Biologie du développement
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Impact du neurodéveloppement dans la maladie de Huntington chez un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
6 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 4 080 nées sur cinq ans pour entretenir deux lignées liées à la maladie de Huntington, et 1 920 embryons qui reçoivent chacun une injection dans le cerveau, dans l'utérus de leur mère opérée sous anesthésie. Les souris nées subissent un prélèvement de moins d'un millimètre au bout de la queue pour le génotypage, et celles retenues pour le comportement passent deux séries de cinq tests, à trois et six mois, dont un seul est décrit, un test de motivation précédé de 24 heures sans nourriture. La mutation peut provoquer dès 12 mois des difficultés à se déplacer, une prostration et une perte de poids, et toutes sont tuées, celles de la lignée entre six et huit mois, avant ces signes, et les reproductrices après six portées. Le porteur renvoie au "long terme" la découverte de biomarqueurs, les pistes de traitement ne venant qu'après.
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie génétique incurable causée par une mutation dominante, si un parent porte une version de la mutation il sera atteint et la transmission à sa descendance sera de 50 pour cent. Cette mutation entraîne le dysfonctionnement et la dégénérescence de sous-populations neuronales. Plus spécifiquement, plusieurs étapes du développement cortical sont modifiées. Cependant, les mécanismes physiopathologiques développementaux observés dans la maladie de Huntington, restent méconnus. En particulier, comment des modifications précoces auront des conséquences sur la dégénérescence du cerveau. Dans ce projet, nous évaluerons les conséquences de cette maladie sur la génération des différents types cellulaires du cortex en développement et du cortex adulte, ainsi que les stratégies de compensations qui pourraient se mettre en place pour pallier aux effets délétères de la mutation. Cette étude permettra la découverte de marqueurs permettant de suivre l’évolution de la maladie à des stades très précoces et d’identifier des cibles thérapeutiques pour retarder ou atténuer cette maladie neurodégénérative.
Bénéfices attendus
L’étude des mécanismes sous tendant le développement de la maladie de Huntington permettront à long terme de mettre en évidence des biomarqueurs qui représentent les différents stades d’évolution de la maladie. Après identification de ces différents stades, l’objectif sera de développer des cibles thérapeutiques adaptées afin de retarder ou limiter les symptômes associés à cette pathologie.
Procédures
La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 12 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids. Pour déterminer la présence de la mutation (génotypage), un prélèvement de l’extrémité terminale de la queue de moins de 1 mm sera effectué. Cet acte sera réalisé rapidement et une seule fois sur chaque animal. Nous réaliserons des injections de produits pharmacologiques ou de vecteurs viraux, dans les cortex des embryons en intra utérin. Ces injections nécessitent une chirurgie sous anesthésie générale des femelles gestantes (30-45 minutes). Chaque embryon reçoit une injection intracérébrale. Les animaux impliqués dans les analyses comportementales réaliseront 2 séries (l’une à 3 mois, la deuxième à 6 mois) de 5 tests comportementaux vigiles sur une période d’un mois. Lors du test de privation de nourriture les animaux seront mis à jeun sur une période de 24 heures. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire appropriée, efficace et reproductible.
Impact sur les animaux
Le prélèvement pour génotypage peut générer une légère douleur chez l’animal. Cet acte sera réalisé rapidement et une seule fois sur chaque animal. L’acte d’injection pratiqué sous anesthésie peut générer de la douleur lors de la chirurgie et en post opératoire pendant quelques jours. Il y a un risque lors de l’anesthésie (dépression cardiorespiratoire, hypothermie), ainsi qu’un risque infectieux et hémorragique. Les tests comportementaux peuvent générer du stress chez les animaux liés à leur manipulation et aux changements de pièces. La privation de nourriture de 24h nécessaire à la mise en place lors du test comportemental explorant la motivation peut également induire un état de stress et de fatigue chez les animaux. La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 12 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids.
Devenir
Les couples ayant permis les générations des animaux seront euthanasiés après 6 portées pour les femelles et 6 mois pour les mâles, lorsqu'une diminution significative de la reproduction est observée. A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de récupérer les tissus post-mortem ou prélever des embryons.
Remplacement
L’étude du cerveau en développement nécessite le recours à un modèle animal car il permet de préserver l’environnement du développement utérin (impliquant différents types cellulaires qui interagissent entre eux, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire). L’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec un modèle de mammifère qui permet de suivre l’évolution du cerveau tout au long du développement et de la vie de l’animal. Le développement cérébral et la génétique de la souris présentent des similarités avec ceux de l’Homme. Ces éléments font de la souris un modèle indispensable pour notre étude. Nous utiliserons des cultures cellulaires afin de valider les outils moléculaires qui seront ensuite injectés chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Il a été déterminé en réduisant au plus petit nombre le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables. Pour cela nous utiliserons des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisées. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés. Pour entretenir les lignées on estime qu’il nous faut 2 trios reproducteurs qui produiront 816 souris/ans (408 par lignée) et 4080 souris au cours des 5 années du projet. Dans ces 4080 souris nous utiliserons des femelles gestantes pour réaliser nos procédures : 40 souris gestantes par génotype (2 génotypes) et par lignée (2 lignées) donc 160 souris au total qui produiront 960 embryons. Nous avons 2 interventions différentes de chirurgie il faut donc multiplier ce chiffre par deux (soit 1920 embryons). Au total nous aurons donc 6000 animaux.
Raffinement
Les cages sont maintenues en portoirs ventilés un accès illimité à la nourriture et à l’eau. La température et l’hydrométrie sont contrôlées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (8h-20h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Chaque cage est enrichie d’un nid et de stick en bois. Les cages d’accouplements bénéficient d’une maison et de papier kraft. Lors du maintien courant de la lignée les souris seront examinées chaque jour par le personnel des animaleries. Les animaux seront euthanasiés à 6-8 mois, avant apparition du phénotype dommageable. Les animaux seront particulièrement surveillés à l’approche des 6 mois. Seront particulièrement surveillé : des difficultés locomotrices et une prostration qui sont 2 signes caractéristiques de souffrance liés à la mutation. Concernant les animaux utilisés lors de la procédure 2 : Les procédures chirurgicales seront raffinées grâce à un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié (risques pris en charge par de bonnes pratiques et la surveillance des animaux). Les cages post chirurgie seront enrichies d’une maison et d’un nid en coton afin d’améliorer le bien-être de la mère. De l’eau et de la nourriture facile d’accès seront fournis à l’animal. Les chirurgies seront réalisées le matin afin de pouvoir venir observer les animaux le soir et administrer les médicaments nécessaires. Une checklist d’observation post opératoire sera remplie. Après les chirurgies les animaux seront observés 2 fois par jour jusqu’à la mise à bas par l’équipe, et chaque jour par l’animalerie. Surveillance particulière d’éventuelles infections ou une mauvaise cicatrisation de la chirurgie. Les signes cliniques généraux et points limites définit avant la chirurgie seront surveillés avec un score de la douleur. Seront également surveillés des signes de prostration ou d’agitation anormaux ainsi qu’une perte de poids anormale. Les animaux seront habitués aux tests pour limiter le stress. Après les tests comportementaux, les animaux seront observés chaque jour par l’animalerie et l’équipe pour évaluer les modifications comportementales (locomotion, prise de nourriture...) des animaux. La privation de nourriture peut induire un état de stress et de fatigue chez les animaux. Cet élément sera particulièrement suivi pour exclure du test les animaux en souffrance. Concernant l’euthanasie, un protocole d’analgésie sera utilisé afin qu’elle se fasse sans douleur.
Choix des espèces
Le but de ce projet étant de suivre l’impact des modifications ayant lieu au stade embryonnaire sur les stades tardifs, nous allons nous focaliser sur les âges suivants : chez l’embryon (jour de gestation 14 et 16) pour observer l’effet direct de la modification pendant l’établissement des couches du cortex cérébral, et à 3 et 6 mois pour évaluer les conséquences au stades adultes en utilisant des tests comportementaux qui permettrons de comparer le phénotype des souris traitées à celui des souris modèles de la maladie de Huntington. Enfin, nous utiliserons des souris adultes à 8 mois pour considérer les effets tardifs de la modification embryonnaire. Nous utiliserons des animaux reproducteurs adultes afin de générer les animaux nécessaires pour nos procédures.
Modèle murin de maltraitance physique infantile : syndrome du bébé secoué
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Secoués sous anesthésie générale à l'âge de sept jours pour reproduire le syndrome du bébé secoué, 909 souriceaux sont tous tués aux stades étudiés pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur liste les atteintes attendues : douleurs cérébrales liées aux lésions, difficulté à s'alimenter, retard du développement psychomoteur, rigidité corporelle, mouvements de convulsion, respiration anormale et anomalies du comportement. Une partie des souriceaux subit en plus une craniotomie d'une heure sous anesthésie, sans réveil. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative parfaite" à un organisme vivant pour étudier les conséquences du secouement, et présente ce modèle comme une préparation d'interventions de prévention chez les enfants.
Objectifs
Les violences faites aux enfants et adolescents sont un fléau sanitaire et sociétal mondial. Un quart des adultes déclarent en avoir été victime mais une minorité d’entre eux est repérée suffisamment précocement pour éviter les conséquences « vie entière » somatiques et neuropsychiatrique de ces violences et leur impact socio-économique majeur. Les violences faites aux enfants et adolescents sont définies par l’OMS comme toutes les formes de mauvais traitements physique et/ou affectifs, de sévices sexuels, de négligences ou d’exploitation, entraînant un préjudice réel ou potentiel pour la santé de l’enfant, sa survie, son développement ou sa dignité, dans le contexte d’une relation de responsabilité, de confiance ou de pouvoir. Dans les pays à économie développée, les estimations de fréquence usuellement acceptées indiquent que 4 à 16% des mineurs seraient victimes de maltraitance physique. Pour les enfants survivants aux violences physiques du syndrome du bébé secoué, les conséquences à long terme sont majeurs sur le plan neurologique et développemental (périmètre crânien diminué, épilepsie, déficiences motrices visuelles intellectuelles, trouble du langages, et anomalies comportementales). Enfin, la pandémie de COVID-19 a augmenté la fréquence et la gravité des violences. Le syndrome du bébé secoué a vu son incidence doubler en 2021 et la mortalité décupler par rapport à la période de prépandémie. Dans ce projet, nous modéliserons chez le souriceau le syndrome du bébé secoué (traumatisme crânien). Plusieurs analyses seront réalisées à des temps spécifiques de la maturation du cerveau : enfance, adolescence et adultes. Nous établirons un profil comportemental individuel sur plusieurs composantes (motrice, sociale, cognitive). Les effets au niveau moléculaires de ces maltraitances seront également étudiés afin de permettre un futur transfert vers la clinique chez l’humain. Les analyses seront ciblées sur les marqueurs moléculaires de deux axes identifiés chez l’humain comme étant tout particulièrement perturbés après exposition à des maltraitance dans l’enfance : la neuroinflammation et la production d’hormones. Les études de la génétique et des protéines sont réalisés sur le sang et le cerveau des animaux juvéniles, adolescents et adultes. Enfin des approches thérapeutiques telles que la thérapie comportementale et des tests de médicaments ciblant les régulateurs clés seront entreprises.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier les mécanismes et l'évolution du traumatisme crânien du syndrome du bébé secoué à l’échelle cellulaire comme comportementale pour mieux définir la période la plus propice pour les futures études thérapeutiques chez les enfants et adolescents. Il permettra de préparer des interventions de prévention secondaires adaptées et correctrices.
