Système endocrinien

Tuées au cours d'une chirurgie de perfusion du foie dont elles ne se réveillent pas, 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines portent un foie ou un système immunitaire humanisé, construit à partir d'hépatocytes humains ou de sang de cordon. Avant l'opération elles reçoivent pendant deux à trente semaines un régime gras et sucré, occidental hypercalorique ou déficient en choline, destiné à provoquer une stéatose ou une fibrose du foie, puis des candidats médicaments par gavage ou injection dont le porteur admet que certains peuvent être toxiques pour le foie. Il passe en revue lignées cellulaires, hépatocytes humains isolés, cellules souches et organoïdes, écarte chacun d'eux et conclut que la souris humanisée constitue un modèle "indispensable".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de candidats médicaments sur la fonction hépatobiliaire et d’isoler les différentes populations cellulaires hépatiques (= du foie) par une perfusion in situ du foie, chez des souris saines et pathologiques. Deux pathologies seront ciblées : le modèle de stéatose hépatique d’origine métabolique (maladie du foie gras) et le modèle de fibrose hépatique. Pour ce faire, nous pourrons travailler chez différentes souches de souris immunodéficientes (diminution de l’état d’immunité de l’organisme) ou immunocompétentes (≠immunodéficience, capacité normale de l’organisme à se défendre contre une infection). Les souris pourront présenter un système immunitaire humanisé à l’aide de cellules souches issues de sang de cordon humain ou de cellules sanguines provenant du sang périphérique humain (PBMC), et/ou un foie humanisé à l’aide d’hépatocytes humains. Les tests fonctionnels pourront être réalisés et nous permettront d’évaluer directement au niveau de l’organe les effets de molécules à visée thérapeutique, administrées préalablement et/ou au moment de la perfusion, mais également leur métabolisation. Par ailleurs, l’isolement des différentes populations cellulaires hépatiques par cette méthode nous permettra non seulement de déterminer les effets cellulaires des candidats médicaments, mais aussi de congeler ou de mettre en culture des cellules pour une utilisation ultérieure (essais in vitro, transplantation chez de nouvelles souris).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’établir les effets fonctionnels de molécules à visée thérapeutique sur le foie, ainsi que leur métabolisation par cet organe, dans des modèles pathologiques d’intérêt. Par ailleurs, ce projet nous permettra d’isoler différents types cellulaires hépatiques en vue de leur utilisation ultérieure. L’utilisation de souris humanisées dans ce contexte permettra l’obtention de données particulièrement pertinentes, en offrant un modèle préclinique se rapprochant de la physiologie de l’espèce cible, l’Homme.

Procédures

Afin d’induire la stéatose, les régimes suivants pourront être administrés ad libitum pendant 2 à 30 semaines avant perfusion : - Diète enrichie en graisses et en sucre - Diète dite « western » (régime occidental hypercalorique) - Diète déficiente en choline (export des lipides du foie) et/ou méthionine (régulation de l’expression des gènes) L’administration de composés de recherche pourra être réalisée préalablement à la perfusion hépatique par voie entérale (gavage, incorporation dans l’alimentation ou dans l’eau de boisson) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intramusculaire). L’administration des thérapies pourra également être réalisée directement pendant la perfusion, par incorporation dans la solution de perfusion, ou sur les cellules isolées. Une chirurgie sous anesthésie générale sera réalisée sur les souris afin de perfuser le foie. Une seule chirurgie sera réalisée, sa durée minimale sera de 10min, le temps nécessaire à la mise en place de la perfusion. Le temps maximal sera fonction de l’objectif de la perfusion. Pour un isolement de cellules, il faudra compter environ 45min ; pour les tests de composés à visée thérapeutique, le temps sera adapté au cas par cas selon les données disponibles de pharmacocinétique/pharmacodynamique et de métabolisation hépatique de la molécule.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par les procédures préalables à la perfusion du foie (par ex. perte de poids en réponse à un régime). Par ailleurs, les composés médicamenteux expérimentaux administrés pourraient potentiellement exercer des effets secondaires hépatotoxiques (toxiques pour le foie) qui pourraient provoquer des nuisances. Chez la souris vigile, la douleur peut se manifester, entre autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux sont mis à mort car la procédure de perfusion du foie est terminale et ne permet pas leur réveil. Les animaux sont également euthanasiés avant la fin d’étude s’ils ont atteint les point limites éthiques prédéfinis ou sur demande du vétérinaire d'établissement.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de lignées cellulaires hépatiques existent, leur utilisation est limitée car ils ne permettent actuellement pas de refléter l’environnement hépatique avec le niveau de fidélité et de complexité nécessaire à une évaluation fiable et pertinente des effets d’un composé à visée thérapeutique, de ses potentiels effets secondaires et de sa métabolisation. Les hépatocytes humains fraîchement isolés, qui seraient le modèle le plus pertinent, bien que ne représentant qu’une seule population cellulaire, se dédifférencient rapidement après isolement et ne se maintiennent pas en culture. Les lignées cellulaires immortalisées ou dérivées de cellules souches pluripotentes induites en laboratoire (IPS), quant à elles, sont sujettes à des dérives génétiques et à l’activation d’oncogènes (gènes dont l'expression favorise la survenue de cancers). Enfin, les systèmes plus complexes et multicellulaires, tels que les organoïdes (culture de cellules en 3D) dérivés de cellules souches hépatiques, sont complexes à obtenir et présentent une variabilité liée au donneur de cellules souches. Par ailleurs, ces systèmes ne permettent actuellement pas de rendre compte du niveau de complexité fonctionnelle de l’organe et des interactions entre les multiples populations cellulaires présentes dans le foie (hépatocytes, cellules non-parenchymateuses, cellules du système immunitaire, …). À l’heure actuelle, la souris, et à plus forte raison la souris humanisée, constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total maximum de 2 500 souris sera utilisé sur une période de 5 ans, permettant de mener 50 études de 50 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques. Par ailleurs, l’isolement de cellules hépatiques permettra, d’une part, leur cryoconservation pour de futurs essais in vitro et, d’autre part, leur mise en culture, sous forme d’organoïdes. Ces techniques participeront à la réduction du nombre d’animaux utilisés pour les futures études.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 6 heures par semaine. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires (type gel nutritif enrichi en électrolytes et vitamines) pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (perte de poids), si leur utilisation n’est pas amenée à biaiser les résultats scientifiques de l’étude. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de coton. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours et seront habituées à la présence humaine régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids. Enfin, un protocole d’anesthésie-analgésie raffiné sera mis en place pour la conduite de la procédure de perfusion.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, âge de première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.

