faible. Elle est désagréable mais n'induit pas de douleur. En ce qui concerne le challenge nutritionnel, l’ajout de glucose-fructose dans l’eau de boisson conduit à une prise de poids modérée ainsi qu’à une stéatose hépatique une résistance à l’insuline asymptomatiques et n'induit donc aucun stress ni aucune douleur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes
Remplacement
Nous avons utilisé un modèle cellulaire de myotubes (cellules C2C12) pour montrer que l’expression du facteur de transcription d'intérêt est induite rapidement et fortement par le glucose. De plus nous collaborons avec d'autres équipes afin d’analyser les fibres musculaires isolées et d’établir un modèle mathématique multi-échelles d’organisation et de fonctionnement des muscles.
Réduction
Nous prélevons 4 muscles (EDL, gastrocnemius, soleus, tibialis antérieur) ainsi que d’autres organes impliqués dans l’homéostasie métabolique (foie, tissu adipeux) chez chaque souris et à partir de ces différents organes nous allons réaliser une analyse transcriptomique, et une analyse des fibres musculaires. Comme nous prélevons 6 tissus/organes à partir de chaque souris, nous réduisons le nombre d'animaux par 6. Une collection d’échantillons d’ARN sera constituée et réutilisable dans le cadre du prolongement de ce projet ou pour d’autres projets. Les données brutes de transcriptomique seront déposées dans un entrepôt de données publiques (ENA, EBI). Les effectifs sont élaborés à partir d'expériences antérieures d'une autre équipe de recherche avec laquelle nous collaborons. Nous utiliserons ensuite des tests non paramétriques pour analyser les résultats.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnement enrichi varié (dôme, briquette en bois, frizzoti pour nidification) , en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur. Le suivi sanitaire effectué chaque jour ouvré par les animaliers permet de déceler tout signe de souffrance ou d’angoisse. En amont de chaque procédure, des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux. Pour limiter le stress lié à l'exercice physique sur tapis roulant, une habituation de 10 minutes au tapis roulant sera réalisée 3 fois par semaine la semaine précédant le début du protocole. La 1ère session d'habituation consiste en une habituation à l'environnement (les souris se déplacent librement sur la ligne du tapis roulant, mise en route du tapis à très faible vitesse (les souris se déplacent en marchant). Les souris incapables de courir ne seront pas incluses dans la procédure. Nous réaliserons les séances d'entrainement et d'habituation en pendant la phase d’activité nocturne des souris. . Points limites : Lors du test de performance physique, si la souris ne court pas spontanément, mais uniquement sous la contrainte de stimulations répétées,nous arrêterons ces stimulations lorsque le nombre de 50 sera atteint. Toutefois, si la souris refuse de courir malgré la stimulation, l'expérience sera immédiatement stoppée et la souris sera considérée comme étant dans le groupe contrôleL’ajout de glucose-fructose n’induit pas de stress car les souris ont une appétence naturelle pour le sucré. Aucune souffrance n’est attendue par cette procédure qui induit une stéatose hépatique connue pour être asymptomatique chez l’homme et l’animal. Avant le test de tolérance au glucose, les souris seront régulièrement manipulées pour éviter le stress au moment du test. La mesure de la glycémie aux temps 0, 15, 30 ,60 et 120 min, se fait par dépôt d’une 1 goutte de sang sur une électrode et analyse avec un glucomètre (Abbott). La goutte de sang est obtenue par scarification de l’extrémité de la queue. Pendant la durée du test, la cicatrisation est incomplète, il n’est donc pas nécessaire de répéter le geste à chaque mesure de glycémie. Point limite : si la souris perd du poids (>10%), si elle a un comportement anormal (prostrée), elle sera euthanasiée.
Choix des espèces
1- La souris est le seul modèle chez lequel des mutants du gène d'intérêt peuvent être générés. 2- Elle est très utilisée dans les études fondamentales sur le métabolisme et permet de faire des analyses physiologiques. Le gène étudié est conservé chez l’humain. Les échantillons permettent d’obtenir assez de matériel pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Des travaux antérieurs de notre équipe et les données in vivo de la littérature sont obtenus sur des souris et les modèles génétiques des mutants de ce gène, ce qui permet de faire des comparaisons indispensables et de ne pas répéter certaines expériences. 3-Nous utilisons la souris C57Bl6J car la régulation du métabolisme est similaire chez la souris et l'humain et la souche C57Bl6J est prédisposée au maladies métaboliques. les souris seront âgées de 2-4 mois au début du challenge exercice physique car c'est à cet âge que les résultats montrant une diminution de l'endurance ont été générés. les souris seront âgées de 6 à 10 semaines au début du challenge hyperglucidique car c'est à cet âge que nous avons montré que la délétion de ce facteur de transcription hépatique aggravait la stéatose hépatique.