Procédures
Les souriceaux subiront un traumatisme crânien par secouement sous anesthésie générale. Après le traumatisme, des groupes d’animaux de différents âges seront anesthésiés, et une perfusion intra-cardiaque sera réalisée post- mortem pour éliminer le sang des vaisseaux du cerveau qui sera étudié. La perfusion est réalisée sous anesthésie générale et avec analgésie. Certains animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale pour réaliser des mesures d’imagerie du cerveau (durée 1 heure). Cette chirurgie consiste en une craniotomie afin de permettre le passage du signal. Cette procédure est sans réveil, les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation. Cette procédure sera réalisée exclusivement par des expérimentateurs aguerris, maîtrisant parfaitement toutes les techniques requises.
Impact sur les animaux
Tout d'abord le jour du traumatisme crânien par secouement : - Séparation d’avec la mère lors de l’anesthésie par inhalation - Une hypothermie causée par l’isolement d’avec la mère - Le secouement horizontale. Ensuite, suite au traumatisme du secouement : - Douleurs cérébrales suite aux lésions occasionnées par le secouement - Difficulté à s’alimenter engendrant un petit poids - Retard dans le développement psychomoteur - Hypertonique, ou rigidité corporel, mouvements anormaux de convulsions, - Respiration anormale - Anomalie du comportement
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt. Les cerveaux seront prélevés post-mortem pour les différentes analyses qui permettront d’étudier de manière approfondie le tissus cérébral après le traumatisme, ainsi que l’inflammation cérébrale.
Remplacement
Il n’y a pas d’alternative parfaite à un modèle sur un organisme vivant pour étudier les conséquences du secouement sur le cerveau et les anomalies du développement qui en découle. Plusieurs analyses de notre projet ne peuvent être modélisée hors de l’organisme vivant, ni par des méthodes utilisant des modèles informatiques de théories de toxicité. Ce modèle, de bébé secoué, réalisé sur organisme vivant nous permet de s’intéresser à des caractéristiques du cerveau en activité, entier et fonctionnel.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés. Nos analyses sont réalisées régulièrement dans notre laboratoire, ainsi nous savons combien d’animaux sont nécessaires afin d’obtenir un résultat. En conséquence, le nombre d’animaux pour ce projet sera au maximum de 909 animaux afin d’obtenir des résultats analysables par les tests statistiques. Le cerveau des animaux issus de l’analyse de la connectivité neuronale et ceux issus des analyses du comportement seront prélevés pour les analyses du tissus cérébral ce qui a réduit le nombre d’animaux dans notre projet. Il est prévu de mettre en place le modèle avec 48 animaux, mais si la fréquence d’agitation est déterminée sur moins d’animaux nous en utiliserons moins ce qui réduira le nombre total d’animaux.
Raffinement
Nous procéderons à l’enrichissement de l’hébergement avec du papier doux absorbant pour la fabrication du nid comme cela est fait dans leur milieu naturel. Les animaux seront réchauffés à l’aide d’une lampe au moment de la procédure du secouement. On surveillera l’état général des animaux dans le nid à l’aide d’un document appelé « arbre décisionnel ». Il permet d’observer les souriceaux dans la portée sans les déranger à nouveau car les soins apportés par la mère sont importants. Dès qu’un animal ne va pas bien il est vite repéré car il est blanchâtre et/ou immobile, donc il attire l’œil. Pendant les protocoles nécessaires pour la mise en place des appareils d'imagerie, les animaux seront anesthésiés et surveillés : si l'animal présente une difficulté respiratoire, une variation importante de sa fréquence cardiaque ou une hypothermie importante, la procédure sera interrompue et l'animal euthanasié. Les animaux seront euthanasiés après administration d’un analgésique et d’un anesthésique. C’est quand la mort sera vérifiée (plus de réflexes) que nous procéderons alors aux prélèvements post-mortem.
Choix des espèces
Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. Le modèle de secouement sera fait à 7 jours de vie, ceci correspond à la petite enfance chez l’humain. Nous étudierons les interactions entre les cellules du cerveau en développement sur un modèle de bébé secoué, pour cela il est nécessaire d’utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l’homme. La souris remplit très bien cette condition. Notre objectif étant d’étudier l’effet du secouement sur le cerveau en développement, nous nous intéresserons à 3 temps de vie : 8 à 21 jours (petite et moyenne enfance), 45 jours (adolescence), et 6 mois de vie (adulte), afin d’étudier l‘évolution du traumatisme cérébrale et les effets à long terme.
Maintien de lignées de Xenopus laevis et production de têtards pour étude de la myélinisation et de la remyélinisation
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Une cinquantaine de xénopes seront tués parce qu'ils ne pondent plus, et 75 juvéniles seront élevés pour les remplacer. Au total 155 xénopes sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, dans un élevage qui fait naître des têtards pour des études pharmacologiques. Les reproducteurs reçoivent des injections hormonales à chaque accouplement, jusqu'à 120 injections pour un mâle sur la durée du projet, ainsi qu'un prélèvement de peau sur une nageoire arrière pour le génotypage. Le porteur justifie la mise à mort des animaux devenus peu fertiles par l'impossibilité de les replacer, "cette espèce étant considérée comme nuisible". Il indique que le choix du xénope tient à la transparence des têtards et au grand nombre d'individus qu'une femelle produit, ce qui facilite les études réclamant beaucoup d'animaux non-humains.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de produire des têtards pour les études pharmacologiques réalisées au laboratoire, nécessitant un nombre élevé de têtards, ainsi que pour des études sur certains mécanismes présents dans des maladies neurodégénératives telle que la sclérose en plaques. Les têtards générés pour chacune des pontes sont utilisés en continu pour les différents projets qui ont lieu en parallèle. Les têtards non utilisés dans les projets sont utilisés pour renouveler les reproducteurs, c’est pour cela qu’ils doivent être génotypés et identifiés lorsque leur taille le permettra.
Bénéfices attendus
Les têtards générés par les adultes Xénopes reproducteurs permettront de produire les lots expérimentaux nécessaires à nos différents projets de recherche. Ils nous permettent notamment d’effectuer des tests pharmacologiques pour étudier l’effet de molécules dans des mécanismes présents dans certaines maladies neurodégénératives, telle que la sclérose en plaques , afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. Ces études pharmacologiques nécessitent un grand nombre de têtards, ce qui explique le nombre de reproducteurs pour ce projet. D’autre part, concernant l’étude de l’effet des perturbateurs endocriniens, avec des effets plutôt délétères sur certains mécanismes dans le cerveau, les têtards utilisés permettraient de mieux comprendre l’augmentation de l’incidence de maladies neurodégénératives dans le monde. Enfin, nous utiliserons des têtards pour identifier de nouvelles voies de signalisation à l’origine de la mise en place de la myéline (enroulement de certaines cellules autour des neurones dans le cerveau), ce qui pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour des maladies neurodégénératives.
Procédures
A l’âge d’environ un an les Xénopes auront un prélèvement de peau au niveau d’une nageoire de la patte arrière, dans une zone peu vascularisée, sur animal vigile. L’acte de la contention jusqu’au prélèvement dure moins d’une minute par animal et est réalisé une seule fois. Enfin, les adultes reproducteurs ont des injections d’hormones pour chaque reproduction (2 injections par accouplement pour les mâles, 1 pour les femelles), qui sont réalisées dans le bas du dos. Les injections sont réalisées sur animaux vigiles pris en contention, à l’aide de seringues fines et stériles, rapidement (moins de 10 secondes) et peu douloureuses (peu de volume injecté et aiguilles de petit diamètre, avec un geste maitrisé). Au maximum les mâles feront 60 accouplements sur la durée du projet et les femelles 15 accouplements, soit 120 et 15 injections maximum respectivement. Pour chaque accouplement, les reproducteurs sont isolés pendant 60 heures maximum (en général du vendredi soir au dimanche soir).
Impact sur les animaux
Pour les adultes utilisés pour les accouplements, un léger stress serait attendu durant la phase de capture, où les animaux sont attrapés grâce à une épuisette et scannés pour identification grâce à une puce sous cutanée. De plus, les animaux sont isolés 60h maximum avant la mise en contact entre les mâles et les femelles, ce qui peut aussi engendrer un léger stress. Lors des injections d’hormones, une contention des animaux est nécessaire, ce qui peut engendrer un stress. Une légère et brève douleur pourra être ressentie par l’animal lors de l’injection en sous cutanée. Un prélèvement de moins de 2mm2 est réalisé au niveau palmaire pour le génotypage, ce qui peut entraîner une légère et brève douleur, à laquelle s’ajoute le stress de la préhension et de la contention.
Devenir
Dans les 80 animaux reproducteurs actuels, on estime au cours du projet que 50 d’entre eux vont présenter une absence répétée de fertilisation ou une diminution de la ponte, qui nécessitera leur euthanasie, puisqu’ils ne peuvent pas être réutilisés ni replacés, cette espèce étant considérée comme nuisible. Nous produirons donc 75 juvéniles qui permettront de remplacer et compléter l’effectif des animaux au fur et à mesure, et qui seront en utilisation continue, ainsi que les 30 animaux reproducteurs qui n’auront pas présenté de baisse de la fertilité. Il devrait donc y avoir au final dans l’animalerie environ 105 animaux, qui seront en utilisation continue pour notre élevage.
