Biologie du développement
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Etude de la prolifération cellulaire dans le testicule au cours du développement fœtal chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
415 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Les femelles gestantes reçoivent une injection sous contention de moins de trente secondes, puis sont mises à mort deux heures plus tard pour que leurs fœtus soient prélevés et tués à leur tour, entre le quatorzième et le dix-huitième jour de gestation. Le porteur annonce des pistes pour "mieux diagnostiquer (et éventuellement traiter)" des pathologies du testicule ou l'infertilité humaine, l'objet immédiat étant de comparer la prolifération cellulaire dans le testicule de fœtus normaux et mutants. Il conclut que l'emploi de la souris est "indispensable" et que le remplacement in vitro est "impossible".
Objectifs
La vitamine A est essentielle au développement embryonnaire de tous les mammifères mais son rôle reste à définir dans les différents tissus. Les cellules dans lesquelles la vitamine A doit agir fabriquent des enzymes, qui transforment la vitamine A en un métabolite actif qui active des récepteurs nucléaires pour relayer son effet biologique. Les cellules dans lesquelles la vitamine A ne doit pas agir fabriquent d’autres enzymes, qui dégradent ce métabolite. Afin de comprendre le rôle de la vitamine A dans la formation du testicule chez la souris, nous devons comparer la prolifération des cellules entre des fœtus normaux et des foetus porteurs de mutations dans les gènes codant les enzymes qui transforment et qui dégradent la vitamine A, ainsi que dans les gènes codant les récepteurs nucléaires, aux étapes clés de la formation du testicule (entre les jours 14.5 et 18.5 post-fécondation).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre l’action de la vitamine A et de ses récepteurs nucléaires dans la prolifération des cellules constitutives de testicule. En découvrant comment la vitamine A agit sur cet évènement chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour mieux diagnostiquer (et éventuellement traiter) des pathologies du testicule ou des cas d'infertilité chez l’Homme, qui sont en augmentation constante dans le monde.
Procédures
Chaque souris femelle gestante reçoit une injection de subtance lors d’une contention simple qui dure moins de 30 secondes. Elle est ensuite euthanasiée. Les fœtus sont isolés et euthanasiés.
Impact sur les animaux
La nuisance subie par les femelles gestantes est limitée à la contention pour l’administration par injection d’une substance permettant de mesurer la prolifération des cellules. Celle méthode est utilisée en routine au laboratoire et nous possédons l’expertise requise. L’administration de la substance entraîne une douleur équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau. Les femelles gestantes et les foetus sont ensuite euthanasiés de sorte qu'ils ne souffrent pas.
Devenir
Toutes les femelles gestantes sont euthanasiées pour permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées, adoptées ou replacées. Tous les fœtus prélevés sont euthanasiés pour les analyses moleculaires ou sur coupes histologiques. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés, adoptés ou replacés.
Remplacement
Le testicule est formé de diverses cellules qui ont toutes un rôle essentiel pour la différenciation des cellules germinales. A l’heure actuelle, nous ne sommes pas capables de reproduire in vitro les conditions nécessaires à la formation d’un testicule. En effet, les techniques de culture cellulaire ne permettent pas d'appréhender le développement dynamique du testicule, qui nécessite vascularisation, contexte tridimensionnel et interactions entre les cellules. Par conséquent, l'emploi d’un modèle animal comme la souris récapitulant toutes les étapes complexes de ce processus de développement, est indispensable. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.
Réduction
La stratégie des accouplements fait en sorte que des contrôles, des mutants simples et des mutants doubles sont obtenus dans les mêmes portées. Relever les jours d’accouplement permet d’anticiper la date de mise à mort des femelles gestantes et de prévoir les dissections des fœtus. Utiliser à la fois les fœtus mâles et les fœtus femelles est impossible, puisque nous étudions le testicule. Les nombres de fœtus requis sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de qualité des résultats obtenus et à la robustesse de leur validité statistique. Dès que le nombre de fœtus requis pour un stade donné est atteint, les prélèvements à ce stade donné sont arrêtés. De plus, dans la mesure où chaque stade est planifié l’un après l’autre, du plus précode (14.5 jours post-fécondation) au plus tardif (18.5 jours post-fécondation), si l’analyse d’un stade révèle qu’il n’est pas nécessaire d’étudier le stade suivant, alors le projet est arrêté.
Raffinement
Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau. La qualité de la contention permet de limiter le stress imposé à l’animal par la procédure. Le personnel est formé à cet effet. Les solutions sont amenées à la température ambiante pour limiter l’inconfort de la femelle. Le bien-être des animaux est surveillé tous les jours et toute altération du comportement (souffrance, angoisse) est immédiatement discutée avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour prendre les mesures correctives nécessaires (soins, euthanasie, le cas échéant). Les animaux seront hébergés par deux ou par trois dans des cages comportant différents types d’enrichissement tels qu’un tunnel de transfert et des fibres pour la construction d’un nid afin de leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.
Choix des espèces
De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques et physiologiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal du testicule est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Nous utilisons une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée. Tous les modèles génétiquement modifiés permettant d’étudier la fonction des gènes d'intérêt dans le testicule fœtal des souris sont déjà à notre disposition. Les femelles gestantes reçoivent la subtance permettant de mesurer la proliferation des cellules 2 heures avant leur euthanasie. Elles sont euthanasiées à différents moments du dernier tiers de la gestation, de sorte que la période de développement du testicule fœtal qui nous intéresse soit couverte: de 14.5 jours post-fécondation (période de différenciation des cellules somatique terminée et démarrage de l’entrée en quiescence des cellules germinales), à 18.5 jours post-fécondation (architecture du testicule et quiescence des cellules germinales établies).
Caractérisation, diagnostique, et traitement des atteintes auditives centrales dans les formes génétiques de surdité
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Exposées à des sons assez forts pour déclencher une crise d'épilepsie réflexe, immobilisées par une pièce fixée chirurgicalement sur le crâne pour enregistrer leur activité cérébrale tous les deux jours pendant huit semaines, 15 385 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées, une partie par perfusion intracardiaque, et au moins 675 d'entre elles reçoivent en plus une injection de vecteur thérapeutique dans la cochlée. Le projet porte sur les atteintes auditives du cerveau associées aux formes génétiques de surdité, dans la perspective d'améliorer les résultats de la thérapie génique et des implants cochléaires. Le porteur écrit qu'aucune nuisance majeure n'est attendue et que la surdité est "largement compensée" chez la souris, tout en décrivant des crises convulsives provoquées, des chirurgies crâniennes et des infections postopératoires traitées aux antibiotiques.
Objectifs
L’étude des atteintes auditives héréditaires a conduit à l'identification de leurs gènes causaux. Les gènes responsables de plus de 140 formes et d'environ 400 formes génétiques de surdité ont déjà été découverts. L'étude de modèles murins de ces formes monogéniques de surdité a permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de l'audition, en particulier ceux impliqués dans le développement et/ou la physiologie de l'organe sensoriel auditif, la cochlée. Parallèlement, l'étude de ces modèles a également permis de déchiffrer les mécanismes physiopathologiques à l'origine des atteintes auditives. Ceci a conduit plusieurs laboratoires à s'intéresser au potentiel de la thérapie génique pour guérir ces formes de surdité. Des preuves de concept ont été obtenues pour le traitement de plusieurs formes de surdité chez la souris, ouvrant la voie à des essais cliniques de thérapie génique cochléaire chez des patients. Néanmoins, la surdité périphérique peut également être associée à des dysfonctionnements auditifs centraux et peut s'étendre bien au-delà du système auditif lui-même, à la suite d'altérations des entrées sensorielles ou de l'implication des gènes responsables de la surdité dans le développement et/ou le fonctionnement des circuits auditifs centraux. L'étude de la diversité, des causes et des mécanismes sous-jacents de ces dysfonctionnements centraux, de la manière dont ils pourraient entraver les avantages escomptés de la restauration de l'audition par la thérapie génique périphérique, et la détermination de la manière dont ces problèmes pourraient être résolus sont devenus un domaine de recherche à part entière. L’objectif du projet est de caractériser les deux grands types de troubles centraux auditifs, i) ceux induits indirectement des suites d’une surdité périphérique, et ii) ceux qui ont pour origine un rôle intrinsèque de gène dans le développement et/ou le fonctionnement des voies auditives centrales. Afin de déchiffrer les mécanismes physiopathologiques induisant ces atteintes auditives centrales, nous caractériserons sur les plans histologiques, transcriptomiques, fonctionnels et comportemental deux grandes classes de modèles de souris mutantes, une première avec des modèles présentant des troubles auditifs périphériques et une seconde avec des modèles pour des gènes de surdité particulier qui induisent une hyperexcitabilité auditive chez l’animal.
Bénéfices attendus
En caractérisant les atteintes auditives centrales directes et indirectes dans les formes génétiques de surdité, notre projet permettra les avancées suivantes : -Nous déterminerons les conséquences vasculaires et neuronales des pertes auditives dans les formes génétiques de surdité. Ce travail contribuera au déchiffrage des mécanismes pathologiques impliqués dans le lien entre perte auditive et risque ultérieur de développer une maladie neurodégénérative. Enfin, notre projet testera la réversibilité de ces déficits vasculaires et neuronaux suite à une récupération auditive. Ce travail sera essentiel pour montrer de quelle façon la pose d’aides auditives est bénéfique afin protéger le système auditif central des patients. - La qualité de la récupération auditive suite à la pose d’un implant cochléaire est variable d’un patient à l’autre. Certains facteurs comme l’âge d’apparition de la surdité et sa durée sont connus pour influer sur le résultat. Cependant, les potentiels troubles centraux auditifs liés à des rôles multiples des gènes de surdité dans la cochlée et le cerveau sont pour le moment mal compris. Notre travail permettra tout d’abord d’identifier les formes génétiques de surdité pour lesquelles il existe des déficits centraux intrinsèques masqués par le déficit périphérique. Puis, il permettra d’étudier les conséquences de ces déficits, de développer de nouveaux outils de diagnostiques et enfin le développement éventuel de thérapies réparatrices ou compensatrices.