Gavées tous les jours pendant un mois avec un glucocorticoïde de synthèse, une partie des 960 souris de ce projet développe la fonte musculaire que l'étude cherche à décrire. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et incluent aussi des injections répétées dans l'abdomen et un test d'agrippement, avec un risque de fausse route et d'irritation de la gorge lié au gavage. Le porteur affirme vouloir "anticiper toute souffrance inutile" et écrit dans la même rubrique n'avoir prévu ni anesthésie ni analgésique, tous les actes se faisant sur animal vigile. Toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure pour des analyses moléculaires et histologiques, les animaux perdant plus de 20 % de leur poids en une semaine étant retirés du lot et tués avant.

Objectifs

Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont relayés par le récepteur des glucocorticoïdes appelé GR. Il est communément admis que GR une fois lié à son hormone est convoyé dans le noyau de la cellule, où il se lie à l’ADN pour activer ses gènes cibles. Il effectue cette tache en coopération avec d’autres protéines qui sont appelées des « corégulateurs ». L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de deux de ces corégulateurs dans l'atrophie musculaire dépendante des glucocorticoïdes en utilisant des souris dans lesquelles ils sont sélectivement supprimés (mutés) dans le muscle squelettique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs (ci-après EU1 et 2 par souci de simplicité). Les animaux seront produits et élevés dans l'EU1. La mutation sera induite dans l'EU1 ou dans l'EU2 s'il s'avère que le personnel de l'EU1 n'est pas disponible. Les autres traitements seront réalisés dans l'EU2 afin que nous puissions suivre l’évolution des animaux. En effet, notre équipe travaille sur ces modèles depuis de nombreuses années et peut ainsi anticiper les dommages occasionnés. Par ailleurs, les animaux seront déjà présents dans l'EU2, à laquelle les membres de l'équipe ont accès, afin d’effectuer des tests d'agrippement, évitant ainsi un nouveau stress généré par le transfert. S’il s’avère que les membres de l’équipe ne sont pas disponibles, les traitements pourront être réalisés dans l'EU1 afin de ne pas gâcher de groupe.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle de deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes dans le muscle au cours de l'atrophie musculaire provoquée par les glucocorticoïdes. Contrôler l'activité du récepteur des glucocorticoïdes en modulant celle des co-régulateurs ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques pour réduire les effets indésirables causés par les traitements prolongés avec ces hormones.

Procédures

Les animaux pour lesquels la mutation doit être induite (groupe 1 et 2) seront traités par le biais d’une nourriture spécifique pendant 3 semaines, puis par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 3 sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 4 sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Un test d'agrippement sera réalisé une seule fois en triplicat sur l'ensemble des cohortes à la fin des traitements (30 sec/ souris) .

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues de traitement ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant lors d’études comparables. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Les traitements aux glucocorticoïdes durant de longue période peuvent entrainer une fonte musculaire, c’est pourquoi nous prendrons soin d’exclure les animaux ayant perdu plus de 20% de leur poids corporel en une semaine. De plus, le gavage répété peut conduire à des fausses routes et une irritation de la gorge pouvant impacter la prise alimentaire que nos pesées régulières nous permettrons d’observer rapidement. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.