Remplacement
Des études in vitro seront réalisées en amont de nos projets, cependant elles ne permettent pas de suivre les mécanismes pathologiques au sein de la complexité du système nerveux. Notre projet prévoit de générer des têtards de Xénope pour trois projets de recherches, ces trois projets nécessitant l’utilisation de Xénope car : - Il s’agit d’un modèle animal, donc un modèle intégré contrairement à des modèles ex vivo et in vitro - La transparence du têtard permet de visualiser tout le système nerveux central sans euthanasie, ce qui permet un suivi in vivo et longitudinal - Le Xénope est une espèce qui génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d’animaux
Réduction
Dans ce projet, afin de respecter la règle des 3R nous favorisons les accouplements naturels plutôt que les fécondations in vitro ce qui évite d’avoir à prélever les testicules et donc d’euthanasier les Xénopes mâles pour la réalisation de fécondation in vitro (FIV). De plus, la pré-stimulation augmente le rendement d’œufs fertilisés, donc plus de têtards générés, pour un nombre de couples limité. Cela évite de manipuler et d’isoler plus d’animaux adultes. Compte tenu de la nature du projet, les tests statistiques ne peuvent pas être appliqués, car il s’agit d’un projet élevage. Cependant, le nombre de têtard à générer pour nos projets de recherche a été déterminé par des tests de puissance statistique pour n’utiliser que le nombre de têtards nécessaires, ce qui permet de réduire au strict minimum le nombre d’accouplements à réaliser, et donc le nombre d’animaux reproducteurs utilisés. Nous mettons en moyenne 65 couples d’adultes en croisement par an pour assurer la production d’œufs et de têtards. Cette espèce accuse une perte importante au cours du développement ce qui explique la fréquence des pontes, pour obtenir les têtards nécessaires à nos études. Nous utilisons à ce jour 48 femelles et 32 mâles, soit 80 animaux qui recevront des injections et pourront être isolés. Les femelles ne peuvent être stimulées que tous les 4 mois, ce qui explique que leur nombre soit plus important que les mâles, qui eux peuvent être réutilisés tous les mois. De plus, nous travaillons avec des animaux génétiquement modifiés, il est donc nécessaire de maintenir les différents génotypes présents à l’animalerie. Nous prévoyons de conserver 75 têtards pour renouveler et compléter l’effectif des adultes reproducteurs. Sur la durée du projet, ces animaux seront identifiés, prélevés pour génotypage et potentiellement injectés et isolés au cours du projet. Ces 75 animaux permettront de remplacer 50 Xénopes, qui arrivent bientôt à l’âge de 8 ans, et qui ne pourront plus être utilisés pour la reproduction. Au total le projet impliquera donc 155 animaux.
Raffinement
Les Xénopes adultes sont hébergés dans des bacs adaptés au nombre d’individu et à la taille, maximum 10 individus par bac. Des enrichissements sont disposés pour permettre aux animaux de se cacher (tuyaux, similis rochers, plantes artificielles), et des enrichissements alimentaires sont proposés une fois par semaine aux animaux (vers de vase rouges congelés). Les paramètres physico-chimiques de l’eau des adultes sont maintenus grâce à un système d’eau circulante automatisé (maintenue à 18 degrés Celsius). Les animaux sont observés quotidiennement si l’un d’entre eux parait amaigri, gonflé, rougeurs…, il est isolé et un avis vétérinaire est demandé. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Un contrôle sanitaire de la zone est effectué de manière annuelle. Les bacs utilisés pour l’isolement et la reproduction sont opacifiés pour que les Xénopes ne soient pas perturbés par l’environnement extérieur. Ces bacs sont remplis avec de l’eau provenant de leur aquarium d’origine, changée tous les deux jours. Un temps de repos de minimum 4 mois sera respecté pour les femelles avant de les remettre en accouplement, et minimum 1 mois pour les mâles. Le génotypage est réalisé sur des juvéniles à partir d’un an, l’animal est attrapé délicatement avec une épuisette et est immobilisé pour avoir accès à une patte arrière. La zone choisie pour le prélèvement nécessaire pour connaitre le patrimoine génétique de l’animal est peu ou pas innervée, et se régénère de façon spontanée au bout d’une semaine. Après le prélèvement, un antiseptique est appliqué afin de prévenir tout saignement ou infection avant remise en bac avec les congénères, et une surveillance accrue est mise en place pendant une semaine, pour repérer tout signe anormal chez l’individu (rougeurs, apathie, gonflements… ).
Choix des espèces
Le choix du Xénope se justifie par plusieurs raisons : 1) les têtards de Xénope sont transparents, ce qui facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction en cas d’étude longitudinale), 2) les amphibiens (Xénope) sont les premiers vertébrés sur l’arbre évolutif à utiliser un profil de protéines des cellules cérébrales différent dans le système nerveux central et périphérique, ce qui est un avantage pour les projets scientifiques que nous menons. Les animaux utilisés à la reproduction sont des adultes, en capacité de se reproduire, donc de plus de 3 ans. Le génotypage est réalisé sur des animaux à la limite du stade juvénile et adulte, soit à partir d’un an, quand ils ont atteint une taille suffisante pour faciliter la manipulation.
Morphogenèse et propriétés mécaniques de l’ovocyte et de l’embryon précoce de souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections hormonales pour induire une superovulation, puis sont mises à mort pour prélever ovocytes et embryons précoces, afin d'étudier les propriétés mécaniques de l'ovule au cours de ses divisions. Le porteur n'attend qu'un stress modéré à la contention et une douleur légère à l'injection. Il affirme que la méiose femelle ne s'observe que dans l'ovocyte et qu'aucune culture cellulaire ni étude in silico ne peut la reproduire.
Objectifs
La formation des ovules s’achève par deux divisions successives. Ces deux divisions doivent être finement régulées pour empêcher les erreurs de ségrégation des chromosomes. Car ces erreurs peuvent avoir des conséquences dramatiques comme des fausses couches ou des trisomies. L’objectif de ce projet est donc de comprendre comment est régulé la formation des ovules avec un nombre correct de chromosomes, pour former un embryon après fécondation. Pour cela nous étudions les propriétés mécaniques des ovules et embryons en analysant les défauts qui sont induits par leur dérégulation.
Bénéfices attendus
Le bénéfice est une meilleure compréhension des régulateurs de la mécanique cellulaire dans les ovocytes et embryons précoces. Ils pourraient constituer des biomarqueurs de qualité ovocytaire qui pourront être potentiellement utilisé pour améliorer la réussite des techniques de procréation médicalement assistée.
Procédures
Les souris seront stimulées pars des hormones afin d’induire l’ovulation. Elles subiront deux traitements successifs. Les aiguilles utilisées pour les injections sont les plus fines possibles et les solutions seront à température ambiante afin de limiter la douleur lors de l’injection. Les injections dureront quelques secondes. Les souris resteront vigiles pendant les traitements et resteront en animalerie dans leur cage pendant cette période.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont un possible stress modéré lors de la contention puis une possible douleur légère à l'injection.
Devenir
Toutes les souris injectées sont euthanasiées afin de disséquer les oviductes et les ovaire et récupérer les ovocytes matures et embryons précoces si accouplement consécutif à l’injection.
Remplacement
La méiose est spécifique des cellules germinales et il n’existe pas de culture de cellule efficace de ce type. La méiose femelle peut être observée uniquement dans les ovocytes. Pour étudier ce processus, nous sommes donc obligés d’utiliser des ovocytes et embryons précoces issus d’animaux. Aucune étude in silico n’a jusqu’à ce jour était capable de récapituler la complexité de la formation d’un ovocyte.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans notre projet est réduit à son minimum dans la limite de ce qui est permis pour obtenir des résultats scientifiquement valides. Ainsi il est nécessaire de reproduire les résultats de manière indépendante et d'avoir plusieurs échantillons pour éviter les différences dues à la variabilité biologique. La superovulation permettra d'augmenter le nombre d'ovocyte par animal et de diminuer le nombre d'animaux utilisé. Nous estimons avoir besoin de 8 souris pour obtenir un nombre d'ovocytes et d'embryons précoces suffisants pour les deux conditions contrôles et traités pour une expérience et un projet. Les tests statistiques utilisés sont l'analyse de variance suivie de tests post-hoc.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont adaptées afin de réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse que pourraient ressentir les animaux. Les injections sont faites avec des solutions à température ambiante et un matériel permettant de réduire la douleur. Les souris seront massées au site d'injection et observées pendant l'heure qui suit et quotidiennement jusqu'à la fin de leur traitement.
Choix des espèces
Il est très difficile d’obtenir des ovocytes humains provenant des centres de Procréation Médicalement Assistée (PMA). La souris est un mammifère très proche de l’Homme dont la méiose dans l’ovocyte est très similaire à celle de l’ovocyte humain. La souris est à la fois le modèle le plus proche de l’homme et le plus accessible pour étudier la méiose et le développement embryonnaire précoce. C'est aussi le seul modèle où les invalidations conditionnelles de gènes sont possibles. Les souris sont utilisées à l’âge adulte à partir de 9 semaines. C’est à cet âge qu’elles produisent la plus grande quantité d’ovocytes.
Impact des dérivés indoliques produits par le microbiote intestinal sur le développement cérébral en période néonatale
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux dépourvus de microbiote sont colonisés par des bactéries, séparés de leur mère à répétition et soumis à 28 tests neurologiques et 8 tests comportementaux entre 6 et 45 jours de vie, les mères étant gavées une fois. Le projet étudie l'effet de dérivés du tryptophane produits par le microbiote sur le développement du cerveau. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro assez complexe n'existe pour cet objectif.
Objectifs
La période néonatale est critique pour le développement du cerveau. Or les facteurs qui influencent ce développement sont encore mal connus. Parmi les facteurs candidats figurent les molécules produites par le microbiote intestinal. En effet, la période néonatale est aussi celle de la colonisation microbienne intestinale, caractérisée par une évolution progressive des populations bactériennes résidentes et de leurs capacités métaboliques. A cet égard, le profil des molécules produites par le microbiote intestinal et présentes dans le cerveau de jeunes souris évolue entre la naissance et le sevrage. Cette évolution concerne notamment le profil des métabolites microbiens du tryptophane, un acide aminé essentiel, à structure indolique, . Ces données rejoignent des observations chez l’être humain montrant que, chez des nouveau-nés à terme, le microbiote de ceux nés par césarienne a un potentiel métabolique altéré. En effet, chez les nouveau-nés par césarienne, il n'y a pas de transmission du microbiote vaginal et fécal de la mère, comme c'est le cas lors d'un accouchement par voie basse. En raison de la fréquence accrue de troubles cognitifs chez les personnes nées par césarienne et des effets neuronaux des substances dérivées du tryptophane produites par le microbiote chez les rongeurs, nous supposons qu'une perturbation de la colonisation microbienne intestinale pourrait influencer le développement cérébral. Pour tester cette hypothèse, nous allons simuler, chez des souris initialement dépourvues de microbiote intestinal, une altération de la production de ces substances en les colonisant avec des bactéries produisant ou non les dérivés en question. Ces souris seront soumises de l’âge de 6 jours à l’âge de 45 jours (jeunes adultes) à des tests comportementaux. Leur cerveau sera analysé pour différents paramètres caractérisant l’état du neurodéveloppement.
