Biologie du développement
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
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- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
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- Système urogénital
Rôle du récepteur nucléaire FXR dans l’homéostasie énergétique (glucidique, lipidique et des acides biliaires)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
6 908 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil, les autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des gavages, des injections virales par voies intracrânienne, intranasale et intra-orbitaire, un régime obésogène et des tests de tolérance au glucose, pour étudier un récepteur nucléaire du métabolisme énergétique. Le porteur précise qu'aucun animal n'est réutilisé ni adopté. Il justifie ce volume par l'activité de tout un laboratoire sur cinq ans et affirme le caractère de "stricte nécessité" du recours à l'animal vivant.
Objectifs
L'étude du rôle du récepteur nucléaire FXR dans l'homéostasie énergétique implique l'étude ce récepteur nucléaire au sein de différents organes clé, impliqués dans la régulation de la balance énergétique (système nerveux central, foie, tissu adipeux banc et brun, pancréas et intestin). Ce projet concerne 5 chercheurs. Cette étude sera réalisées grâce à des approches in vivo (modèles murins d'invalidation tissu spécifique de FXR ou activation pharmacologique) et des approches in vitro (culture primaire de neurones, d'astrocytes, d’hépatocytes, de cellules non-parenchymales primaires, de pré-adipocytes ou de fibroblastes embryonnaires).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet cont une meilleure compréhensuin du rôles des recepteurs nuclaires aux acides biliares dans l'homéostasie énergétique mais également dans le contrôle central de cet dernière, avec l'utilisation de modèles intégrés et le souhait d'évaluer la communication interorganes.
Procédures
administration par gavage : 1-3x, moins de 5 minutes injection intracrâniale de virus : 1-2x, moins de 5min, procédure entière moins de 60 min administration intranasale de virus : 4 administrations/narine sur une session, moins de10 min) injection intraveineuse : 1-5x, moins de1 minute injection intrapéritonéale pour anesthésie : 1, moins de1 min injection intrapéritonéale de virus 1-6x, moins de 1 min injection en intra-orbital de virus: 1-2x, moins de 1 minute injection intrapéritonéale des animaux soumis à un régime obésogène (moins de20 semaines): 1-6x, moins de 1 min (glycémie : 1x/mois au maximal ; tolérance au glucose et a l’insuline : moins de 2 minutes ; 8x/session) des prélèvements de sang des animaux soumis à un régime obésogène : au maximum 4 fois, espaces d’au moins 3 semaines.Biopsie de queue: 1x , moins de 5 minutes
Impact sur les animaux
Les nuisances des procédures chirurgicales de classe modérée (procédure 2 et 15 - stéréotaxie) peuvent concerner 1/ la douleur lors du placement de l’animal dans la cadre stéréotaxique ; 2/ l’incision de la peau ; 3/ le conditions de réveil de l’animal. les nuisances énumérées seront minimisées par l’ anesthésie et l’analgésie et le suivi post-opératoire réalisé par du personnel forme au bien-être animal.
Devenir
Nn dehors de la procedure de generation et de genotypage, l'ensemble des animaux sera mis a mort en fonction des objectifs annonces. Aucun animal ne sera réutilisé ni adopté.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie de désordres métaboliques en ciblant les réaux acides bilaires, mettant en jeu une communication inter-organes. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches neurobiologiques et intégrées. Ces évaluations ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux. Le laboratoire est néanmoins conscient de l’aspect nécessaire de recourir à des méthodes alternatives quand cela est possible, ce qui est effectivement fait pour un certain nombre d’études cellulaires et moléculaires ne nécessitant pas de modèles animaux
Réduction
Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de notre laboratoire (16 chercheurs, 8 ITA statutaires, 4 post-docs, 10 étudiants) sur les 5 ans à venir est estimé à 6888. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombre d’animaux, lorsque cela sera possible une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera réalisée. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R à l’aide du site https://eda.nc3rs.org.uk/experimental-design-group.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours, pesés régulièrement, par du personnel spécialement formé. Durant les différents protocoles, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition, par exemple coton pour la confection de nids... Les animaux seront suivis précisément pour chaque protocole, pour lesquels des points limites adaptés ont été définis. Toute souffrance, angoisse ou comportement inhabituel sera pris en charge par des approches appropriées. Les procédures expérimentales de chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale par une combinaison de kétamine et de xylazine par voie intrapéritonéale. En cas de douleur, un analgésique sera administré. Les animaux présentant un des points limites spécifiés pour chaque approche expérimentale seront sacrifiés dans une salle dédiée; le tout en lien avec le responsable du bien être animal.
Choix des espèces
Cette espèce est utilisée parce que les souris peuvent être évaluées par méthodes comportementales et être génétiquement modifiées par injections virales ou transgénèse. La lignée présentant une séquence floxée pour le récepteur nucléaire FXR permet son invalidation conditionnelle. La délétion dans une structure cérébrale précise sera obtenue par injection stéréotaxique ou intra-nasale d'AAV2/9-Cre, la délétion hépatique, intestinale sera obtenue par le croissement des souris FXR-flox avec des souris albumine-cre, des souris dont l'expression de la Cre sera dépendante d'un promoteur spécifique des cellules entéro-endocrines, respectivement. Si un phénotype dommageable apparait au cours des expérimentations, les études seront interrompues. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 2 mois à 12 mois. Etant donné que l'ensemble des procédures réalisées concerne le métabolisme, il est nécessaire d'utiliser des souris adultes (càd 2 mois minimum et en dehors de la courbe de croissance). Par ailleurs, les protocoles ont été validés (publications) au sein du laboratoire sur des souris adultes (de 2 à 12 mois) et ce, en accord avec les 3R.
Etudes structurales et fonctionnelles lors du développement du Xénope
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
6 702 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tués et 680 femelles réutilisées. Les femelles reçoivent des injections d'hormone tous les quatre mois pendant toute leur vie pour produire des ovocytes, tandis que les mâles et les larves sont tués pour prélèvement. Un test de réponse à la lumière évalue la vision des larves. Le porteur présente le xénope comme une "méthode alternative de remplacement" des modèles mammifères.
Objectifs
Ce projet englobe les questions scientifiques de notre institut utilisant le modèle Xénope et qui sont développé avec l'objectif de réduire en les mutualisant les expériences. Les objectifs sont l’étude : a) de la division des cellules de l'épiderme embryonnaire par des approches d’imagerie en temps réel dans des larves aux stades neurula. b) de la cataracte dans la larve de xénope. Le développement du cristallin est aisément observable dans l’embryon de xénope et dépend de l’expression de gènes dont la mutation est à l’origine de cataracte humaine. Les études dans la larve de xenope permettent d’analyser la fonction de ces gènes dans le développement de l’œil in vivo. c) au cours du développement (stades 1 à 45) de l’expression d' ARN circulaires pouvant servir de régulateurs de l'expression des gènes. d) du controle du fuseau de division cellulaire par des approches de microscopie electronique. Le fuseau permet la répartition fidèle du matériel génétique entre deux cellules filles. La taille et la structure du fuseau sont essentielles pour sa fonction. Cependant, malgré des décennies d'étude, on ignore comment le fuseau adopte une morphologie optimisée pour sa fonction.
Bénéfices attendus
Les 4 sujets de recherche développés dans cette demande d’autorisation de projets visent à l’avancée des connaissances scientifiques sur des sujets liés à la Biologie/Santé. En particulier le projet a) vise à préciser le rôle des acteurs de la cytokinese des épithéliums. La majorité des cancers provenant de tissus épithéliaux, la connaissance des mécanismes contrôlant ces divisions participent à la lutte anti-cancéreuse. Le projet b) vise à identifier et caractériser des gènes potentiellement impliqués dans le développement des cataractes et ainsi à ouvrir la voie à l’identification de cibles potentielles pour le traitement ou la prévention de la cataracte. Le sujet c) vise à décrire de nouveaux acteurs des régulations des gènes lors du développement embryonnaire et à analyser les mécanisme contrôlant leur production. Le sujet d) vise à la compréhension des mécanismes de contrôle de l’architecture du fuseau mitotique en tirant profit d’une comparaison inter-espèce.
Procédures
Une solution d'hormone (HCG) est injectée afin d'induire la ponte ou la spermatogenese. Cette opération dure une quinzaine de seconde. Pour les males il s'agit d'une injection unique. Dans le cas des femelles cette procédure est répétée environ tous les 4 mois tout au long de leur vie pour obtenir des ovocytes. Les larves issues de fécondation in vitro sont injectés au stade 1 à 8 cellules (environ 30' à 2h30min après fécondation, à un stade larvaire non autonome). Dans le cadre du sujet cristallin, un test comportemental unique de réponse à la lumière permet d'évaluer la fonction visuelle de chaque larve.
Impact sur les animaux
Les procédures décrites dans cette demande impliquent l'administration d'hormones par injection sous cutanée dans l'animal. Les nuisances associées à ces injections sont a) l'isolement temporaire des animaux et le stress induit par la maniupulation et la contention le temps de l'injection. La procédure s'appliquant aux larves de stades supérieurs à 45 est une procédures d'évaluation de la fonction visuelle par des test comportementaux sans nuisances particulières associé à ce test. Les larves expérimentales ont été microinjectés aux stades 2-8 cellules puis se sont développés jusqu'au stade 48. Les phénotypes attendus sur ces animaux devrait etre associés à la fonction visuelle sans préjudice autre a priori.
Devenir
Xenopus laevis ne peut être adopté puisqu'il s'agit d'une espèce invasive. Les animaux femelles sont en utilisation continue pour la production d'ovocytes (680 animaux) tout au long de cette DAP. La durée de vie de ces animaux étant supérieure à 10 ans, et les procédures étant légères, les animaux sont conservés à l'issue du projet et réutilisés dans le cadre des nouveaux projets. Les males et les larves sont sacrifiés pour prélèvement.