Choix des espèces

Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et deux de ses co-régulateur dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux inductibles seront donc traités au tamoxifène entre 5 et 7 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection.

640 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à trente-cinq injections dans l'abdomen sur animal vigile et passant jusqu'à quatre semaines isolée en cage calorimétrique. Une partie porte une mutation qui reproduit la progéria humaine, avec chute des poils, disparition de la graisse sous-cutanée et rides, ce que le porteur déclare sans effet sur leur bien-être. Les prises de sang se font également sur animal vigile, l'anesthésie modifiant la protéine étudiée, et toutes les souris sont tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le bénéfice avancé, valider une piste thérapeutique contre une maladie qui tue les enfants atteints vers treize ans, reste au conditionnel, tandis que les injections et l'isolement sont, eux, programmés.

Objectifs

La progéria est une maladie qui reste indétectable à la naissance, mais elle commence à se manifester très tôt, souvent dès la première année de vie. Les enfants affectés présentent des signes qui évoquent un vieillissement prématuré et accéléré, tels que la rareté des cheveux (alopécie), une peau fine, ridée, dépourvue de graisse, ainsi que des ongles peu développés. Par ailleurs, ces enfants connaissent une croissance lente, des problèmes osseux et musculaires, et un retard dans la pousse des dents. Ils souffrent également de douleurs articulaires et font face à des problèmes cardiovasculaires, mais il est important de noter que leurs capacités intellectuelles ne sont généralement pas affectées. Malheureusement, le pronostic de cette maladie est très sombre. Le décès survient en général entre l'âge de 6 et 20 ans, principalement à cause de problèmes cardiovasculaires, comme l'athérosclérose, une dégénérescence des artères, des crises cardiaques ou des accidents vasculaires cérébraux. L'espérance de vie des enfants atteints de cette maladie se situe aux alentours de 13 ans. Nous souhaitions démontrer que, dans des modèles de souris appropriés, l'inhibition d’une protéine par différentes méthodes (neutralisation de la protéine par des anticorps monoclonaux de haute affinité ou par des auto-anticorps polyclonaux), pourrait retarder le vieillissement prématuré dans des modèles murins de la progéria de Hutchinson-Gilford.

Bénéfices attendus

La progéria provoque un vieillissement prématuré du patient. L'espérance de vie des enfants atteints de cette maladie se situe aux alentours de 13 ans. C’est pourquoi il est important de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet nous permettra de valider dans plusieurs modèles précliniques une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter la progéria.