Bénéfices attendus
En examinant comment les substances issues du tryptophane produit par les microbes intestinaux peuvent agir comme messagers entre le microbiote intestinal et le système nerveux central pendant la période néonatale, nous aiderons à comprendre comment ces mécanismes et ces voies de communication fonctionnent à un moment crucial qui influence la vie d'un individu.
Procédures
Les femelles reproductrices (animaux vigiles, n=96) seront gavées 1 fois à l’aide d’une sonde de gavage souple (durée 1 à 2 minutes). Elles subiront 1 prélèvement de fèces émis spontanément, d’une durée de quelques minutes. Les souriceaux (animaux vigiles, n=128) subiront à J42 1 prélèvement de fèces émis spontanément, d’une durée de quelques minutes. Les souriceaux (animaux vigiles, n=128) dans la périodes entre J6 et J44 subiront en tout 28 tests neurologiques de développement en 4 sessions de 5 à 15 mn, et 8 tests comportementaux en 8 sessions de 6 à 15 mn.
Impact sur les animaux
Pour effectuer les évaluations neurologiques, les portées seront séparées temporairement de leur mère ce qui va générer du stress. Lors des prélèvements fécaux les souris seront isolées quelques minutes dans des pots individuels. Le gavage des mères sera effectué par des personnes entraînées, qui les pratiquent en routine, mais un accident pourrait se produire pouvant entrainer une douleur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d'échantillons biologiques.
Remplacement
Ce projet vise à déterminer l’effet de l’inoculation de 2 souches bactériennes produisant ou non les dérivés métaboliques d’intérêts sur le développement du cerveau de jeunes souris. Ces bactéries sont capables de générer des métabolites pouvant agir sur les structures cérébrales par voie nerveuse ou circulatoire. L’utilisation d’animaux est donc obligatoire, car il n’y a aucun modèle in vitro ou in silico suffisamment complexe qui existe et puisse être utilisé dans cet objectif.
Réduction
Le nombre d’animaux a été fixé au strict nécessaire. Le facteur limitant est l’étude biochimique des cerveaux. En effet, l’étude comporte la détermination de plusieurs marqueurs cérébraux qui ne peuvent pas être mesurés simultanément sur les mêmes cerveaux. Nous avons évalué à 8 souris femelles et 8 souris mâles par type de marqueurs. Pour les tests neurologiques et comportementaux, et les analyses dans les autres échantillons biologiques, le nombre sera de 16 souris femelles et 16 souris mâles.
Raffinement
Chaque cage comporte un tunnel en plastique transparent, des bâtons à ronger et du matériel de nidification en guise d'enrichissement. Les souriceaux seront conservés avec leur mère pendant la durée de la lactation. Lors des évaluations neurologiques et comportementales avant le sevrage, les souriceaux seront isolés par portée entière dans une cage contenant de la litière de la cage d’origine, et du papier absorbant déchiqueté par la mère. La durée de chaque évaluation sera courte et les souriceaux seront immédiatement replacés dans la portée. Pour éviter le rejet de la portée, le nid n'est pas déplacé pendant le change, la litière est enlevée et replacée autour du nid sans le déranger. Les animaux sont surveillés quotidiennement et pesés une fois par semaine et les points limites préalablement définis sont contrôlés.
Choix des espèces
Seuls les rongeurs permettent la mise au point de modèles d’animaux à microbiote intestinal particulier en isolateur adaptés à notre étude. La souris a été préférée au rat car, en isolateur, où l'espace est restreint, cette espèce permet de tester simultanément un nombre d’animaux plus important, et d’utiliser des dispositifs expérimentaux de plus petite taille, donc plus nombreux et plus variés. Par ailleurs, puisque la majorité des études publiées au cours des dernières années sur les relations entre le microbiote intestinal et le système nerveux central de l’hôte ont été réalisées chez la souris, les études menées avec cette espèce permettent une meilleure comparaison des résultats avec ceux de la littérature. Les souris sont utilisées de la naissance à la fin de l’adolescence, car nous voulons déterminer l’impact de produits bactériens sur le développement cérébral.
Etude de l’inactivation d’un gène pour un modèle de neurocristopathie
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
896 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour un modèle génétique de malformations de la face et de l'intestin. Le porteur indique que les souriceaux les plus atteints meurent après la naissance de malformations qui les empêchent de se nourrir, et qu'une analgésie n'est pas possible pour ces animaux trop fragiles pour survivre au sevrage. La survie d'une partie est suivie pendant trois semaines au maximum avant mise à mort, tandis que des femelles et des mâles reproducteurs sont gardés et réutilisés pour d'autres portées. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro pour ces maladies rares et qu'il est "nécessaire" de faire naître des animaux.
Objectifs
Il existe dans la cellule des processus de régulation de la production d'energie. Nous avons montré que l'inactivation de l'une de ces voies dans les cellules à l'origine de la formation des os de la face et du système nerveux de l'intestin aboutissait à la naissance de souriceaux présentants de graves malformations de la face et de motricité digestive. Dans notre modèle génétiquement modifié dans lequel une voie de production d'ernergie est inactivée,nous inactivons un second gène. Il est décrit dans le littérature scientifique que cela avait des effets bénéfiques dans d'autres pathologies de la même famille.
Bénéfices attendus
Les malformations associées aux defauts de développement que nous étudions sont à l'origine de maladies congénitales chez l'enfant qui se traduisent comme dans notre modèle par des malformations de la face et du système nerveux de l'intestin. Ce groupe de maladies s'appelle des neurocristopathies. Parmi les plus connues il y a le syndrome de Hirschsprung et celui de Waardenburg. D'autres malformations sont aussi concernées comme celles qui surviennent suite à la consommation d'alcool pendant la grossesse ou la prise de médicaments dit tératogènes, c'est à dire qui peuvent induire des malformations du foetus lorsqu'ils sont pris en période de grossesse. Ce sont des maladies orphelines, pour lesquelles presque aucun traitement n'est disponible à ce jour. Les bénéfices attendus sont notamment une amélioration de nos connaissances sur le rôle des processus cellulaires de production d'ernergie et du métabolisme en général dans l'apparation de ces syndromes.
Procédures
Bien que le phénotype attendu soit sévère nous utilisons 42 % des animaux produit à la naissance ou avant. Pour ces animaux il n'y aura aucune souffrance. Pour 7% nous étudierons leur survie après inactivation d'un gène, pour une période de 3 semaines maximum. Les animaux seront observés et monitorés selon les points limites décrits dans le projet. Enfin 59% sont des animaux d'élevage pour lesquel il n'y aura aucune souffrance. Pour suivre les animaux reproducteur nous effectuerons avant leur 15jours un tatouage aux phalanges en conformité avec les recommandations de la CNEEA et sous la supervision de notre SBEA. En outre pour le génotypage de nos animaux, nous effectuerons 1 biopsie de moins d'un millimètre de large à l'oreille.
Impact sur les animaux
Les animaux les plus sévèrement atteint meurent après la naissance à cause de multiples malformations qui les empêches de se nourrir et de digérer normalement. La gravité de ces malformations est variable d'un individu à l'autre et les points limites nous permettrons de minimiser la souffrance de ces animaux. Une analgésie n'est pas possible pour ces animaux fragiles qui ne survivront pas jusqu'au sevrage. La biopsie pour le génotypage des individus pourra produire douleur légère de courte durée au moment du prélèvement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure car leur maladie est sévère et incurable. L'euthanasie sera suivi de prélèvement post mortem pour des études de biologie moléculaire et d'histologie.
Remplacement
Nous travaillons sur des syndromes liés à des défauts de développement embryonnaire. Ces pathologies génétiques rares au tableau clinique complexe n'ont pas de modèle in vitro. En parallèle d'études des mécanismes moléculaires in vitro sur une lignée de cellule de crêtes neurales, il est nécessaire d'étudier le devenir de ces cellules in vivo, dans leur microenvironnement. Pour étudier l'impact réel des modifications génétiques sur l'évolution de ces pathologies, nous devons faire naitre des animaux.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux à faire naitre, nous obtimisons nos croisements pour maximiser les chances d'obtenir. Pour la réalisation d'une coube de survie, la dispersion le long de l'axe temporel nécéssite que nous utilisions 10 individus pour nos statistiques. hormis cette expérimentation, toutes nos analyses sont réalisés sur des tissus post-mortem. La pénétrance du phénotype étant variable d'un individu à l'autres 10 individus permet de nous assurer que nos conclusions sont robustes.
Raffinement
Les femelles seront regroupées et réutilisées après l'expérimentation pour générer d'autres portées. Les points limites prédictifs et précoces sont en place pour éviter toute souffrance aux animaux. (mise à mort si perte de poids, euthanasie des animaux avant l'apparition des tumeurs chez nos animaux reproducteurs. Les mâles reproducteurs devront être isolés après les accouplements car il n'est plus possible de les mettre entre mâles et les laisser avec des femelles engendrerrait trop de portées inutiles. Les cages font déjà l'objet d'un enrichissement important dans toutes les cages. Les cages ouvertes dans notre animalerie permet des échanges olfactifs et visuels. Les mâles pouvant reservir pour de nombreux accouplement nous les gardons pour les réutiliser.
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré dont de developpement de l'embryon est très proche de celui de l'Homme, En outre, nous avons déjà beaucoup de donnée dans nos modèles animaux. Nous travaillons à la compréhension du famille de maladie du developpement induisant des malformations graves chez les enfants. Nous travaillons donc à un stade embryonnaire E15,5 et avec des animaux nouveaux-nés. Nous travaillons aussi avec quelques animaux en période de lactation pour évaluer l'évolution de la pathologie les jours suivants la naissance après des traitements correcteurs.
Déchiffrer le code de la myélinisation chez la chimère Drosopus (Xénope et Drosophile)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
400 têtards de xénope vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit sous anesthésie une transplantation de cellules de drosophile dans le chiasma optique, puis est disséqué pour observer l'enroulement de ces cellules autour des neurones. Le porteur indique qu'une transplantation peut traverser une veine et provoquer une hémorragie, l'animal étant alors tué dans les cinq minutes, et que l'exposition au métronidazole tue environ 10 % des têtards. Il revendique le remplacement de vertébrés comme la lamproie par un invertébré, la drosophile, et justifie le xénope par sa transparence et sa position sur l'arbre évolutif.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie du système nerveux central qui dans sa forme la plus fréquente évolue par poussées et régressions des symptômes. La régression des symptômes, plus ou moins complète en début de la maladie, devient de moins en moins complète au cours de la progression de la maladie. La SEP associe une atteinte inflammatoire et de dégénérescence des neurones. Depuis les 30 dernières années des progrès considérables ont été réalisés dans la prise en charge du volet inflammatoire de la maladie. En nous attaquant à la compréhension du processus de mise en place des couches (myéline) qui entourent les neurones, pour les protéger et permettre une conduction nerveuse rapide, nous espérons pouvoir identifier des cibles thérapeutiques pour lutter contre la dégénérescence des neurones dans la SEP.