Remplacement
Le modèle xénope permet par sa capacité de ponte élevé l’obtention de nombreuses larves dont le développement est externe. Ceci permet donc l’étude des phénomènes complexes impliqués sont le développement embryonnaire. L’utilisation du modèle xénope dans un contexte d’étude du développement embryonnaire en général est donc en soi une méthode alternative de remplacement de modèles mammifères, murins en particulier. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle de gènes d’intérêt dans l’organogenèse (épithélium, cristallin, embryon entier), ces processus complexes ne peuvent être reproduits en leur globalité en culture cellulaire et nécessite donc l’utilisation de ce modèle animal. L’une des forces de ce modèle est de permettre, en intervenant dans le cadre de procédures sur quelques animaux adultes, d’obtenir en quantité de nombreux stades larvaires permettant l’expérimentation et une bonne puissance statistique des analyses. Par ailleurs, l’utilisation du modèle Xénope nous permet d’obtenir les ovocytes servant à la préparation d’extraits cytoplasmiques capables de reproduire in vitro les évènements du cycle cellulaire associé à la formation du fuseau de division et de les observer par microscopie electronique. La génération in vitro de tels fuseaux ne peut être réalisée qu'avec ces extraits d’ovocytes, de plus ce projet repose sur l'étude comparative entre X. laevis et X. tropicalis. C’est pourquoi aucune autre méthode, y compris les extraits de cellules en culture, ne peut être utilisée comme substitut.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pour les expériences, nous cherchons à mutualiser entre les différents sujets l’utilisation des animaux entrant dans le cadre d’une procédure. 1) Pour cela les larves obtenues lors d’une FIV seront potentiellement utilisées pour tous les sujets. En effet, en microinjectant les larves à différents stades de développement nous pouvons étaler les expériences et ainsi utiliser au mieux les larves produites lors d’une FIV. De ceci découle que le nombre de procédures FIV et le nombre d’utilisations d’animaux adultes sera diminué. 2) Des mâles doivent être mis à mort pour la collecte des testicules nécessaire aux FIV. L’utilisation des testicules issus de ces mâles est mutualisée lors de la réalisation des FIV et les testicules sont conservés au froid pour permettre la réalisation de FIV sur environ 2 semaines. 3) Le travail expérimental utilisant un nombre d’échantillons élevé pour l’analyse statistique est réalisé uniquement sur des stades larvaires. 4) Les femelles Xénopes ont une espérance de vie en captivité de l’ordre de 20 ans. Ces animaux subissant pour toute procédure des injections d’Hormone Chorionique Gonadotrophique (HCG) tous les 4/5 mois sont réutilisés tout au long de leur vie.
Raffinement
Le milieu est enrichi par l'adjonction d'artéfacts permettant aux animaux de se dissimuler, tandis que les aquariums sont partiellement dissimulés par des plaques opaques afin de limiter l’apport de lumière directe dans les aquariums. Les espaces d'élevages sont séparés des espaces de manipulation et à l’écart des bruits et circulations parasites. Les femelles en procédures sont isolées en bacs individuels lors de cette période qui s'étend au maximum sur 48 heures.
Choix des espèces
De par son mode de fécondation externe, il est possible de récupérer les ovocytes de Xénope après une simple stimulation hormonale, sans chirurgie ni mise à mort. Ces ovocytes permettent soit la réalisation d’extraits cytoplasmiques reproduisant le cycle cellulaire, soit, après fécondation in vitro, d’obtenir de nombreuses larves au stade une cellule qui peuvent être microinjecté par des molécules traceurs ou des molécules interférant avec l’expression des gènes afin d’analyser l’impact de certains produits de gènes sur l’expression des gènes, le développement embryonnaire et l’organogenèse, ou la dynamique des divisions cellulaires des épithéliums. Seuls des animaux adultes sexuellement rentrent dans nos procédures expérimentales. Les stades larvaires expérimentaux sont généralement arrêtés avant le stade 45, les larves allant au stade 48 sont utilisés pour un test fonctionnel non invasif. Les larves surnuméraires non expérimentales pourront être utilisées pour générer des animaux adultes.
Caractérisation des atteintes consécutives à un traumatisme crânien chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un impact crânien est infligé à des souriceaux de 17 jours, suivi de l'implantation d'un mini-microscope par une fenêtre crânienne, puis de tests comportementaux (exploration, coordination motrice, sensibilité tactile, état anxieux) et d'imagerie du cerveau. Le porteur qualifie le traumatisme de "léger" et affirme qu'aucun signe de douleur n'apparaît au réveil. Toutes les souris sont tuées pour des analyses en immunohistochimie et par IRM.
Objectifs
Chaque année 1,5 millions d'européens sont victimes d'un traumatisme crânien le plus souvent subit lors d'un accident de la route, d'une chute ou au cours de pratiques sportives. 70 000 personnes perdent la vie des suites du traumatisme et environ 100 000 ne présentent pas de récupération totale et demeurent handicapées, notamment chez les enfants et les jeunes adultes qui représentent une population particulièrement vulnérable en regard de ce type de traumatisme. Bien qu'au cours des dernières années un raffinement des procédures de prise en charge par les urgences et les hôpitaux a permis de réduire la mortalité des traumatisés crâniens, il est apparu qu'un grand nombre de patients souffrent par la suite de désordres chroniques invalidants tels que : épilepsie, dépression, démence progressive, etc. À ce jour, aucun traitement ne permet d'empêcher la mise en place de tels désordres à la suite d'un traumatisme crânien. Le projet que nous avons développé vise à étudier les changements qui se mettent en place à la suite d'un traumatisme crânien (TC) au sein du cerveau et qui contribuent aux atteintes comportementales à long terme. Nous allons nous focaliser dans ce projet sur les atteintes des vaisseaux sanguins ainsi que sur les processus inflammatoires qui se mettent en place après un TC. Le caractère unique de ce projet est assuré par l’utilisation d’une technique innovante permettant d’imager les cerveaux de souris se comportant grâce à un mini-microscope qui sera implanté sur leur tête.
Bénéfices attendus
Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu).
Procédures
1. trauma crânien léger juvénile (TC): 17 jours après leur naissance, les animaux seront anesthésiés pendant 5 min et subiront un impact léger calibré de 200 µs. Animaux contrôles soumis au même geste, sauf impact. Réalisé une seule fois. 2. Implantation des lentilles de miniscope. Réalisé un mois après TC sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Réalisation d’une fenêtre crânienne. Le cas échéant injection stéréotaxique de virus. Insertion et fixation du prisme, scellement de la base d’ancrage. Durée de 1h à 1h30, plus 30 min en cas d’injection virale. Réalisé une seule fois. 3. Tests comportementaux et imagerie calcique sur animal vigile. Tous les 3 mois (2 fois pour la moitié des animaux, 4 fois pour l’autre moitié). A. mise en place du miniscope. Contention à la main et positionnement du miniscope à l’aide d’une plateforme aimantée sur la lentille. B. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration, 3 tests de coordination motrice, 2 tests de sensibilité tactile, et 1 test d’évaluation de l’état anxieux. Tests de 5 minutes réalisés à raison d’1 test/jour. C. Injection intrapéritonéale unique (environ 3 secondes) lors de la dernière session comportementale (6 mois post TC pour la moitié des animaux, 12 mois pour l’autre moitié), une demi-heure avant le test d’évaluation de l’état anxieux.
Impact sur les animaux
Ce projet repose sur l’utilisation d’un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile anesthésié. Une fois réveillé l’animal ne montre aucun signe de douleur et reprend immédiatement un comportement normal. Les conséquences incluent des altérations d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de mobilité, d’anxiété ou de douleur. Il n’y a pas de phénotype dommageable. Nous utiliserons des modèles de souris permettant une exploration longitudinale par imagerie calcique parfaitement décrits qui sont très utilisés dans le domaine et très bien décrits dans la littérature. Aucun phénotype dommageable n’a été décrit. La chirurgie envisagée peut entraîner à faible niveau hypothermie, déshydratation, douleur postopératoire et stress. La pose d’un implant tel que la lentille de miniscope s’accompagne de la possibilité de perte de l’implant. Lors de l’imagerie calcique sur animal vigile couplée au comportement, la pose du miniscope sur la lentille entrainera une contention très courte d’environ 20s. Le poids (< 2g) et le câble reliant le miniscope peuvent occasioner une gêne. Chaque série comportementale peut représenter une source de stress pour les animaux. L’injection IP du composé peut entraîner une douleur ou une gêne locales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de la procédure, soit 224 animaux. Ceci est nécessaire pour les analyses en immunohistochimie et par imagerie IRM qui complèteront et seront essentielles à cette étude.
Remplacement
Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données scientifiques permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.
Réduction
Les procédures expérimentales ont été spécialement conçues pour réduire le nombre d’animaux utilisés par l’obtention d’un suivi longitudinal non invasif. En effet, l’utilisation de l’imagerie in vivo permet d’enregistrer sur un même animal l’évolution de l’unité neurovasculaire au cours du temps, limitant significativement le nombre d’individus nécessaires à cette étude (par exemple, pour 4 temps d’intérêt un seul groupe d’animaux ne sera nécessaire contre 4 groupes avec des techniques classiques). De même cette technique permet de diviser par 2 le nombre d’individus nécessaires pour une approche pharmacologique, les animaux représentant leurs propres contrôles, et augmentant de fait la significativité des résultats. Pour permettre la réalisation des enregistrements d’imagerie, l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype non-dommageable sera privilégié dans la mesure du possible à l’utilisation d’injection virale. Ceci permettra d’augmenter l’efficacité des techniques d’imagerie et donc réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en conservant une puissance statitistique satisfaisante, nous avons réalisé une étude de la robustesse de notre nombre d’animaux pour déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser.