Procédures

Un prélèvement de quelques millimètres à l’oreille sera effectué sur les animaux pour génotypage à raison de quelques secondes par animal effectuée sur animal vigile. Les souris transgéniques développant un syndrome de progéria de type Hutchinson-Gilford présentent un phénotype clinique très semblable à la progéria humaine comme par exemple l’alopécie (accélération de la chute des poils), la perte du gras sous-cutanée, ou encore les rides sans que cela n’affecte le bien-être des animaux ou implique de soin ou de suivi spécifique au modèle. Les symptômes n’apparaissent qu’aux alentours de la dixième semaine. Toutes les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales (injection au niveau de l’abdomen de quelques secondes) (entre 4 et 35 au maximum sur animal vigile) et à un isolement (pour un maximum de deux fois deux semaines soit un total de 4 semaines) en cage calorimétrique. Les prélèvements sanguins (quelques secondes par prélèvement, volume de prélèvement relativement faible pour analyse moléculaire) seront effectués sur animal vigile (anesthésie modifiant les paramètres de la protéine étudiée). A l’issue de la période de maintien ou en cas d’atteinte de points limites, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Les sites des injections ou des prélèvements sanguins pourraient s’infecter. Les manipulations ainsi que le passage en cage calorimétrique pourraient stresser les animaux. Toutes les souris seront soumises à un prélèvement de quelques millimètres à l’oreille, à des injections intrapéritonéales, à des prélèvements sanguins et à être isolées (pour un maximum de 2 fois deux semaines) en cage calorimétrique. Ces injections et ces prélèvements sanguins entrainent un stress lié à la contention et une douleur de courte durée au point d'injection ou de prélèvements. Les isolements peuvent être une source de stress. Les souris transgéniques développant un syndrome de progéria de type Hutchinson-Gilford présenteront un phénotype clinique très semblable à la progéria humaine comme par exemple l’alopécie (accélération de la chute des poils), la perte du gras sous-cutanée, ou encore les rides sans que cela n’affecte le bien-être des animaux ou implique de soin ou de suivi spécifique au modèle.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude macroscopique et systémique de la progéria.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 640 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de 20 souris (10 femelles et 10 males) pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Le comportement général des animaux sera suivi. Le poids sera mesuré 1 fois par semaine. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces, seront appliqués afin de limiter la douleur des animaux à leur minimum. Il y aura une vigilance accrue si les animaux ont les mi-clos ou fermés ou s’ils sont isolés. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont d'abord rendues obèses et diabétiques par douze semaines de régime gras, puis soumises à un jeûne de seize heures, à un jeûne intermittent de six semaines ou à un régime cétogène, avec des tests de tolérance au glucose comprenant six heures de jeûne et sept piqûres de la queue en deux heures. Il s'agit de savoir si une protéine du foie explique les effets bénéfiques de ces régimes, déjà observés au laboratoire dans une étude non publiée. Le porteur écrit qu'il est "impossible" de reproduire par des méthodes alternatives le jeu combiné du foie, des tissus adipeux, de l'intestin, du cerveau et du muscle.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie (stéatose hépatique non alcoolique, ou NAFLD pour non-alcoholic fatty liver disease) sont en expansion dans les pays industrialisés, parallèlement à la prévalence croissante de l’obésité. Le premier stade de la maladie correspond à une accumulation de graisses dans le foie et est bénin mais peut évoluer chez certains patients vers une forme inflammatoire, puis vers une cirrhose, à l’origine d’autres complications sévères telles que le cancer du foie. Les mécanismes de progression de ces maladies sont encore mal compris et aucun traitement médicamenteux efficace n’est disponible à ce jour. Dans une étude non publiée du laboratoire, nous avons récemment démontré que plusieurs stratégies alimentaires sont capables de diminuer l’obésité, le diabète et la stéatose hépatique chez la souris. Nous souhaitons à présent déterminer les mécanismes impliqués dans ces effets bénéfiques. Nous émettons l’hypothèse que la protéine PPARa pourrait être impliquée dans ces effets. PPARa est principalement exprimée dans le foie où elle contrôle la dégradation des graisses, faisant d'elle une bonne cible thérapeutique pour traiter les maladies métaboliques. Nous disposons au laboratoire de souris mâles et femelles chez qui le gène PPARa est non fonctionnel dans le foie. Dans ce projet, nous utiliserons des souris mâles et femelles qui n'expriment pas PPARa dans le foie et comme contrôle, des souris chez qui PPARa s’exprime. Elles seront nourries par un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l’Homme. Une fois la pathologie installée, les animaux seront soumis à différentes stratégies alimentaires : un retour à un régime contrôle, un jeûne aigu ou intermittent, un régime cétogène (presque exclusivement constitué de graisses et contenant très peu de sucre). Les effets de ces différentes stratégies alimentaires seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses des prélèvements d’organes (foie, tissus adipeux brun et blanc).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir l’importance de PPARa spécifiquement dans le foie dans les effets bénéfiques des différentes interventions sur la progression de l’obésité, du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. En conséquence, ce projet pourrait identifier un des mécanismes hépatiques pouvant être impliqué dans les effets de ces différentes interventions. En effet, aucun traitement de référence n’est disponible à ce jour pour les patients atteints de ces maladies chroniques du foie qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie du monde.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime standard ou un régime obésogène riche en graisses pendant 12 semaines. A l'issue de ces 12 semaines, les animaux subiront l'une des interventions nutritionnelles suivantes : une mise à jeun pendant 16h, un jeûne intermittent de 16 h par jour pendant 6 semaines, un régime cétogène riche en gras et pauvre en sucre pendant 6 semaines, un régime standard pendant 6 semaines, un groupe contrôle qui restera nourri avec le régime obésogène pendant 6 semaines. Les animaux seront aussi soumis à des tests de tolérance au glucose (OGTT) ou à l’insuline (ITT) au début et à la fin de chaque intervention. Ces tests consistent en : 6h de jeûne, suivi d'une mesure de la glycémie puis un gavage avec du glucose pour les OGTT ou une injection d'insuline pour les ITT, puis des mesures de la glycémie toutes les 15 min pendant 2h. Pour les OGTT, le glucose est administré par gavage une fois et pour les ITT, l'insuline est administrée par injection une fois. Le gavage et l'injection prennent chacun moins de 30 secondes. Pour les mesures de glycémie, le prélèvement d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Les régimes obésogènes vont induire une obésité et des perturbations du métabolisme associées tels qu'un diabète et une stéatose, sans souffrance visible des animaux ni changement de leur comportement. La mise à jeun peut entraîner une hypoglycémie et une hypothermie. Le prélèvement sanguin et le gavage oral de glucose et d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car la pathologie étudiée (stéatose non alcoolique) est complexe et fait intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible de mimer la pathologie étudiée grâce à l’utilisation du régime gras.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Ainsi, les souris seront en hébergement collectif et dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, l’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (régime standard et aucune procédure réalisée).