Procédures
Les interventions seront: - Une biopsie sera effectuée sur tous les animaux du projet afin de les marquer et de les génotyper. - L’hyperexcitabilité auditive sera testée par des expositions sonores pouvant générer un début de crise audiogène, i.e. une crise d’épilepsie réflexe (réversible) en réponse à un son fort, ou en effectuant des tests de sursaut. Cette procédure impliquera des tests d’une durée d’1h tous les deux jours sur 1 à 3 mois. - L’hyperexcitabilité auditive sera testée par la susceptibilité aux crises audiogènes (2 min de test), puis les tissus seront fixés par perfusion intracardiaque. - L’hyperexcitabilité auditive sera testée au cours du développement par la susceptibilité aux crises audiogènes (2 min de test), puis l’activité du cerveau auditif sera testée en réponse à des sons sur des animaux profondément anesthésiés. Les enregistrements durent 4 à 8h. -Des animaux auront une chirurgie afin de fixer une pièce de maintien sur leur tête en vue de les immobiliser lors des enregistrements ultérieurs de l’activité intracérébrale sur animal éveillé. Ces enregistrements intracérébraux auront lieu tous les 2 jours pendant 2 à 8 semaines sur 870 animaux. A noter qu’une partie de ces animaux aura en plus une injection de vecteur thérapeutique intracochléaire afin de restaurer l’audition. -Nous effectuerons un suivi audiologique de modèles de souris pour des atteintes auditives du cerveau impliquant parfois des anesthésies légères pour immobiliser l’animal. Ces tests dureront environ 2h et seront répétés tous les 2 semaines pendant 6 à 9 mois de vie de l’animal. Enfin, les tissus seront fixés par perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde. A noter qu’une partie de ces animaux (270 souris) aura en plus une injection de vecteur thérapeutique intracochléaire afin de restaurer l’audition. -Nous effectuerons un suivi comportemental de modèles de souris pour des atteintes auditives du cerveau. Ces tests perceptifs auditifs seront effectués dans une chambre opérante connectée à la cage de vie des animaux. L’expérience dure 4 à 6 semaines. A noter qu’une partie de ces animaux (405 souris) aura en plus une injection de vecteur thérapeutique intracochléaire afin de restaurer l’audition.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures impliquent des expérimentations légères ou une succession d’expérimentations légères. On ne s’attend donc pas à des nuisances majeures ou effets indésirables sur les animaux. Les modèles de souris que nous utilisons ont des modifications génétiques entraînant des surdités périphériques associées parfois à des atteintes auditives centrales. La souris reposant principalement sur l’olfaction, son système somatosensoriel et dans une moindre mesure sur son système visuel lors des interactions sociales, ces atteintes auditives sont largement compensées et n’entrainent pas de phénotype dommageable. Quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : -Certaines expositions sonores à forte intensité mais de courte durée pourraient induire un stress temporaire sur l’animal. C’est pourquoi les différentes mesures utilisant ces tests sont espacées dans le temps. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. -En ce qui concerne les chirurgies classées modérées visant à injecter un gène médicament ou à enregistrer l’activité cérébrale, les animaux bénéficient de traitements antalgiques et antidouleurs adaptés afin de limiter les effets indésirables. Les animaux récupèrent de ces chirurgies généralement en quelques jours. Parfois, ces chirurgies sont susceptibles d’entrainer des infections. Dans ce cas, ces animaux suivent un traitement antibiotique adapté
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés empêchant tout replacement ou adoption. Par ailleurs, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations de physiologie, de transcriptomique ou d’histologie. Les autres procédures impliquent des interventions comme des injections de produits ou des entraînements comportementaux auditifs ou des chirurgies. On ne peut donc pas considérer ces animaux comme naïfs expérimentalement. De plus, la plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant leur réutilisation, par exemple par d’autres équipes, encore plus difficile. Leur réutilisation pourrait donc mettre en péril les conclusions des nouvelles expériences car trop de paramètres ne pourraient pas être contrôlés. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles. Ces partages se font typiquement à l’échelle de l’Institut au-delà de notre équipe de recherche.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative que ce soit des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.
Réduction
Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 20%. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Nous utilisons des tests statistqiues classiques pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et nous nous concentrerons sur le nombre limité d’animaux en fonction de la capacité des dispositifs expérimentaux et de l’application des mesures sur le même animal le cas échéant.
Raffinement
Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (observation du poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Plusieurs méthodes de raffinement sont utilisées dans nos projets. Nous avons par exemple veillé à ce que nos tests comportementaux ne reposent pas sur des motivations par des déprivations de nourriture ou d’eau. Lors des chirurgies, des antalgiques et des couvertures chauffantes sont utilisées afin de limiter au strict minimum le risque d’hypothermie et de stress physique. Nous utilisons également des enrichissements de cage par défaut et renforcés après certaines procédures, comme par exemple après les chirurgies. Notre projet comporte plusieurs procédures chirurgicales toutes effectuées sous anesthésie. Un suivi régulier des animaux inclus dans le projet selon leur état général de santé est prévu. Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux lors des procédures douloureuses (chirurgie), une analgésie sera administrée en combinaison avec l'anesthésie. Une surveillance postopératoire avec administration d'analgésiques sera assurée pour garantir le confort total de l'animal. Le Dietgel et l'amélioration de la température des cages seront fournis pour certains protocoles. Des points limites précoces spécifiques sont définis pour les différentes étapes de chaque procédure afin d'éviter toute douleur et tout inconfort inutiles.
Choix des espèces
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. Le projet impliquera des animaux de stades très différents. En effet, la plupart des molécules que nous étudions sont directement impliquées dans le développement du système auditif central (à partir du jour embryonnaire 9). Nous étudierons leur rôle au cours du développement mais aussi les conséquences de leur absence plus tard pendant le développement et la maturation du système auditif. L’étude utilisera donc des animaux âgés de 9 jours embryonnaires à l’âge adulte (15 mois maximum).
Effet du stress prénatal sur le développement et la fonction des mécanorécepteurs à bas seuil d’activation
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
222 souris gestantes sont immobilisées sous une lumière vive, trois fois par jour, trente minutes par séance, six jours de suite. 4 002 souris vont être utilisées, 2 304 dans des procédures menées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 1 698 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec prélèvement de fœtus à E15 et E18,5 puis mise à mort des souriceaux à plusieurs âges. La plupart des souris de la première génération sont tuées pour prélever les organes, les géniteurs non stressés étant proposés à d'autres équipes puis tués si personne ne les reprend, le tout pour mesurer l'effet du stress maternel sur les neurones du toucher affectif. 1 008 souris passent des tests d'anxiété, d'état dépressif et de sensibilité mécanique qualifiés de non invasifs, sans qu'aucun soit nommé, celui de l'état dépressif durant trois heures.
Objectifs
Le toucher est un sens qui comprend non seulement la perception tactile de son environnement, mais également une composante émotionnelle et motivationnelle appelée toucher affectif. Cette composante est notamment très importante pour le développement social des individus. Dans la peau, cette composante émotionnelle de l'information tactile est dépendante de l'activation d'une population de neurones sensitifs spécialisée appelée les fibres C mécanoréceptrices à bas seuil d'activation ou C-LTMRs. Chez l'homme une altération de ce toucher affectif peut aboutir à des comportement d'isolement social (trouble du spectre autistique) associés à des états anxieux et/ou dépressifs. Il a été montré chez la souris que l'activation spécifiques des C-LTMRs est suffisante pour engendrer une augmentation des interactions sociales. Le développement des C-LTMRs intervient chez la souris entre le jour embryonnaire E13, où les précurseurs neuronaux commencent à se différencier, pour se poursuivre jusqu'à plusieurs jours après la naissance. La période prénatale est une période critique durant laquelle tous les systèmes physiologiques, y compris le système nerveux, développent leurs fonctions spécifiques et apprennent à s'adapter aux éventuels stimuli déclencheurs. Nous avons récemment mis en évidence chez la souris qu’un stress prénatal (c'est à dire subit par la mère durant la gestation) entraine à la fois une hypersensibilité mécanique, mais aussi une modification transcriptomique profonde dans les neurones sensitifs, notamment de gènes spécifiques des C-LTMRs. Nous émettons donc l'hypothèse que le stress prénatal pourrait induire une perturbation du développement des cLTMRs chez la descendance, et donc perturber le sens du toucher et donc le développement des interactions sociales chez les souris nées de mères stressées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de possiblement mettre en évidence l'effet du stress prénatal sur la susceptibilité des individus à développer des troubles du comportement anxieux/dépressif, ainsi que des troubles du comportement social. Il explorera également pour la première fois les mécanismes biologiques sous-jacents, en se concentrant sur le développement des neurones sensoriels périphériques, notamment les c-LTMRs. Il apportera donc des informations cruciales sur les effets du stress subit par la mère durant sa grossesse sur le développement des organes sensoriels de l'enfant, et sur le remodelage des comportements qui pourraient en découler.
Procédures
Procédure 1 : Modèle de stress prénatal Les souris seront mises en stress de contention sous une lumière vive, 3 fois par jour, 30 minutes par session, sur 6 jours consécutifs (222 animaux) . Procédure 2, 5 et 6 : Les animaux subiront des tests comportementaux (1008 animaux) non invasifs visant à évaluer l'état d'anxiété (durée des tests, 10 minutes et 30 minutes), l'état dépressif (durée du test, 3h) , et la sensibilité mécanique (stimulation de 1s maximum). Procédure 5 : les nouveaux nés seront injectés sous anesthésie par le froid et par voie intrapéritonéale (durée de l'injection, 3 secondes maximum) . A l’âge adulte ils seront injectés par voie intrapéritonéale (576 animaux). Procédure 6 : Les souris seront injectées en intra-péritonéal (durée de l'injection, 2 secondes maximum) avant chaque session de stress, voire trois fois par jour, sur 6 jours consécutifs (36 animaux)
Impact sur les animaux
Dans le projet proposé, les souris subiront des tests pas ou peu invasifs. Bien que nous n’ayons pas observé de nuisance qui perturberaient le comportement soit de la mère stressée, soit de la descendance dans les expériences que nous avons déjà fait en accord avec le protocole éthique précédent utilisant ce modèle, les souris seront accompagnées et suivies et observées régulièrement (au moins une fois par jour), pour détecter la présence de comportements anormaux (prostration, isolement, absence de nettoyage). L'injection de l'inhibiteur de corticosterone sera également contrôlée (fréquence, dose, etc.) d’autant que la corticostérone joue un rôle clé durant la gestation. Nous utiliserons des doses déjà validées dans la littérature et suivront attentivement l'état des souris et souriceaux.