Bénéfices attendus
Dans un premier temps le bénéfice de notre projet est fondamental, conduisant à comprendre les signaux minimums qui permettent la mise en place de la couche de protection autour des neurones (myéline). A plus long terme notre ambition est d’ouvrir des voies thérapeutiques dans les maladies dégénératives dont la plus fréquente est la sclérose en plaques.
Procédures
Dans notre protocole expérimental, les têtards seront soumis à une étape de transplantation des cellules dans le chiasma optique sous anesthésie générale. Du début à la fin de l’anesthésie nous estimons que la durée ne dépassera pas 10min. Le chiasma optique est la structure anatomique dans laquelle les deux nerfs optique (un pour chaque œil) se croise. Réaliser la transplantation dans le chiasma optique, nous permet d’envisager que les cellules transplantées migreront dans les nerfs optiques et seront facilement identifiables et analysables. Cette procédure de transplantation n’a lieu qu’une seule fois par animal, sous anesthésie générale, avec un taux de survie dépassant les 90 pour cent pour les concentrations de cellules injectées. L’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle) entraine une perte d’environ 10 pour cent de têtards. La même technique d’anesthésie est utilisée pour une observation du nerf optique au macroscope, mais le têtard est cette fois ci placé sur une petite boite dans une goutte d’anesthésiant, l’observation ne dépasse pas 5 min, ce qui fait que le têtard est anesthésié au maximum pendant 10 min. Ces observations auront lieu 5 fois pendant toute la durée du protocole. Pour le comportement, les têtards sont amenés dans la pièce agréée dans leur bac, et prélevés délicatement avec une épuisette pour les placer dans une large boite avec leur milieu de nage. Leur nouvel environnement ne semble pas induire de stress car aucun comportement de fuite n’est observé. Cette expérience n’est réalisée que 2 fois et dure moins de 5 minutes par têtard. A la fin de la procédure les têtards seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
L’anesthésie est maintenue durant toute la durée de la procédure pour ne pas engendrer de stress chez le têtard mais peut entrainer des risques cardio-respiratoires, les battements du cœur sont donc fréquemment contrôlés durant l’anesthésie (facilement visible chez les têtards). La capture avec une épuisette peut générer un stress, ainsi que le changement d’environnement lors du test comportemental. L’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle) entraine une perte d’environ 10 pour cent de têtards. Lors de la transplantation, il est possible de traverser une veine, ce qui provoque une hémorragie, dans ce cas-là, à la reprise de la nage à la suite de l’anesthésie, le têtard peut soit nager de travers, soit avoir une poche de sang visible. Le têtard est donc directement euthanasié dans les 5 minutes après la transplantation.
Devenir
Suite aux transplantations, les têtards sont euthanasiés pour observer les cellules gliales de Drosophile qui ont été injectées dans le chiasma optique. Cette euthanasie est nécessaire pour observer l’enroulement possible des cellules gliales de Drosophile autour des neurones de Xénope, et cette observation n’est possible qu’après dissection des têtards.
Remplacement
L’enroulement autour des axones par des cellules gliales (myélinisation), comme la remyélinisation (suite à une ablation de ces cellules gliales, évènement de démyélinisation), ne peut que difficilement s’étudier sur un autre modèle que chez les vertébrés. Une autre possibilité eut été d’utiliser deux espèces de vertébrés : Tous les vertébrés sont myélinisés sauf les plus anciens, dépourvus d’une mâchoire à savoir la lamproie et la mixine. Nous aurions pu ainsi transplanter des cellules gliales de lamproie dans le système nerveux de Xénope. Afin d’éviter l’utilisation de ces vertébrés nous avons préféré les remplacer par la Drosophile, qui est un invertébré, dont les cellules gliales ne s’enroulent par autour des axones (au plus 1 à 2 tours) mais forment des empilements protégeant les axones.
Réduction
La transparence des têtards de Xénope permet de suivre in vivo la progression des expériences et ainsi d’éviter des suivis histologiques nécessitant l’euthanasie des têtards expérimentaux à différents points critiques du protocole. Le chiffre de 400 têtards utilisés pour ce projet a été déterminé de sorte à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en s’assurant de résultats statistiquement robustes. Il est à noter que dans un souci de respecter au plus près la règle des 3R ces expérimentations in vivo ne seront que l’aboutissement d’études préalables, n’entrant pas dans le champ d’une demande Apafis, réalisées sur des co-cultures de cellules de Drosophile et de Xénope.
Raffinement
Les têtards sont placés dans un bain à une température de 23 degrés celsius avec une pompe pour oxygéner l’eau. L’eau (moitié osmosée moitié dure) est renouvelée régulièrement pour maintenir un volume suffisant et réduire l’accumulation des déchets urémiques. L’eau est oxygénée de manière plus importante après anesthésie pour permettre une meilleure récupération du têtard. Les têtards sont observés quotidiennement, et ceux qui présentent des anomalies (déformations, retard de développement, troubles de la nage…) sont euthanasiés, les cadavres liés aux problèmes de développement et les surplus de nourriture sont aussi retirés de l’eau quotidiennement. De plus, des branches de plantes artificielles sont placées dans les bacs des têtards, qui leurs permettent de se cacher dessous. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Pour les manipulations, les têtards sont attrapés par une épuisette, ce qui n’entraine normalement pas de blessures ou de comportements anormaux suite à la capture. Pour le comportement, les têtards sont amenés dans la pièce agréée dans leur bac, et attrapés par une épuisette pour les placer dans une large boite de Pétri (145 x 20mm) avec leur milieu de nage. Leur nouvel environnement ne semble pas induire de stress car aucun comportement de fuite n’est observé. Les têtards sont isolés seulement 5 minutes avant d’être replacés dans leur bac d’origine avec leurs congénères, ce qui n’entraine pas de troubles de comportement visible. Durant l’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle), les têtards sont placés dans un incubateur opaque. Cette absence de cycle jour/nuit n’impacte pas les têtards car nous n’avons pas observé de stress ou d’augmentation de la mortalité durant les 10 jours d’exposition. De plus, les têtards aiment les zones qui sont peu lumineuses, ils se cachent naturellement dans les plantes et dans les tuyaux. Le passage à l’obscurité n’est donc pas une perturbation pour eux.
Choix des espèces
Le choix du Xénope se justifie pour 3 raisons : 1) le Xénope vit à la même température que les Drosophiles, critère indispensable pour créer les transplantations 2) les têtards de Xénope sont transparents, ce qui facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction) ; 3) contrairement aux poissons (osteichtyens(danio) ou chondrichtyen) les amphibiens (Xénope) sont les premiers vertébrés sur l’arbre évolutif à utiliser un profil protéique myélinique différent dans le système nerveux central et périphérique. Les transplantations seront réalisées à différents stades de développement : au début de la myélinisation (stade 48) et des têtards déjà bien myélinisés juste avant la métamorphose (stade 55-60). Ceci afin de déterminer le stade auxquels les axones sont le plus "aptes" à être myélinisés.
Effet de la complémentation en citrulline sur la vascularisation placentaire et la croissance foetale chez des brebis soumises à un stress thermique en fin de gestation
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
28 brebis gestantes vont être utilisées, puis replacées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une complémentation en citrulline et deux prises de sang à la jugulaire pendant le dernier mois de gestation, une partie étant placée en stress thermique qui peut provoquer une hyperthermie, des difficultés respiratoires et un risque accru d'avortement ou de mise bas précoce. Le porteur relie le projet au "besoin" d'atténuer les effets du stress thermique sur la productivité du bétail, et affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour valider une approche nutritionnelle. Le raffinement décrit une récompense en granulés après chaque prélèvement et l'absence d'anesthésie locale jugée plus douloureuse que la prise de sang.
Objectifs
Dans un contexte global de changement climatique, les animaux d’élevage sont de plus en plus fréquemment exposés au stress thermique. Sachant que c’est l'un des déterminants environnementaux les plus importants de la productivité du bétail, de nombreuses études montrent que le stress thermique en fin de gestation peut compromettre la croissance du fœtus, affecter l'absorption postnatale des immunoglobulines du colostrum et avoir des actions à long terme qui se traduisent par une réduction de la production laitière lorsque l’animal devient adulte. Afin de réduire les effets du stress thermique, les animaux sont en général placés à l’ombre et rafraichis grâce à des ventilateurs et des arrosages automatiques, mais toutes ces approches ne sont pas sans conséquences en termes de risque sanitaire pour les animaux ou de consommation d’énergie. C’est pourquoi, d’autres approches, en particulier nutritionnelles, peuvent être envisagées. Sachant qu’il a été démontré chez le bovin que le retard de croissance intra-utérin observé chez les veaux pourrait correspondre à une altération de la vascularisation placentaire, nous avons choisi un acide aminé impliqué dans la synthèse locale d’oxyde nitrique (NO) pour améliorer la régulation vasculaire placentaire. De plus, le projet sera réalisé sur des ovins car les pratiques de dessaisonnement en élevage, induisent un stress thermique en fin de gestation lors de dessaisonnement des animaux pour la mise bas du mois de septembre. Ainsi, l’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet de la supplémentation en citrulline dans le dernier mois de gestation chez la brebis, dans des conditions de stress thermique ou non, sur la vascularisation et la fonction placentaires, le poids des agneaux à la naissance et leur croissance post-natale.
Bénéfices attendus
Validation d'une approche nutritionnelle pour atténuer les effets négatifs du stress thermique sur le placenta et le poids des animaux à la naissance
Procédures
Les animaux auront 2 prises de sang réparties de la manière suivante: une à 110 jours de gestation et une à 140 jours de gestation. Chaque prise de sang dure environ 20 secondes.
Impact sur les animaux
Il n’est pas attendus de conséquences néfastes à la prise alimentaire de Citrulline qui est un acide aminé favorisant la santé vasculaire. Il pourrait arriver en revanche une hyperthermie des lots mis en stress thermique avec des difficultés de régulation de température et de respiration dues au stade de fin de gestation, et un risque accru d’avortements ou de mise bas précoce. Un petit hématome peut dans de rare cas subvenir à la veine jugulaire après les prises de sang.
Devenir
Les animaux seront replacés à l’issue de la procédure.
Remplacement
Le recours à l'animal est indispensable puisque l'objectif du projet est de valider une approche nutritionnelle pour permettre d'atténuer l'effet du stress thermique sur la croissance foetale.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés (7 femelles par lots) a été rationalisé dans le but de ne pas utiliser plus d'animaux que nécessaire pour pouvoir mettre en évidence un effet après analyse statistique. La taille de nos effectifs permettra de réaliser des analyses statistiques qui dépendront de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests de comparaison de type ANOVA. Si les conditions ne permettent pas d’utiliser des tests paramétriques, alors nous utiliserons des tests non paramétriques pour comparer les lots expérimentaux. Pour cette configuration, on réalisera le test de Mann et Whitney ainsi que le test de permutation pour mesures indépendantes via le logiciel R.
Raffinement
Les brebis étant des animaux grégaires, elles seront toujours manipulées par lot. Elles seront hébergées sur aire paillée et la contention des brebis pour le prélèvement sanguin se fera dans un espace réduit entre des claies. La cellule sera enrichie avec des miroirs et des filets de foin suspendus. Les prélèvements de sang par ponction à la veine jugulaire, seront réalisées par du personnel qualifié et expérimenté. La présence récurrente des expérimentateurs en interaction positive en dehors de la procédure (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du stress face à la contention. Après chaque prélèvement et chaque échographie, les animaux recevront une récompense sous forme de granulés. Lors de la prise de sang, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée n’entrainant pas de trouble de l’état général (pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité) ; il ne sera pas fait d’anesthésie locale qui s'avèrerait plus douloureuse que la prise de sang, et augmenterait le risque d’hématome. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera ensuite assurée dans le cadre du suivi de la mise à la reproduction. En cas d’apparition de symptômes, un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Les ovins ont été choisis car c'est une espèce soumise au stress thermique en fin de gestaion lors de désaisonnement des animaux pour une mise bas en septembre. Les animaux utilisés sont en fin de gestation car l'objectif est d'évaluer l'effet de la supplémentation en citrulline dans le dernier mois de gestation sur la vascularisation placentaire et le poids des agneaux à la naissance, dans des conditions de stress thermique.
Effet de la température sur la spermatogenèse du médaka et transmission multigénérationnelle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
739 poissons médakas vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des mâles passent cinq semaines dans une eau à 32 °C, une température qui réduit fortement la mobilité de leurs spermatozoïdes, puis subissent sous anesthésie un prélèvement de sperme par pression sur le ventre, et leurs descendants sont étudiés sur une ou deux générations. Les poissons élevés à 32 °C et leurs descendants sont tués, comme une partie des témoins dont on prélève les testicules, tandis que 157 témoins élevés à 25 °C pourront être réutilisés. Les retombées annoncées visent l'aquaculture, où selon le porteur le coût de la réfrigération impose de connaître les températures qui permettent de "maintenir le bien-être et les performances des animaux". Sa réponse sur le remplacement tient en une phrase : il n'existe "pas d'alternative", puisque l'équipe étudie précisément la spermatogenèse à température élevée.
Objectifs
Les poissons présentent une importante plasticité phénotypique (grande capacité d'adaptation) face aux variations environnementales. A l’interface entre l’environnement et l’ensemble des gènes, des molécules dites «méthyle » (groupements CH3), constituent un code dit « épigénétique » ou méthylation de l'ADN. Elles sont capables d’interagir avec l’ADN sous l’influence de l’environnement et permettre par exemple, la mise en place d'un métabolisme adapté à un changement de température. On appelle méthylome l'ensemble des groupes méthyle pour une cellule ou pour un tissu donné. Chez la truite arc-en-ciel, une augmentation de 4°C de la température d’élevage durant la spermatogénèse entraîne des modifications de la méthylation de l’ADN des spermatozoïdes produits. Ces spermatozoïdes sont cependant fonctionnels, et donc susceptibles de transmettre leurs modifications épigénétiques à la descendance, et d’en impacter leurs performances, ou au contraire, favoriser leur adaptation à un environnement changeant. Les gènes impactés concernent la spermiogénèse (fonction de reproduction) et de métabolisme lipidique (fonction de croissance). Dans un contexte de réchauffement climatique, ces résultats soulignent la nécessité de tester comment des variations épigénétiques du spermatozoïde induites par une augmentations de température peuvent impacter les performances des descendants de première (F1), voire puis seconde (F2) génération. L'objectif de ce projet est donc d'aborder le rôle de la méthylation de l'ADN dans la transmission paternelle inter et transgénérationnelle des effets de température chez le poisson. Pour ce type d'étude, l'espèce modèle médaka (Oryzias latipes) est parfaitement adaptée, du fait de son court temps de génération, et de l'importance des ressources génétiques disponibles. Notre première hypothèse de travail : le méthylome de l'ADN du sperme de médaka est sensible à la température d'élevage au cours de de la spermatogenèse. La deuxième hypothèse : le méthylome de l'ADN du sperme contribue au développement embryonnaire et adulte et module les phénotypes. La troisième hypothèse : les altérations du méthylome de l'ADN sont transmises de génération en génération à travers la ligné germinale mâle et persistent même lorsque les individus ne sont plus exposés à la température élevée.
Bénéfices attendus
Nous nous intéressons au gamète mâle, comme vecteur intergénérationnel d'information sur les conditions de vie des individus (potentiellement changeantes). L'objectif du projet est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la réponse des poissons à une augmentation de température, à l'échelle inter- puis trans-générationnelle, dans un contexte de changement climatique. Il s'agit donc d'évaluer leur aptitude à s'adapter au fil des générations, ou au contraire, mettre en évidence les possibles challenges de performances auxquels ils font face en étudiant plus particulièrement les effets sur les capacités reproductives. Pour les espèces d'aquaculture ces connaissances pourront influencer les pratiques d'élevages. En effet, la température de l’eau est une composante particulièrement difficile à moduler en élevage ouvert classique, et la période estivale coïncide avec des étapes clefs de la gamétogénèse chez de nombreuses espèces domestiques, dont les salmonidés. L’augmentation des températures estivales ces dernières années pose la question de la plasticité de ce processus gamétogénétique et de la façon dont les dernières étapes de la spermatogénèse peuvent être affectées. Le développement récent des élevages en système clos (eau recirculée) permet dans une certaine mesure de contrôler ce paramètre, mais les coûts de réfrigération de l’eau imposent de bien connaître les limites de température qui permettent de maintenir le bien-être et les performances des animaux. Aborder l’impact des températures d’élevage pendant la gamétogénèse est donc un enjeu important pour l’aquaculture à la fois continentale et marine.
Procédures
Les interventions prévues sont des prélèvements de sperme. Ils seront réalisés sous anesthésie et durent moins d'une minute. Pour cela,après anesthésie, les poissons sont sortis de l'eau et placés sous loupe binoculaire. Grâce à une légère pression exercée sur la partie ventrale, environ 1 à 2 µL de sperme sont émis et collectés dans une pipette. Les poissons sont alors placés en bac de réveil. Pour cette procédure, les expérimentateurs sont munis de gants en latex et les animaux sont pêchés délicatement à l'aide d'une petite épuisette.
Impact sur les animaux
Une première expérience a permis de déterminer la température et la durée d’exposition. La température d’exposition à 32°C pendant 5 semaines a été validée : les poissons médaka élevés à 32°C pendant un cycle de spermatogénèse présentent une forte diminution de la motilité des spermatozoïdes, mais néanmoins, les mâles testés étaient toujours capables de féconder des œufs et de produire une progéniture, (embryons éclos). D'après la littérature et nos premières observations, l'exposition à 32 °C pendant 5 semaines pendant la spermatogenèse ne produit pas de phénotype dommageable chez la descendance. De plus, aucun comportement de type pathologique n'a été observé après exposition à 32°C lors de notre expérience précédente. Les risques potentiels attendus : stress thermique ; modifications de la prise alimentaire et métabolisme énergétique ; altération de la spermatogénèse ; stress de capture.
Devenir
Les animaux élevés à 32°C et leurs descendants ne pourront être réutilisés. En effet nous suspectons que ce dispositif expérimental affecte un certain nombre de paramètres biologiques, dont l'épigénétique des poissons. Ils seront euthanasiés. Parmis les animaux contrôles issus de contrôles (élevés à 25°C), certains devront être euthanasiés afin de prélever leurs testicules pour des analayses moléculaires ou cellulaires. En revanche, 157 animaux contrôles issus de contrôles (élevés à 25°C) pourront être réutilisé après avoir participé au test de fécondance ou à la génération suivante.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale car nous recherchons précisément les mécanismes intervenant pendant une spermatogénèse à température augmentée.
Réduction
Le nombre d’animaux est adapté au plus juste pour permettre des analyses statistiques fiables malgré les fortes variabilités entre les individus. En outre, nous organisons l'emploi des animaux et les méthodes de manière à réutiliser les animaux pour plusieurs approches : les femelles utilisées pour les tests de motilité du sperme seront également utilisées pour la génération des F1, les mâles analysés en motilité du sperme permettront également de réaliser les analyses moléculaires (méthylation ADN et transcriptomique), et les mâles étudiés au niveau histologique seront également testés pour la qualité mitochondriale de leur sperme.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l'espèce (photopériode, qualité d'eau, densité, conditions sanitaires) à l'exception du lot de mâles exposés à 32°C. Il s'agit cependant précisément de l'objet de l'étude (effet du réchauffement) et la littérature ne montre pas de mortalité chez des médakas élevés à cette température. Les bacs seront enrichis (ajout de plantes artificielles), les animaux toujours manipulés délicatement, avec des gants en latex et pêchés avec une petite épuisette. Les mesures de taille et de poids, ainsi que les prélèvements d’oeufs et de spermes sont des gestes doux, très rapides et non invasifs. Les prélèvements de sperme, nécessitant un geste précis, seront réalisés sous anesthésie pour limiter le stress des animaux. Les mesures de taille et poids seront réalisées lors de la même anesthésie et très rapidement (moins de deux minutes par animal, mesures poids, taille, et prélèvement du sperme compris).
Choix des espèces
Choix de l'espèce medaka Oryzias latipes : - court temps de génération en prévision d'étude d'effets inter- et transgénérationnels - spermatogénèse continue (et non saisonnière) - techniques édition génome et épigénome accessibles - ressource importante pour intégration de données bio-informatiques, bibliographie, outils moléculaires (anticorps par exemple) - spermatozoïde à histones (contrairement au zebrafish), plus proche des modèles mammifères Nous travaillerons avec des adultes de 4.5 mois car nous souhaitons étudier la spermatogénèse qui a lieu chez les mâles adultes, et la capacité des spermatozoïdes à féconder des oeufs (émis par des femelles adultes de 4.5 mois).
Caractérisation du rôle neuroprotecteur des cavéolines dans les atteintes consécutives à un traumatisme crânien léger chez la souris juvénile.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le jour de leur naissance, elles reçoivent une injection dans le cerveau, puis subissent à 21 jours un traumatisme crânien provoqué par un impact sous anesthésie, suivi de séries de tests comportementaux et d'IRM, avant d'être tuées par perfusion d'un fixateur. Le porteur présente ce modèle comme reproduisant un traumatisme crânien pédiatrique et renvoie les retombées thérapeutiques à un potentiel futur. Il affirme qu'"aucun modèle in vitro ou informatique" ne permet cette étude et que le projet "ne peut pas se passer de l'expérimentation animale".
Objectifs
Le projet que nous avons développé vise à étudier les changements qui se mettent en place au sein du cerveau à la suite d'un traumatisme crânien léger et qui contribuent aux atteintes comportementales à long terme. Ce projet unique va explorer le potentiel thérapeutique d’une protéine d’intérêt, la cavéoline, en étudiant son rôle protecteur dans le cerveau. Notre équipe utilisera un modèle léger de traumatisme crânien chez la souris, nous permettant d'étudier sur le long cours, à l'aide de tests comportementaux et d'outils d'imagerie innovants, les processus induits sur le système nerveux central avec une définition encore inaccessible chez l'homme. Ces processus chroniques seront étudiés par l’utilisation de souris ayant reçu une injection permettant l’augmentation de notre protéine d’intérêt. Suite à l’induction du traumatisme crânien, ces animaux seront soumis à une évaluation comportementale permettant d’évaluer leurs capacités locomotrices, leur niveau d’anxiété et leur mémoire et nous réaliserons également un suivi au cours du développement par imagerie IRM. Notre étude sur le rôle de cette protéine d’intérêt pourrait nous permettre d’établir la pertinence de cette protéine dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques innovantes.
Bénéfices attendus
Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu). D’autre part ce projet déterminera si la protéine CAV1 (CAVéoline-1) représente une cible thérapeutique intéressante dans le cadre du développement de traitements post-trauma chez l’enfant.
Procédures
1. injection unique dans le cerveau le jour de naissance sous anesthésie générale courte (moins de 15 minutes) adaptée à ce stade de développement. Réalisé une seule fois. 2. trauma crânien léger juvénile (TC): 21 jours après leur naissance, les animaux subiront une anesthésie générale courte (5 minutes) pendant laquelle il recevront un impact léger au niveau du crâne. Animaux contrôles soumis uniquement à l’anesthésie générale. Réalisé une seule fois. 3. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes, 2 tests de coordination motrice d’environ 5 minutes chacun, 1 test de sensibilité tactile d’environ 5 minutes, 2 tests d’évaluation de l’état anxieux de 5 minutes et 2 tests d’apprentissage spatial qui nécessitent des sessions quotidiennes de 5 minutes sur 5 jours. Chaque test sera effectué à un jour différent, ainsi chaque série comportementale s’étalera sur 2 semaines, avec 11 jours où l’animal sera testé sur une durée de 5 min par jour. Réalisé une fois pour un tiers des animaux, 2 fois pour un autre tiers, 3 fois pour le dernier tiers. 4. Exploration d’imagerie fonctionnelle par IRM réalisée sous anesthésie générale d’environ 1 heure. Réalisé une fois pour un tiers des animaux, 2 fois pour un autre tiers, 3 fois pour le dernier tiers, un jour après le dernier test comportemental. 5. Fixation du tissu cérébral. Anesthésie générale profonde et adaptée. Perfusion d’un fixateur pendant 5 minutes jusqu’à l’arrêt du cœur. Prélèvement des tissus.
Impact sur les animaux
Notre modèle repose sur une injection dans le cerveau à la naissance sous anesthésie très courte. Ce geste peut entraîner une réduction de la température du corps ou un retard de croissance. De plus, nous utiliserons un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile. Les conséquences possibles incluent des altérations d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de mobilité, d’anxiété ou de douleur. Chaque série comportementale peut entraîner du stress et de la fatigue. L’anesthésie réalisée lors de l’imagerie par IRM peut aussi entraîner une dépression respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de la procédure, soit 348 animaux. Ceci est nécessaire pour les analyses en immunohistochimie et par imagerie IRM qui complèteront et seront essentielles à cette étude.
Remplacement
Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données scientifiques permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.
Réduction
Le projet concerne 348 souris mais permet de réduire le nombre d'animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet en effectuant un suivi longitudinal non invasif par imagerie. Nous planifions des groupes expérimentaux correspondant au nombre minimal permettant l'utilisation de tests statistiques visant à comparer les différents groupes lors des tests comportementaux / IRM.
Raffinement
Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme, en s'appuyant sur la mise en place d'une démarche de suivi des animaux permettant de limiter et traiter la souffrance éventuelle des animaux, et en employant les méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. L'ensemble des procédures mises en place dans le projet sera assuré par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales en adéquation avec les directives européennes. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. La procédure chirurgicale d’injection stéréotaxique chez le nouveau-né sera réalisée avec des protocoles d’anesthésie et d'analgésie permettant de supprimer toute douleur durant et après la procédure. Les traumatismes crâniens seront réalisés sur animal anesthésié en utilisant des impacts calibrés. De plus, la cage de réveil est placée sur un tapis chauffant afin de prévenir toute hypothermie. Lors de la réalisation des tests comportementaux, les animaux ne se retrouveront isolés que peu de temps : 5mn pour la plupart des tests et 1h au maximum. Le bien-être des animaux sera assuré par des protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés.
Choix des espèces
Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. Dans ce projet, les souris seront injectées en intracérébral le jour de la naissance afin de permettre une transfection robuste 3 semaines plus tard. Les traumatismes crâniens seront donc réalisés sur des souris juvéniles à 21 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un TC en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 6 mois après le TC afin d’évaluer les conséquences à moyen terme.
Albinisme et développement du système visuel de modèles murins
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
1833 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, une partie étant opérée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections dans le cerveau ou dans l'œil, une électroporation in utero sur les embryons, puis des tests visuels comme le test de la falaise visuelle et l'électrorétinogramme, avant d'être tuées pour prélever leurs yeux et leur cerveau. Le porteur étudie des mutations responsables de déficits visuels congénitaux et renvoie les retombées thérapeutiques au "long terme". Il décrit un recours à des cellules et des organoïdes pour une partie des expériences, mais indique que la souris reste "le modèle de choix" pour reproduire ces mutations.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de mieux comprendre quelles sont les altérations structurelles et fonctionnelles du système visuel dans différents modèles murins de maladies génétiques causant des déficits visuels provenant d’un mauvais développement de l’œil aux stades embryonnaires. Ce projet a l'avantage de combiner des approches variées de génétique de la souris ou permettant l'expression de molécules d'intérêt dans la rétine ou dans le cerveau, des méthodes histologiques et de traçage neuronal permettant d’observer les projections visuelles.
Bénéfices attendus
L’étude de ces souris modèles murins de pathologies visuelles héréditaires permettra de caractériser précisément les défauts visuels (anatomiques, structurels et fonctionnels) et de déterminer ainsi l’impact de chaque mutation afin de comparer leur effet délétère. Ceci nous permettra notamment d’établir des liens de cause à effet et de déterminer un ordre hiérarchique de ces différentes mutations dans les mécanismes à l’origine des divers défauts visuels. De plus, ce projet nous permettra d’identifier les conséquences de ces mutations et de trouver les mécanismes impliqués afin de pouvoir proposer des nouvelles voies thérapeutiques à long terme.
Procédures
1833 animaux seront soumis aux différentes interventions suivantes : - Une biopsie prélevée au niveau de la queue pour déterminer le profil génétique des animaux - une injection stéréotaxique cérébrale (procédure chirurgicale, 45 min) ou une injection intraoculaire (procédure chirurgicale, 20 min) - une électroporation in utero (procédure chirurgicale, 30 min) suivie d’une injection intraoculaire (procédure chirurgicale, 20 min) - des tests comportementaux : test de la taille relative (5x5min en 1 jour), test de la falaise visuelle (10x5min en 3 jours) à suivre, puis 3 jours au moins après au test optomoteur (animal vigile, 2,5 min) et à nouveau 3 jours après au moins à un electrorétinogramme (procédure chirurgicale, 30min) -Pour tous les animaux, une euthanasie sous anesthésie et analgésie générale est réalisée pour prélèvement de tissus (yeux et cerveaux). -Toutes les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie et analgésie générale avec une prise en charge analgésique post-opératoire.
Impact sur les animaux
Une biopsie prélevée au niveau de la queue pour déterminer le profil génétique des animaux peut causer de la douleur. Suite à l’anesthésie, il peut survenir de manière rare une réaction de détresse respiratoire ou de mort immédiate. Suite aux actes chirurgicaux, les plaies (crâne ou abdomen) ou site d’injection (œil) peuvent être inflammés ou infectés. Suite à l’électroporation in utero, des problèmes au niveau de la mise bas pourraient survenir du fait de la manipulation des embryons lors de la procédure. Après tous les actes chirurgicaux, une douleur post-opératoire est possible. Les tests comportementaux peuvent induire un stress chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux de chaque procédure seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques sur les tissus.
Remplacement
Certaines des expériences pour étudier la fonction des gènes impliqués dans ces maladies congénitales visuelles seront réalisées sur des lignées cellulaires ou des cellules rétiniennes ou organoïdes issus de cellules souches pluripotentes induites afin de remplacer l’utilisation de modèles animaux par des modèles cellulaires.
Réduction
Le nombre total d’animaux utilisés est 1833. L'électroporation in utero pour marquer les axones rétiniens et également inactiver ou surexprimer des gènes a l’avantage d’être rapide et de réduire le nombre de souris nécessaires par comparaison aux méthodes classiques de génération de lignées de souris mutantes. Les différentes procédures comportementales pour mesurer la vision binoculaire et l’acuité visuelle ainsi que l’enregistrement des cellules rétiniennes seront faites sur les mêmes animaux afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Ces mêmes animaux seront utilisés pour des prélèvement de cerveau et de rétine afin de diminuer le nombre d'animaux utilisés pour le prélèvement de tissu fixé. La taille des effectifs a été établie grâce à des tests statistiques sur des lignées similaires. Plus spécifiquement sur la procédure d’électroporation in utero, des femelles gestantes additionnelles sont utilisées comme mères adoptives car les femelles s’occupent moins bien de leur portée après un contexte d’opération au niveau de l’abdomen. Aucune procédure expérimentale ne sera réalisée sur ces mères adoptives, mais cela permet d’augmenter la survie des petits électroporés et donc de réduire le nombre de souris sur lesquelles des procédures chirurgicales seront effectuées.
Raffinement
Les expérimentateurs sont formés par des personnes compétentes en respectant les réglementations en vigueur (formation d’expérimentation animale et de chirurgie). La Structure chargée du Bien Etre des Animaux et les personnels de l’animalerie veillent au respect des règles et assurent une surveillance quotidienne, ainsi que le maintien du statut sanitaire. Les animaux sont hébergés selon la législation en vigueur. Les animaux provenant d’un autre établissement utilisateur auront une période d'acclimatation d’au moins 5 jours avant le début des procédures expérimentales. Un suivi post-opératoire ainsi que des points limites ont été définis pour chaque procédure (tels que la surveillance du poids des animaux, l'absence de locomotion, l'état du pelage, la prostration) conduisant à l’euthanasie après consultation du SBEA ou d’un vétérinaire. Toutes les procédures chirurgicales sont accompagnées d’anesthésie et d’analgésie générale. L’anesthésie gazeuse est privilégiée car elle permet un réveil quasi immédiat après chirurgie, ce qui permet à l’animal de récupérer plus vite. Pendant la chirurgie, les animaux sont maintenus sur un coussin chauffant. Pour l’électroporation in utero, des femelles gestantes sont utilisées comme mères adoptives car les femelles s’occupent moins bien de leur portée et encore plus après un contexte d’opération au niveau de l’abdomen. Aucune procédure expérimentale ne sera réalisée sur ces mères adoptives, mais cela permet d’augmenter la survie des petits électroporés.
Choix des espèces
L'organisation des voies visuelles est bien conservée entre la souris et l'humain. Le développement de la rétine et du cerveau est bien caractérisé chez la souris, permettant d’étudier les anomalies dans des modèles de souris de pathologies visuelles congénitales. La souris reste le modèle de choix pour la génération de lignées transgéniques et la plupart des mutations humaines à l’origine des différentes pathologies que nous étudions n’ont été reproduites que dans des modèles murins. Plusieurs stades seront analysés: nous nous intéressons au développement du système visuel en étudiant majoritairement les stades postnataux et adultes pour étudier la connectivité neuronale entre la rétine et le cerveau. Les âges étudiés, jour de naissance (P0), puis 3ème jour postnatal (P3) et 7ème jour postnatal (P7), correspondent différentes étapes de développement du système visuel et il est important de savoir à quel moment les défauts apparaissent chez les modèles murins de maladies. Quand ce n’est pas nécessaire, notamment pour étudier la fonction visuelle, nous utiliserons des souris adultes.
Etude de l’effet de l’harmaline sur le développement de l’organisation modulaire du réseau olivo-cérébelleux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
563 souris vont être utilisées, les souriceaux tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les 60 mères étant réutilisées pour l'élevage. Les souriceaux reçoivent deux injections intrapéritonéales d'harmaline par jour pendant cinq jours, ce qui provoque des tremblements aigus et une phase d'hyperactivité gênant la prise alimentaire. Le porteur indique un retard de poids inférieur à 4 % et signale que la manipulation peut conduire les mères à rejeter leurs petits. Il étudie le rôle de l'activité neuronale dans le développement d'un réseau du cervelet et affirme qu'une telle étude n'est pas possible en culture cellulaire.
Objectifs
Dans le cerveau, la cellule de Purkinje du cervelet reçoit différents types de connexions, dont celles des fibres grimpantes, axones des neurones de l’olive inférieure. L’activité neuronale régule la formation et le maintien des synapses entre fibres grimpantes et cellules de Purkinje, ce qui fait du réseau olivo-cérébelleux un système d’étude idéal pour analyser les mécanismes moléculaires dépendants de l’activité menant à l’établissement de réseaux neuronaux fonctionnels. De plus, le réseau olivo-cérébelleux présente une organisation en modules, traitant différentes informations sensorielles et motrices, et permettant un contrôle précis de différentes fonctions et en particulier la motricité. Nous proposons d’étudier le rôle de l’activité neuronale dans l’établissement de l’organisation modulaire de ce réseau ainsi que dans la régulation des facteurs moléculaires contrôlant sa mise en place.
Bénéfices attendus
Les maladies mentales et neurologiques constituent un réel problème de santé publique puisqu’elles sont la première cause d’invalidité dans le monde. Parmi ces maladies, la schizophrénie et l'autisme touchent chacune environ 1% de la population. Les symptômes associés à ces maladies sont très variés et apparaissent dans l'enfance pour l'autisme, et à la fin de l’adolescence ou chez le jeune adulte pour la schizophrénie. Les patients présentent par exemple des déficits cognitifs (concentration, attention, mémoire de travail…) qui apparaissent dans l’enfance et auraient pour origine des défauts neurodéveloppementaux. Les traitements, qui restent pour l’heure purement symptomatiques, sont la plupart du temps peu efficaces. Il est donc crucial de comprendre l’origine de ces maladies, pour pouvoir ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Les synapses, connexions permettant aux neurones de communiquer entre eux, sont indispensables au bon fonctionnement du cerveau. Aujourd’hui, il est très bien établi que des déficits de connectivité neuronale sont présents dans le cortex chez des patients atteints d'autisme ou de schizophrénie. En revanche, en dépit de la présence évidente de déficits cérébelleux chez certains patients, l’implication du cervelet dans ces pathologies reste très peu étudiée. La présente étude nous permettra d’identifier des déficits synaptiques dans le réseau olivo-cérébelleux, suite à la modulation de l’activité neuronale au cours du développement du cervelet et nous aidera à mettre en évidence les protéines synaptiques potentiellement modulées par l’activité neuronale qui pourraient provoquer l’apparition de certaines maladies du cerveau lorsqu’elles sont dérégulées.
Procédures
Nous injecterons les souris en intra-péritonéal, 2 fois par jours pendant 5 jours. Chaque injection prend moins d'une minute. Le poids des souriceaux sera déterminé avant chaque injection afin d'adapter la dose à injecter. Les animaux sont maintenus immobiles en réalisant un pli de peau au niveau du dos, légère contention permettant l’insertion de l’aiguille très fine dans l'abdomen. Lors des injections, les souriceaux sont séparés seulement quelques minutes de leur mère afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux. Lorsque l'âge voulu est atteint, les souris seront toutes anesthésiées grâce à un gaz anesthésiant puis euthanasiées.
Impact sur les animaux
Chez la souris, la dose de produit injectée conduit à des tremblements aigus et temporaires des muscles axiaux et a un effet de type anxiolytique. Après chaque injection, les souris présentent une période de quelques heures d’hyperactivité qui semble conduire à une difficulté à se nourrir pendant cette période, avec un retard de prise de poids que nous avons établi à moins de 4% par rapport aux contrôles dans notre précédent projet autorisé par le CEEA. Lorsque les souris sont en âge de se nourire, de la poudre de croquette humidifiée est ajouté dans la cage pour favoriser le nourrisage. La manipulation des souriceaux peu parfois amener les femelles à rejeter leurs petits. Pour éviter cela, les cages ne sont pas changées pendant la période d’injection pour conserver au maximum les odeurs familières et rouler les souriceaux dans la sciure souillée au moment de les remettre avec leur mère. Aucun autre effet indésirable n’a été observé sur ces animaux dans notre précédent projet.
Devenir
Pour les études d’électrophysiologie, de biochimie ou d'histologie, les 563 animaux injectés seront euthanasiés en fin de procédures. Les 60 mères seront réutiliées à des fins d'élevage dans notre animalerie. Après les injections, les animaux resteront auprès de leur mère dans une cage enrichie (cotons et dôme en carton pour leur nid) jusqu’à l’âge du prélèvement.
Remplacement
La souris est devenue un modèle de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. Elle permet l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elle permet également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. Certaines études fonctionnelles ne peuvent pas être réalisées chez les patients. De plus, il est important d’étudier les réseaux cérébelleux dans le contexte du cerveau puisque le cervelet est connecté à d’autres régions du cerveau dont le cortex qui est déjà connu pour son implication, par exemple, dans l'autisme ou la schizophrénie. Une telle étude ne serait donc pas possible en culture cellulaire et nécessite d’avoir recourt à des animaux vivants.
Réduction
Le projet est conçu pour limiter le nombre de souris au minimum dans la limite de ce qui est permis pour obtenir des résultats statistiquement et scientifiquement valides en prenant en compte la nécessité d’avoir plusieurs échantillons et de reproduire les résultats de manière indépendante pour éviter les différences dues à la variabilité biologique (sexe, caractéristiques génétiques…), à la variabilité environnementale (différence liée à la vie avec la mère). Après sevrage des souriceaux, les mères peuvent continuer à être utilisées pour de nouveaux accouplements dans notre animalerie.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Notamment, des compléments environnementaux (dômes en carton, cotons, baguettes en bois) sont ajoutés afin de permettre à la femelle de créer un meilleur nid, de diminuer tout stress éventuel et d'user ses dents. De même, les injections intrapéritonéales chez le souriceau seront réalisées avec des aiguilles très fines afin de minimiser la douleur. Lors de ces injections, les souriceaux sont séparés de la mère afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux. Les cages ne sont pas changées pendant la période d’injection pour conserver au maximum les odeurs familières et rouler les souriceaux dans la sciure souillée au moment de les remettre avec leur mère afin d’éviter le rejet des souriceaux par la mère. Les animaux sont surveillés quotidiennement jusqu’à leur euthanasie. Lorsque les souris sont en âge de se nourrir seules, de la poudre de croquette humidifiée est ajouté dans la cage pour favoriser le nourrissage après l'injection qui provoque des tremblements temporaires. Nous utilisons une grille de suivi des animaux, les points limites sont mis en place pour éviter toute douleurs ou mal être des animaux.
Choix des espèces
Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. En effet, elles permettent l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elles permettent également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. De plus, le court cycle de reproduction chez la souris et sa petite taille permettent de maintenir ces animaux relativement facilement, tout en gardant une espèce assez proche de l’homme en terme de développement. La topographie du réseau olivo-cérébelleux s’établit en plusieurs étapes, dont une étape de raffinement qui est dépendante de l' activité et qui se produit entre P5 et P21. Le stade auquel l’activité joue un rôle majeur n’est pas connu et sera défini en réalisant plusieurs séries d’expériences avec plusieurs groupes de souris entre P5 et P21. Nous utiliserons également des souris plus agées (P45) comme contrôles, car à ce stade la carte topographique est établie et l'activité neuronale continue de contrôler la connectivité.