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

Certains poissons subissent une montée de la température de l'eau jusqu'à perdre l'équilibre, pendant deux heures au maximum, pour déterminer leur température critique. 2 000 chevaines et spirlins pêchés dans le Rhône vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 800 tués pour l'analyse de leurs cellules et 200 relâchés sur leur lieu de capture. Chaque individu est anesthésié pour être marqué, puis à chaque transfert entre bassins, et reste isolé jusqu'à vingt-quatre heures dans un tunnel de nage. Le porteur inscrit ce travail dans un objectif de conservation des espèces du Rhône, et mentionne 800 poissons supplémentaires tués sans expérimentation préalable, qu'il choisit de ne pas comptabiliser dans le tableau récapitulatif.

Objectifs

Une augmentation de la température environnementale peut entraîner des conséquences dramatiques sur les organismes, notamment chez les animaux ectothermes, dont la température corporelle dépend directement de la température ambiante. Ce projet vise à comprendre comment les poissons d’eau douce vont réagir face au réchauffement global. En effet, une augmentation de la température de l’eau entraine une augmentation des dépenses énergétiques des organismes, ayant pour conséquences directes une diminution de la croissance et de la reproduction. Depuis plusieurs années, le réchauffement de la planète est un phénomène qui s’accélère et donc les organismes doivent mettre en place des mécanismes adaptifs plus rapidement s’ils veulent survivre. Pour ce qui est des réponses à la contrainte thermique, 2 principales hypothèses se dégagent : (1) les individus vivant dans des milieux relativement chauds pourraient être plus résistants et mieux adaptés au réchauffement et aux périodes de stress thermique par rapport aux individus vivant dans des milieux plus frais ou (2) le fait de vivre dans des conditions thermiques suboptimales pourrait rendre les organismes ectothermes plus sensibles aux stress subséquents. Cette étude a pour but de définir des températures de tolérance pour les espèces du Rhône et de mettre en lumière les mécanismes d’adaptation à long terme et/ou d’acclimatation plus rapide face à une augmentation des températures. Afin de pouvoir étudier ces réponses physiologiques, deux espèces de poissons seront utilisées comme modèles expérimentaux : le Chevaine, espèce eurytherme présente partout dans le Rhône et le Spirlin, espèce plus abondante en aval des centrales nucléaires productrices d’énergie (CNPE), là où l’eau est plus chaude. Cette zone plus chaude pourrait être considérée comme une condition future étant donné le réchauffement actuel. Donc, étudier les différences d'adaptation entre les populations en amont et en aval s’avère pertinent. Le projet se fera le long du Rhône selon un gradient nord sud et donc les échantillonnages se feront sur 5 sites ; Brégnier-Cordon (nord), en amont et en aval de la CNPE du Bugey, et en amont et en aval de la CNPE du Tricastin (sud) afin de pouvoir comparer les capacités d’acclimatation et les préférences thermiques des différentes populations selon leur lieu d’origine.

Bénéfices attendus

L’étude des conséquences du réchauffement climatique sur la physiologie des poissons d’eau douce est au centre des préoccupations du grand public, des instances gouvernementales et des chercheurs. Ce projet s’inscrit directement dans cet axe d’intérêt, et les résultats obtenus permettront notamment de donner des réponses concrètes sur les effets d’une augmentation de température de l’eau afin de réfléchir à des directives de conservations des écosystèmes basées sur des données physiologiques. Cette étude va définir des températures de tolérance pour les espèces du Rhône et potentiellement permettre de mettre en lumière les mécanismes d’adaptation et d’acclimatation face à une augmentation des températures. De plus, comme nous travaillons sur une espèce eurytherme (chevaine) et une que l’on retrouve de plus en plus en aval des centrales thermiques (spirlin), si ces poissons ont du mal à s’adapter au réchauffement des températures alors nous pouvons supposer que cet échauffement entraînera des conséquences d’autant plus délétères pour des poissons qui supportent moins bien le réchauffement et les variations de température. Donc, ce projet a non seulement un but de caractérisation des adaptations à la température, mais aussi un but de conservation d’espèces plutôt endémiques du Rhône. Le protocole de CTmax permet de définir la température maximale de tolérance thermique, qui n’a jamais été documentée pour les deux espèces étudiées ici. Les protocoles de mesures croisées (répétition de 3 performances de nage à 3 différentes températures) sont indispensables pour élucider les mécanismes d’acclimatation et les réponses aigues aux différentes températures, et le métabolisme énergétique pourra être ainsi abordé selon une double approche in vitro et in vivo. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes adaptatifs mis en place chez différentes populations de poissons distribuées selon le gradient naturel « haut-Rhône » froid et « bas-Rhône » plus chaud d’une part et selon l’amont ou l’aval des deux CNPE d’autre part, mettant en exergue des variations environnementales provenant directement d’activités anthropiques. Ainsi, ce projet a pour but de participer aux efforts de conservation de la biodiversité et via une connaissance accrue des capacités d’adaptation de ces espèces, permettant de mieux appréhender comment ils pourraient réagir face au changement climatique.