Analyse de mitochondries des souris déficientes en seipines
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour isoler et caractériser les mitochondries du tissu adipeux de souris privées de seipine, une protéine dont l'absence détruit la graisse corporelle, 384 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit cinq jours de suite une injection de tamoxifène dans le péritoine, qui déclenche la suppression du gène. Le porteur décrit le phénotype obtenu comme très léger, une perte de masse graisseuse sans effet sur le poids total. Toutes sont tuées quinze jours après l'injection, six d'entre elles étant tuées pour chaque préparation de mitochondries, à raison de huit préparations par groupe et pour chacun des quatre paramètres étudiés.
Objectifs
L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que la dysfonction adipocytaire joue un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. Notre équipe s’intéresse à différents facteurs qui contrôlent l’homéostasie de l’adipocyte. Au cours de ces 10 dernières années, nous avons identifié plusieurs cibles moléculaires impliquées dans la bonne santé adipocytaire. Depuis plus de 15 ans, nous nous intéressons au rôle de la seipine, une protéine dont l'absence entraîne la perte du tissu adipeux. Récemment, nous avons montré que la seipine régulait la bonne santé du tissu adipeux via sa localisation dans les points de contact entre deux structures cellulaires, le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries. Nous avons d'ores et déjà étudié un modèle murin de déficience inductible et adipospécifique qui de la seipine. Ces dernières années, grâce à des analyses in vitro, nous avons montré que la seipine contrôle l'activité des mitochondries, des organites cellulaires impliqués dans la production de l'énergie et la synthèse des lipides. Afin de confirmer la relevance de nos résultats chez l'animal, nous souhaitons isoler les mitochondries de souris déficientes en seipine et les caractériser. De plus en plus d'évidences montrent que les mitochondries jouent un rôle important dans l'homéostasie du tissu adipeux et que leur fonction est altérée dans le tissu adipeux des souris obèses et des patients atteints d'obésité. Notre travail pourrait permettre de mieux comprendre comment les mitochondries contrôlent les propriétés du tissu adipeux et comment la correction de leurs propriétés pourrait améliorer l'état du tissu adipeux des patients vivants avec une obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux définir les déterminants de la bonne santé adipocytaire et dans le futur, de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les souris recoivent une injection intrapéritonéale (durée 20 secondes) pendant 5 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances principales sont liées aux injections par voie intrapéritonéale de tamoxifène qui permettent l'induction de la délétion. Les souris sont mise à mort 15 jours après l'injection, à ce stade le phénotype est très léger et se traduise principalement par une perte de masse graisseuse sans effet sur le poids total et sans altération du métabolisme.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour permettre les analyses biologiques nécessaires pour le projet
Remplacement
Nous avons déjà validé in vitro que la seipine joue un rôle central dans le contrôle des propriétés des mitochondries. Les expériences proposées ici interviennent à un moment où le rationnel est solide. Cependant, une validation in vivo est indispensable car les propriétes du tissu adipeux restent différentes de celles des modèles celulaires disponibles.
Réduction
Le projet nécessite l’utilisation d’un nombre total de 384 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utilisons 6 animaux pour une préparation d'isolement de mitochondries, et pour avoir des données robustes nous avons besoin de 8 préparations par groupe, pour chacun des 4 paramètres étudiés. Nous utiliserons des tests non paramétriques pour tester la valeur statistique de nos données.
Raffinement
Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. Les souris sont hébergées 5 par cages. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduisent la douleur. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en termes de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) comprise permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.
Choix des espèces
Nous avons généré et étudié les souris iATSKO. Nous connaissons bien le modèle et nous savons d'ores et déjà que dans le tissu adipeux de ces souris agées de 8 semaines, les mitochondries ont des propriétés altérées. C'est pour cette raison que nous utiliseraons des souris adultes de 8 à 10 semaines, à un stade où la dysfonction mitochondriale est déjà présente.
Etude de la stéatose hépatique non alcoolique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des dommages hépatiques sévères provoqués par une molécule, un régime riche en graisses maintenu des semaines, jusqu'à huit injections, un gavage et trois prises de sang : 2 340 souris subissent ces procédures, déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur décrit chacune de ces atteintes en une ligne et qualifie de légères la douleur des injections comme la contrainte du gavage, la seule mention de sévérité portant sur les dommages au foie qu'il induit délibérément. Il ajoute que les souris deviendront un peu moins actives en prenant du poids, et qu'une mise à jeun de six heures leur imposera une sensation de faim. Toutes sont tuées en fin de procédure pour récupérer des prélèvements qu'il juge "indispensables" à la compréhension de la stéatose hépatique.
Objectifs
La stéatose hépatique non-alcoolique est une maladie chronique caractérisée par une accumulation de graisses dans le foie associée à une inflammation. Elle est plus fréquente chez les personnes atteintes d’obésité et/ou du diabète de type 2. Dans notre projet, nous visons à utiliser des modèles de souris pour comprendre le développement et les facteurs contribuant à cette maladie et proposer des solutions thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes gouvernant l’inflammation du foie et pourrait permettre de définir de nouvelles approches thérapeutiques dans la stéatose hépatique non-alcoolique et ses complications.
Procédures
Injections sous anesthésie locale (maximum 8, durée 1 minute). Gavage (n=1, durée 1 minute). Prélèvements de sang (n=3, durée 2 minutes).
Impact sur les animaux
Régime riche en graisse (HFD) long-terme : les souris vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines et devenir un peu moins actives. - Injection : douleur légère. - Mise à jeun de 6 heures: Les animaux n’auront plus accès à la nourriture, ils pourront subir une contrainte due à la sensation de faim. - Gavage : contrainte légère due à la contention et à la sonde de gavage. -Induction de dommages sévères au foie par une molécule.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.
Remplacement
Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans le foie dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…). Pour réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables. Seul un animal vivant peut permettre d’étudier dans sa globalité le comportement des macrophages du foie soumis à différentes régimes.
Réduction
Le nombre de souris est réduit a son minimum. De nombreux tissus et cellules seront collectés apres la mise a mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et transcriptomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses données. De plus nous avons determiné un nombre de souris par groupe, suivant les procédures, en fonction de données de la littérature ou grâce a l'utilisation d'un outil statistique (calcul de puissance) pour le calcul des effectifs. En détail, nous avons déterminé le nombre de souris par régime et par génotype grâce à l'utilisation d'un outil statistique pour le calcul des effectifs avec un test de puissance . Concernant les résultats, une analyse statistique sera réalisée en tenant compte de la variabilité intra-groupe ainsi que test d'analyse de variance sur mesures répétées par les valeurs d'enzymes hépatiques et les poids des souris.
Raffinement
Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe de recherche pour évaluation clinique adaptée à chaque procédure, et mise en place d'actions correctives pertinentes. Des traitements antalgiques seront mis en place pour soulager les animaux en procédure. Des point limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Toutes les interventions seront faites sous anesthésie locale ou générale.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de l’obésité alimentaire et l’insulinorésistance. De plus, notre modèle murin (souris invalidées pour le gène d'intérêt) a déjà été validé dans des travaux publiés précédents. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront entre 8 et 10 semaines au début de la procédure, il s’agit de souris adultes car la pathologie humaine se développe chez le jeune adulte et chez l'adulte.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement altérés utilisés pour l’étude de la déficience en OTC
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Tuées quand leur génotype ne présente pas d'intérêt, gardées vivantes dans le cas contraire : sur les 3 113 souris de ce projet d'élevage, 2 823 sont conservées pour être utilisées dans d'autres projets. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et consistent, pour une partie des animaux, en un prélèvement de trente secondes à l'oreille pour lire leur génotype. Le projet sert à purifier le fond génétique d'une lignée modifiée pour ne plus produire un acide aminé, lignée dont les souris perdent du poids et voient leur fonction cardiaque se dégrader sous régime pauvre en protéines. Le porteur affirme qu'un modèle in vivo est "indispensable" pour cette physiologie intégrée et que la souris est la seule espèce permettant de choisir le lieu et le moment exacts de la mutation.
Objectifs
Depuis plusieurs années, l’intérêt s’est porté sur les propriétés régulatrices des acides aminés. En effet, différents travaux ont montré qu’un acide aminé particulier avait des effets sur plusieurs fonctions de l’organisme, comme sur la fonction musculaire, la fonction cardiaque, le système immunitaire, le métabolisme glucidique,... Cependant, dans toutes les études réalisées jusqu’alors sur cet acide aminé, celui-ci était apporté par voie exogène. Les effets de cet acide aminé endogène, c’est-à-dire produit par l’organisme, et plus particulièrement dans un organe précis, n’ont quant-à-eux jamais été étudiés. Pour palier cela, nous avons développé une lignée de souris qui n’exprimait pas le gène de l’enzyme responsable de la production de cet acide aminé, et qui ne produisait donc pas cet acide aminé au niveau de l’organe voulu. A l’aide de ce modèle, nous avons mis en évidence que l’absence de cet acide aminé au niveau plasmatique (via l’absence de production), lors d’un régime standard, n’avait pas d’effet sur les animaux. En revanche, sous régime faible en protéines, l’absence de cet acide aminé au niveau plasmatique entrainait une importante perte de poids chez les animaux (masse maigre et masse grasse) ainsi qu’une forte altération de leur fonction cardiaque. Cependant, le rôle majeur de cet acide aminé en cas de régime hypoprotéique, et non sous régime standard, sur le métabolisme protéino-énergétique et sur le système cardiovasculaire n’est pas encore totalement compris. Lorsqu’on possède une lignée de souris transgéniques, il est nécessaire, pour éviter une dérive génétique, de purifier le fond génétique de ces souris en les croisant avec des souris sauvages ayant un fond génétique « pur ». Le but de ce projet-ci est donc de purifier puis de conserver notre lignée de souris génétiquement modifiées. Pour cela, nous devons effectuer un génotypage invasif afin de définir les animaux qui comportent la modification génétique et ceux qui ne la possèdent pas.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de purifier le fond génétique de notre lignée de souris transgénique, puis de conserver nos 2 lignées de souris de façon à poursuivre les investigations pour une meilleure compréhension du rôle de notre acide aminé d’intérêt dans les différentes fonctions de l’organisme.
Procédures
Une partie des animaux sera prélevée au niveau de l’oreille pour génotypage (durée : 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les nuisances sur les animaux sont les suivantes : stress lié au prélèvement d’un morceau de l’oreille pour le génotypage.
Devenir
Certains animaux sans génotype d’intérêt sont mis à mort et les autres sont conservés pour une utilisation continue dans les projets (2823 souris).
Remplacement
Le modèle animal que nous souhaitons conserver est utilisé dans des projets qui étudient les conséquences d’une diminution de la concentration d’un acide aminé au niveau plasmatique (via la suppression de l’enzyme permettant sa production) sur différentes fonctions de l’organisme, et notamment le métabolisme protéino-énergétique. Le recours à des modèles alternatifs comme des cellules en culture n’est, dans l’état actuel des connaissances, pas possible parce que nous nous situons dans le domaine de la physiologie intégrée. L’objectif des projets qui utilisent ce modèle de souris transgéniques est de mieux comprendre comment cet acide aminé module différentes fonctions de l’organisme au niveau corps entier. Dans ce but, un modèle in vivo est indispensable. Le choix de la souris se justifie car c’est la seule espèce qui permet de créer des animaux transgéniques pour lesquels nous pouvons choisir le lieu exact de la mutation génétique, ainsi que le moment précis où nous voulons que celle-ci apparaisse.
Réduction
Comme un des gènes que nous ajoutons au génome des souris transgéniques doit absolument rester à l’état hétérozygote, nous devons obligatoirement conserver les 2 lignées distinctes. Cependant, tous les calculs ont été effectués de façon à ajuster au maximum les accouplements et les animaux à conserver pour la purification du fond génétique de la lignée dans laquelle notre gène d’intérêt est marqué et la conservation de ces 2 lignées.
Raffinement
Les animaux seront en collectivité, en cages ouvertes, permettant aux individus de sentir la présence de leurs congénères, avec un milieu enrichi par l'ajout d'objets dans les cages (tunnels, abris en carton...). De plus, nous utiliserons des points limites gradés précis et adaptés permettant de suivre objectivement l’état général des animaux, et d’agir rapidement en cas de problème. Enfin, les expérimentateurs/soigneurs ont été formés aux différentes techniques utilisées dans ce protocole, et ont développé les compétences permettant de respecter le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le recours à l’utilisation de lignées cellulaires n’est, dans l’état actuel des connaissances, pas réalisable parce que nous évoluons dans le domaine de la physiologie intégrée et nous nous inscrivons dans une approche fonctionnelle du métabolisme. L’objectif des projets utilisant ces lignées de souris est de mieux comprendre le rôle d’un acide aminé endogène dans la régulation de l’équilibre protéino-énergétique au niveau corps entier. Dans ce but, un modèle in vivo est indispensable. Le choix de la souris se justifie car c’est la seule espèce qui permet de créer des animaux transgéniques pour lesquels nous pouvons choisir le lieu exact de la mutation génétique, ainsi que le moment précis où nous voulons que celle-ci apparaisse. Les animaux seront mis en accouplement à l’âge de leur maturité sexuelle, soit 8 semaines.
Rôle des récepteurs Toll-like dans l’inflammation, l’autoimmunité et le syndrome métabolique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour comprendre comment un récepteur de l'inflammation contribue à l'obésité et aux maladies auto-immunes, 56 souris sont nourries jusqu'à l'obésité pendant toute la durée du protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune passe 48 heures isolée de ses congénères en cage calorimétrique et une heure et demie sous anesthésie pour une imagerie. Toutes seront tuées pour prélever leurs tissus, le porteur jugeant leur mise en liberté inconcevable du fait de leur modification génétique. Des points limites gradés et un arbre décisionnel sont prévus, et le porteur précise qu'aucune analgésie n'est prévue dans ce protocole.
Objectifs
L'obésité est un problème majeur de santé publique dans le monde entier, lié aux maladies auto-immunes et à l'inflammation chronique, mais les mécanismes sous-jacents sont inconnus. Les récepteurs de l'inflammation jouent un rôle essentiel dans la conduite des réponses immunitaires et ont été identifiés comme contribuant à l'obésité et aux maladies auto-immunes chez la souris et l'homme. Le ciblage de ces récepteurs pourrait constituer une nouvelle approche thérapeutique de l'obésité et des maladies inflammatoires. Ce projet vise à comprendre comment ce récepteur contribue à l'obésité et aux maladies auto-immunes et à tester l'hypothèse selon laquelle le contrôle de la fonction de ce récepteur peut prévenir leurs effets néfastes. Le projet explorera le métabolisme énergétique, la répartition des masses grasses et maigres et la fonction cardiaque chez la souris ne possédant plus ce récepteur.
Bénéfices attendus
L'obésité est liée à un risque plus élevé de troubles auto-immuns et inflammatoires, qui ont tous deux augmenté de manière significative dans les pays occidentaux. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles stratégies de prévention et de traitement. Les modèles murins d'obésité et de lupus induits par l'alimentation ont permis de comprendre le rôle d'un récepteur de l'inflammation dans les maladies auto-immunes et l'obésité. D'autres études animales sont nécessaires pour comprendre les mécanismes exacts impliqués dans l'autoréactivité et durant l'obésité. Nos études permettront de mieux comprendre la contribution d'un récepteur de l'inflammation à l'obésité et aux maladies auto-immunes et pourraient déboucher sur de nouvelles approches en matière de prévention et de traitement, réduisant ainsi le fardeau social et économique de ces troubles.
Procédures
Les animaux passeront 48 h en cage calorimétrique. Aucun risque particulier n'est associé à cet examen non invasif. L’IRM sera réalisée sur l’animal anesthésié, c’est un examen non invasif, l’examen dure environ 1h30, les risques sont liés à l’anesthésie. Les animaux seront manipulés quelques minutes chaque semaine lors des mesures de masse. De plus ils seront soumis à une alimentation les rendant obèses durant toute la durée du protocole.
Impact sur les animaux
Les animaux seront manipulés une fois par semaine pour la prise de poids. Ils seront passés en cage calorimétrique durant 48 heures et seront donc isolés de leur congénères. Pour l'imagerie, les animaux seront anesthésiés, ce qui est une source de nuisance. Enfin le régime est destiné à rendre les animaux obèses, ce qui sera également une source de nuisance.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue de la procédure pour prélever post-mortem différents tissus. Etant donné que nous travaillons sur des souris génétiquement modifiées, leur mise en liberté est inconcevable.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune méthode de substitution in vitro pour étudier l'impact de l'obésité induite. Les systèmes organoïdes au niveau immunitaire et intestinaux sont insuffisants, face à ces contraintes notre projet nécessite un organisme (souris) vivant entier. La souris est un donc modèle de choix car elle présente des mécanismes physiologiques proches de ceux qui sont observables chez l'homme. Le but de ce projet est de rechercher les conséquences métaboliques d'une lignée de souris transgéniques pour TLR7. Ce processus est complexe et met en jeu de nombreux organes et systèmes métaboliques, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux est le minimum nécessaire pour étudier la variabilité biologique des souris. Ce nombre minimal est également nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives, à l'aide les tests statistiques, entre les groupes. Le nombre d'animaux sera de 6 à 10 par génotype.
Raffinement
Un délai d'acclimatation minimum de 8 jours sera assuré. Les animaux seront hébergés en cage de 4 pour les mâles et les femelles, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton, du coton, des rondins de bois à ronger, une roue d'activtié…. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle pour une durée inférieure à 24h, avant d'etre replacé avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.
Choix des espèces
La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme et permet d’avoir accès à des modifications génétiques contrôlées. Les animaux seront âgés d’environ 8 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.