Devenir
La plupart des animaux de la 1ère génération (F1) sera euthanasiée à l'issu des procédures, pour récupérer les organes d'intérêt. Les souris mâles, et femelles non stressées ayant servi de géniteurs seront proposés à la communauté, et euthanasié si non utilisés.
Remplacement
Ce projet vise à identifier les mécanismes biologiques induits par l'exposition au stress durant la gestation. Il n'existe à ce jour aucun modèle cellulaire qui peut remplacer l'usage d'animaux pour investiguer cette thématique. La substitution par l'humain n'est pas évidente, étant donné d’une part que le niveau de stress est relatif à chaque personne (ce qui sera source de variabilité pour notre étude), et l'accès à des neurones sensoriels de foetus ou de mamans durant la gestation n'est pas possible. Le modèle murin est donc un élément clé et incontournable pour étudier l'effet du stress prénatal sur le développement des neurones sensoriels et sur les comportements associés.
Réduction
L'expérience du porteur du projet dans le modèle de stress prénatal (protocoles éthiques obtenus précédemment) et la présence de data préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 12 mères par groupe, par génotype, réparties entre contrôle et stress. Ce nombre pourra éventuellement varier à la hausse ou à la baisse (+/- 3 animaux par groupe) en fonction des résultats expérimentaux obtenus avec chaque génotype analysé pour chacun des modèles étudiés. Ces femelles seront accouplées avec 8 mâles aux génotypes correspondants, pour un rapport 2 mâles / 3 femelles . Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et de l'expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées, . L’utilisation de vecteur viraux pour permettre l’expression de gènes d’intérêt dans les souris permettra également d’éviter le recours à des lignées de souris transgéniques supplémentaires.
Raffinement
Jusqu'à présent, le taux de mortalité lors des expériences proposées n'atteint pas les 0.1%. Lors de la mise en place des procédures expérimentales, l’état clinique des animaux sera monitoré tous les jours. Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, les souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Lors du suivi quotidien des souris, nous analyserons les paramètres suivants : poids, température, signes extérieurs de stress tels qu’un comportement anormal (mouvement stéréotypés, isolement du groupe), la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Nous examinerons également la présence de problèmes visibles (plaies cutanées étendues, dents longues, prolapsus anal). Si nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine, ou bien un comportement apathique, des plaies trop importantes ou la présence de dents longues ou de prolapsus, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines, surtout l'inflammation de la peau (taux de similarité important). En effet, l’élevage de souris est très productif et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués transgéniques, qui dans notre cas, permettront l'étude du rôle des C-LTMRS et l'effet du stress sur ces cellules. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sont déjà disponibles dans le laboratoire. L'utilisation de méthodes alternatives (ex. avoir recours à des biopsies humaines, etc. sera d'un grand intérêt mais cependant limite le projet, étant donné que les niveaux de stress sont relatifs à la personne en question, ce qui apportera une variabilité dans nos analyses. Trois stades/périodes de développement seront d'intêret durant notre projet: Jour embryonnaire (E) 13 à E18 : Cette période de gestation sera la période durant laquelle les sessions de stress seront conduites. Cette période correspond également à la période de développement des neurones Jour embryonnaire E15, E18,5: Les souris gestantes seront euthanasiées et les foetus prélevés, euthanasiés et analysés pour nos études, pour évaluer l’impact du stress sur la différenciation neuronale in utero. Jour post-natal P0, P5, P21 et P56 : Les souriceaux ou souris adultes de premieère génération seront euthanasiées à ces différents temps pour étudier l’impact du stress sur la maturation des neurones cLTMRs innervant la peau qui se déroule durant cette periode (P0 à P21) puis à l’age de jeune adulte (P56) .
Analyse des interactions entre cellules cancéreuses et les neurones dans un modèle d’épilepsie tumorale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des femelles gestantes subissent une chirurgie de quarante-cinq minutes pour que leurs embryons, à 14,5 jours de développement, reçoivent une injection puis une électroporation destinées à faire naître une tumeur cérébrale. 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 128 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 16 un niveau modéré. Les souriceaux sont tués à cinq ou vingt jours de vie pour analyser les propriétés électriques de leurs tumeurs et comprendre comment les connexions entre neurones et cellules cancéreuses provoquent l'épilepsie. Le porteur affirme qu'aucun symptôme n'est attendu, les signes cliniques apparaissant après la date prévue de prélèvement, et ne justifie pas l'effectif, se bornant à indiquer que "les effectifs seront déterminés" avec des tests statistiques adaptés.
Objectifs
Le cerveau est composé de differents types de cellules et la mise en place de connexions entre elles au cours du développement embryonaire est indispensable à son bon fonctionnement. L’altération de ces connexions est à l’origine de l‘épilepsie dans des pathologies cancéreuses. L’objectif de se projet est de comprendre comment les tumeurs se dévellopent et comment les connexions entre neurones et cellules cancéreuses induisent de l’epilepsie.
Bénéfices attendus
Le but de cette étude est d’identifier de nouvelles options thérapeutiques pour les patients atteints de certaines tumeurs cérébrales et souffrant d'épilepsie. Ce type d’épilepsie est souvent reistant aux traitements existants. Donc, la découverte de nouveaux mécanismes dans ces tumeurs peut fournir de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Chirugie avec analgésie et anesthésie – 45 min, une fois. Injection sous-cutanées, 30 sec, cinq fois. Inj intra-cerebrale, 5 sec, une fois.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut être source de douleur et de stress. Dans le modèle de tumeur cérébrale, les symptômes apparaissent après le délai fixé pour le prélèvement des tissus, de sorte qu'aucun symptôme n'est attendu.
Devenir
Tous les animaux seront utilisés pour le prélèvement d'organes et l'analyse phénotypique.
Remplacement
Cette étude nécessite l'utilisation de différents types de cellules au cours d'une période embryonnaire spécifique, ce qui ne peut être fait qu'avec des animaux.
Réduction
Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés
Raffinement
Nous veillerons en continu au bien-être des animaux par l’utilisation d’analgésiques et d’anesthésiques lors de la procédure opératoire et par un enrichissement de leur environnement dans les cages d’hébergement.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le fonctionnement des circuits neuronaux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. Des femelles adultes gestantes âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées pour l'électroporation d'embryons. Les embryons sont électroporés à E14.5 et seront utilisés pour le prélèvement de tissus à l'âge postnatal 5 ou 20 afin d'étudier les caractéristiques électrophysiologiques des néoplasmes à deux stades du développement tumoral.
Etude de l’impact de mutations Nr2f1 sur le développement du cerveau et des yeux chez des modèles de souris du syndrome d’atrophie optique
- Recherche fondamentale
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- Oncologie
- Système nerveux
Les femelles gestantes porteuses d'embryons mutés sur leurs deux copies du gène Nr2f1 sont tuées avant la mise bas, faute de savoir, pour deux des trois lignées, si les souriceaux survivraient. 2 214 souris vont être utilisées, 600 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 1 554 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 60 un niveau léger. Il s'agit de comprendre comment des mutations du gène NR2F1 perturbent le développement du cerveau et des yeux dans le syndrome d'atrophie optique de Bosch-Boonstra-Schaaf, en injectant des traceurs fluorescents dans le cerveau ou dans l'œil des animaux, puis en les tuant dix jours après pour analyser leurs tissus. 60 souris sont transférées vers d'autres procédures, les autres tuées pour prélever cerveau, œil et gonades.
Objectifs
Le syndrome d’atrophie optique de Bosch-Boonstra-Schaaf (BBSOAS) est une maladie génétique qui touche le développement du cerveau et des yeux. Les personnes atteintes de ce syndrome rencontrent des problèmes de vue ainsi que des difficultés d'apprentissage, parfois associées à un retard cognitif. Cette maladie est causée par des variations dans un gène spécifique appelé NR2F1. Ces variations, appelées mutations, perturbent le fonctionnement normal du gène et peuvent entraîner des anomalies dans le développement du système nerveux central. Pour mieux comprendre comment ces mutations génétiques conduisent à la maladie, nous utilisons des modèles de souris génétiquement modifiées. Ces souris possèdent des mutations similaires à celles observées chez les patients atteints de BBSOAS. En étudiant ces modèles animaux, nous pourrons observer les effets des mutations sur le développement du cerveau et des yeux. Les objectifs principaux de ce projet sont de : 1. Identifier comment chaque mutation du gène NR2F1 contribue aux défauts observés dans le développement du système nerveux central. Certaines mutations pourraient affecter certaines parties du cerveau plus que d'autres, ce qui pourrait expliquer les variations de symptômes observées chez les patients. 2. Déterminer quelles cellules du système nerveux central sont impactées par les différentes mutations. Comprendre quelles régions du cerveau sont affectées et quelles cellules sont impliquées peut aider à mieux cibler les recherches sur de nouveaux traitements. 3. Comprendre comment ces mutations altèrent les mécanismes du développement du système nerveux central. Comprendre ces mécanismes peut fournir des informations cruciales sur les processus biologiques perturbés dans la maladie et aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. En comprenant mieux les mécanismes sous-jacents à la maladie et en identifiant les cellules et les processus biologiques impliqués, nous espérons ouvrir la voie à de nouveaux traitements et thérapies pour améliorer la prise en charge des personnes atteintes de BBSOAS.