Procédures

Suite à leur prélèvement en milieu naturel, tous les poissons seront acclimatés à l’animalerie et stabulés dans des conditions adaptées à leur espèce. Les poissons seront soumis à une anesthésie / analgésie afin de les implanter avec des marques pour les individualiser. Cette intervention dure au maximum 15 minutes par poisson. Les poissons seront ensuite soumis à une période de pré-conditionnement thermique (2 jours à 6 semaines selon la procédure). A chaque manipulation (lors des transferts entre les aquariums de stabulation et les enceintes expérimentales), les poissons seront légèrement anesthésiés afin de limiter le stress du déplacement. Cette anesthésie ne fera pas effet pendant plus d’une minute sur le poisson. Certains poissons subiront une augmentation de la température de l’eau jusqu’à perte d’équilibre (3h). Certains poissons seront mis à mort après une stabulation courte à l’animalerie. Certains poissons subiront des tests de préférence thermique (12h) puis 3 tests de performance de nage (

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables de ces protocoles pourrait être un niveau de stress accru faisant suite à la pêche, à la stabulation dans un nouveau milieu, et/ou aux expérimentations. Cette augmentation du stress peut s’exprimer via l’apparition d’infections chez les poissons. En effet, les risques d’infections sont plus hauts que la normale car comme les poissons viennent de milieux naturels, on ne connaît pas leur histoire et ce qu’ils auraient pu rencontrer dans leur habitat. Un autre point de surveillance sera lié à la période d’isolement des poissons (entre 2h et

Devenir

200 individus seront replacés en liberté sur leur lieu de capture. 800 poissons seront euthanasiés sans expérimentation préalable et seront utilisés post-mortem pour la caractérisation des mécanismes cellulaires in vitro. 1800 individus seront euthanasiés pour la caractérisation des mécanismes cellulaires in vitro.

Remplacement

A ce jour, seule l’expérimentation sur animaux permet de réaliser une étude intégrative qui prend en compte l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques, surtout lorsqu’il s’agit d’animaux sauvages. Cela permet notamment de caractériser les interactions complexes entre les tissus et leurs fonctions cellulaires. Cette vision globale est indispensable pour étudier de façon complète, les réponses métaboliques de l’animal face à son environnement.

Réduction

Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, compte tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés dans cette étude. En effet, une forte variabilité interindividuelle est attendue du fait du brassage génétique et de l’impact des différents facteurs environnementaux du milieu naturel. La taille des échantillons a été ainsi définie pour permettre une analyse statistique fiable. Pour ce qui est de la procédure expérimentale pour obtenir la température critique maximale (CTmax), minimum 20 poissons par endroit d’échantillonnage sont nécessaires car comme expliqué ci-dessus, une forte variabilité interindividuelle peut entrer en jeu. Donc 5 endroits x 2 espèces x 20 individus = 200 poissons pour la CTmax au total. Pour les mesures de bioénergétique sur populations naturelles, il y a 5 endroits x 4 saisons x 2 pêches /an x 1 espèce (uniquement les spirlins) x 20 individus = 800 individus. Mais au vu de la courte durée de stabulation au sein de l’EU, ces individus utilisés uniquement post-mortem ne seront pas comptabilisés dans le tableau récapitulatif. Pour ce qui est de la procédure d’acclimatation à la température, 1800 poissons seront utilisés, soit 1200 spirlins (5 endroits x 2 pêches/an x 2 ans x 20 individus x 3 groupes) et 600 chevaines (5 endroits x 1 pêche/an x 2ans x 20 individus x 3 groupes) ; 200 poissons supplémentaires sont prévus afin de palier d’éventuelles morts spontanées.