Raffinement
Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme. Il s’appuie sur la mise en place des méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. Pour permettre la réalisation des enregistrements d’imagerie, l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype non-dommageable sera privilégié dans la mesure du possible à l’utilisation d’injection virale. Ceci permettra de réduire le temps de chirugie d’environ 30 min et donc favoriser la récupération post-opératoire des animaux. Le projet sera mis en oeuvre par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le bien-être des animaux sera assuré par des protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. Une fiche de suivi post-opératoire sera mise en place.
Choix des espèces
Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. De plus, le modèle murin permet l’utilisation de souches génétiquement modifiées. Dans ce projet, les traumatismes crâniens seront réalisés sur des souris juvéniles à 17 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un traumatisme crânien en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 12 mois après le traumatisme crânien afin d’évaluer les conséquences à long-terme.
Etude de la fonction des gènes de modification et d’aminoacylation des ARN de transfert (ARNt) dans le développement cortical
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
7 553 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes subissent une laparotomie, leur utérus étant transpercé par un capillaire de verre pour injecter le cerveau de chaque embryon, puis les nouveau-nés sont tués à sept jours pour prélever leur cerveau. L'objet est d'étudier des gènes de modification des ARN de transfert dans le développement du cortex. Le porteur affirme que la complexité du cortex ne peut pas être recréée in vitro et met en avant l'efficacité de la souris, qui porte environ huit embryons par portée.
Objectifs
Le cortex cérébral est la partie superficielle du cerveau qui permet à l’homme d'effectuer des tâches complexes. Il est composé de différents types de cellules cérébrales spécialisées dont les neurones. Au cours du développement du cerveau chez l'embryon, un seul groupe de cellules progénitrices génère tous les types de cellules du cerveau qui doivent se former au bon endroit et au bon moment pour avoir un cerveau fonctionnel. Les processus qui régulent la création des différentes cellules du cortex ne sont pas encore entièrement connus et des perturbations dans ces processus pendant le développement conduisent à des maladies rares appelées troubles du neurodéveloppement. Notre équipe souhaite comprendre les processus qui régulent le développement du cortex cérébral et la production des différents types de cellules du cortex. Parmi les processus impliqués, le décodage de l'information génétique des cellules en une succession d'acides aminés formant les protéines, apparait comme un élément clé et sa molécule adaptatrice responsable du décodage, l’ARN de transfert (ARNt) comme une molécule décisive. Pour être pleinement actifs, les ARNt doivent être modifiés puis chargés avec leurs acides aminés. Ces modifications sont effectuées par des molécules appelées enzymes. A ce jour, 84 gènes de modification et 20 gènes de chargement des ARNt ont été identifiés. L'objectif de ce projet est d’étudier l’implication des enzymes de modification et de chargement des ARNt dans le développement cortical et d’identifier quelles enzymes influencent la génération et la diversité des cellules du cortex. Pour ce faire, nous allons utiliser une nouvelle approche chez la souris qui permet d’inactiver une des enzymes de modification des ARNt dans chaque cellule progénitrice du cortex chez l’embryon au début du développement du cortex et d’analyser les effets 7 jours après la naissance lorsque le développement des neurones est terminé. L’intérêt de cette approche est que nous pourrons tester toutes les enzymes de modification des ARNt en même temps chez un même embryon et observer les effets sur les cellules individuellement. Pour chaque cellule, nous identifierons quelle enzyme de modification a été inactivée et les conséquences sur la cellule. Ainsi, nous pourrons déterminer quelles modifications de l'ARNt sont importantes pour la génération et le développement des cellules du cortex.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux comprendre le rôle des molécules adaptatrices de la traduction, les ARNt, et de leurs modifications et leur chargement dans le développement du cortex cérébral. Il permettra d’identifier les gènes de modification des ARNt importants pour le développement du cortex et dont l’inactivation pourrait conduire à des malformations du cerveau. L’identification des tels gènes permettra de proposer de nouveaux gènes candidats dans la recherche des causes génétiques chez les patients atteints de malformations du développement cortical. Enfin, la compréhension des mécanismes pathologiques responsables peut permettre d’envisager des pistes thérapeutiques.
Procédures
Les femelles gestantes vont subir une injection d’anti-douleur (environ 5 secondes), suivie d’une chirurgie abdominale (consistant en l'ouverture de l'abdomen : laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon pour une durée de 1 à 10 secondes par embryon). La durée totale de la chirurgie n'exèdera pas 45 minutes. Les femelles gestantes seront par la suite placées dans des cages isolées puis avec leur portée jusqu'à la mise à mort des souriceaux. Les embryons au stade embryonnaire E12.5 vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin (entre 1 et 10 secondes).
Impact sur les animaux
La barrière cutanée des femelles gestantes sera rompue en plusieurs endroits (site d'injection dans le dos entre les omoplates avec une aiguille très fine et cicatrice de la laparotomie sur le ventre), il en résulte une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Les femelles seront par la suite placées dans des cages isolées et de ce fait, privées de congénères. L'isolement sera uniquement physique (pas visuel, olfactif et auditif) car les souris verront, sentiront et entendront leurs congénères. Les embryons à 12.5 jours de gestations vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin. Depuis 8 ans que nous effectuons ce type d’injection dans le cerveau au laboratoire, nous n’avons pas observé de phénotypes dommageables chez les souris après la naissance ou à l’âge adulte.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles gestantes sont herbergées jusqu’à la mise à mort des nouveau-nés. Les nouveaux-nés sont herbergés 7 jours, puis mis à mort pour collecter leur cerveau.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les conséquences de l’inactivation de gènes sur le développement embryonnaire du cortex. Le projet vise à utiliser une approche groupée in vivo afin d’analyser les effets de la perturbation des différents gènes de modification et de chargement des ARNt simultanément sur le développement du cortex et sur la quantité et la diversité des neurones générés. Cette approche a déjà été utilisée chez la souris au cours du développement en 2020 par Jin et ses collaborateurs pour évaluer la fonction de 35 gènes candidats de troubles du spectre autistique et de retard du neurodéveloppement et elle a permis d’identifier des types cellulaires et des gènes communément affectés, justifiant la pertinence de cette approche et sa faisabilité dans le modèle murin.
Réduction
Les approches conventionnelles pour étudier les effets de l’inactivation d’une enzyme sur le développement du cerveau requiert de générer une lignée de souris pour chaque enzyme analysée, ce qui demande de produire un grand nombre d’animaux pour chaque enzyme. Nous avons choisi une stratégie qui nous permet d’utiliser une seule lignée de souris pour tester les effets de l’inactivation d’environ 30 enzymes simultanément dans un même embryon et donc de diminuer considérablement le nombre d’animaux manipulés. De plus, nous avons choisi de générer la lignée de souris utilisée sur un fond génétique présentant un faible taux de cannibalisme des nouveau-nés et un nombre important de nouveau-nés par portée permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux manipulés. Nos croisements de souris seront faits de manière à utiliser 100% des embryons générés pour les expériences. Nous avons prévu une phase de formation à l’injection dans le cerveau des embryons à 12.5 jours de gestation de 2 expérimentateurs sous la supervision de l’assistante ingénieure de l’équipe qui a acquis une très bonne maitrise de cette technique chirurgicale au long de ces 8 dernières années. L’objectif de cette formation est d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons afin de limiter le nombre de femelles gestantes manipulées. Pour cela, nous avons également investi dans un système de loupe équipé d’un écran afin de mieux visualiser les embryons et ainsi d’optimiser les conditions d’injections. De plus, nous utiliserons des nouveau-nés d’autres expérimentateurs de l’animalerie pour optimiser la collecte et la préparation des cellules au lieu d’élever des souris supplémentaires. Enfin, nous exploiterons les données publiées et l'analyse de puissance pour déterminer le nombre approprié d'animaux pour notre étude et ses analyses statistiques. Les analyses statistiques sont effectuées par l’analyse différentielle au niveau des cellules individuelles. En optimisant le protocole au mieux de nos capacités, nous serons en mesure d'obtenir des cellules de haute qualité et en quantité suffisante pour chaque animal utilisé, augmentant ainsi la taille de notre échantillon pour les tests statistiques tout en maintenant un nombre d'animaux utilisés à un faible niveau.
Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien-être des animaux utilisés pour ce projet. Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Des nids et des tunnels seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Tout inconfort de la souris détecté durant la gestation ou la mise bas sera traité en fonction des symptômes détectés. Au début de l’expérience, les femelles reçoivent une injection d'un anti-douleur 30 minutes avant l’anesthésie. Durant l’expérimentation, les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse. Leurs yeux sont protégés de la déshydratation par du gel pour les yeux. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes maximum sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’anesthésie gazeuse. Un anti-inflammatoire est injecté à la fin de l’opération afin de prendre le relai de l’analgésie pendant 24h. L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections post-chirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les femelles gestantes sont euthanasiés immédiatement et les embryons sont sortis de leur sac utérin et mis à mort.
Choix des espèces
L'approche utilisée a été mise au point chez la souris et dans le cerveau d'embryons de souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par femelles gestantes rend cette méthode efficace. De plus, la technique utilisée nécessite l’utilisation de souris génétiquement modifiées déjà existantes. Enfin, les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets de l’inactivation des gènes analysés dans le développement cortical.
Création et maintien de lignées de poissons zèbres génétiquement altérées pour l’étude de syndromes neuro-développementaux rares.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
9 550 poissons zèbres vont être utilisés, classés en gravité légère, dans un projet de création et de maintien de lignées génétiquement altérées. Chaque animal subit à quatre mois une amputation d'un morceau de la nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, geste que le porteur présente comme le plus invasif du projet. Les géniteurs et génitrices retenus sont conservés jusqu'à dix-huit mois, tandis que les autres, porteurs de modifications génétiques et jugés non nécessaires, sont mis à mort. Le porteur affirme que seul un organisme vivant complexe permet d'étudier ces syndromes neuro-développementaux et met en avant la transparence des embryons et les pontes nombreuses pour justifier le choix de l'espèce.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de permettre l'étude d’un ensemble de maladies génétiques rares du neuro-développement caractérisés par une microcéphalie et un nanisme. Actuellement, la prise en charge clinique des patients est strictement symptomatique; aucun traitement curatif n’existe à ce jour. Ces syndromes sont dus à des mutations dans un gène spécifique identifié. Le projet de recherche vise à comprendre les mécanismes qui mènent à ces syndromes et pourquoi des mutations distinctes de ce gène conduisent à des pathologies différentes. Afin de mener ces études à bien, le poisson-zèbre a été choisi comme modèle car il permet de reproduire et ainsi de comprendre ces maladies. Le projet proposé ici vise à établir et maintenir des lignées de poissons-zèbre présentant deux mutations emblématiques de ce gène, ainsi qu’une invalidation fonctionnelle totale de ce gène. Ces lignées permettront de mettre en évidence les particularités propres à chaque type de mutation expliquant la variabilité́ des symptômes observés chez les patients, et ce, tout particulièrement sur le développement cérébral.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale permettant de mieux comprendre comment les mutations d'un gène sont impliquées dans la survenue de syndromes présentant des pathologies plus ou moins sévères. A court terme, l’établissement de ces lignées permettra d’établir un modèle de référence de la maladie pour l’étude de ces syndromes. A moyen terme, l’analyse de l’expression des gènes dans les premiers stades de développement du poisson-zèbre aidera à mieux comprendre quels sont les gènes impliqués dans la survenue de retard de croissance et de microcéphalies et de mettre en lumière pourquoi ces symptômes sont plus prégnants pour certaines mutations que pour d’autres. A long terme, ces résultats pourront permettre un éclairage sur les mécanismes cellulaires les plus affectés dans ces syndromes. Ces lignées pourront s’avérer être d’une grande aide dans le test de molécules à visée thérapeutique visant à soulager les patients et à améliorer leur vie.
Procédures
La création de lignées de poissons-zèbre implique de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Aussi, un génotypage des individus s’avère obligatoire. La procédure nécessite le prélèvement d’un morceau de tissu de la nageoire caudale du poisson afin d’en extraire l’ADN. Le choix d’un prélèvement de la nageoire caudale tient au fait que celle-ci se régénère très rapidement. Ce prélèvement sera réalisé une seule fois au cours de la vie de l’animal, à 4 mois. Afin de limiter la douleur liée au prélèvement, celui-ci sera effectué sous anesthésie générale brève de l’animal et à l’aide d’un scalpel dont la lame sera préalablement stérilisée à l’alcool et changée à chaque série de prélèvement. Après le prélèvement, le poisson sera immédiatement transféré dans un bac individuel contenant de l’eau sans anesthésique pour permettre son réveil. Le poisson sera surveillé pendant 10mn pour vérifier son état général. Classiquement, cette technique ne génère pas de mortalité.
Impact sur les animaux
La transmission des syndromes, par le biais de mutations est de type « autosomique récessive » indiquant que les parents sont porteurs sains et asymptomatiques. L’ensemble des progéniteurs de nos lignées seront des poissons porteurs des modifications génétiques, sains et asymptomatiques. De même, il est attendu que la génération de ces lignées poissons-zèbres porteurs des modifications génétiques d’intérêt conduise à des individus sains, libre de se mouvoir et ne présentant aucun signe de mal être. Néanmoins un suivi régulier des poissons-zèbre sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être. Lors de la création de ces lignées, certains poissons zèbres seront amenés à subir un prélèvement d’un morceau de la nageoire caudale afin de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Il s’agit là du geste le plus invasif qu’auront à subir les poissons zèbres dans ce projet.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux d’intérêt (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois. Les autres seront mis à mort afin de ne pas garder d’animaux, non nécessaires à la conduite de ce projet et porteurs de modifications génétiques, qui ne peuvent pas être replacés.
Remplacement
L’étude du développement neuronal à partir de cellules souches issues de patients et d’un modèle animal, le poisson-zèbre, permet de comprendre les mécanismes de ces maladies. Seul un organisme vivant complexe comme l’animal permet de récapituler l’ensemble des phénomènes physiologiques et de les étudier avec pour objectif une possible application à l’Homme. Le poisson zèbre présente de nombreux avantages, notamment la transparence optique des embryons ce qui permet le suivi, en temps réel, du développement embryonnaire et notamment du système nerveux (deux marqueurs majeurs affectés dans les syndromes étudiés). De précédentes études ont déjà démontré la pertinence du poisson-zèbre comme modèle d’étude car la perte temporaire de la fonction du gène d’intérêt provoque chez cet animal un éventail de symptômes/syndromes spécifiques des maladies humaines, dont une microcéphalie. L’apparition de l’ensemble de ces symptômes/syndromes peut être bloqué par la réexpression de la forme « saine » du gène humain chez le poisson mais pas par les formes « malades », qui portent les mutations identifiées chez l’Homme. Pour poursuivre la caractérisation de ces maladies, l’établissement des lignées poisson-zèbre présentant des mutations stables du gène d’intérêt permettra de disposer de modèles physiologiquement pertinents.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre de poissons de la génération F0 à élever jusque l’âge de 4 mois, une estimation préalable de l’efficacité des systèmes de modification génétique sera réalisée en amont sur des œufs de poisson zèbre de type sauvage à 24-48h heures post fécondation. Le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de la nageoire caudale sera limité au maximum, en réalisant des prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres, afin de ne sélectionner que le nombre minimum de poissons zèbres hétérozygotes nécessaires. Dès lors que le nombre de poissons d’intérêt sera atteint, les prélèvements seront interrompus. Pour le maintien des lignées, seuls les poissons zèbres hétérozygotes nécessaires au maintien de chaque lignée seront conservés, ce qui correspond à une vingtaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Dès lors que le nombre d’animaux d’intérêt sera obtenu, les prélèvements de nageoire caudale pour génotypage seront interrompus. Dans le cas de figure où la génération de poissons-zèbre avec une invalidation totale du gène d’intérêt se révélait trop difficile à obtenir, les autres lignées de poissons-zèbre ne seront pas générés.
Raffinement
Seul le strict minimum d’animaux nécessaires à la génération et au maintien des lignées subira le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale. Le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale se fera uniquement sur des animaux anesthésiés et le temps d’isolement des poissons-zèbres pendant cette phase de caractérisation sera limitée au minimum en maintenant les animaux dans des bacs avec des séparateurs transparents afin qu’ils soient au minimum 2 par 2 le temps de la procédure. Les individus d’intérêt seront ensuite regroupés en fonction de leur génotype. Les poissons-zèbres conservés seront tous hétérozygotes et ne présenteront pas de phénotype dommageable (le syndrome étudié étant récessif). Toutefois, une surveillance hebdomadaire pour détecter tout éventuelle anomalie du comportement des animaux sera réalisée. L’observation de blessures sur l’animal ou d’anomalies de comportement (nage anormale, prostration au fond du bac…) conduira à la mise à mort de l’animal afin de limiter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Avec la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec l’Homme, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier des maladies génétiques dans un contexte physiologique et à l'échelle d’un organisme complexe entier. De plus, ce modèle présente de nombreux avantages avec notamment une fertilisation externe et des pontes supérieures à 100 œufs, permettant ainsi de limiter le nombre de génitrices nécessaires au projet et ainsi de les préserver, tout en obtenant une puissance statistique optimale avec peu de croisements. Enfin, la transparence optique des embryons permet le suivi en temps réel du développement embryonnaire et notamment du système nerveux (deux marqueurs majeurs affectés dans le syndrome étudié). Lors de la création des lignées de poissons-zèbres, les animaux subiront un unique prélèvement de nageoire caudale, à l’âge de 4 mois. Ce prélèvement s’effectue à ce stade car les poissons-zèbres sont suffisamment développés et la quantité de tissu prélevé suffisante pour le génotypage. La cicatrisation et la régénération de la nageoire s’opèrent de manière optimale à ce stade de développement. Par la suite, ces mêmes poissons-zèbres seront les géniteurs et génitrices du projet (à partir de l’âge de 5 à 6 mois).
Sauvetage pharmacologique des symptômes sensoriels, émotionnels et cognitifs de rats exposés à la séparation maternelle néonatale
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
864 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 432 dans des procédures classées sévères. Séparés de leur mère dès les premiers jours de vie pour reproduire les effets de la prématurité, ils reçoivent des injections répétées, une chirurgie sous anesthésie profonde et des tests de nociception, d'anxiété et de cognition. Le porteur indique que ce modèle induit anxiété et douleur, et que les mères, rendues anxieuses par la séparation, sont tuées après le sevrage. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne peut restaurer les réseaux neuronaux impliqués et retient le rat comme modèle de la prématurité humaine.
Objectifs
Les données cliniques suggèrent que la prématurité impacte le développement du système nerveux, modifiant plusieurs paramètres neurologiques à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN) chez le rongeur est un modèle de stress reflétant la prématurité humaine et induisant des altérations nociceptives, une anxiété accrue, ainsi que des troubles des comportements sociaux. Ces altérations sont associées aux dysfonctionnements du ocytocinergique (OT), qui joue un rôle dans les réponses au stress et à la douleur. La douleur a déjà été étudiée dans le modèle de SMN au niveau sensoriel et émotionnel, mais les potentielles altérations cognitives de la SMN sont encore méconnues chez l’animal, alors que la cognition est une des composantes principales de la douleur chez l’Homme. Elles ont été examinées dans les structures de l’émotion chez l’Homme. Plusieurs études ont démontré une hausse de molécules pro-inflammatoires dans le cerveau de rats SMN sans ces structures. Dans ce contexte, la première étape du projet vise à préciser le comportement des animaux SMN en étudiant leurs potentielles altérations cognitives à l’âge adulte. Par la suite, le but du projet est aussi d’expliquer ces altérations comportementales : différentes hypothèses cellulaires et moléculaires seront confirmées ou infirmées grâce à l’injection de différentes molécules durant la période de séparation ou à l’âge adulte. Ainsi, le mode d’action moléculaire de l’ocytocine dans le cas de séparation précoce pourra être précisé.
Bénéfices attendus
Le modèle de SMN a permis de décrypter nombre des mécanismes d’altération du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, l’étude permettra de mieux comprendre l’impact d’un stress néonatal non douloureux (i.e. une séparation précoce avec la mère) sur les processus cognitifs à l’âge adulte, ainsi que les mécanismes et structures mises en jeu lors de ce stress. Ce projet vise aussi à caractériser l’action potentiellement bénéfique de l’ocytocine et de molécules du système ocytocinergique sur le phénotype altéré des animaux SMN et donc à envisager l’utilisation de ces molécules en clinique comme moyen thérapeutique. En plus, l’effet de molécules inhibitrices des cellules gliales sera étudié pour comprendre le rôle de la neuroinflammation observée chez les rats séparés. En effet, d’après la littérature, les marqueurs de l'inflammation sont directement associés à des déficits de la fonction cognitive, qui sera aussi étudiée dans notre étude. Comprendre le lien entre les deux pourrait fournir des informations pour prévenir le déclin cognitif après un stress précoce.
Procédures
La moitié des animaux recevra un total de 10 injections (1 injection quotidienne de 10 sec pendant 10 jour). L'autre moitié des animaux recevra un total de 3 injections durant 5 min sous anesthésie générale 2 heures avant chaque test comportemental. Une chirurgie sous anesthésie générale profonde d'une durée de 45 min sera réalisée 1 semaine avant la 1ère injection. Les tests comportementaux pour évaluer la nociception, l'anxiété et la cognition des animaux (5 à 40min/animal) seront réalisés 1 seule fois chacun entre le 30ème et le 60ème jour postnatal, avec un délai de 24h minimum entre chaque test.
Impact sur les animaux
Le modèle de séparation maternelle néonatale chez le rat est un modèle classique de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux. La SMN induit également au niveau comportemental une anxiété accrue chez la mère. Une attention particulière est accordée à la surveillance du site d’injection pour repérer un potentielle infection ou plaie. Cette surveillance est aussi appliquée post-chirurgie, les animaux étant douloureux pendant quelques jours après la chirurgie, et pour repérer une potentielle infection ou inflammation de la plaie, auquel cas des soins seront apportés à l’animal. Un stress mineur sera causé aux animaux lors du maintien de ceux-ci par contention pour les injections ainsi que lors des tests comportementaux.
Devenir
Toutes les mères de cette étude seront mises à mort après sevrage de leurs petits (P21) puisque la SMN leur cause potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. En fin d’expériences, tous les animaux seront également mis à mort après une anesthésie préalable et des prélèvements seront effectués.
Remplacement
Les comportements d’anxiété, la cognition et la douleur étant des processus intégrés, ce projet nécessite l’étude d’un système intégré et mature. De plus, l’étude vise à caractériser les propriétés et le mode d’action de molécules d’intérêt dans notre modèle, et il est donc impossible de se passer de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable de restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans les comportements observés.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux du projet, la solution controle injecté aux animaux sera commune à toutes les molécules utilisées au cours de l’étude. Ce nombre d’animaux a été calculé pour obtenir des résultats fiables et robustes. L’intégralité des animaux de chaque portée sera analysée à chaque fois, permettant également de préciser les différences mâles-femelles si elles sont observées.
Raffinement
A leur arrivée, les femelles gestantes sont laissées 1 semaine dans l'animalerie pour acclimatation. Durant la SMN, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Les animaux sont hébergés en cages collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à disposition de la frisure pour un nid, un bâton à ronger et un tunnel. Les animaux sont suivis quotidiennement afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental. Dans ce cas, des aliments humides seront mis à disposition dans les cages pour faciliter la prise alimentaire. Les chirurgies se feront sous anesthésie avec une analgésie pré- et post-opératoire, et les animaux seront observés quotidiennement en respectant les points limites fixés avant de la chirurgie et en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental de animaux.
Choix des espèces
Le rat est un standart en tant que modèle expérimental pour ce type d’expérience impliquant des processus intégrés. Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de SMN a déjà été bien caractérisé chez cette espèce, permettant de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus, ce modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3ème trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3ème trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3ème trimestre de gestation chez l’Homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie postnatales chez le rat; ainsi, les animaux sont utilisés à partir du 2ème jour post-natal.
Mécanismes de transport de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) à travers les barrières du système nerveux central – applications thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 418 dans des procédures classées sévères et 254 opérées sous anesthésie sans réveil. Elles reçoivent des injections de protéines puis un accident vasculaire cérébral provoqué par injection de thrombine dans une artère cérébrale, suivi d'IRM et de tests de récupération fonctionnelle non précisés, avant prélèvement du cerveau. Le porteur indique que ces procédures peuvent provoquer perte de poids, douleurs post-opératoires et déficits fonctionnels, les souris perdant plus de 15 % de leur poids étant mises à mort. Il affirme que les méthodes sans animaux n'apporteraient pas le même niveau d'information et retient la souris comme modèle d'AVC.
Objectifs
Le système nerveux central (SNC) compte plusieurs barrières qui ont pour rôle le maintien de l’homéostasie cérébrale, notamment en régulant le transport de molécules entrant ou sortant du SNC, ce qui peut constituer un obstacle à l’administration d’agents thérapeutiques. L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une protéase clé du système fibrinolytique sanguin. Par ses propriétés, le tPA est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques Les expériences menées in vitro et in vivo suggèrent que le tPA vasculaire peut traverser les barrières du SNC et se retrouver dans le compartiment cérébral par un mécanisme actif spécifique d’un récepteur et que ce transport implique une seule partie du tPA (appelée « domaine Finger »). L’objectif de cette étude est de mieux comprendre les mécanismes de transport du tPA à travers les barrières du SNC par des approches in vivo sur des souris et de convertir ces découvertes en approches thérapeutiques pour vectoriser le passage d’agents thérapeutiques connus, incapables d’atteindre leur cible par injection intraveineuse. Ces outils seront testés dans un modèle d’AVC ischémique (développé au laboratoire) réalisé sur des souris, afin de proposer une stratégie thérapeutique pour améliorer la prise en charge des patients victimes d’AVC.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées pour permettre le passage de molécules thérapeutiques du compartiment sanguin au compartiment cérébral. Une meilleure compréhension des interactions sang/cerveau permettra d’une part, à évaluer le potentiel thérapeutique de différentes molécules, et d’autre part, une amélioration de la prise en charge des patients victimes d’un AVC ischémique.
Procédures
1 : Injection intraveineuse de protéines à travers les barrières du système nerveux central (SNC) (20 minutes). Prélèvement liquide cerebro-spinal (LCS), du sang, et du cerveau 10, 30 ou 60 minutes après injection des protéines (20 minutes) 2 : Injection intra-carotidienne de protéines à travers les barrières du SNC (10 minutes). Prélèvement LCS, sang, et cerveau 5 minutes après injection des protéines (20 minutes). 3 : a. Evaluation du potentiel thérapeutique des protéines après un modèle d’accident vasculaire (AVC) sans rtPA (traitement médicamenteux pour un AVC ischémique) Jour 0 (J0) : Induction d’un AVC ischémique par injection de thrombine dans l’artère cérébrale moyenne (40 minutes) / 20 minutes après injection des protéines (20 minutes) J+1 : Evaluation des lésions cérébrales par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (15 minutes) J+1, J+7, J+15 : Etude de la récupération fonctionnelle avec test de comportement (5 minutes) Prélèvement LCS, sang et cerveau à J+1 et J+15 (20 minutes) b: Evaluation du potentiel thérapeutique des protéines après un modèle d’AVC avec administration précoce de rtPA J0 : Induction d’un AVC ischémique (40 minutes) / 20 minutes après injection des protéines et du rtPA (20 minutes) J+1 : Evaluation des lésions cérébrales par IRM (15 minutes) J+1, J+7, J+15 : Etude de la récupération fonctionnelle avec un test de comportement (5 minutes). Prélèvement LCS, sang et cerveau à J+1 et J+15 (20 minutes) c: Evaluation du potentiel thérapeutique des protéines après un modèle d’AVC avec administration tardive de rtPA (J0) : Induction d’un AVC ischémique (40 minutes) / 4 heures après injection des protéines et du rtPA (20 minutes) J+1 : Evaluation des lésions cérébrales par IRM (15 minutes) J+1, J+7, J+15 : Etude de la récupération fonctionnelle avec un test de comportement (5 minutes). Prélèvement LCS, sang et cerveau à J+1 et J+15 (20 minutes). L’ensemble des procédures, hormis les tests comportementaux, sera fait sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les rongeurs seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Dans chaque phase du projet, le minimum de souris a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec les tests statistiques prévus lors de ce projet. Le nombre de souris pour chaque étude a été défini à partir d’une analyse de puissance et de nos données sur chaque modèle.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront pesés tous les jours et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques suivant l’approche chirurgicale. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’ensemble des procédures, les souris seront sous anesthésie générale (isoflurane 2% O2/N2O 30/70%) et sous anesthésie locale (Xylocaine 5%, nébuliseur). Les yeux seront couverts (vitamine A en gel et gel oculaire) afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir leur déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Développement du coeur et des muscles de la tête et du cou chez des modèles murins de malformations congénitales
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 100 dans des procédures menées sans réveil. Il s'agit surtout d'embryons issus de croisements, les femelles gestantes recevant une injection intrapéritonéale ou une administration orale unique, pour étudier le développement du cœur et des muscles de la tête et du cou et l'origine de malformations congénitales. Le porteur décrit comme seul effet attendu sur les adultes le stress de contention lors de l'injection. Il affirme que les cultures de cellules ne peuvent "pas remplacer" la complexité des interactions tissulaires de l'embryon et présente les souris génétiquement modifiées comme "indispensables".
Objectifs
Ce projet vise à comprendre les mécanismes à la base du développement du cœur et des muscles de la tête et du cou et ainsi de comprendre les origines des malformations congénitales. Le cœur et les muscles de la tête se forment dans la même région de l'embryon et des défauts dans le développement de ces structures entraînent des malformations observées dans des syndromes génétiqueshumains. Comprendre comment ces destins musculaires sont établis dans l'embryon est donc une question de recherche majeure avec des conséquences importantes pour la compréhension de la pathologie humaine. Notre projet porte sur le développement du cœur et des muscles de la tête et du cou chez la souris, où ces processus sont très conservés chez l'homme. Les objectifs de notre projet sont les suivants: 1) Caractérisation de la régulation génétique des cellules qui forment le cœur chez l'embryon de souris. La perturbation de ces cellules entraîne des malformations congénitales qui touchent 1 naissance sur 100. Nous nous concentrerons sur les mécanismes de régulation des cellules qui contribuent aux cloisons entre les ventricules et les oreillettes du coeur. 2) Caractérisation des liens entre le développement du cœur et les muscles squelettiques de la tête et du cou. Ces muscles diffèrent dans leur origine des muscles du tronc et des membres. Nous définirons ici les régulateurs des différents destins musculaires.
Bénéfices attendus
Nos expériences contribueront à disséquer l'étiologie des pathologies du cœur et des muscles de la tête et du cou. Ces résultats permetttront la compréhension des mécanismes à la base des cardiopathies congénitales qui touchent 1 naissance sur 100 chez l’homme. . Nos résultats fourniront de nouveaux aperçus sur l'origine des défauts des muscles de la tête et du cou et, à long terme, pourraient mener au développement de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques.
Procédures
Dans ce projet, nous étudierons essentiellement des embryons de souris générées par croisement de souris adultes sans phénotype. Les interventions dans de notre projet concernent les souris femelles gestantes et sont 1) l'injection intrapéritonéale durant quelques secondes (une fois dans la vie d'une souris, n=120) ou l'adminstration orale pendant un dizaine de secondes (une fois dans la vie d'une souris, n=130).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sur les animaux adultes seront réduits au stress dû à la contention pour l’injection ou pour l’alimentation orale.
Devenir
Tous les animaux adultes seront euthanasiés à la fin des procédures, afin de pouvoir prélever les embryons et analyser l'expression génique et la structure du coeur et des muscles en développement. Les embryons de stade de développement tardif seront également euthanasiés.
Remplacement
Les méthodes utilisant les cellules en culture ne peuvent pas remplacer la complexité des intéractions tissulaires dans l’embryon. La mise en culture isole les cellules du contexte physiologique, rendent impossible l'analyse de multiples destinées cellulaires et ne peuvent pas récapituler les étapes d'organogenèse nécessaires pour notre projet.
Réduction
Nous nous efforçons de limiter le nombre d’animaux par groupe en tenant compte des contrôles et en utilisant le maximum de données de chaque animal. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous étudierons les cœurs et muscles de la tête et cou dans les mêmes embryons. Notre expérience antérieure a montré que l’injection et l'adminstration orale pouvait entraîner des variabilités dans les phénotypes. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables, nous en avons tenu compte dans l’estimation de l’effectif nécessaire de chaque groupe.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des zones satisfaisant leurs besoins physiologiques et leur apportant un maximum de bien-être. Les conditions de température, lumière, et humidité sont contrôlées. Les souris sont au nombre de 5 maximum par cage et disposent de différents enrichissements (coton, dôme et tubes en carton). L’eau et l’alimentation sont bien sûr en quantité et en qualité satisfaisante. Les animaux sont surveillés et soumis à une grille de score évaluant leur bien-être tout au long de leur vie. Elle établit les points limites nécessaitant une euthanasie.
Choix des espèces
L’expérimentation animale qui utilise des souris adultes en âge de procréer (âgées entre deux et dix mois) est indispensable à l’étude et à la réalisation de notre projet. Les souris génétiquement modifiées fournissent des modèles de cardiopathies congénitales et des études récentes ont mis en évidence des pathologies communes qui affectent le cœur et les muscles de la face et du cou. Malgré les stratégies de remplacement, par exemple l'approche cellulaire, ces dernières ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique et de l’impossibilité d’analyser conjointement différents destinées cellulaires. Les animaux génétiquement modifiés sont essentiels pour nos projets afin d’identifier l’origine embryonnaire des anomalies couplées et d’intégrer les processus développementaux. Les résultats doivent permettre des avancées majeures pour la compréhension et le traitement à long terme de ces pathologies chez l’homme.
Supplémentation en graine de chia de la rate obèse gestante : effet sur l’enrichissement en acides gras oméga-3 de la mère et du fœtus
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
256 rats vont être utilisés, dont 224 tués à l'issue et 32 femelles non gestantes réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les rates reçoivent un régime gras pendant six semaines pour les rendre obèses, puis une supplémentation en graine de chia pendant la gestation, avant d'être tuées un jour avant la mise bas avec leurs fœtus pour prélever plusieurs organes. Le projet étudie le transfert des oméga-3 vers le fœtus. Le porteur reconnaît qu'aucune transposition directe à la femme enceinte ne sera possible et qu'il n'existe pas de modèle in vitro équivalent.
Objectifs
Les lipides appelés acides gras oméga 3 jouent un rôle crucial dans le développement du cerveau du fœtus pendant la grossesse. Il existe plusieurs types d’acides gras oméga 3, une première catégorie (gras oméga 3 essentiels) qui doit être apportée par l’alimentation car elle n’est pas fabriquée par le corps humain et une deuxième catégorie, nécessaire pour le développement du cerveau, fabriquée à partir de la première mais en quantité très faible, insuffisante pour répondre au besoin de l’organisme. Ainsi dans des situations vulnérables comme la grossesse, la couverture de ce besoin est vitale pour le fœtus. Quelques études ont montré des effets bénéfiques d’une supplémentation en acides oméga 3 essentiels sur la santé de l’enfant. Malgré ces éléments favorables, aucune recommandation n’est faite chez la femme enceinte. Dans l’étude nationale ELFE, 75% des femmes enceintes sont en dessous des apports satisfaisants en acides gras oméga 3 essentiels qui sont de 2g/j. La graine de chia est connue pour être très riche en acides gras oméga 3 essentiels. Les résultats des études chez l’animal et des essais cliniques suggèrent que l’ajout des graines de chia dans l’alimentation de l’adulte augmente la concentration en ces deux catégories d’oméga 3. Cependant, aucune étude ne s’est intéressée au transfert de ces oméga-3 vers le fœtus à travers le placenta et à la quantité de ces oméga 3 dans la circulation fœtale qui influence le développement cérébral, suite à une supplémentation en graine de chia de l’alimentation des mères gestantes. Les objectifs du projet sont d’étudier si l’effet d’une supplémentation en graine de chia des rates gestantes (1) augmente la quantité en oméga 3 et particulièrement la deuxième catégorie de la mère au moment de la mise bas ; (2) améliore le métabolisme des oméga-3 dans le placenta et le transfert de ces nutriments importants, vers le fœtus à des périodes clés pendant la gestation et à la naissance. Cette étude se place dans un contexte d’obésité maternelle chez la rate gestante de souche Wistar, où il est connu que la formation de la deuxième catégorie des acides gras est plus faible.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la supplémentation en chia sont une augmentation du stockage des acides gras oméga 3 dans le tissu adipeux maternel et de la transformation des oméga 3 essentiels en oméga 3 de deuxième catégorie dans le foie maternel résultant à une amélioration du rapport oméga 6/oméga 3 dans la circulation sanguine de la mère et du fœtus. Si des bénéfices en termes d’amélioration en acides gras oméga 3 sont observés la rate à l’issue de cette étude aucune transposition directe des résultats ne pourra être réalisée chez la femme et seule une étude clinique permettrait de le prouver. Supplémenter l’alimentation des femmes enceintes avec de la graine de chia, dès le début de la grossesse, serait envisageable puisque les doses utilisées chez la rate, sont celles déjà testées chez l’homme adulte, sans que des effets indésirables n’aient été observés. La prise en considération de la vulnérabilité accrue de la femme en période de grossesse serait évidemment à considérer.
Procédures
Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle pendant les 6 semaines qui précèdent la gestation (régime gras), puis durant la gestation (graine de chia) (20 jours), et à un seul prélèvement de sang (2 min/animal).
Impact sur les animaux
Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle pendant 6 semaines avant la gestation (régime gras modéré), qui peut engendrer une prise de poids modérée sans conséquence sur la posture et la mobilité de l'animal. Un léger stress de courte durée pourra être perçu lors du prélèvement de sang au niveau de la queue effectué par une personne habilitée. Au moment de l’accouplement, nous nous assurerons que la rate est en période d’ovulation avant de la mettre au contact du mâle pour éviter tout stress.
Devenir
Si aucun évènement n’a justifié l’euthanasie prématurée des animaux, ils seront euthanasiés aux temps de prélèvements de tissus préalablement établis dans les procédures expérimentales. Les rates sont suivies jusqu’à un jour avant la naissance, temps auquel elles sont euthanasiées, notamment pour un prélèvement de Sang, Foie, Tissu adipeux et glande mammaire. Les foetus seront euthanasiéà ce même temps, pour prélever placenta, cerveau et Cœur. Les femelles non gestantes (32 rates) seront recyclés dans la mesure du possible, vers les autres protocoles de l’animalerie.
Remplacement
Il s’agit d’une étude in vivo visant à évaluer des stratégies nutritionnelles sur la production de lait maternel. Il n’existe donc pas de modèle in vitro ou ex vivo permettant le remplacement de l’étude animale. Tous les animaux utilisés pour ce projet proviennent d’élevages reconnus et sont nés en captivité. Il n’existe pas encore de méthode alternative (modélisations, modèles in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques dans la mise en place de la lactation, pendant la phase de gestation.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au minimum. Il prend en compte la nécessité d’avoir au moins 8 mères différentes par groupe expérimental pour des raisons de calcul statistique et de garder 3 fœtus mâles et 3 fœtus femelles par mère pour tenir compte d’un effet sexe et d’un effet « portée ».
Raffinement
Des mesures sont mises en place lors du seul prélèvement de sang au niveau de la queue, avec une analgésie locale qui sera appliquée 15 min avant l’incision. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel agréé et seront pesés 3 fois par semaine ce qui permettra de surveiller une éventuelle perte de poids et de vérifier leur état général. Les rats sont hébergés dans des portoirs ventilés avec différents enrichissements de milieu (frisottis, tunnels, morceau de bois) afin de réduire leur stress.
Choix des espèces
L'avantage du modèle rat sur le modèle porcin utilisé dans certaines références bibliographiques est la petite taille des animaux (permettant d'augmenter les effectifs et donc de diminuer la variance des mesures) et la rapidité de croissance et de reproduction, permettant de réaliser des protocoles expérimentaux en beaucoup moins de temps. Les mâles seront commandés à l’âge de 6 semaines et les femelles à l’âge de 4 semaines auprès du fournisseur. Les rates seront acclimatées pendant une dizaine de jours avant d’être mis sous régime « High Fat » pendant 6 semaines afin de les rendre obèses. Nous effectuerons ensuite des frottis vaginaux sur 4 jours afin de mettre uniquement les femelles en oestrus en accouplement. La supplémentation du régime alimentaire en graine de chia sera testée sur deux périodes,15ème (G15) et 20ème (G20) jours de la gestation qui correspondent à deux périodes importantes dans la croissance fœtale et particulièrement dans le développement du cerveau du foetus. Afin de déterminer l’impact de la supplémentation sur le métabolisme de la descendance, 3 fœtus mâles et 3 fœtus femelles par mère seront prélevés à G15 et G20.
Étude des effets d’une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, sur le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique durant la gestation chez le rat Wistar.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
964 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent un régime gras et sucré pendant plusieurs semaines, une injection sous-cutanée quotidienne et des gavages de glucose répétés pendant la gestation, avant d'être tuées un jour avant la mise bas pour prélever leurs organes et ceux des fœtus. Le projet cherche à comprendre le rôle d'une modification protéique dans l'hypertrophie cardiaque liée au diabète gestationnel. Le porteur affirme que reproduire le développement cardiaque in vitro n'est "pas envisageable" et juge l'usage d'animaux "indispensable".
Objectifs
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. L’identification et la compréhension de ces mécanismes sont des enjeux scientifiques et cliniques afin d’améliorer la prise en charge des patients. L’O-GlcNAcylation est une modification protéique qui est augmentée lors d’hyperglycémie et qui a été démontrée comme étant impliquée dans l’hypertrophie cardiomyocytaire. L’hypothèse de ce projet est que l’augmentation des niveaux d’O-GlcNAcylation associée à l’hyperglycémie, pourrait être un facteur pathogénique de l’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel. Les objectifs de ce projet sont : (1) Définir l’implication de l’O-GlcNAcylation dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique au cours de la grossesse (2) Identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans les atteintes du développement cardiaque induites par l’hyper O-GlcNAcylation.
Bénéfices attendus
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. Les bénéfices associés à ce projet sont 1) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel et 2) identifier des cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subissent 1 unique procédure qui correspond à une alimentation standard ou riche en sucre et lipides sur une période de 9 à 17 semaines. 1 jour avant l’accouplement et jusqu’au sacrifice ou la mise bas les mères recevront une fois par jour, une injection sous cutanée de NButGT afin d’augmenter les niveaux de O-GlcNAcylation indépendamment de la diète. Entre la 12ème semaine d’âge et jusqu’à la mise bas, 1 fois par semaine, des tests de tolérance au glucose oral ainsi que des mesures de glycémie seront réalisées afin de valider l’intolérance au glucose. Le test de tolérance au glucose orale consiste en un gavage oral de glucose et au suivi de la glycémie sur les 2 heures suivantes. Les mesures de glycémie sont réalisées grâce à un glucomètre avec prélèvement d’une goutte de sang à la queue des animaux. L’étude de l’impact structurel et fonctionnel du diabète +/- O-GlcNAcylation sera réalisée via une échocardiographie et un électrocardiogramme sur les animaux à 60 jours post naissance. A la fin de cette période, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les différents organes (cœur, aorte, rein, poumons, foie, sang).
Impact sur les animaux
L’alimentation riche en sucre et gras utilisée dans ce projet est une alimentation très bien décrite dans la littérature. A ce jour, aucune étude n’a démontré une modification délétère du phénotype des animaux nourris avec cette diète. L'injection sous cutanée peut entrainer une inflammation localisée qui sera surveillé quotidiennement.
Devenir
A la fin de la procédure (procédure sans réveil), l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Après euthanasie, le cœur, l’aorte, les poumons, les reins, le foie et le sang seront prélevés pour des analyses.
Remplacement
Le développement cardiaque est un processus complexe et intégré faisant intervenir une multitude d’acteurs. Mimer le développement cardiaque par des approches in vitro n’est pas envisageable ; rendant l’usage d’animaux indispensable pour mieux comprendre le lien entre l’hypertrophie cardiaque, le diabète gestationnel et l’O-GlcNAcylation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude). Enfin, lorsque cela est possible, plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Au total, le nombre d’animaux maximal utilisé dans ce projet est de 964 animaux. Lors de la phase d’analyse, des tests statistiques type ANOVA 1 voie seront réalisés.
Raffinement
Après leur arrivée, les animaux seront placés par 3 dans des cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Lors de la procédure d’accouplement et après cette dernière, les animaux seront placés individuellement dans des grandes cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. L’alimentation et l’eau de boisson seront assurées par un membre de l’équipe, assurant une surveillance quotidienne des animaux. Lors de l'euthanasie des animaux, et lorsque cela est possible (euthanasie des mères, des animaux à 60 jours), une couverture anesthésique sera mise en place. L'euthanasie des animaux à 12 jours et à la naissance (J0) ne peut être réalisé respectivement que par dislocation et décapitation. Ces gestes sont connus de l’équipe qui y a régulièrement recourt et qui les maitrise.
Choix des espèces
Ce modèle est l’un des modèles les plus utilisés en recherche. De plus, notre équipe possède une expertise sur ce modèle animal, son comportement et sur l’ensemble des procédures associées. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’objectif du projet est d’étudier le lien entre une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, et l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel. Afin d’étudier l’impact sur le développement cardiaque, différents stades de développement sont nécessaires dans ce projet. L’utilisation d’animaux au stade embryonnaire E15,5 ; E20,5, à la naissance (J0), à 12 et 60 jours post naissance (J12 et J60), permet d’obtenir une information complète sur l’impact de l’O-GlcNAcylation lors du développement cardiaque embryonnaire et post-natal.
Etude de souris avec déficits partiels de l’hydrolyse de l’acétylcholine
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Aucun geste expérimental ne leur est infligé, la souffrance provenant des modifications génétiques elles-mêmes, qui produisent un retard de croissance, un nanisme et des faiblesses musculaires, certaines souris ne survivant pas au sevrage. Le projet étudie deux enzymes qui dégradent un neuromédiateur, avec pour horizon les inhibiteurs médicaux et les gaz neurotoxiques. Sur le remplacement, le porteur affirme que la fatigabilité musculaire et la communication entre organes ne peuvent être reproduites en culture cellulaire.
Objectifs
L’acétylcholine est une molécule de communication locale entre neurones (neuromédiateur) mais aussi une molécule de communication à l’extérieur du système nerveux. Nous cherchons à comprendre les fonctions de deux cholinestérases qui détruisent très efficacement l’acétylcholine. Dans les jonctions neuromusculaires, ces deux enzymes sont localisées dans des domaines différents et contrôlent la fatigabilité des souris. Nous utilisons des approches génétiques sophistiquées pour établir une nouvelle voie de signalisation contrôlée par ces enzymes dans cette synapse et montrer son importance dans la fatigabilité. Au niveau de l’animal entier, ces deux cholinestérases jouent des rôles complémentaires probablement pour maintenir les réseaux de communications par l’acétylcholine relativement indépendants. Nous utilisons des approches génétiques sophistiquées pour établir que les muscles pourraient être une source d’acétylcholine qui interfère avec des fonctions physiologiques autres que la motricité.
Bénéfices attendus
Les inhibiteurs de cholinestérases sont largement utilisés (Alzheimer, myasthénie, anesthésie, syndrome du golfe) et provoquent beaucoup d’effets indésirables. Des pesticides et des armes de destruction massive (gaz neurotoxiques sarin VX novitchok) sont aussi des inhibiteurs de cholinestérases et sont extrêmement toxiques. En comprenant les fonctions respectives des deux cholinestérases dans le contrôle du niveau d’acétylcholine dans les systèmes nerveux et en dehors des systèmes nerveux, nous devrions pouvoir 1) sélectionner de nouveaux inhibiteurs pour le traitement des maladies neuromusculaires ou pour les anesthésies; 2) proposer de nouvelles prises en charge des intoxications par des pesticides ou des gaz neurotoxiques.
Procédures
Aucune. Les animaux présentent des altérations fonctionnelles d'origines génétiques.
Impact sur les animaux
Les résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire ainsi que sur les lignées transgéniques publiées ont montré que les nuisances pour les souris sont variables en fonction des génotypes mais concernent principalement un retard staturo-pondéral et des faiblesses musculaires. Nous anticipons qu’une partie des lignées aura un développement incomplet jusqu’à l’âge adulte. Ces phénotypes ont été observés avec des souris sans la protéine AChE ou souris sans les protéines AChE et BChE. Les souriceaux de ces lignées seront étudiés dans la période périnatale (P0-P1) et en fin de développement embryonnaire. Certaines souris ne survivent pas après le sevrage et seront étudiés à P13-P15. L’autre partie de lignées développées pourront développer des atteintes du fonctionnement de la communication neuromusculaire mais peuvent se développer jusqu’à l’âge adulte. Elles sont actives, se nourrissent dans la mangeoire. La respiration basale s’est adaptée et les souris vivent plus d’un an. Ces souris présentent une fatigabilité notable, une faiblesse musculaire qui ne permet pas à la souris de rester accrocher à une barre. Elles sont plus petites à partir de 7-8 jours de développement post-natal et ce nanisme persiste à l’état adulte. Les mécanismes impliqués sont probablement nombreux (thermorégulation, métabolisme, digestion, circulation).
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort afin de procéder à des analyses histologiques
Remplacement
Objectif 1 La fatigabilité est une notion qu’il est difficile d’explorer ex-vivo car les stimulations nerveuses utilisées ex-vivo pour contracter un muscle ne reproduisent pas le profil d’activations utilisé dans la réalisation de ses mouvements. La fatigabilité n’est pas simplement liée à la force maximale développée par un muscle. Objectif 2 Le retard de croissance dans les différents mutants de souris résulte probablement d’une communication entre organes, l’ACh qui s’échappe des muscles, interfère avec des communications médiées par l’ACh entre les cellules variées dans d’autres organes. Cette communication ne peut pas être reproduite en culture cellulaire ou organoïde. La modélisation est impossible en absence de connaissance 1) du niveau de la fuite potentielle d’ACh à partir des muscles (hypothèse), 2) des cibles possibles : cardiorespiratoires, vasculaire, digestives, inflammatoires ; 3) des conséquences sur le métabolisme ; de la dynamique de l’ACh dans le milieu intérieur.
Réduction
Les études sur l’ACh sont conduites jusqu’à présent en utilisant des inhibiteurs des cholinestérases, ces approches nécessitent l’utilisation de différentes doses d’inhibiteurs et donc de nombreuses cohortes d’animaux. Les interprétations sont difficiles car les inhibiteurs peuvent avoir d’autres cibles que les enzymes visées. Nous développons ici des approches génétiques pour utiliser moins d’animaux. Pour l’objectif 1, chaque souris est son propre contrôle. Le suivi longitudinal des souris dans leur cage d’élevage limite le nombre d’animaux. Pour l’objectif 2, une approche systématique permettait de produire 48 génotypes, nous proposons de produire une moitié de ces génotypes (24), et les avons soigneusement choisis afin qu’ils soient pleinement exploités pour valider notre hypothèse.
Raffinement
Pour étudier spécifiquement les questions liées aux conséquences de l’ACh endogène, nous avons développé des approches génétiques sophistiquées, mutations ponctuelles dans une sélection de gène qui abolissent la fonction hydrolyse d’ACh et pas d’autres propriétés du gène AChE, délétion de courte séquence dans le génome pour limiter les modifications chromosomiques. Nous avons aussi sélectionné des lignées parmi toutes les combinaisons alléliques possibles, pour lesquelles le retard de croissance devrait être visible de façon précoce et touchera tous les animaux nés. Nous utilisons des conditions propices à l’élevage des souris. Les croisements sont conduits avec un mâle et une femelle en élevage continu.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui permet d’aborder la dynamique de l’ACh dans l’organisme, 1) L’ACh est le neuromédiateur des muscles chez la souris comme chez l’homme (une source majeure d’ACh); 2) il est possible de créer des modèles génétiques afin de modifier précisément la fonction, la production ou la localisation des enzymes de dégradation de l’ACh. Objectif 1 Souris adultes âgées de 2 à 9 mois. Objectif 2 Jeunes à P0et à P13.
Evaluation des modifications vasculaires cérébrales par microscopie de localisation ultrasonore (ULM) sur un modèle de la dépression chez le rat.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
99 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 67 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 32 en souffrance modérée. Issus d'une lignée sélectionnée pour un caractère "dépressif", ils reçoivent des injections d'antidépresseur, une neurostimulation par ultrasons cinq jours de suite, une craniotomie sous anesthésie, puis une imagerie cérébrale avant d'être tués par décapitation sans réveil. Le projet cherche à mesurer la vascularisation du cerveau dans ce modèle de dépression. Le porteur affirme n'avoir "pas d'autre alternative" pour la microvascularisation cérébrale ni pour modéliser la dépression.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’évaluer, par microscopie de localisation ultrasonore (ULM), la vascularisation cérébrale dans un modèle animal de dépression. Les animaux dépressifs proviennent d’une lignée consanguine de rat exprimant spontanément un caractère dépressif à l’âge adulte.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est d’améliorer la compréhension des mécanismes neurovasculaires liés à la dépression et de proposer des paramètres quantifiables (volume sanguin, vitesse des flux, nombre de vaisseaux, etc.) pour discriminer les animaux atteints et sains, ainsi qu’évaluer l’efficacité des traitements de la dépression.
Procédures
Interventions sur les animaux : - 3 injections intra-péritonéale d'un antidépresseur en 24h - Neurostimulation par ultrason (US) : 1 fois par jour pendant 5 jours ; durée journalière : 10 minutes. - Anesthésie gazeuse pendant l’imagerie par microscopie de localisation ulrasonore (ULM) et le neurostimulation (5x10 minutes neurostimulation + 1x15minutes ULM) - Craniotomie (1 fois, 15 minutes) - Euthanasie par décapitation sans réveil.
Impact sur les animaux
La contention nécessaire à l'induction de l'anesthésie rajoute un stress supplémentaire. Une douleur au point d'injection en intraveineuse de l'agent de contraste et au point d'injection en intra-péritonéale peut être ressentie et peut générer un hématome. Lors de la neurostimulation, il peut être observer un inconfort lié à l'utilisation d'un cadre stéréotaxique.
Devenir
Nous prélèverons les cerveaux pour des analyses histologiques. De ce fait, tous les animaux seront mis à mort à l’issu des manipulations d’imagerie cérébrale.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier la vascularisation cérébrale. Au préalable de ce projet, des tests ont été pratiqués sur des dispositifs tubulaires mimants les petits vaisseaux. A ce stade de notre projet, nous n’avons pas d’autre alternative pour tester la microvascularisation cérébrale. De même, il n’existe pas d’alternative pour modéliser la dépression.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, lors de phase de mise au point, chaque animal pourra subir plusieurs fois l’étape d’imagerie de contraste. Ceci permettra de tester plusieurs concentrations (du moins concentré au plus concentré) d’agent de contraste et paramètres d’imagerie sans avoir recours à d’autres animaux et sans reprise de conscience de l’animal. Pour cette phase du projet, nous pensons que l’utilisation de 35 animaux est jugée suffisante pour atteindre l’objectif de cette procédure. De plus, nous ne jugeons pas utile de faire ces mises au point sur les deux sexes. Nous utiliserons donc que des rats mâles. Pour la 2ème étape du projet, nous souhaitons appréhender les différences de vascularisation entre des rats sains et des rats dépressifs. Nous pensons que l’utilisation de 64 animaux est suffisante pour atteindre cet objectif. Des tests stastitiques appropriés seront utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les rats seront hébergés par groupe social, de 2 à 4 par cage, en présence d'enrichissements comprenant un tunnel et/ou une cabane en carton ainsi qu'un bâton à ronger, papier absorbant. Toutes les stratégies d'analgésie et d'anesthésie et de soins seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être observés lors de leur hébergement avant la procèdure d’imagerie.
Choix des espèces
Le rat semble l’espèce la plus adaptée pour cette étude. La taille de la boite cranienne est suffisante pour procéder à l’amincissement de crâne. De plus, il existe un modèle de rats dépressif utilisable pour ce projet . La dépression est souvent une pathologie de l’adulte. Nous aurons donc recours à des rats adultes de 8 semaines.