Bénéfices attendus
De précédentes études ont déjà révélées des similitudes entre un modèle de souris et les jeunes patients atteints du BBSOAS, notamment une atrophie du nerf optique, des problèmes de myélinisation (l'enveloppe protectrice des nerfs) et des défauts dans la prolifération et la différenciation de certains types de cellules du cerveau. Pour approfondir notre compréhension de cette maladie, nous utilisons plusieurs modèles de souris ayant différentes mutations du gène NR2F1, similaires à celles observées chez les patients. Ces mutations ont été choisies pour représenter la diversité des altérations génétiques observées chez les patients. En étudiant ces modèles, nous pourrons examiner les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les symptômes spécifiques liés à chaque mutation. À moyen terme, cette approche devrait nous permettre de mieux anticiper les symptômes chez les jeunes patients en fonction de leur mutation génétique, ce qui pourrait améliorer leur prise en charge précoce. À long terme, nous espérons identifier des cibles thérapeutiques pour contrer les effets néfastes des mutations sur le développement du cerveau et des yeux, afin d'améliorer les soins et le bien-être des jeunes patients.
Procédures
Afin de suivre le comportement des cellules dans le cerveau et les yeux à différents stades de développement post natal, nous injecterons des traceurs fluorescent dans le cerveau ou les yeux des animaux. Ces interventions ne dépasseront pas 15 minutes et seront réalisées sous anesthésie générale. Après la chirurgie, les animaux recevront une injection sous cutanée d’antalgique et d’antibiotique répétée toutes les 24h sur 3 jours. Chaque animal ne subira qu’une seule injection et sera sacrifié 10 jours après pour analyser ses tissus. Pour suivre la prolifération cellulaire nous injecterons des nucléotides modifiés à différents stades de développement. L’injection unique, réalisée sur animal vigile sous contention, durera moins d’une minute. Si aucun signe de douleur ou d’inconfort n’est constaté dans les 15 minutes post injection, les animaux seront euthanasiés entre 2 et 24h après l’injection pour analyser leurs tissus.
Impact sur les animaux
Pour ce projet, nous utiliserons 3 lignées de souris transgéniques portant des mutations du gène Nr2f1, similaires à celles trouvées chez les patients atteints du syndrome d’atrophie optique. Pour la première lignée, dont la mutation entraîne la perte d’expression de Nr2f1, l'absence de phénotype dommageable chez les souris porteuses de cette mutation sur une seule des deux copies du gène (souris hétérozygotes) a été montré par de précédentes études. Pour les deux autres lignées étudiées, l'absence de phénotype dommageable chez les souris hétérozygotes est attestée par ceux ayant généré ces lignées. Nous savons, pour la première lignée, que l’absence totale de Nr2f1 (mutation présente sur les deux copies du gène) entraîne la mort des souris dans les 7 premiers jours de vie, mais aucune information n'est disponible pour les deux autres mutations étudiées. Par mesure de précaution, nous ne ferons naitre aucune souris portant des mutations sur les 2 copies du gène Nr2f1 et les femelles gestantes susceptibles d’avoir de tels embryons seront prélevées avant la mise bas. Ces trois lignées pourront être croisées avec une lignée rapportrice, dont l'expression du marqueur GFP n'affecte pas le phénotype des animaux. Les animaux pourront être impliqués dans diverses procédures nécessitant des injections ou interventions chirurgicales. Pour les animaux subissant une stéréotaxie, une douleur ou un inconfort au niveau de l’incision de la peau du crane peut persister après la chirurgie jusqu'à la cicatrisation complète. Dans le cas de l'injection intravitréale, l'utilisation d'une aiguille fine et de volumes de liquide très faibles minimise le risque de lésions ou de pression intraoculaire gênantes. De plus, les traceurs injectés ne devraient pas la physiologie de l'œil ou du cerveau. L'injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur aiguë transitoire due à la piqûre, mais cette sensation disparaît rapidement. Pour les femelles gestantes, une attention particulière sera accordée à la surveillance post-injection, car leur état peut entraîner une douleur accrue, des saignements ou des contractions. Par mesure de sécurité, aucune injection ne sera administrée à des femelles ayant dépassé 16 jours de gestation.
Devenir
A la fin des procédures procédures tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir récupérer leur tissus (cerveau, oeil, gonades) et les analyser pour notre étude.
Remplacement
Afin de limiter autant que possible les expériences sur animaux vivants, nous utilisons, en parallèles des lignées de souris, des cultures cellulaires in vitro. Cependant, la détermination du programme de chaque cellule ne dépend pas seulement des facteurs génétiques. Les cellules communiquent entre elles et s’adaptent à leur environnement. Par conséquent, les facteurs spatiaux et temporels jouent un rôle crucial dans le bon développement du système nerveux central et sont impossibles à reproduire de manière identique in vitro. C’est pourquoi le recours à un modèle animal reste indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques qui mènent aux symptômes observés chez les patients. Les modèles animaux nous permettent de prendre pleinement en compte la complexité des interactions cellulaires et des influences environnementales dans le développement et la progression des maladies neurologiques, ce qui est essentiel pour notre compréhension globale de ces troubles et pour le développement de traitements efficaces.
Réduction
Nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés, indépendamment de leur sexe, réduisant ainsi le nombre total d'animaux produits. Pour optimiser au mieux l’utilisation de chaque animal, nous prélèverons systématiquement plusieurs organes (cerveau, yeux, gonades), et nous effectuerons une analyse complète des échantillons. Les protocoles utilisés ont été soigneusement choisis afin de réduire au maximum le nombre et l’ampleur des interventions pratiquées sur les animaux sans en compromettre l’efficacité.
Raffinement
Toutes nos interventions seront réalisées par des utilisateurs compétents et formés, réduisant ainsi le temps de manipulation et le stress pour les animaux. Les chirurgies seront effectuées sous anesthésie générale administrée par injection intrapéritonéale d'un mélange permettant à la fois une anesthésie générale, un bon relâchement musculaire et une couverture analgésique générale jusqu'à 24h après l'injection grâce à une combinaison d’un analgésique et d’un anti-inflammatoire. Pour les animaux maintenus en vie pendant et après la chirurgie, un protocole supplémentaire de prise en charge de la douleur sera mis en place. Ainsi, une anesthésie locale au niveau du site de la chirurgie sera administrée par une injection sous-cutanée pour les chirurgies crâniennes ou par l'application de collyre pour les injections dans les yeux. De plus, pour prévenir les infections post-opératoires, les animaux recevront un traitement antibiotique juste après la chirurgie. Ce traitement sera adapté à la nature spécifique de la chirurgie effectuée. Pour ce faire, une injection sous-cutanée de gentamicine ou l'application de crème ophtalmique antibiotique seront utilisées. Ces médicaments ont été choisis pour leur efficacité dans la prévention des infections et leur compatibilité avec les procédures chirurgicales réalisées. Enfin, un suivi quotidien des animaux en procédure sera assuré pour détecter tout signe de douleur avec une mise en place de points limites impliquant un arrêt immédiat de la procédure si la douleur ou l'inconfort détecté ne peut être soulagé dans les 24h.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris en raison de sa grande similarité génétique avec l'homme, ce qui en fait un modèle précieux pour étudier les gènes impliqués dans le développement du système nerveux central. De plus, les mécanismes neurodéveloppementaux que nous souhaitons étudier sont identiques chez la souris et l’homme et il existe déjà des lignées de souris transgéniques portant des mutations du gène Nr2f1 retrouvées chez les patients atteints du syndrome d’atrophie optique qui sont d’excellents modèles pour étudier cette maladie génétique. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment différentes mutations du gène Nr2f1 affectent le développement du cerveau et des yeux. Ces mutations peuvent entraîner des dysfonctionnements dans le développement de ces organes, conduisant aux symptômes observés chez les patients. Dans ce but, nous analyserons différents stades de développement embryonnaires et postnataux chez des modèles de souris de cette maladie. Nous commencerons notre étude à 10,5 jours embryonnaires où, chez la souris, les bases du cortex cérébral et des yeux sont établies. Puis nous progressons à travers plusieurs autres stades embryonnaires (12.5 ; 14.5 ; 16.5 et 18 jours embryonnaire) où les structures cérébrales et oculaires continuent à se former et à se différencier. Chez les souris, tout comme chez les humains, le système nerveux central continue à se développer et à mûrir après la naissance, notamment par la myélinisation des fibres nerveuses. Pour cette raison, nous étudierons également plusieurs stades postnataux, jusqu'à ce que le processus de myélinisation soit complet. L’expression de Nr2f1 étant maintenue à l’âge adulte, nous analyserons aussi des souris adultes pour voir l’impact des mutations étudiées sur un système nerveux central pleinement mature.
Edition du genome de poisson zebre par CRISPR-Cas9 en vue de creation de lignees
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Le génome de ces poissons est modifié par CRISPR-Cas9 pour livrer des lignées stabilisées à des laboratoires privés ou publics, clients de la prestation, qui réaliseront ensuite leurs propres expériences. 6 500 poissons zèbres sont utilisés dans des procédures déclarées légères et sévères, ceux qui portent le génotype recherché étant gardés comme géniteurs, les autres tués. Chacun subit une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, et le porteur reconnaît que les modifications génétiques apportées peuvent être physiquement dommageables, occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Il décrit une espèce dont les femelles pondent jusqu'à 200 œufs par semaine et qui atteint l'âge adulte en trois mois, l'élevage d'un grand nombre d'individus étant "aisé".
Objectifs
Ce projet a pour but de créer des lignées génétiquement modifiées par la technique CRISPR-Cas9 sur le modèle poisson-zèbre pour des laboratoires privés ou publics dans le cadre de prestations. Les lignées stabilisées seront alors délivrées à l’organisme demandeur pour réaliser ses expériences. Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. En 3 mois il atteint l’âge adulte et est capable de se reproduire. Les femelles peuvent pondre jusqu’à 200 œufs par ponte et ce chaque semaine. Son développement externe permet la micro-injection et donc facilite les procédures d’édition du génome.
Bénéfices attendus
Notre unité d’appui et de recherche a pour mission de fournir de nouvelles lignées de poissons zèbres à la communauté de chercheurs utilisant les modèles poissons zèbres. Les lignées ainsi produites permettront de mieux comprendre la fonction des gènes invalidés (knock-out) ou modifiés (mutations ponctuelles) ou insérés (knock-in).
Procédures
Biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie, de maximum 3 mm², 1 fois par animal. Temps de la biopsie (anesthésie incluse) : environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les modifications génétiques apportées peuvent potentiellement être physiquement dommageables pour le poisson, lui occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Le génotypage, qui s’opère par une biopsie de la nageoire caudale, est réalisé rapidement sous anesthésie en balnéation (pas d’injection traumatisante). Le prélèvement n’impacte que temporairement voire pas du tout l’animal grâce à la régénération totale du membre en quelques jours. Parmi les effets indésirables potentiels nous pouvons donc lister : comportement d'aversion pour l'anesthésique, douleur suite à la biopsie si le geste est mal effectué, comportements de stress (tels que la désorientation) suite au réveil ou à la manipulation à l'épuisette.
Devenir
Les animaux présentant le génotype d’intérêt seront gardés en vie et utilisés comme géniteurs. Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt seront euthanasiés.
Remplacement
Notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre pour étudier des phénotypes complexes par exemple des modifications du comportement ou des modifications à l’échelle d’organes entiers, l’espèce animale utilisée ne peut donc être remplacée par des expériences sur cellules ou organoïdes.
Réduction
Une attention particulière sera portée à la gestion du cheptel, notamment via un suivi informatisé, afin de ne produire que le nombre d’individus nécessaires à la création de lignée. Un bon suivi des lignées permet par exemple d’éviter de produire davantage d’individus alors que des juvéniles sont déjà prêts à être utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera particulièrement observé. Si les animaux montrent des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Comme le poisson zèbre est une espèce grégaire, il est donc placé en groupe dans les aquariums d'élevage. Pendant le moment où les individus sont isolés (génotypage) les aquariums sont enrichis avec des structures ou objets (algues synthétiques, tuyaux de PVC) permettant aux individus de s’isoler temporairement si nécessaire ou de pallier un manque de compagnie (statut temporaire, généralement durant un séquençage pour identification génétique ou lors d’un isolement dû à une lésion observée sur un animal et qui requiert une convalescence). Deux ou trois congénères au phénotype différent visible (long fin ou nacre) seront également ajoutés à l’aquarium afin de limiter l’isolement pendant la période d’isolement qui n'excède pas deux semaines. Les paramètres de la qualité de l‘eau seront surveillés, ainsi que le bien-être et la santé des poissons. Pour cela nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, modification de la pigmentation. Si des signes de douleur sont observés suite à la biopsie, une administration par balnéation de lidocaïne (analgésique) à 2 mg/L sera effectuée.
Choix des espèces
Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. Il permet l’obtention non invasive et indolore de plusieurs centaines d'œufs par ponte nécessaires à la mutagénèse. L’élevage d’un nombre important d'individus est aisé et la caractérisation génétique est peu traumatique. La création de lignée nécessite d’utiliser des animaux en âge de se reproduire, dans notre cas le poisson zèbre atteint ce stade à 3 mois. Ils seront utilisés pour générer une lignée mutante stable afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses expériences sur le modèle. Pour le génotypage, les biopsies des nageoires sont effectuées sur des individus entre un mois et trois mois.
Analyse de la dynamique cellulaire chez l’amphibien Xenopus Laevis
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Injectées d'hormone dans les sacs lymphatiques la veille de la ponte, les femelles xénopes sont laissées au repos cinq mois avant d'être stimulées de nouveau. Les mâles, eux, sont tués pour prélever leurs testicules et féconder les œufs hors du corps. Sur 170 xénopes utilisés dans des procédures déclarées de souffrance légère, 70 sont réutilisés et 100 tués, pour étudier des enzymes impliquées dans la migration cellulaire, le porteur décrivant une espèce qui fournit "beaucoup de matériel d'étude" avec peu d'animaux mis à mort. Il ne mentionne comme effet indésirable que des nausées et des vomissements en cas de dose hormonale trop forte, et affirme que la stimulation de la ponte ne met pas en danger le bien-être des femelles.
Objectifs
La migration cellulaire est essentielle à de nombreux phénomènes physiologiques tels que le fonctionnement normal du système immunitaire, la cicatrisation des plaies ou encore le développement embryonnaire. De plus, la migration cellulaire est impliquée dans des processus pathologique comme la dissémination des cellules cancéreuses (métastases). Le projet vise à mieux comprendre comment les cellules adaptent des capacités migratoires et comment cette migration est ensuite régulée via des interactions entre cellules ou via des informations présentes dans l’environnement des cellules. Le projet porte particulièrement sur le rôle d’enzymes de la famille des métalloprotéases matricielles (MMPs). Ces enzymes sont exprimées et sécrétées par de nombreux types cellulaires au cours du développement et chez l’adulte. Elles sont principalement connues pour permettre aux cellules de modifier la matrice extracellulaire et faciliter ainsi la migration et l’invasion. Toutefois, ces enzymes sont aussi détectées à l’intérieur des cellules. Elles ont de nombreux substrats non-matriciels. Enfin, elles présentent des fonctions indépendantes de leurs capacités enzymatiques. Ces fonctions annexes restent peu ou pas caractérisées. Le projet a pour objectif de mieux définir ces fonctions non-canoniques des MMPs et de valider leurs importances physiologiques de façon expérimentale in vivo dans un modèle amphibien, le Xénope.
Bénéfices attendus
A court termes, le projet permet d’obtenir des informations cruciales sur le mode de fonctionnement des MMPs in vivo et leurs rôles sur l’initiation et le contrôle de la migration cellulaire. Ce projet a déjà donné lieu à plusieurs productions scientifiques dans lesquelles nous avons démontré des rôles précoces des MMPs en amont de l’acquisition du phénotype migratoire notamment via la régulation de la polarité cellulaire et/ou le contrôle de l’expression de gènes régulant la transition épithélium-mésenchyme. A long terme, les informations recueillies sur le rôle des MMPs chez l’embryon permettra d’affiner les analyses d’échantillon pathologique (biopsie de tumeur) et contribuera à la mise au point de protocole permettant de moduler leurs activités dans le cadre des pathologies (cancers, fibroses).
Procédures
Stimulation des femelles : La ponte des femelles d'amphibien doit être stimulée par injection d'hormone. Une injection au niveau des sacs lymphatiques est pratiquée la veille du jour de ponte. Cette procédure est suivie d'une période de repose de 5 mois (20 semaines) à l'issu de laquelle les femelles peuvent être à nouveau stimulées. Stimulation des mâles : Les mâles d'amphibien sont injectés au niveau des sacs lymphatiques. Les mâles ainsi injectés sont fertiles pendant quatre semaines. Les testicules sont prélevés chirurgicalement.
Impact sur les animaux
La stimulation de la ponte par injection hormonale peut entraîner des nausées et vomissements si la dose est trop forte et si les animaux injectés sont nourris le jour de l'injection.
Devenir
Le prélèvement des testicules requiert l’euthanasie préalable. La stimulation de la ponte ne met pas en danger le bien-être des femelles, elles sont donc gardées en vie le plus longtemps possible.
Remplacement
Le contrôle de la migration cellulaire est impliqué dans de nombreux phénomènes physiologiques (immunité, cicatrisation) et des pathologies comme le cancer et les inflammations chroniques. Nos objectifs scientifiques (analyse de la migration des cellules) et nos stratégies expérimentales nécessitent de travailler sur des cellules animales dans des systèmes qui permettent des manipulations in vivo et in vitro. Le choix est fait d'utiliser un animal modèle (Amphibien/Xénope) qui fournit beaucoup de matériel d'étude (oeufs fécondés) avec un nombre limité d'animaux mis à mort comparativement aux modèles mammifères
Réduction
Les embryons de Xénopes sont obtenus par fécondation in vitro à partir de testicules prélevés sur des mâles mis à mort. Les testicules sont conservés en milieu de culture, au froid, pendant deux semaines ce qui permet de féconder les pontes de 4 à 8 femelles. Afin de réduire le nombre d’animaux mis à mort, nos études sont complétées par l'utilisation de lignées cellulaires de souris et d'embryons précoces de poulet qui ne nécessitent aucuns animaux mis à mort. A activité scientifique constante, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés de 40% par rapport aux projets de recherche précédents.
Raffinement
Afin de réduire la manipulation des animaux nous avons modifié le protocole de stimulation des femelles par rapport aux projets de recherche précédents. Elle s’effectue désormais en une seule injection la veille de la ponte au lieu de deux injections à 5 jours d’intervalle. Par ailleurs, avant injection les femelles sont pesées afin d’ajuster au mieux la dose d’hormone nécessaire. Cette pesée permet également un suivant sanitaire. Enfin, pour éviter les risques de nausées et de vomissements les animaux sont mis à jeûn le jour de l'injection.
Choix des espèces
Le choix du Xénope est justifié de par la possibilité d'obtenir un grand nombre d'ovocytes (1000 oeufs pondus par femelle) sans mettre à mort les femelles, par opposition à la souris notamment. Par ailleurs, nous avons choisi comme population cellulaire modèle les cellules de la crête neurale. Ces cellules utilisent un programme de développement qui est ensuite réutilisé de façon opportuniste lors des cancers. Ceci en fait un modèle extrêmement pertinent du point de vue physiologique. Cependant, cette population de cellules n'existe que chez les vertébrés ce qui exclut un remplacement du Xénope par un organisme "inférieur" comme la drosophile. Les femelles et mâles sont achetés et utilisées à maturité sexuelle. Ensuite à partir des oeufs fécondés obtenus, nous travaillons uniquement sur des embryons entre les stades 2 cellules et 3 jours de développement (avant acquisition de l'autonomie).
Evolution de nos protocoles de transfert d’embryons et d’insémination de sperme par voie chirurgicale afin de raffiner la prise en charge de la douleur
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Rats : 28
Pour valider un protocole antidouleur que le service pourra ensuite appliquer en routine à ses chirurgies de transfert d'embryons, 20 souris et 28 rats vont être utilisés, 20 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 28 un niveau léger. Les rates reçoivent quatre injections, une pour synchroniser leur cycle, une d'analgésique, une d'anesthésique et une dernière pendant leur sommeil. La moitié des femelles subit en plus une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes, l'autre moitié seulement l'anesthésie, puis toutes mettent bas et leurs petits sont comptés avant que mères et portées ne soient tuées, faute de pouvoir être réutilisées dans les activités de service de l'établissement. Le porteur écrit aussi que toute femelle chez qui une douleur ou un inconfort serait détecté sera mise à mort, dans un projet dont l'objet déclaré est la prise en charge de la douleur.
Objectifs
L'objectif du projet est de valider une nouvelle prise en charge de la douleur (administration de médicaments anti-douleur et anti-inflammatoire) lors de nos chirurgies de transfert d'embryons et d'insémination de sperme afin de raffiner nos procédures actuelles. L'utilisation de ces molécules et dans cette chronologie définie autour de la chirurgie doit être validée comme n'ayant aucun effet nocif sur la gestation et la mise bas afin de la passer en routine chez nous.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont d'améliorer la prise en charge de la douleur liée à la chirurgie de transfert d'embryons ou d'insémination de sperme sur nos rongeurs (rats et souris) et donc raffiner nos techniques. Le bien-être animal est une préoccupation majeure au sein de nos activités. Un animal qui ne souffre pas à des rendements plus fiables et plus reproductifs, ce qui impacterai également le R de Réduction. Donc sur ce projet on envisage d'impacter favorablement les R de raffiner et réduire.
Procédures
Les rates recevront une injection, sous simple contention rapide de 5 secondes, afin de synchroniser leur cycle pour devenir mères ou mères porteuses. 4 jours plus tard, les animaux recevrons une injection d'antidouleur sous simple contention rapide de 5 secondes, puis 40 minutes plus tard, ils seront anesthésiés par une autre injection, là encore sous simple contention rapide de 5 secondes. Une fois endormis, la moitié des animaux prévus vont passer en petite chirugie de transfert d'embryons sous anesthésie, alors que l'autre groupe, sera simplement anesthésié, sans aucune procédure invasive supplémentaire. La chirurgie dure environ 5 minutes. Juste après la chirugie, pendant que les animaux dorment encore, afin de limiter le stress, elles recevront un réhydratant et un anti-infammatoire en injectable. Ainsi, une rate recevra un total de 3 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie et 4 injections au total. Pour la souris, elle recevra 2 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie au total.
Impact sur les animaux
Le geste technique d'injection sous contention est un acte qui peu être un peu stressant pour l'animal, mais il ne dure que quelques secondes (environ 5 secondes) et est peu douloureux. Les animaux restent sous surveillance après leurs diverses injections, afin d’observer aucune apparence physique externe de souffrance. Les points de surveillance sont les suivants : rougeur, gonflement, traces de griffures si l’animal se gratte au niveau du site d'injection. Les animaux opérés (acte chirurgical) restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme, dans leur cage placée sur une platine chauffante. Les points de surveillance post-opératoire sont : l’apparence de l’animal, son comportement (prostré….), l’aspect du site de chirurgie (rongeur, gonflement, écoulement, automutilation….)
Devenir
Les femelles gestantes doivent mettre bas et nous devons comptabiliser le nombre de petits pour l'analyse de notre projet. Elles seront ensuite mises à mort, puisque nous ne pouvons pas réutiliser ces femelles dans le cadre de nos activités de service. Il en est de même pour les portées.
Remplacement
Pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour l'analyse de l'effet des molécules antalgiques et anti-inflammatoires sur le bon déroulement de la gestation in vivo et la mise bas afin de raffiner nos protocoles chirurgicaux de transfert d'embryons et d'insémination de sperme.
Réduction
Notre activité est connue et il existe bon nombre de données témoins, ainsi, nous avons juste besoin de faire des groupes expérimentaux. Un bonne analyse bibliographique a été faite pour ajuster au mieux le protocole antalgique choisi avec le vétérinaire. Le projet se fera en 2 parties. La première partie (groupe 1) consiste uniquement à valider le fait que les molécules et doses choisies n'altèrent pas le bon déroulement des gestations et mises bas, sur les femelles gestantes mais qui n'ont pas subies de chirurgie. Seulement si cette étape est validée, nous passerons à la phase 2 (groupe 2, avec chirugie de transfert d'embryons). Nous avons choisi un effectif de 10 femelles pour chaque groupe et pour chaque espèce afin d'obtenir des résultats de comparaison fiables.
Raffinement
Du gel oculaire est placé systématiquement sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée de l’animal. De plus, les animaux anesthésiés sont placés sur une plaque chauffante pour pallier à toute déperdition de chaleur liée à l’anesthésie. Les animaux opérés restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme, dans leur cage placée sur une platine chauffante à 37°C. Les animaux sont hébergés en cages ventilées dans des conditions adéquates pour l'espèce. Des enrichissements (nids et quelques croquettes dans le fond de la cage pour les souris et nids + bois et balles à ronger + croquettes dans le fond de la cage pour les rats) sont mis à disposition dans la cage des futures mères lors de leur convalescence et gestation. Comme il s'agit ici d'un test, si une douleur ou un inconfort est détéctée, la femelle sera mise à mort pour lui éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les rongeurs sont de petits mammifères à reproduction rapide qui sont très largement utilisés par la communauté scientifique. Ils sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Nous voulons des mère porteuses, il nous faut donc des femelles en âge de procréer donc entre 10 semaines et 6 mois (pour les 2 espèces).
Etude du rôle de l’acide rétinoïque dans la différenciation des cellules germinales chez le foetus
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Gavées deux fois par voie orale sous contention de moins de trente secondes, des souris femelles gestantes sont ensuite tuées pour que leurs fœtus soient prélevés, puis tués à leur tour. 440 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur conclut que la mise à mort des femelles gestantes et de leurs fœtus fait qu'ils ne souffrent pas. Il ajoute qu'aucun ne peut être gardé en vie, réutilisé, adopté ni replacé, les testicules des fœtus mâles étant l'objet même de l'étude, consacrée au rôle de la vitamine A dans leur formation.
Objectifs
La vitamine A est essentielle au développement embryonnaire de tous les mammifères mais son rôle reste à définir dans les différents tissus. Pour agir pendant le développement embryonnaire, la vitamine A est transformée par des enzymes en un métabolite actif qui se fixe ensuite sur des récepteurs nucléaires qui relayent son effet biologique. Les cellules dans lesquelles la vitamine A ne doit pas agir fabriquent d’autres enzymes qui dégradent ce même métabolite. Afin d’étudier et de comprendre le rôle de la vitamine A dans la différenciation des cellules constitutives du testicule chez la souris, nous proposons de comparer des fœtus normaux à des fœtus porteurs de mutations dans les gènes codant les enzymes qui transforment et qui dégradent la vitamine A, ainsi que dans les gènes codant les récepteurs nucléaires, aux étapes clés de la formation du testicule (entre les jours 14.5 et 18.5 post-fécondation).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre l’action de la vitamine A et de ses récepteurs nucléaires dans les différentes étapes de différenciation des cellules constitutives de testicule. En découvrant comment la vitamine A agit sur ces évènements chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour mieux diagnostiquer (et éventuellement traiter) des pathologies du testicule ou des cas d'infertilité chez l’Homme, qui sont en augmentation constante dans le monde. Comprendre le rôle de la vitamine A dans le testicule au cours du développement peut également fournir des pistes pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux, à condition de bien caractériser et comprendre au préalable tous les mécanismes mis en jeu dans un modèle expérimental comme la souris.
Procédures
Les souris femelles gestantes sont traitées par gavage oral pour permettre la mutation (recombinaison). Il s’agit de deux contentions simples qui durent moins de 30 secondes chacune. Les souris sont ensuite euthanasiées. Après prélèvement (quelques secondes), les fœtus sont euthanasiés.
Impact sur les animaux
La nuisance subie par les femelles gestantes est limitée à la contention et l’administration de substance par gavage. Le gavage oral est utilisé en routine au laboratoire et nous possédons l’expertise requise pour cette expérimentation. Les doses de solution de gavage sont déterminées pour n’induire aucun effet indésirable lié directement à l’ingestion. Immédiatement après le gavage, tout signe de fausse route (par exemple suffocation) sera suivi de la mise à mort immédiate de l'animal. A ce jour, nous n'avons jamais rencontré ce problème. Dans le cadre de ce projet, les femelles gestantes et les foetus sont euthanasiées, de sorte que les femelles gestantes et les foetus ne souffrent pas.
Devenir
Tous les animaux décrits dans ce projet (femelles gestantes et fœtus) sont euthanasiés. Les femelles gestantes sont euthanasiées pour permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées, adoptées ou replacées. Les fœtus sont euthanasiés pour les analyses moléculaires ou sur coupes histologiques. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés, adoptés ou replacés.
Remplacement
Le testicule est formé de diverses cellules qui ont toutes un rôle essentiel pour la différenciation des cellules germinales. A l’heure actuelle, nous ne sommes pas capables de reproduire in vitro les conditions nécessaires à la formation d’un testicule. En effet, les techniques de culture cellulaire ou d’organoïdes ne permettent pas d'appréhender le développement dynamique du testicule, qui nécessite vascularisation, contexte tridimensionnel et interactions endocrines/paracrines. Par conséquent, l'emploi d’un modèle animal comme la souris récapitulant toutes les étapes complexes de ce processus de développement, est indispensable. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.
Réduction
La stratégie des accouplements fait en sorte que parmi des fœtus obtenus, une moitié possède le génotype contrôle pour les allèles conditionnels et l’autre moitié possède le génotype mutant pour les allèles conditionnels. Relever les jours d’accouplement permet d’anticiper la date de mise à mort des femelles gestantes et de prévoir les dissections des fœtus. Utiliser à la fois les fœtus mâles et les fœtus femelles est impossible, puisque nous étudions le testicule. Les nombres de fœtus requis sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de qualité des résultats obtenus et à la robustesse de leur validité statistique.
Raffinement
Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux femelles gestantes. La qualité de la contention permet d’assurer un gavage efficace et rapide, limitant le stress et la douleur imposés à l’animal par la procédure. Le personnel est formé à cet effet. Les solutions sont amenées à la température ambiante pour limiter l’inconfort de la femelle. Le bien-être des animaux est surveillé tous les jours et toute altération du comportement (souffrance, angoisse) est immédiatement discutée avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour prendre les mesures correctives nécessaires (soins, analgésie, euthanasie, le cas échéant). Les animaux seront hébergés par quatre dans des cages comportant différents types d’enrichissement tels qu’un tunnel de transfert et suffisamment de fibres pour la construction de nids afin de leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.
Choix des espèces
De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques et physiologiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal du testicule est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Nous utilisons une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée. Tous les modèles génétiquement modifiés permettant d’étudier la fonction des gènes d'intérêt dans le testicule fœtal des souris sont déjà à notre disposition. Les femelles gestantes sont euthanasiées à différents moments du dernier tiers de la gestation, de sorte que la période de développement du testicule fœtal qui nous intéresse soit couverte.
Etude du rôle d’Arhgef18 dans la biologie endothéliale chez la souris_Amendement
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à des âges échelonnés de six jours à treize semaines. Les nouveau-nés reçoivent trois injections en trois jours, les adultes une injection intrapéritonéale par jour cinq jours par semaine pendant deux semaines, puis un prélèvement rétro-orbitaire et des mesures répétées de pression artérielle à la queue. Le porteur rattache ce travail sur une protéine des parois vasculaires à la prise en charge de l'anévrisme intracrânien, responsable selon lui de 36 000 hémorragies par an dans l'Union européenne, bénéfice qu'il situe à long terme. Aucun calcul n'appuie le chiffre de 420 souris, le porteur indiquant seulement que l'expérience de son équipe permettra d'en réduire le nombre.
Objectifs
La physiologie vasculaire est fortement influencée par la circulation sanguine qui génère des contraintes mécaniques variables sur la paroi des vaisseaux. Les artères sont principalement soumises à un fort flux sanguin générant de fortes contraintes de cisaillement sur les cellules endothéliales tapissant l’intérieur des vaisseaux. Ces contraintes participent à la production de facteurs vaso-actifs et à la quiescence des cellules endothéliales. Une modification de ces contraintes ou une perte de sensibilité des cellules endothéliales impactent la fonction de ces dernières. Aujourd’hui il est reconnu que les contraintes de cisaillements participent à certains processus développementaux et leur modification ou mauvaise perception par les cellules endothéliales contribue à de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose ou l’anévrisme intracrânien. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces contribue, à terme, à l’identification de nouveaux axes de recherche pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce au travail réalisé in vitro, nous avons identifié une protéine mécano-sensible, ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions endothéliales : l’adhésion, la prolifération et l’inflammation. Maintenant que nous avons déterminé la pertinence d’ARHGEF18 in vitro, nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Cela nous permettra de valider son impact sur les fonctions identifiées in vitro et d’identifier sa contribution exacte dans la physiologie vasculaire.
Bénéfices attendus
La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie sous-arachnoïdienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Malheureusement, il n'y a que peu de laboratoires travaillant sur la physiopathologie de l'anévrisme intracrânien. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle d’ARHGEF18 dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie, diminuer le risque de rupture et optimiser l'évaluation du risque pronostique pour prévenir les hémorragies aiguës. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Une des perspectives de ce projet est le développement de nouveaux modulateurs pharmacologiques ciblant ARHGEF18 ou les voies de signalisation associées. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.
Procédures
Procédure 1: injection intra-gastrique ou intra-péritonéale chez le nouveau-né: 3 injections sur 3 jours. Chaque injection dure moins d'une minute par animal. Procédure 2: injection intra-péritonéale chez l'adulte: 5 injections/semaine sur 2 semaines (cad 1injection IP/jour/5j/2semaines, à raison d'une minute par injection et par souris). Procédure 3: prélèvement rétro-orbitaire chez l'adulte. Le prélèvement est réalisé une seule fois et ne dure pas plus de 5 minutes. Procédure 4: prise de pression artérielle systolique chez l'adulte (tail cuff). 2 semaines d'acclimatation + 3 mesures définitives. Chaque cycle de mesures dure en moyenne une vintaine de minutes. Procédure 5: 1 injection intrapéritonéale à 6 jours d'âge. L'injection dure moins d'une minute par animal
Impact sur les animaux
Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Nous n'attendons pas, à priori, de nuisances particulières. Toutefois, les risques potentiels sont: Injection de tamoxifen: les injections intrapéritoéales répétées (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. C'est pourquoi une alternance Droite/Gauche est prévue, pour palier à ce problème. Prélèvement rétro-orbital: une douleur post-prélèvement peut survenir, c'est pourquoi un analgésique local à base de lidocaïne est appliqué après le prélèvement.
Devenir
Procédure 1: Lot 0: mis à mort après la fin d'entrainement Lot 1 : jusqu’à 6 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 2 : jusqu’à 14 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 3 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire) Lot 4 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Lot 7 : utilisés pour la procédure 5 pour analyse de la perméabilité vasculaire à 6 jours. Procédure 2: Lot 5 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire). Lot 6 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Procédure 3: Lot 4 et Lot 6 entièrement pour la procédure 4. Procédure 4: Mise à mort des Lots 4 et 6 pour prélèvement d'organes en vue d'analyse histologique.
Remplacement
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites. Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Réduction
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites.
Raffinement
Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Choix des espèces
Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire. Le but de cette saisine est d’établir le rôle d’ARHGEF18 dans le développement vasculaire et son homéostasie. Par conséquent, la recombinaison chez les animaux sera faite à deux stades : post-natal (procédure 1) ou à l’âge adulte (procédure 2). Pour la partie développementale, les animaux seront utilisés à P6 et P14. Pour la partie homéostasie vasculaire qui s’étudie à l’âge adulte, les souris seront utilisées entre 7 et 13 semaines (procédures 3 et 4).
Mise au point d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans des souris immunodéficientes BRGS dans le but d’étudier le développement des lymphocytes B
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Dépourvues de lymphocytes T, de lymphocytes B et de cellules NK par construction génétique, donc incapables de combattre le moindre pathogène, une partie des 540 souris du projet vit en confinement sanitaire strict. Toutes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une irradiation qui détruit leurs cellules souches sanguines, une greffe de cellules par injection dans la queue préalablement chauffée, puis un prélèvement sanguin toutes les quatre semaines, l'irradiation à forte dose pouvant provoquer perte de poids, léthargie et dos courbé faute de reprise de l'hématopoïèse. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever la rate, les ganglions et les autres organes de l'immunité, exploration que le porteur juge "indispensable" pour conclure sur la reconstitution immunitaire.
Objectifs
Le but de ce projet est double. Tout d'abord un objectif fondamental qui sera d'évaluer le rôle de différentes mutations dans le développement et la maturation des lymphocytes B, qui sont les cellules productrices des anticorps. Pour cela, nous allons induire in vitro des mutations précises sur des cellules souches hématopoïétiques murines et injecter ces cellules mutées à des souris receveuses n'ayant plus de cellules souches hématopoïétiques. Les cellules souches hématopoïétiques ayant la capacité de reconstituer tous les composants du système hématopoïétique et immunologique, nous pourrons alors suivre dans les souris l'effet des mutations sur le comportement des lymphocytes B. L'objectif étant de repérer les mutations impliquées dans l'hyperprolifération des lymphocytes B, afin de mieux comprendre les mécanismes ayant lieu dans les lymphomes. Ensuite un objectif plus translationnel avec la mise au point d’une stratégie permettant de faire produire aux lymphocytes B un anticorps choisi, ciblant spécifiquement une protéine exprimée par les cellules tumorales. Ce système permettra alors d’induire une réponse immunitaire spécifique contre les tumeurs. Nous allons donc modifier génétiquement les lymphocytes B ou les cellules souches hématopoïétiques humaines puis injecter ces cellules à des souris immunodéficientes, souris qui ne pourront pas rejeter les cellules humaines. Nous quantifierons alors la production des anticorps dans les souris et implanteront les tumeurs spécifiques des anticorps induits pour évaluer leur capacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Concernant le projet sur les cellules souches hématopoïétiques murines, de nombreux résultats seront attendus sur le rôle des différentes mutations induisant des syndromes lymphoprolifératifs (prolifération excessive des lymphocytes), ceci permettant une meilleure compréhension de la physiologie des lymphomes. Pour le projet sur la production d'anticorps humains, nous testons la faisabilité d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à faire produire par des lymphocytes B des anticorps thérapeutiques. Ce projet pourra ensuite être valorisé et potentiellement ouvrir une autre voie dans les traitements d'immunothérapie.
Procédures
Les cellules souches hématopoïétiques murines mutées seront greffées dans des souris ayant reçues une forte dose d'irradiation, ceci afin d'éliminer toutes les cellules souches hématopoïétiques présentes et permettre uniquement à celles injectées de se développer. Dans le cas de la greffe des cellules humaines, l’irradiation sera plus légère car il faut garder des cellules souches hématopoïétiques murines mais juste faire de la place pour les cellules humaines. La greffe des cellules se fera ensuite par injection intraveineuse dans la veine de la queue. Des prélèvements sanguins itératifs (toutes les 4 semaines) seront ensuite réalisés sur tous les animaux et dans toutes les procédures afin d'évaluer et de suivre la reconstitution immunologique au cours du temps. Enfin des immunisations pourront être appliquées sur les animaux en post-greffe si la reconstitution a été jugé optimale.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont à attendre à la suite d'injection intraveineuse des cellules dans la veine de la queue. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention afin de chauffer leur queue avant l'injection. Un léger inconfort pourra être ressenti à cause de la chaleur et une douleur pourra être ressentie lors de la piqure dans la queue au moment de l'injection. Les souris seront suivies de façon hebdomadaire afin de repérer tout signe indiquant un inconfort ou une douleur. Des nuisances plus importantes viendront de l'irradiation à forte dose. Le développement d'une immunodépression complète induite par l'irradiation à forte dose peut engendrer un affaiblissement notable de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter une potentielle absence de reprise de l'hématopoïèse (qui devrait être obtenues suite à la greffe des cellules souches hématopoïétiques murines) avec l'apparition de signes de l'immunodépression (perte de poids, léthargie, dos courbé...). L'irradiation à faible dose ne provoque en général aucune nuisance.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité, ganglions, rate notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution hématopoïètique et immunologique ainsi que sur développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Le projet est basé sur le pouvoir de reconstitution des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Ces dernières sont en effet capables de se différencier en de nombreux précurseurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse. Ces précurseurs vont ensuite continuer de se différencier soit dans la moelle osseuse soit dans d’autre organes du système immunitaire et ainsi reconstituer un système immunitaire entier et compétent. Il est actuellement possible de différencier des CSH in vitro mais uniquement vers une voie donnée, ce qui permet d’obtenir qu’un type de cellules immunitaires. Aucun modèle ne permet une différenciation complète des CSH. Seul un environnement complet (moelle osseuse, facteurs de croissance, signaux de survie, organes du système immunitaire…) permettra d’obtenir les conditions idéales pour reconstituer un système immunitaire compétent. C’est pourquoi l’utilisation de souris immunodéficientes ou de souris immunocompétentes irradiées à forte dose reste l’unique modèle utilisable aujourd’hui.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes de cellules, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal (notamment vérification in vitro des mutations). Lors de chaque expérimentation, des groupes de 5 souris seront formés afin de comparer les différentes conditions utilisées ou de comparer l'effet des mutations réalisées sur les CSH avant l'injection. Si une différence apparaît mais qu'elle n'est pas significative, l'expérimentation sera répétée afin d'obtenir une significativité.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel. Toutes les procédures ne seront réalisées que par des personnes ayant une excellente maîtrise des gestes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon une surveillance de l’état général des animaux (posture et comportement) par le personnel de l’établissement ou le responsable du projet. De plus, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par le responsable du projet selon les mêmes critères généraux cités précédemment en plus de critères spécifiques: suivi du poids et mesure du score grimace permettant d’évaluer l’état de santé des animaux. Le « score de grimace » correspond a une échelle permettant d’évaluer la douleur chez l’animal, en particulier chez la souris. Si ce score excède 1.5 sur 2, les animaux seront alors euthanasiés. Également si la perte de poids excède 20% du poids de référence alors les animaux seront alors euthanasiés. Si des effets secondaires ou signes d'inconfort non soulagés par l’administration d'analgésiques ainsi que des changements perceptibles (aspect, comportement, poids, isolement dans la cage, déplacements limités) sont observés, les animaux seront alors euthanasiés.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes choisies pour le projet des cellules humaines sont complètement dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK, ce qui permet donc d'éviter le rejet de la xénogreffe de cellules humaines. Ces souris permettent la croissance de nombreuse lignées lymphoïdes humaines et l'utilisation d'effecteurs d'origine humaine. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet de par leur taux élevé́ de prise de xénogreffes. Cependant, l’utilisation d’animaux immunodéprimés exposent au risque de l’expression d’un phénotype dommageable car les souris ne sont plus capables de combattre les pathogènes environnementaux. Ce risque sera parfaitement maîtrisé par la mise en place de précautions sanitaires adaptées. Le maintien de ces souris en hébergement protégé de type A2 permettra de prévenir tout risque d’infection. Les utilisateurs se muniront d'une combinaison recouvrant tout le corps ainsi que d'un masque chirurgical et d'une 2eme pair de gant. Enfin, les souris seront manipulées sous hotte à flux laminaire. L’expérimentation sera commencée chez des animaux de 5 semaines à 3 mois. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 6 mois.
Effet de la qualité de la lumière et de la couleur du bac d’hébergement sur la pigmentation de la seiche
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Élevées sans aucune cachette sous une lumière colorée de 3 000 lux douze heures par jour, 240 jeunes seiches européennes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique qu'il ne peut pas enrichir les bacs, un abri permettant aux animaux d'échapper à la lumière et ruinant du même coup l'expérience. Toutes sont tuées par refroidissement progressif, dix à quinze minutes entre l'anesthésie sous six degrés et la mort sous quatre, pour prélever et fixer leurs tissus. Parmi les bénéfices annoncés, le projet doit "optimiser les conditions d'élevage et d'hébergement" d'une espèce dont le porteur précise que les standards restent en cours d'élaboration.
Objectifs
Parmi les animaux aquatiques, les céphalopodes montrent des capacités de camouflage complexes et uniques. Le camouflage est permis par les motifs colorés qui sont dynamiques et changeants. Les couleurs sont dues aux pigments contenus dans les chromatophores, organes dont l’activité est contrôlée directement par le cerveau, permettant ainsi des modifications rapides des motifs. Notre espèce est la seiche européenne dont le développement et les premiers mois de vie se déroulent en milieu côtier. La pigmentation de la peau par les chromatophores a lieu dès la phase embryonnaire et les motifs se complexifient après éclosion, en lien avec les facteurs environnementaux directs, comme la lumière et le fond sur lequel elles vivent. Ce projet a pour objectif de tester différents facteurs comme l’effet d’un éclairement de “couleur” différente et la couleur du bac sur le niveau de pigmentation des animaux au cours de leur développement après éclosion. Par une expérimentation conduite sur des juvéniles de seiche, nous déterminerons si la “couleur” différente de la lumière d’éclairement et la couleur du bac modifient 1) les régulations moléculaires en lien avec la synthèse des pigments et 2) la couleur générale adaptée au fond et au type de lumière. Ce projet permettra une meilleure connaissance des adaptations et des effets des changements environnementaux sur le cycle de vie de ces animaux marins, il permettra d’élaborer des hypothèses évolutives et fonctionnelles sur l’influence du facteur couleur du bac et couleur de la lumière au cours du développement, chez l’embryon et chez le juvénile après éclosion. Ce projet permettra également d’optimiser les conditions d’élevage et de maintien des juvéniles Des caméras situées au-dessus des bacs permettent d’évaluer l’intensité de pigmentation des juvéniles en expérimentation par acquisitions d’images.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’identifier si la couleur de la lumière et la couleur du bac sont des facteurs importants dans le contrôle de la mise en place de la pigmentation. L’approche par l’expression des gènes permet de tester les régulations moléculaires mises en place par l’animal face à son environnement et de les corréler avec la pigmentation observée (plus ou moins foncée) et son comportement de camouflage. Il a été montré chez des poissons que la “couleur” d’éclairement et la couleur du bac entrainaient des différences de pigmentation. Nous avons observé une pigmentation plus importante des jeunes seiches élevées sur bac de couleur noire et nous souhaitons confirmer ou infirmer cette observation. Tester chez la seiche l’ effet éventuel de la “couleur” de lumière et de la couleur du fond permettrait d’apporter des éléments de réponse à la mise en place et la régulation des motifs colorés, qui conditionnent chez l’adulte la qualité du camouflage. En plus de mieux comprendre les facteurs conditionnant la mise en place des motifs colorés, ce projet permettra d’optimiser les conditions d’élevage et d’hébergement et le bien-être animal de cette espèce pour laquelle les standards d’élevage sont en cours d’élaboration.
Procédures
Les animaux sont soumis à des éclairages différents (photopériode de 12h de lumières et 12h de nuit). Les animaux ne subissent aucune intervention avant leur mise à mort. Lorsqu’ils sont retirés des bacs à l’épuisette, ils sont immédiatement transférés dans un récipient. La mise à mort dérogatoire par le froid amène progressivement les animaux vers une anesthésie (
Impact sur les animaux
Trois prélèvements manuels à l’épuisette d’une durée de 10 à 20 secondes sont prévus par aquarium sur toute la durée de l’expérimentation, ce qui peut occasionner un stress passager. En l’absence de cachettes, on ne peut exclure que l’éclairement appliqué avec une intensité peu élevée d’environ 3000 lux et le type de couleur d’éclairement puissent occasionner une nuisance.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus. Pour étudier l’expression des gènes dans les tissus, il est nécessaire que les organes soient extraits et fixés, ce qui implique la mise à mort des animaux. Il n’est pas possible de prélever une partie de l’animal sans causer des dommages irréversibles (pas de survie après prélèvement des organes/tissus d’intérêt).
Remplacement
Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui cherche à comprendre la mise en place chez la seiche des motifs colorés qui constituent un élément fort du comportement de camouflage. Le développement requiert l’implication des organes du système nerveux (entre autres) qui contrôle ces éléments cutanés. Il s’agit donc d’un projet nécessitant un organisme entier intègre. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle
Réduction
La mise en place de collecteurs (support de ponte artificiel) relevés tous les jours dans le milieu naturel permet de récolter le nombre d’œufs nécessaires pour réaliser cette expérimentation en s’affranchissant de la conservation d’un stock de géniteurs en laboratoire. Il n’y a donc pas de maintenance de géniteurs sauvages. Le nombre de juvéniles est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’éviter de la répéter ultérieurement si les résultats n’étaient pas satisfaisants. Expérimentalement et statistiquement, le nombre de 10 animaux par groupe est un minimum afin de respecter les limites acceptables de la validité scientifique.
Raffinement
Les juvéniles éclosent dans leur aquarium d’origine (où ont été déposés les œufs); ils ne sont donc pas déplacés. Ils sont nourris à satiété avec des crevettes de taille adaptée (petites crevettes et mysis sp.) deux fois par jour (matin et après-midi). L’acquisition de données relatives à la pigmentation des animaux est réalisée sur photos prises par une caméra directement installée au-dessus du bac afin de limiter l’intervention humaine. Les rations sont réévaluées quotidiennement pour adapter la quantité d’aliment distribué à la biomasse de l’aquarium. Il n’est pas possible d’ajouter un enrichissement physique sous la forme de cachettes diverses (pièces en plastique) car cela contrecarrerait les objectifs du projet en permettant aux animaux de ne plus être sous l’influence de la lumière. L’éclairement est appliqué sur une période de 12h ; l’intensité de l’éclairement est d’environ 3000 lux grâce à la mise en place d’un variateur permettant la modulation de l’intensité. La mise en route ou l’arrêt de l’éclairement s’effectue sur une période de 30 min. Le bien être des animaux est évalué quotidiennement par une feuille de suivi permettant de quantifier l’expression de points limites en expérimentation.
Choix des espèces
Les céphalopodes sont les seuls mollusques possédant des capacités cognitives et des comportements élaborés. La seiche européenne pond des œufs sur nos côtes. Contrairement à d’autres espèces de céphalopodes comme les pieuvres, il n'y a pas de larves chez les seiches et les juvéniles se développent en 2 mois maximum ce qui permet de réaliser des observations. Les individus du projet sont des juvéniles après éclosion, pour évaluer la pigmentation et son contrôle nerveux, l’animal étant en lien direct avec les facteurs environnementaux.