Raffinement

Lors des protocoles non invasifs in vivo (mesure de la consommation d’oxygène associée aux performances de nage et tests comportementaux), un des principaux objectifs est de limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Chaque geste contraignant (mesure et placement des poissons dans les tunnels de nage) sera réalisé sous anesthésie légère, suivi par un temps d’acclimatation de 12h dans le tunnel de nage, avant le protocole de nage (Ucrit) ou de 2h dans les arènes de choix. Après chaque expérience, les poissons seront replacés dans leur aquarium de stabulation et toutes les précautions seront prises pour leur éviter toutes nuisances visuelles et sonores. Les poissons sont maintenus dans des aquariums de 60L ou 90L en densité adaptée à leur espèce. Les spirlins et les chevaines juvéniles sont des poissons vivant en banc. Ils seront donc maintenus à plusieurs dans les aquariums (environ 30 par bac) afin d’optimiser les conditions de stabulation. Des cachettes adaptées (tubes de gros diamètres leur permettant de se cacher en banc), des plantes artificielles et du gravier sont disposés dans chaque aquarium. Un système de pompe filtrante assurera également une circulation d’eau bullée continue dans les aquariums. Les poissons seront nourris une fois par jour, avec des cubes de moules hachées avec du mix (différentes larves de moustiques, daphnies et de la verdure (épinards, spiruline)) et lors du nourrissage, leur comportement est observé. En effet, si un poisson ne se nourrit pas, des mesures seront prises à son égard. Une observation biquotidienne sera réalisée par le personnel animalier et les expérimentateurs afin de veiller au bien-être des animaux depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à l’euthanasie. Les états de santé et de bien-être des animaux seront ainsi évalués en prenant en compte les signes cliniques et comportementaux selon des grilles d’évaluation afin de définir des points limites adaptés. Dès l’apparition de signes cliniques de mal-être, les animaux seront sortis du protocole et remis en conditions standard d’élevage. Dans le cas où des signes de douleur ou de mal-être devaient persister au-delà de 24 heures après la mise en stabulation, les animaux seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Le chevaine est une espèce plutôt ubiquiste du Rhône, généraliste et eurytherme avec un panel de tolérance thermique large. Le spirlin est une espèce que l’on retrouve de plus en plus en aval des centrales thermiques ce qui laisse supposer une bonne adaptation à des variations de températures. L’étude de cette espèce dans des environnements thermiques élevés permettra d’évaluer précisément ses capacités d’acclimatation et d’anticiper l’impact délétère du réchauffement sur des espèces moins adaptatives. De plus, ces espèces sont en statut préoccupation mineure, sur la liste rouge UICN (Union internationale pour la conservation de la nature), donc les pêcher n’aura pas de grand effet sur les populations naturelles. Enfin, les organismes avec qui nous allons pêcher font des suivis de populations et sont donc au courant des statuts des différentes espèces dans le Rhône. Aucun prélèvement n’aura d’impact négatif sur les populations naturelles. Les spirlins utilisés sont des spirlins adultes. Leur petite taille (30 cm) étant incompatible pour une telle étude, seuls des chevaines juvéniles seront employés.

Quinze semaines d'un régime gras rendent 288 souris obèses, diabétiques et porteuses d'un foie chargé de graisse, avant sept prélèvements de sang en deux heures le jour du test au glucose. Elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue. Le porteur ne décrit comme douleurs que celles des piqûres de la queue et des prélèvements à la veine sous-mandibulaire, qualifiées de légères, l'obésité, le diabète et la stéatose induits restant rangés au titre des perturbations métaboliques attendues. La mise à mort finale sert à récolter le sang et les organes pour identifier les protéines associées à la protéine p85 dans la voie de l'insuline.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie métabolique caractérisée par une concentration élevée de sucre (hyperglycémie) dans le sang. Le nombre de cas est en constante augmentation, en parallèle avec l’augmentation des cas d’obésité. Les patients diabétiques développent fréquemment des maladies chroniques du foie, notamment caractérisées par une accumulation de graisses dans le foie (stéatose). L'hyperglycémie, qui définit le diabète de type 2, est liée à l'action inadéquate de l'insuline. L'insuline est libérée par le pancréas suite à l'ingestion d'un repas. Elle agit avec d’autres protéines en cascade afin de faire entrer le sucre dans les cellules et maintenir sa concentration correcte dans le sang. Parmi les protéines de cette cascade, on retrouve notamment une protéine appelée p85. Afin de mieux comprendre les mécanismes liés au développement d'un diabète et d'accumulation de graisses dans le foie, nous souhaitons identifier les protéines qui participent au maintien de la concentration correcte de sucre dans le sang chez des souris mâles et femelles obèses. Pour cela, nous utiliserons des souris transgéniques afin d'identifier les protéines qui sont associées à la protéine p85. Ces souris seront nourries avec un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une stéatose chez l'animal. Les études cliniques et précliniques indiquent des différences majeures liées au sexe dans la voie de l'insuline, ainsi nous utiliserons des souris des 2 sexes. A la fin de l'expérience, différents organes seront prélevés afin de purifier la protéine d'intérêt et d'identifier les protéines auxquelles elle est associée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de la voie de l'insuline dans les pathologies du diabète de type 2 et du foie gras (stéatose hépatique). La purification spécifique des protéines d'intérêt de la voie de l'insuline permettra d'identifier et de comparer leurs interactions avec d'autres protéines chez des souris saines et des souris obèses. Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.

Procédures

Les animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou un régime obésogène riche en graisses pendant 15 semaines. Les animaux seront pesés toutes les semaines. Un prélèvement d’une seule goutte de sang à la queue sera réalisée 1 fois toutes les 2 semaines (petite piqûre de la veine caudale avec une lancette de 1 mm). Ce prélèvement ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. Les animaux recevront une fois une solution de glucose par gavage et une fois de l'insuline par injection intrapéritonéale. Le gavage et l'injection prennent chacun moins de 30 secondes et seront espacés au minimum d'une semaine. Le même jour, des prélèvements d’une seule goutte de sang seront réalisés à la queue toutes les 15 min minutes sur une durée de 2h pour étudier, soit 7 prélèvements prenant moins de 5 secondes chacun. Un prélèvement intermédiaire de sang, prenant environ 15 secondes, pourra aussi être réalisé (1 fois 100 μl), espacé au minimum d’une semaine avec les autres prélèvements. Juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire.

Impact sur les animaux

Les animaux nourris avec les régimes gras deviendront obèses et présenteront des perturbations métaboliques associées à l’obésité telles que le développement d’un diabète (concentration élevée de sucre dans le sang) et d'une stéatose (accumulation de graisses dans le foie). Les prélèvements sanguins (intermédiaire et final) à la veine submandibulaire et les injections de glucose (OGTT) et d’insuline (ITT) peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention et une légère douleur. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang (pour la mesure de la glycémie) peut entraîner une légère douleur.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation de l’animal entier car les pathologies étudiées sont complexes et ne peuvent pas être mimées avec fidélité en culture cellulaire. En effet, dans ces pathologies, plusieurs organes de l'organisme communiquent entre eux. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d'étudier une version modifiée d'une protéine d'intérêt.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant la piqûre permettant de prélever une goutte de sang. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

Gavées de prednisone tous les jours pendant un mois ou injectées à la dexaméthasone trois jours de suite, sans anesthésie ni analgésique, 960 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses moléculaires et histologiques. Trois semaines de nourriture médicamenteuse puis cinq jours d'injections intrapéritonéales servent d'abord à désactiver dans leur muscle deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes. Un test d'agrippement, réalisé une seule fois en trois essais, mesure ce qu'il reste de force musculaire. Le porteur écrit qu'aucun effet secondaire majeur n'avait été observé lors d'études comparables, tout en prévoyant d'exclure les souris ayant perdu plus de 20 % de leur poids en une semaine et en signalant que le gavage répété peut causer des fausses routes et une irritation de la gorge.

Objectifs

Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont relayés par le récepteur des glucocorticoïdes appelé GR. Il est communément admis que GR une fois lié à son hormone est convoyé dans le noyau de la cellule, où il se lie à l’ADN pour activer ses gènes cibles. Il effectue cette tache en coopération avec d’autres protéines qui sont appelées des « corégulateurs ». L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de deux de ces corégulateurs dans l'atrophie musculaire dépendante des glucocorticoïdes en utilisant des souris dans lesquelles ils sont sélectivement supprimés (mutés) dans le muscle squelettique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs (ci-après EU1 et 2 par souci de simplicité). Les animaux seront produits et élevés dans l'EU1. La mutation sera induite dans l'EU1 ou dans l'EU2 s'il s'avère que le personnel de l'EU1 n'est pas disponible. Les autres traitements seront réalisés dans l'EU2 afin que nous puissions suivre l’évolution des animaux. En effet, notre équipe travaille sur ces modèles depuis de nombreuses années et peut ainsi anticiper les dommages occasionnés. Par ailleurs, les animaux seront déjà présents dans l'EU2, à laquelle les membres de l'équipe ont accès, afin d’effectuer des tests d'agrippement, évitant ainsi un nouveau stress généré par le transfert. S’il s’avère que les membres de l’équipe ne sont pas disponibles, les traitements pourront être réalisés dans l'EU1 afin de ne pas gâcher de groupe.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle de deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes dans le muscle au cours de l'atrophie musculaire provoquée par les glucocorticoïdes. Contrôler l'activité du récepteur des glucocorticoïdes en modulant celle des co-régulateurs ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques pour réduire les effets indésirables causés par les traitements prolongés avec ces hormones.

Procédures

Les animaux pour lesquels la mutation doit être induite (groupe 1 et 2) seront traités par le biais d’une nourriture spécifique pendant 3 semaines, puis par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 3 sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 4 sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Un test d'agrippement sera réalisé une seule fois en triplicat sur l'ensemble des cohortes à la fin des traitements (30 sec/ souris) .

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues de traitement ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant lors d’études comparables. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Les traitements aux glucocorticoïdes durant de longue période peuvent entrainer une fonte musculaire, c’est pourquoi nous prendrons soin d’exclure les animaux ayant perdu plus de 20% de leur poids corporel en une semaine. De plus, le gavage répété peut conduire à des fausses routes et une irritation de la gorge pouvant impacter la prise alimentaire que nos pesées régulières nous permettrons d’observer rapidement. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.

Choix des espèces

Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et deux de ses co-régulateur dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux inductibles seront donc traités au tamoxifène entre 5 et 7 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection.