Biologie du développement
- Autre recherche fondamentale
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Cartographie fonctionnelle et spatiale du tPA endogène au cerveau, en conditions normales ou ischémiques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 10 tuées sans réveil. Une lignée génétiquement modifiée rend le tPA cérébral fluorescent, et une partie des souris subit un accident vasculaire cérébral provoqué au laboratoire, suivi d'une imagerie à trois, six, douze et vingt-quatre heures avant le prélèvement du cerveau. Le porteur signale une possible perte de poids, des douleurs post-opératoires, une détresse et des déficits fonctionnels, l'objet étant de cartographier l'origine cellulaire de cette protéase. Il affirme le "caractère de stricte nécessité" du recours à la souris et l'absence de méthode de remplacement.
Objectifs
L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une protéase clé du système fibrinolytique sanguin. Par ses propriétés, le tPA est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est aussi un élément clef dans le système nerveux central (SNC), mais l’élucidation des sources cellulaires de tPA est limitée par un manque d’outils de détection fiable. Cette question est pourtant majeure, pour comprendre comment le tPA favorise ou limite les fonctions et la survie neuronale. L’objectif de cette première étude est de mieux comprendre l’origine cellulaire et les fonctions du tPA dans le SNC par des approches ex vivo/in vivo en se basant sur un nouvel outil original d’étude : une souris génétiquement modifiée, qui d’une part exprime le tPA (associé à une protéine fluorescente) pour le rendre détectable, et d’autre part permet de déléter spécifiquement celui-ci dans les cellules du SNC sans altérer son expression dans les autres compartiments. Cette lignée de souris sera utilisée pour des études histologiques et fonctionnelles, en conditions physiologiques ou dans un modèle d’AVC ischémique développé au laboratoire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles pour comprendre le rôle complexe d’un acteur clef de la physiopathologie cérébrale. Cette meilleure compréhension permettra d’identifier des cibles thérapeutiques pour la prise en charge des patients victimes d’un AVC ischémique.
Procédures
Procédure 1 : Prélèvement sous anesthésie (sans réveil). Procédure 2 : - Chirurgie sous anesthésie ; évaluation des lésions cérébrales et des transformations hémorragiques par imagerie cérébrale : J+3h, J+6h, J+12h, J+24h. - Prélèvement sous anesthésie (sans réveil)
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : une perte de poids/arrêt de la prise alimentaire et de boisson, des douleurs post-opératoires, des signes de détresse, du stress, des déficits fonctionnels.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser autant que possible le nombre minimal d’animaux adéquat, afin de correspondre au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible. Les tests statistiques utilisés pour les résultats de l’étude comprendront des tests non-paramétriques (Test de Kruskal-Wallis, suivi du test post-hoc de Dunn’s) ou un t-test si la distribution des échantillons suit une loi normale (Shapiro-Wilk).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Etude de la maturation du BDNF dans les plexus choroïdes de souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
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- Système immunitaire
- Système nerveux
92 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Elles reçoivent une injection intraveineuse d'une protéase fluorescente, le tPA recombinant, avant un prélèvement de liquide cérébro-spinal, un prélèvement de sang intra-cardiaque et l'extraction du cerveau, une partie servant d'abord à un apprentissage de la pose de cathéter. L'objet est de comprendre si les plexus choroïdes participent à la maturation du BDNF, les retombées pour les patients victimes d'accident vasculaire cérébral ou de sclérose en plaques restant renvoyées à un horizon thérapeutique lointain. Le porteur affirme le "caractère de stricte nécessité" du recours aux souris et l'impossibilité d'un remplacement.
Objectifs
Les plexus choroïdes, structures cérébrales dont le principal rôle est de produire le liquide cérébro-spinal (LCS), sont aussi capables de sécréter de nombreux facteurs neurotrophiques dont le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF). Le BDNF existe sous sa forme précurseur (pro-BDNF) ou, après protéolyse, mature (mBDNF). Malgré leur localisation parfois commune, le mBDNF et le pro-BDNF se distinguent parfois dans leurs (dys)fonctions neurologiques. Différentes protéases semblent capables de réaliser la maturation du pro-BDNF en mBDNF, notamment l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Le tPA est une protéase synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour favoriser la fibrinolyse, grâce à sa capacité à activer le plasminogène en plasmine. Il est également sécrété par les neurones et par d’autres types cellulaires du système nerveux, tels que les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes. Par ses propriétés fibrinolytiques, le tPA recombinant (rtPA) est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. En plus de participer à la maturation du BDNF, l’ARNm (acide ribonucléique messager) du tPA est parfois retrouvé dans les mêmes régions cérébrales que celui du BDNF. De plus, le tPA et le BDNF sont présents dans les mêmes vésicules au niveau des neurones, co-transportés et co-libérés par les dendrites neuronales. Le tPA a précédemment été identifié dans les plexus choroïdes, suggérant également une synthèse endogène de cette protéase dans ces structures. De plus, le tPA vasculaire peut être transporté par des vésicules à travers les plexus choroïdes. Ainsi l’objectif de cette étude est de determiner si les plexus choroïdes peuvent être une zone de maturation et de libération de BDNF et si le tPA (endogène ou exogène) est un acteur de la maturation et/ou de la sécrétion de BDNF dans le LCS par des approches in vivo chez des souris entièrement déficientes en tPA (tPANull) et des souris contrôles (tPAWT).
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales sur la maturation du BDNF dans les plexus choroïdes et sa modulation potentielle par le tPA à des fins thérapeutiques. En effet, une meilleure compréhension de la maturation du BDNF nous aidera d’une part à évaluer le potentiel effet du tPA vasculaire, et d’autre part, à envisager d’améliorer les performances de patients dans des conditions pathologiques, par le couple pro/m-BDNF.
Procédures
L'unique procédure réalisée, consistera en une injection intraveineuse de tPA recombinant couplé à un fluorochrome chez des souris entièrement déficientes en tPA et des souris contrôles, pour suivre son passage du compartiment vasculaire vers le parenchyme cérébral et détecter sa présence en immunohistochimie à différents temps. De même, du LCS et du sang seront prélevés pour réaliser diverses études protéiques et transcriptomiques. - Souris Swiss : phase d’apprentissage (Pose d’un cathéter veineux et prélèvement intra-cisternal de LCS). - Souris contrôles : injection I.V saline ou rtPA. - Souris déficiente : injection I.V saline ou rtPA. Mise à mort des souris de la phase d’apprentissage, immédiatement après le prélèvement intra-cisternal. Mise à mort des souris contrôles/déficientes à différents temps post injection : +10 minutes, à +30 minutes et à +60 minutes. Pour chaque animal : un prélèvement de LCS sera effectué, puis un prélèvement de sang en intra-cardiaque et enfin le cerveau sera extrait.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour cette procédure sans réveil : du stress lié à la manipulation des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (AVC, SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, la procédure expérimentale décrite dans ce projet a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards aux normes. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront pesés tous les jours et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques suivant l’approche chirurgicale. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’ensemble des procédures, les souris seront sous anesthésie générale (et sous anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir leur déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature.
Rôle de l’homéostasie chlorure spinale dans l’hypersensibilité nociceptive induite par une séparation maternelle néonatale
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
176 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier l'hypersensibilité à la douleur induite par une séparation maternelle précoce. La moitié des nouveau-nés est séparée de leur mère, puis soumise à des tests de douleur et à des injections dans la moelle épinière, l'autre moitié subit une chirurgie sans réveil avec ablation d'une vertèbre pour enregistrer la moelle jusqu'à huit heures. Le porteur indique aussi que toutes les mères sont mises à mort après le sevrage, au motif que la séparation altère leur système nerveux. Il affirme que la nociception est un processus intégré, impossible à étudier sans sujets vivants dotés d'un cortex développé.
Objectifs
Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN) est un modèle reflétant la prématurité humaine et des études ont montré que les animaux exposés à la SMN présentent des déficit de comportements et une hypersensibilité douloureuse. Des études récentes suggèrent également un déréglement de l'expression de certaines molécules pouvant ainsi contribuer aux altérations comportementales observées suite à la SMN. Dans ce contexte, nous chercherons à évaluer le rôle de certaines de ces molécules exprimées par les neurones de la moelle épinière impliqués dans la transmission de l'information douloureuse. L’objectif du projet sera d’étudier l’effet du bumétanide (BTD), qui pourrait rétablir a) les seuils de douleur chez l’animal SMN adulte et b) la transmission de la douleur par des neurones dans la moelle épinière d'animaux SMN.
Bénéfices attendus
Le modèle de séparation maternelle a permis de décrypter nombre des mécanismes d’altération du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, l’étude permettra de mieux comprendre les voies et mécanismes impliqués dans la douleur qui sont altérés lors d’un stress néonatal non douloureux, et plus particulièrement une séparation précoce avec la mère. Ce projet vise aussi à caractériser l’action potentiellement bénéfique du bumétanide sur le comportement modifié des animaux séparés et sur les modifications moléculaires observées dans ce modèle.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis au protocole de séparation maternelle néonatale, tandis que l'autre moitié des nouveau-nés resteront avec leur mère. Des tests d'évaluation de la douleur (durée 10min/animal), n'induisant pas de stress accru chez les animaux seront effectués une fois chacun du jour 30 au jour 60 postnatal pour la moitié des animaux. Ceux-ci recevront un total de 4 injections sous anesthésie générale 30 minutes avant chaque test comportemental. Une chirurgie durant 45 minutes sera effectuée sur l'autre groupe d'animaux puis des enregistrements de la moelle épinière seront effectués. Ces enregistrements dureront 8 heures maximum.
Impact sur les animaux
Le modèle de séparation maternelle néonatale chez le rat est un modèle de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation altère le fonctionnement de son système nerveux, induisant potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. Les nuisances possibles liées à l'injection intrathécale seront le stress lié à l’anesthésie ainsi qu'une inflammation ou infection potentielle du site d’injection. Les tests comportementaux induisent un changement d’environnement pour les animaux et donc un stress.
Devenir
Toutes les mères de cette étude seront mises à mort après sevrage de leurs petits (P21) puisque la séparation altère le fonctionnement de son système nerveux, induisant potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. En fin d’expérience, tous les animaux seront aussi mis à mort. Pour la moitié des animaux, la chirurgie subie est sans réveil puisqu'une vertèbre est ôtée lors de celle-ci et que leur moelle épinière est manipulée. Les animaux y prenant part seront mis à mort par excès d'anesthésie.
Remplacement
La nociception étant un processus intégré, ce projet nécessite l’étude d’un système intégré et mature. De plus, l’étude vise à caractériser les propriétés et le mode d’action d’une molécule d’intérêt dans notre modèle, et il est donc impossible de se passer de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable de restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans les comportements observés.
Réduction
Chaque groupe de rats requiert 2 portées différentes (comportant chacune minimum 10 animaux) pour une bonne analyse statistique et confirmation des tests comportementaux. L’intégralité des animaux de chaque portée sera analysée à chaque fois, permettant également de préciser les différences mâles-femelles si elles sont observées. Les résultats obtenus sont alors statistiquement robustes et exploitables.
Raffinement
Durant la SMN, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Leur prise de poids sera contrôlée 2 fois par semaine. Les animaux sont hébergés en cages collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à disposition de la frisure pour un nid, un bâton à ronger et un tunnel. Les animaux sont suivis quotidiennement par les zootechniciens de l’animalerie et par les expérimentateurs afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental. Si des changements sont observés, le vétérinaire sera contacté pour décider de la procédure. Pour l’appréciation de la perte de poids, si lors d’une pesée hebdomadaire, il est observé qu’un animal ne prend pas de poids ou en perd par rapport à la pesée précédente, des aliments humides seront mis à disposition dans les cages pour faciliter la prise alimentaire. Si l’un de ces changements persiste plus de trois jours et est observé par un zootechnicien ou l’expérimentateur, le vétérinaire sera contacté et l’animal sera retiré de l’étude. Les injections seront effectuée sous anesthésie générale profonde (isoflurane 3%) pour limiter le stress des animaux. Les tests comportementaux sont realisés après une semaine d’habituation (manipulation par l'expérimentateur 5 minutes par animal chaque jour) afin de réduire le stress.
Choix des espèces
Le rat est un standart en tant que modèle expérimental pour ce type d’expérience impliquant des processus intégrés. Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de SMN a déjà été bien caractérisé chez cette espèce, permettant de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus, ce modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3ème trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3ème trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3ème trimestre de gestation chez l’Homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie postnatales chez le rat. Le protocole de SMN intervient au stade nouveau-né, entre le jour 2 et le jour 12 postnatal. Cependant, les conséquences de ce stress seront observées à l’âge adulte (45 jours postnatal).
Impact des champs électromagnétiques sur l’état de santé et le comportement de la petite roussette
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
200 petites roussettes, une espèce de requin, vont être utilisées dès le stade œuf dans des procédures classées en gravité légère, avec l'objectif de les relâcher en mer sous réserve de l'accord d'un vétérinaire. Elles sont marquées, mesurées chaque mois et exposées pendant un an à des champs électromagnétiques reproduisant ceux des câbles de parcs éoliens, avec des tests de respirométrie de 24 heures et des enregistrements vidéo de leur comportement. Le porteur reconnaît que la littérature manque de points limites pour l'expérimentation sur les poissons et que l'exposition prolongée pourrait altérer leur santé, auquel cas les individus seraient tués. Il présente le projet comme un appui à la fois à la conservation et à l'"exploitation durable" des espèces marines, dans le contexte du développement des énergies marines.
Objectifs
Dans le contexte de changement climatique, la production d’énergie constitue l’un des défis socio-économiques et environnementaux majeurs des décennies à venir et soulève d’importants enjeux stratégiques, économiques et financier. Les énergies marines renouvelables (EMR), basées sur le vent, les marées et les courants marins font des océans et des mers une source inépuisable d’énergie permettant de produire de l’électricité. Parmi elles, les parcs éoliens offshores (OWF) sont aujourd’hui en plein essor notamment en Europe. Les OWF peuvent induire du bruit, des vibrations, l’interruption de continuité écologique et des perturbations liées aux champs électromagnétiques qui peuvent avoir des impacts potentiellement négatifs sur les espèces marines. En transportant l’énergie produite, les câbles électriques sous-marins au sein des OWF génèrent des champs électromagnétiques (CEM) qui peuvent affecter le comportement d’espèces électro- et magnéto-sensibles , qui utilisent les champs électromagnétiques pour se déplacer et se nourrir. La forte croissance de l’éolien offshore risque d’amplifier ces effets mais les informations existantes sur leurs conséquences sur les communautés ichtyologiques restent aujourd’hui encore insuffisantes. Les études réalisées sont limitées à quelques espèces d’intérêt commercial et sur une durée relativement courte. Ce projet vise à répondre à cette lacune et à identifier et évaluer les effets des parcs éoliens en mer et leur raccordement sur les requins, espèces élétro-sensibles. L’état de santé des individus sera évalué à travers un panel d’indicateurs : survie, mesures taille/poids (i.e. biométrie) et suivi de la croissance, développement, métabolisme énergétique (i.e. indicateur de stress évalué via des mesures de consommation d’oxygène au repos et à l’effort)
Bénéfices attendus
L’implantation d’un parc éolien offshore entraine une modification de l’habitat. Au vu de la forte croissance de ces projets de développement, il est nécessaire de mieux connaitre les effets de ces structures sur les écosystèmes marins. Il existe très peu de connaissances à ce sujet les requins. Ces connaissances relatives à la biologie de ces espèces d’intérêt serviront de cas concrets pour la mise en place de suivi pérennes des populations aux sein des OWF afin d’atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines en général. Les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément comment les requins réagissent aux champs électromagnétiques. Ils permettront d’améliorer les connaissances des impacts des EMR sur les espèces marines et ainsi apporteront les informations essentielles aux gestionnaires et décideurs pour répondre aux enjeux de développement des EMR sans nuire au maintien de la biodiversité marine.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure de marquage sous cutané juste apres l'éclosion. Ce marquage durera une minute environ par individu. Cette marque permettra d'identifier chaque individu durant la phase expérimentale juvenile. Il y aura une procédure par individu qui durera 12 mois. Biométrie : une fois par mois les individus seront pesés et mesurés pour assurer un suivi de leur croissance et de leur bonne condition (indice de fulton) Mesures de respirométrie : chaque mois, chaque individu sera testé en respirométrie afin d’évaluer sa capacité métabolique aérobie. Ce test durera 24 h et 12 juvéniles par condition (i.e. contrôle, 3 différents champs électromagnétiques) seront testés soit 6 poissons par bassin. Tests comportementaux : les tests comportementaux auront lieu 1 fois par mois au stade juvenile soit pour 6 fois sur 6 mois. Une camera placée au dessus de chacun des bassins permettra d'enregistrer leur comportement à différents temps de la journée. L'experimentateur n'interviendra pas dans le bassin ni sur les animaux mais enclanchera les enregsitrement à des temps donné (1fois 2h le matin, 1 fois 2h l'apres midi, 1 nuit).
Impact sur les animaux
La littérature récente souligne le manque de connaissances s'agissant des points limites (objectifs et quantitatifs) applicables pour l'expérimentation sur les poissons, les réponses à la douleur étant par ailleurs très variables entre les espèces. L’ensemble des manipulations (mise en bassin, anesthésie, mesures taille poids, réveil, chasse avec un stick, respirométrie) seront réalisées sur une période de temps optimisée afin de minimiser un maximum ce stress. La condition des poissons (indice de condition, état général) sera évaluée au niveau individuel durant toute l’expérimentation. Le manque de connaissances sur l’impact des champs électromagnétiques sur les requins de manière générale ne permet pas de déterminer la sévérité de ce type d’exposition en amont. L’exposition aux champs électromagnétiques pourrait avoir des effets indésirables sur l’espèce étudiée. Li’solement sensoriel des individus dans les respiromètres pourrait engendrer un léger stress.
Devenir
Les individus seront relâchés dans l’environnement après accord d’un vétérinaire. Le cas échéant les individus seront euthanasiés. En effet les individus vont etre exposés de manière prologée à des champs électromagéntiques. SI cette expostion altere le développement ou a santé des individus ils ne pourront etre relachés dans l'environnement. Les individus marqués sont maintenus en vie et utilisés durant toute l’expérimentation
Remplacement
Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser l’impact des champs électromagnétiques sur les requins, aucune méthode alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne peut être envisagée puisqu’aucune méthode de remplacement ne saurait reproduire le développement et le comportement de cette espèce. Nous ne pouvons pas imiter la complexité d’un organisme en entier subissant des conditions particulières impactant sa biologie et son comportement en milieu naturel Aussi, pour atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines, l’évaluation de l’état écologique de l’écosystème marins doit pouvoir s'appuyer sur des connaissances relatives à l'écologie et la biologie des espèces vivants dans l’habitat impacté.
Réduction
Le nombre d’individus a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique L’exposition se fera au stade œuf de 4 semaines jusqu’au stade juvénile. En prenant en compte l’incertitude de la fécondation des œufs, du bon développement des embryons et la littérature existante, un nombre total de 25 individus par bassin est conseillé afin d’intégrer une variabilité naturelle représentative et ainsi garantir la robustesse des analyses statistiques et des résultats pouvant être extrapolé à l’échelle de la population.
Raffinement
Dans le cadre des procédures, plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors de l’élevage, de mesures biologiques telles que le poids et la taille, des tests comportementaux et l’évaluation de l’état de santé de l’organisme via des indicateurs de stress Une surveillance de routine sera effectuée quotidiennement dans les bassins d’élevage. Une bonne oxygénation du milieu et une température de 16°C seront maintenus tout au long de l’expérience, un cycle jour/nuit de 13h/11h. Les bassins seront enrichis de tubes PVC permettant de mettre à disposition des cachettes pour les individus. Lors de leur manipulation, en plus de l’utilisation d’anesthésiant, les individus seront placés en immobilité tonique afin de limiter le stress et la douleur. Les individus seront retirés de la procédure dès qu’un point limite sera atteint. Les points limites sont identifiables à travers le comportement des poissons (activité de nage anormale) ou des signes extérieurs de stress (e.g. couleur de peau, plaies). Une fois éclos, les juvéniles seront surveillés quotidiennement afin de s’assurer du bon état de santé des individus et bon état des installations. Des suivis plus poussés, notamment des tests comportementaux (e.g. prise alimentaire, locomotion) et écophysiologiques (métabolismes aérobie, indice de condition, croissance) , seront assurés par les agents une à deux fois par mois. Au bout d’un an, un point d’étape sera réalisé sur les travaux effectués sous la forme d’un rapport intermédiaire et d’une réunion dédiée. A l’issue de ces expérimentations, si les résultats le permettent, les données seront analysées et valorisées sous forme d’article(s) scientifique(s).
Choix des espèces
Les requins sont des espèces électrosensibles susceptible être impactées par les champs électro- magnétiques générés par les OWF. L’ensemble de ces espèces sont présentes sur les différents sites d’étude avec un degré de mobilité plus ou moins importants. La petite roussette (classée « préoccupation mineure » par l’IUCN) présente globalement une sédentarité au site avec des déplacements relativement limités. L'étude débutera au stade embryonnaire (oeuf de 3-4 semaines) jusqu'au stade juvénile de 6 mois. Les oeufs sont fixés par les femelles sur le lieu de ponte qui peut être par consequent un parc éolien. Ensuite, les juvéniles sont très peu mobiles à la naissance et vont rester sur la zone de ponte quelques mois. Afin d' évaluer l'impact des champs électromagnétiques sur le développement il est donc nécessaire d'exposer les individus à partir du stade embryonnaire. Le stade de 3-4 semaines permet de s'assurer de l'a viabilité et de la fécondation des oeufs avec un embryon qui commence à être visible. Cela permet de ne pas exposer d'oeufs dits "clairs" et non fécondés.
Des interactions cellulaires à l’emergence de mouvements morphogénétiques.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
560 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée et 186 maintenus en élevage jusqu'à l'âge de réforme. La seule procédure déclarée est le prélèvement de deux millimètres carrés de nageoire caudale sous anesthésie, pour génotyper des lignées mutantes, le travail scientifique portant sur les embryons précoces. Le porteur revendique le poisson zèbre pour éviter, contrairement à la souris, de tuer la mère afin d'accéder aux œufs. Il indique tester des méthodes de génotypage moins invasives, encore trop peu fiables pour être utilisées.
Objectifs
La construction d’un organisme, mais aussi la dissémination de cellules cancéreuses, implique des migrations cellulaires, qui sont souvent des processus collectifs : les interactions entre cellules sont nécessaires à la bonne migration des cellules et à la coordination de leurs mouvements. Nous avons ainsi mis en évidence dans l’embryon précoce de poisson un nouveau type de guidage des cellules par celles qui les suivent, basée sur la transmission d’une information mécanique. Le projet vise d’une part à mieux comprendre ce mécanisme (comment une information mécanique oriente-t-elle l’activité migratoire d’une cellule), et d’autre part à comprendre comment, à partir des interactions cellule-cellule, émergent des mouvements morphogénétiques complexes et coordonnés.
Bénéfices attendus
Nos travaux trouvent des applications en cancérologie, de nombreuses cellules métastatiques migrant collectivement, et en médecine régénérative, où l’un des grands enjeux actuels est de réussir à reproduire et contrôler in vitro les processus de morphogenèse. Ces questions peuvent en partie être abordées sur des modèles cellulaires en culture (cicatrisation de monocouches épithéliales), mais la complexité et la diversité de l’environnement cellulaire physiologique est impossible à reproduire in vitro, impliquant la nécessité d’analyser ces phénomènes in vivo.
Procédures
Sur certains animaux, l'extrémité de la nageoire caudale inférieure est prélevée, afin de séquencer leur ADN. Le prélèvement est réalisé sous anesthésie générale. L'intervention prend moins d'une minute. Le tissu prélevé est de 2 mm2, et repousse en 2 semaines environ. Un animal ne subit cette intervention qu'une seule fois au cours de sa vie.
Impact sur les animaux
D'après la littérature disponible, le prélèvement de l'extrémité de la nageoire caudale inférieure peut causer une douleur à l'animal. Pour l'éviter, une analgésie est mise en place avant l'intervention, et maintenue après intervention en cas de signes de douleur.
Devenir
A l'issue du prélèvement de l'extrémité de la nageoire caudale, les animaux de génotype d'intérêt sont conservés (2/3 des animaux), les autres sont mis à mort. Tout au long du projet, les animaux atteignant l'âge de réforme (2 ans), sont mis à mort. La moitié des animaux seront de ce fait mis à mort au cours du projet. Ainsi, en fin de projet, sur les 560 animaux ayant subi un prélévement de l'extremité de la nageoire caudale, 560 * 2/3 * 1/2 = 186 animaux, qui seront maintenus en élevage jusqu'à l'âge de réforme.
Remplacement
Nos travaux visent à mieux comprendre comment les interactions entre cellules modulent leurs déplacements et permettent la mise en place de grands mouvements morphogénétiques coordonnés. Ces questions peuvent en partie être abordées sur des modèles cellulaires en culture (cicatrisation de monocouches épithéliales) et elles le sont par d’autres équipes. Néanmoins, la complexité et la diversité de l’environnement cellulaire physiologique est impossible à reproduire in vitro, impliquant la nécessité d’analyser ces phénomènes in vivo. C’est d’ailleurs l’un des enjeux de ces travaux que de parvenir à comprendre les bases cellulaires des mouvements morphogénétiques pour pouvoir les reproduire in vitro, dans le cadre d’approches en médecine régénérative. L'embryon précoce de poisson permet l’analyse des phénomènes qui nous intéressent sans aucune procédure invasive, tout en assurant une proximité évolutive avec l'humain. Comparé à d’autres modèles, comme la souris, il permet ainsi de ne pas mettre à mort la mère pour accéder aux œufs. Aucune expérimentation n’est effectuée sur les animaux (embryons précoces uniquement). Par contre, le maintien de certaines lignées mutantes implique leur génotypage, qui nécessite le prélévement de tissu.
Réduction
Le projet nécessite l’utilisation de 7 lignées mutantes (phénotype non dommageable), dont le génotypage implique le prélèvement de l’extrémité de la nageoire caudale. Le nombre d’animaux nécessaires au projet est calculé comme suit : nombre de reproducteurs nécessaires à un instant donné (dépendant de la fréquence d’emploi de la lignée, varie de 5 à 10 couples), multiplié par le nombre de générations nécessaires pour couvrir la durée du projet (un couple restant fertile +/- 18 mois, 3 générations sont nécessaires), divisé par 0.8 (pour prendre en compte les animaux infertiles ou d’enventuels biais de sexe ratio, qui font que certains adultes ne sont pas utilisables). Pour les lignées mutantes, s’ajoute à cela le fait qu’un tiers des animaux élevés sont sauvages (les embryons homozygotes ne se développent pas et laissent donc 1/3 de sauvages et 2/3 d’hétérozygotes). Pour 7 lignées mutantes, cela représente 560 animaux environs. Les autres lignées utilisées sont des lignées transgéniques (phénotype non dommageable) porteuses de rapporteur fluorescents, qui peuvent donc être génotypées par simple observation des larves avant élevage. Ceci réduit le nombre d’animaux élevés, et réduit le nombre de prélèvement nécessaires au génotypage. Enfin, nous testons des méthodes alternatives au prélèvement de l’extrimité de la nageoire sur adulte, mais pour l’heure, elles ne sont pas suffisemment fiables pour être utilisées.
Raffinement
L’unique procédure de ce projet est le prélèvement de l’extrêmité de la nageoire caudale, afin de génotyper les lignées mutantes. Pour réduire au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux : - la surface de nageoire prélevée est limitée à 2 mm2. - une analgésie est mise en place avant le prélévement, par traitement à la Lidocaïne, prolongée si nécessaire après prélévement. - après prélèvement, les animaux doivent être maintenus isolés, le temps que le génotypage soit réalisé. Celui-ci sera effectué le plus rapidement possible, pour limiter la durée de l’isolement. Les animaux isolés sont maintenus à proximité d’autres animaux, assurant un contact visuel. Si le génotypage n'a pas été effectué sous 15 jours, les animaux sont hébergés avec au moins 2 autres animaux d'un fond génétique différent, permettant une identification visuelle simple.
Choix des espèces
Nous utilisons le poisson zèbre pour ses qualités en terme d’accessibilité à l’embryon (développement externe), d’imagerie (embryon translucide autorisant l’imagerie de processus internes sans acte invasif), de génétique (génome séquencé, nombreuses lignées disponibles), et de proximité à l'humain. L’accessibilité et la transparence de l’embryon permettent d’effectuer nos travaux sans les gestes invasifs qui seraient nécessaires sur un modèle mammifère, et de limiter le nombre d’embryons utilisés (embryons suivis sur plusieurs heures au lieu de sacrifier de nombreux embryons). Enfin, il existe une large littérature scientifique utilisant le poisson pour aborder des questions proches des nôtres sur lesquelles nous nous appuyons pour concevoir nos expériences. Le prélèvement de l’extrêmité de la nageoire pour génotypage sera réalisée entre 1 et 6 mois.
Etude du phénotype cérébrale et craniofaciale d’embryons de souris transgéniques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
6 330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 010 embryons prélevés puis anesthésiés par le froid. Les adultes subissent un génotypage par prélèvement de l'extrémité de la queue, décrit comme source d'inconfort passager, et les embryons sont prélevés entre le 14e et le 18e jour de développement pour examiner leur cerveau et leur crâne. L'objet est d'évaluer le rôle de variations génétiques dites synonymes dans une malformation rare du cerveau, l'holoprosencéphalie. Le porteur affirme recourir déjà à des cellules souches humaines et à l'édition du génome in vitro, mais conclut qu'un embryon de vertébré reste "essentiel" pour confirmer l'implication des gènes.
Objectifs
L'holoprosencéphalie (HPE) est une anomalie rare du développement du cerveau qui se produit lorsque le cerveau antérieur ne se divise pas correctement. Cette condition, qui touche environ 1 naissance sur 10 000, est associée à des problèmes variables au niveau du cerveau et du visage. Les mutations du gène Sonic Hedgehog (SHH) sont la principale cause génétique de cette maladie. Le dépistage génétique de l'HPE s'est amélioré, mais dans près de 70 % des cas, la cause génétique reste inconnue. Les variants synonymes, qui correspondent à des changements de nucléotides dans la séquence d'ADN sans entraîner de modification des acides aminés de la protéine, sont souvent négligés en raison de leur grand nombre présent dans le génome de chaque individu. Dans cette étude, nous nous intéressons à évaluer le rôle des variants synonymes dans le développement de l'HPE en utilisant un modèle murin. Ce modèle nous permettra de comprendre comment ces mutations peuvent influencer le développement du cerveau et du squelette du crâne, et d'explorer leur pertinence clinique dans l'HPE. Les résultats de cette étude contribueront à améliorer le diagnostic de l'HPE et à mieux comprendre les mécanismes de cette maladie.
Bénéfices attendus
Si ces animaux présentent des anomalies au niveau de l'hypophyse et des os du crâne, cela confirmera l'effet d'une variation génétique sur la maladie. Cette découverte permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes de la maladie. En étudiant ces phénomènes, nous pourrons obtenir des informations précieuses sur la façon dont la maladie se développe et comment elle peut être identifiée chez les patients. Cela ouvrira la voie à de meilleures options de dépistage et de diagnostic, ce qui sera bénéfique pour les personnes atteintes de cette condition.
Procédures
La procédure 1 permettra d'identifier les animaux à partir d’un échantillon de queue prélevé par biopsie caudale. Cela représente 864 animaux par an. La procédure 2 permettra d'explorer le phénotype de la tête des embryons entre les stades E14,5jpc et E18.5jpc (Dernier tiers de développement). Cela représente 402 embryons par an.
Impact sur les animaux
- Les effets indésirables attendus concernent uniquement les adultes devant être soumis au génotypage. Actuellement, le génotypage est effectué en extrayant l'ADN à partir de biopsies caudales ; ce qui peut engendrer une sensation d'inconfort chez l'animal. Cette gêne est passagère et n'entraîne pas de complications majeures.
Devenir
Tout les animaux des procédures 1, 2 et 3 seront euthanasiés
Remplacement
Nous utilisons des technologies innovantes, commme les cellules souches humaines induites et l’édition du génome (CRISPR/Cas9) pour examiner in vitro la fonction des gènes lors de la différentiation du neurectoderme, le tissu précédant la formation du cerveau. Ces études préliminaires nous permettent d’analyser comment un gène spécifique ou une mutation influe sur les processus biologiques liés au développement, facilitant ainsi l'identification des gènes les plus pertinents. Néanmoins, pour confirmer leur implication dans l'apparition de la pathologie, il est essentiel de recourir à un modèle d'embryon vertébré. Le modèle murin est adapté à nos recherches, car il permet d'obtenir des animaux transgéniques et présente des similitudes dans le développement précoce du cerveau avec celui de l'être humain.
Réduction
D’après notre expérience, seulement 70% des femelles accouplées (repérées par la présence d’un bouchon vaginal) développent une gestation. Afin d'éviter l'euthanasie inutile de femelles qui pourraient ne pas être gestantes, nous avons élaboré un protocole qui repose sur la surveillance quotidienne du poids des femelles accouplées. Seules les femelles ayant enregistré une prise de poids suffisante sont considérées comme gestantes. La population d'adultes, qui est élevée et génotypée, est restreinte au maintien de nos lignées transgéniques et à la réalisation des accouplements nécessaires pour obtenir des femelles en gestation pour prélèvement d’embryons. Notre équipe possède une longue expérience dans l'étude du développement précoce du cerveau antérieur chez la souris, englobant des compétences telles que la dissection des animaux, l'évaluation morphologique des phénotypes et l'analyse histologique. Cette expertise, combinée à nos recherches passées sur des modèles liés à notre pathologie d'intérêt, nous permet de diriger nos analyses de manière ciblée et de minimiser l'utilisation d'embryons de souris au strict nécessaire.
Raffinement
Un suivi périodique du score de grimace sera instauré pour les spécimens issus des nouvelles lignées transgéniques. Leur poids et comportement seront surveillés de manière à garantir un suivi constant de leur état de santé, permettant ainsi la détection éventuelle d'un phénotype dommageable. Les embryons seront soumis à une cryoanesthésie immédiatement après leur prélèvement pour assurer éviter toutes douleurs. Pour minimiser la douleur associée au prélèvement de l'extrémité de la queue des souris de 3 semaines, l'équipe de l'animalerie travaille activement à l'exploration de nouvelles techniques de génotypage. Des approches alternatives, comme le prélèvement de poils, de salive ou de fèces, sont actuellement en cours d'étude. Une surveillance quotidienne des animaux ainsi que des conditions d'hébergement est mise en place. Les souris bénéficieront d'un environnement enrichi comprenant du coton et/ou du carton, dans le but de les stimuler et de réduire le stress.
Choix des espèces
Le développement du cerveau chez la souris est proche de celui de l'humain. Le modèle murin présente l'avantage de disposer de nombreuses lignées trangéniques. Les animaux concernés sont soit juvéniles (3 semaines) ou des embryons compris entre 14.5 et 18,5 jours de développement.
Etude chez la souris de l’impact d’une inflammation lors des premiers jours de vie sur la prédisposition à l’obésité. 1/2
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
3 225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les mères suivent un régime hypergras et chaque souriceau subit jusqu'à quatorze interventions, dont neuf injections d'une molécule inflammatoire dès le lendemain de la naissance, une ouverture du crâne sous anesthésie pour l'imagerie et des prélèvements sanguins répétés à la queue. Le porteur décrit un retard de croissance, des troubles comportementaux et moteurs, et prévoit l'euthanasie pour prélever cerveau, foie et pancréas. Il affirme qu'il est impossible de reproduire hors de l'organisme les connexions étudiées, les bénéfices pour l'humain étant renvoyés à un éventuel traitement de l'obésité.
Objectifs
La naissance prématurée (avant la fin normale de la grossesse) est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons prématurés qui survivent au-delà de l’enfance est en hausse. Il existe néanmoins une inflammation importante chez 20 à 40% de ces enfants à la naissance, qui peut s’étendre au cerveau et y entraîner des lésions. Ces lésions sont à l’origine de handicaps, de déficits des certaines capacités intellectuelles et de troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte et sont regroupées sous le terme d'Encéphalopathie du Prématuré (EDP). En plus de ces déficits, des études récentes ont démontré qu’1 enfant prématuré sur 5 développe de l’obésité pendant l’enfance. L'obésité est le principal facteur de risque pour le diabète de type 2. Pour comprendre comment une inflammation au moment de la naissance peut favoriser le développement d’une obésité et du diabète, nous utiliserons un modèle de EDP chez le souriceau combiné avec un régime hypergras des mères pendant la lactation. Les mères seront soumises jusqu’au sevrage de leurs petits soit à un régime hypergras soit à un régime contrôle sous forme de croquettes plus ou moins riches en graisse.
Bénéfices attendus
Comprendre pourquoi la naissance prématurée et l’inflammation à la naissance peuvent favoriser l’apparition d’une obésité et d’un diabète peut permettre de proposer des régimes alimentaires ou des traitements pour prévenir et éviter ces maladies chez l’homme.
Procédures
Les mères seront soumises jusqu’au sevrage des petits (21 jours) à un régime hypergras ou à un régime contrôle (croquettes plus ou moins riches en graisse). Chaque souriceau sera soumis à 14 interventions au plus. 1/ Ils recevront 2 injections intrapéritonéales (dans le ventre, au niveau de l’abdomen, dans la cavité où se trouvent les organes digestifs, l’injection est faite un peu au-dessus de l’aine) par jour de la molécule inflammatoire ou du contrôle (matin et fin d’après-midi) du jour après la naissance (P)1 à P4, puis une le matin du P5. Il y aura donc au total 9 injections, de quelques secondes chacune. 2/ A 4 semaines, sous anesthésie générale, une ouverture de l’os du crâne sera réalisée sur un lot d’animaux pour des mesures d’imagerie, pendant lesquelles du glucose sera administré. Cette mesure dure de 1h à 1h30 en totalité. 3/ Pour savoir si les animaux développent un diabète, un autre lot de souris recevra de l’insuline et la glycémie sera mesurée à t=0’, 5’, 10’, 15’, 20’, 30’, 40’, 60’, 90’ et 120’ sur une goutte de sang récupérée par légère piqure au bout de la queue (animal éveillé). Chaque prélèvement dure quelques secondes. Le même test sera reproduit 48h plus tard, en remplaçant l’insuline par du glucose (une seule dose de chaque). L’efficacité d’un anti-diabétique sera testée sur un lot de souris spécifique (1 injection par jour pendant 3 jrs à partir de 4 semaines). Deux heures après la 3ème injection, un test d’insuline sera réalisé comme décrit précédemment. Le lendemain, un prélèvement de sang au niveau de la veine sous-mandibulaire sera réalisée sous anesthésie, avant euthanasie par dislocation cervicale. 4/ D’autres animaux seront utilisés pour l’analyse de leur métabolisme. Ceci nécessite leur isolement dans des cages individuelles appelées « cages métaboliques », permettant le recueil des urines, des selles et des gaz. Une habituation à l’isolement en cages individuelles classiques sera réalisée auparavant. Au total les animaux resteront isolés pendant 2 semaines : 1 semaine d’habituation puis 1 semaine en cage métabolique. 5/ A 6 semaines, un autre lot d’animaux subira le test de « l’arêne » où les souris se déplaceront librement pendant 10 min sous une caméra pour évaluer leur comportement. 6/ A 4 et 6 semaines, une perfusion intracardiaque de liquide sera réalisée sur certains animaux, sous anesthésie générale et avec analgésie, pour éliminer le sang des vaisseaux des organes qui seront prélevés et étudiés post-mortem.
Impact sur les animaux
- L’injection intrapéritonéale peut créer une infection locale dans la zone d’injection - Chez les animaux inflammatoires, on peut observer un retard de croissance (taille et poids inférieurs à la normale) et des troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible...) et moteurs. - Un «graissage» du pelage peut être observé chez les animaux sous régime hypergras, car les miettes de croquettes qui tombent dans la cage lors de la prise alimentaire des animaux entraînent un dépôt lipidique dans la cage. - Une accélération du rythme de la respiration peut survenir chez les animaux à tous les stades. - La chirurgie crânienne peut entraîner dans de rare cas la mort de l’animal. Cela n’a pas d’impact sur le nombre d’animaux utilisé. - La récupération d’une goutte de sang à 10 reprises en 2h après administration d’insuline ou de glucose à 4 semaines peut engendrer un peu de stress chez les animaux, et parfois une hémorragie si la coagulation naturelle ne se fait pas normalement. - L’isolement en cage métabolique peut induire un stress.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour permettre le prélèvement des organes et du sang, et comprendre si l’inflammation au début de la vie peut causer un diabète. Le rôle du cerveau, du foie, du pancréas et du système immunitaire sera analysé.
Remplacement
Notre étude s’intéresse aux liens entre le cerveau et l’utilisation des lipides par l’organisme. Il est impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques) toutes les connexions concernées.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été obtenu grâce aux données du laboratoire, de la littérature et d’une estimation statistique. Si les résultats obtenus à mi-projet sont suffisamment clairs, il sera réduit de moitié.
Raffinement
Avant sevrage, les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. Des grilles de surveillance en fonction de l’âge des animaux seront utilisées pour s’assurer de leur bien-être et déterminer l’atteinte éventuelle des points limites. Une surveillance quotidienne règlementaire est respectée dans l’établissement. Une surveillance spécifique des animaux du projet est par ailleurs appliquée : - Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, et jusqu’à P10, on surveillera quotidiennement l’apparence, le poids, et le positionnement des animaux au sein du nid. - A partir de P10, avant sevrage, la surveillance aura lieu deux fois par semaine. - Après sevrage, les animaux sont surveillés toutes les semaines au moment du change des cages et les vendredis après-midi (avec prise de poids) avant le weekend. Les scores de surveillance prendront également en compte une éventuelle prise de poids susceptible de gêner la locomotion de l’animal. Si le score atteint le niveau du point limite, l’animal sera euthanasié selon les méthodes réglementaires. Une semaine d’habituation en cage individuelle classique sera réalisée avant celle passée en cage métabolique. Une anesthésie générale sera réalisée lors des mesure d’imagerie, et pour le prélèvement sanguin des souris ayant reçu le traitement anti-diabétique. Avant la perfusion intracardiaque de liquide, une analgésie et une anesthésie seront réalisées.
Choix des espèces
Dans le cas de l’étude de l’inflammation cérébrale, les études scientifiques montrent que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau, car les régions principales de cet organe (qui correspondent aux fonctions motrices et intellectuelles), et ses cellules sont très proches de celles de l’homme. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; les observations pourront donc être extrapolables au nouveau-né humain. Les différents temps d’exploration et de prélèvements choisis ensuite permettent de suivre les animaux jusqu’au stade jeune adulte.
Rôle des dysfonctions microgliales dans les troubles neurodévelopementaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
3720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation est déclenchée pendant la gestation par injection, avec un risque de fausse-couche pouvant atteindre 40 %, puis la descendance subit une série de tests comportementaux dont un conditionnement de peur, pour étudier le rôle des microglies dans les troubles neurodéveloppementaux. Le porteur indique que ces tests provoquent un stress léger à modéré et prélève ensuite les structures cérébrales après mise à mort. Il conclut que les modèles in vitro ne reproduisent pas ces étapes du développement et qu'un recours à des animaux non-humains vivants est nécessaire.
Objectifs
Les troubles neurodéveloppementaux ont des causes multiples y compris environnementales. Un lien entre des épisodes inflammatoires pendant la gestation et une augmentation du risque de développer des troubles neurodeveloppementaux chez le descendant ont été démontrés. Récemment, le rôle des microglies (cellules immunitaires du cerveau) dans ces troubles a été mis en évidence chez la descendance mâle. Cependant, aucune donnée sur la descendance femelle, ni sur les troubles cognitifs de la descendance n'ont été générées. Ce projet se base sur un modèle d'inflammation gestationnelle couramment utilisé et maîtrisé par les porteurs du projet. L'objectif est d'étudier le rôle des microglies dans les troubles cognitifs neurodéveloppementaux chez le mâle et la femelle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'établir le rôle des microglies dans la mise en place des troubles cognitifs à l'âge adulte des descendants mâles et femelles après inflammation gestationnelle. Cette étude permettra d'obtenir des données concrètes sur les deux sexes, ce qui n'est actuellement pas disponible mais également sur la sphère cognitive, très peu documentée à ce jour. L'approche par renouvellement des microglies permettra par ailleurs d'établir une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement des troubles neurodéveloppementaux.
Procédures
Prélèvement de sang unique de quelques secondes sur animal vigile pour la présélection des femelles. Injection unique de quelques secondes durant la gestation pour la mère gestante. Tests comportementaux à la période juvénile quotidien durant en tout moins de 15 minutes afin d'évaluer les comportements émotionnels et le développement général (6 tests en juvénile), pouvant engender un léger stress chez l'animal. Tests comportementaux à l'âge adulte afin d'évaluer les capacités de mémoire et les comportements émotionnels ( 5 tests, un test par jour, espacés d'au moins un jour entre les tests, sur une période de 2 semaines– quelques minutes par test), pouvant engender un léger stress, voir modéré lors de l'apprentissage de peur conditionné chez l'animal.
Impact sur les animaux
Le modèle d'inflammation gestationnelle présente un risque de fausse-couche pouvant atteindre 40% sans impacter la survie des mères. Les mères gestantes injectées peuvent présenter une baisse de leur prise de poids sans signe majeurs de comportement de maladie. Les bébés mâles présentent généralement un poids inférieur par rapport aux contrôles. Aucune différence de poids n'est trouvée chez les femelles. Aucune mortalité après mise bas n'est documentée sur ce modèle. Les autres tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entraîner un léger stress notamment durant les deux tests sur les réponses émotionnelles, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules et/ou vésicules extracellulaires nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.
Remplacement
L’étude des phénotypes microgliaux au cours du développement nécessite des modèles non humains. L'étude des effets de l’inflammation maternelle ne peut se faire de manière fine chez l'homme et nécessite de fait l'utilisation d'animaux vivants. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser ces étapes du développement cérébral et la recherche bibliographique indique que la réponse inflammatoire correspondant à nos modèles n'est pas développée in vitro à ce jour. La proximité des signatures microgliales entre l'homme et l'animal permettra un transfert à l'homme à la suite de ce projet, ce qui reste notre priorité et notre objectif scientifique premier : comprendre chez l'homme le développement des microglies durant les phases développementales.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, nous avons utilisé le site Idele.fr permettant de calculer la taille des effectifs en prenant en compte le nombre de groupes, une significativité à 5%, une puissance statistique à 80% et des moyennes et écarts types fictifs basés sur nos expériences passées. Nous avons alors choisi un nombre permettant un équilibre entre la robustesse des données omiques générées malgré la faible puissance statistique liée au nombre de groupes générés. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre de destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer sur une population cellulaire triée à partir de structures cérébrales. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude.
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques (buprénorphine à 0.1 mg/kg) les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Une anesthésie par injection intrapéritonéale de pentobarbital (Exagon 300 mg/kg, 100ul/10g de poids corporel) avec une prise en charge de la douleur préalable par utilisation de buprénorphine (0.1 mg/kg) 30 min avant sera utilisée pour réduire la douleur des animaux. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientifique.
Choix des espèces
Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Leurs données préliminaires ont été générées chez la souris et l'accrétion de données nouvelles sur modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. De plus, les microglies de la souris et de l'homme partagent de nombreux gènes en commun et permettent de conduire à une valorisation des données chez l'animal par transfert chez l'homme, rendant cette étude pertinente au vu du choix du modèle animal. Les analyses seront conduites au cours de la période post-natale pour le comportement juvénile et à l'âge adulte pour l'évaluation comportementale et les études biologiques subséquentes.
Caractérisation des atteintes consécutives à un traumatisme crânien chez la souris : Rôle de HIF1.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un traumatisme crânien est provoqué chez des souriceaux de 17 jours, suivi pendant six mois d'une batterie de tests comportementaux (open field, poutre, échelle, test de Von Frey, labyrinthe en croix surélevé, labyrinthe de Barnes) et d'IRM sous anesthésie, pour étudier le rôle du facteur HIF1. Le porteur qualifie le traumatisme de "léger" et affirme que l'animal "ne montre aucun signe de douleur" une fois réveillé, alors que la procédure est classée en gravité modérée. Le bénéfice annoncé, cerner les conditions de séquelles après un traumatisme crânien pédiatrique, reste une perspective de recherche.
Objectifs
Chaque année 1,5 millions d'européens sont victimes d'un traumatisme crânien (TC) le plus souvent subit lors d'un accident de la route, d'une chute ou au cours de pratiques sportives. 70 000 personnes perdent la vie des suites du traumatisme et environ 100 000 ne présentent pas de récupération totale et demeurent handicapées, notamment chez les enfants et les jeunes adultes qui représentent une population particulièrement vulnérable en regard de ce type de traumatisme. Bien qu'au cours des dernières années un raffinement des procédures de prise en charge par les urgences et les hôpitaux a permis de réduire la mortalité des traumatisés crâniens, il est apparu qu'un grand nombre de patients souffrent par la suite de désordres chroniques invalidants tels que : épilepsie, dépression, démence progressive, etc. À ce jour, aucun traitement ne permet d'empêcher la mise en place de tels désordres à la suite d'un traumatisme crânien. Après un TC, les atteintes des vaisseaux ont pour conséquence de diminuer l’apport en oxygène aux cellules du cerveau. Cette baisse en oxygène (hypoxie) peut aller jusqu’à provoquer la mort de certaines cellules du cerveau. La réponse de l’organisme face à l’hypoxie est régulée par le facteur HIF1 (Hypoxia Inducible Factor). Nous voulons tester si ce facteur joue un rôle délétère dans les évènements cellulaires après un TC. Si tel est le cas, ce facteur représenterait une cible potentielle de traitement innovante et à fort intérêt thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu). D’autre part ce projet déterminera si la protéine HIF1 représente une cible thérapeutique intéressante dans le cadre du développement de traitements post-trauma chez l’enfant.
Procédures
Les 640 animaux subiront tous les procédures non-terminales suivantes : 1. traumatisme crânien léger unique sous anesthésie générale courte (5 minutes) pour moitié des animaux et anesthésie générale courte seule pour l’autre moitié (animaux contrôles dits « sham ») à 17 jours après la naissance. 2. Exploration comportementale sur animal vigile répétée à 1 et 7 jours après le trauma. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes (Open Field) et un test de coordination motrice sur échelle (Foot Fault) réalisés la même journée. 3. Exploration comportementale sur animal vigile répétée à 1 mois, 3 mois et 6 mois après le trauma. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes (Open Field), 2 tests de coordination motrice sur poutre et échelle (Beam walk et Foot Fault) d’environ 5 minutes chacun, 1 test de sensibilité tactile (Von Frey test) d’environ 5 minutes, 2 tests d’évaluation de l’état anxieux (Elevated Plus Maze et White/Black box) de 5 minutes et un test d’apprentissage spatial (Barnes Maze) qui nécessite des sessions quotidiennes de 5 minutes sur 5 jours. Chaque test sera effectué à un jour différent, ainsi chaque série comportementale comprendra 11 tests quotidiens d’environ 5 minutes répartis sur 2 semaines. 4. Exploration d’imagerie fonctionnelle par IRM réalisée sous anesthésie générale d’environ 1 heure répétée à 1, 3 et 6 mois après le trauma, un jour après le dernier test comportemental.
Impact sur les animaux
Notre projet repose sur l’utilisation d’un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile. Le traumatisme est réalisé chez l’animal anesthésié, et une fois réveillé l’animal ne montre aucun signe de douleur, il reprend immédiatement un comportement normal. Comme il s’agit d’un traumatisme léger, les conséquences à long terme ne sont pas anxiogènes ou douloureuses pour l’animal. Ces conséquences sont principalement des retards/défauts d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de la mobilité de l’animal. De plus, le modèle murin utilisé n’engendre pas de phénotype dommageable.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, soit 640 animaux.
Remplacement
Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données (PubMed, Web of science, …) permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.
Réduction
Le projet concerne 640 souris mais permet de réduire le nombre d'animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet en effectuant un suivi longitudinal non invasif par imagerie. Nous planifions des groupes expérimentaux correspondant au nombre minimal permettant l'utilisation de tests statistiques visant à comparer les différents groupes : analyses multi-ANOVA avec répétition / analyses de régression entre les différents paramètres mesurés pour des tests comportementaux / IRM (voir annexes pour le plan expérimental).
Raffinement
Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme, en s'appuyant sur la mise en place d'une démarche de suivi des animaux permettant de limiter et traiter la souffrance éventuelle des animaux, et en employant les méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. L'ensemble des procédures mises en place dans le projet sera assuré par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales en adéquation avec les directives européennes. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. Les traumatismes crâniens seront réalisés sur animal anesthésié en utilisant des impacts calibrés. De plus, la cage de réveil est placée sur un tapis chauffant afin de prévenir toute hypothermie. Lors de la réalisation des tests comportementaux, les animaux ne se retrouveront isolés que peu de temps : 5mn pour la plupart des tests et 1h au maximum. Les protocoles expérimentaux s'appuient notamment sur l'utilisation d'un agoniste opioïde, la Buprénorphine, afin de prévenir ou traiter la manifestation de douleurs.
Choix des espèces
Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. De plus, le modèle murin permet l’utilisation de souches génétiquement modifiées. Notre projet s'appuie sur l'utilisation d’une de ces souches : des souris pour lesquelles le gène codant pour le facteur HIF1-alpha a été inactivé dans les astrocytes. Cette invalidation de gène n'induit pas d'effet sur le développement, la survie, la croissance et les fonctions neuromusculaires. Dans ce projet, les traumatismes crâniens seront réalisés sur des souris juvéniles à 17 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un TC en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 6 mois après le TC afin d’évaluer les conséquences à long-terme.
Etude morpho-fonctionnelle de la mise en place développementale du circuit hippocampique en condition saine et pathologique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
584 souris, dont des nouveau-nés, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. Dès la naissance, elles reçoivent des injections dans le cerveau, certaines subissant à partir du cinquième jour une chirurgie avec pose d'une fenêtre optique et injection d'un virus de la rage modifié, avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le porteur indique que les petits opérés, incapables de se nourrir et rejetés par leur mère, sont euthanasiés et leur cerveau prélevé. Il affirme que ce réseau ne peut pas s'étudier hors de l'"organisme entier" et qu'aucune méthode de substitution n'existe, concluant à la nécessité de la souris.
Objectifs
L'objectif est double. Tout d'abord il est de comprendre comment le réseau hippocampique se développe en condition saine. La seconde partie du projet est de comprendre, a partir de la base que nous aurions déjà établie, comment ce circuit dysfonctionne pour plus tard donner des pathologies tel que l’Autisme. Plus particulièrement nous étudierons, au cours du développement postnatal, les modifications de l’innervation périsomatique à la suite de la perturbation de l’activité des interneurones. Nous testerons ensuite l’état de cette inhibition a diffèrent stade du développement ainsi qu’en condition pathologique (modèles d’autisme). Par ailleurs, l’activité des neurones de l’hippocampe est significativement associée aux mouvements pendant la première semaine de vie post-natale. Nous faisons l’hypothèse qu’en inhibant les voies extra-hippocampiques, nous réduirons la corrélation entre les mouvements spontanés et l'activité synchrone de CA1 et perturberont la maturation de la dynamique hippocampique. Afin de mieux connaitre le développement du connectome des neurones GABAergiques ou glutamatergiques de CA1, nous réaliserons des traçages neuronaux rétrogrades transynaptiques grâce à l'utilisation du virus défectif de la rage.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche est important car en plus de décrypter les mécanisme anatomique et fonctionnel par lequel les neurones PV contribuent à la dynamique de CA1, il nous a permis de comprendre les règles qui régissent le développement de l'hippocampe. Cette partie fondamentales du projet est indispensable pour comprendre ce qui dysfonctionne dans des pathologie neurodéveloppementale tel que les TSA. Par nos experience de manipulations du circuit, nous esperons potentiellement contrebalancer les dysfonctionnement observé dans les modèles de TSA.
Procédures
Procédures chirurgicales tels que injections intraventriculaire, injection intra hippocampiques, pose d'une fenêtre optique pour l'imagerie à deux photons des neurones de l'hippocampes (492 animaux). Perfusion intracardiaque : Les animaux seront perfusé après une analgésie (burprenorphine 6,6ml/kg d'une solution 0.015mg/ml; 0.1mg/kg, IP) suivie 30 min plus tard d'une anesthésie profonde (Domitor à 0.9mg/kg et Zoletil 60mg/kg) (92 animaux, environs 33 mins/animale en comptant le temps d’action de l’analgésie et de l’anesthésie).
Impact sur les animaux
Comme décrit dans la procédure 1, les animaux subiront des injections stéréotaxiques a P0 puis, pour certains d’entre eux, une chirurgie à partir de P5. Dans le cas des injections stéréotaxique, l’animale est en dehors de la portée et de sa mère pendant 15 minutes. En ce qui concerne les chirurgies faites à partir de P5 les nuisances sont les suivantes : Stress préopératoire, douleurs per et postopératoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Procédure 1, 2, 4 : Ayant subie une chirurgie lourde, les animaux auront du mal à se nourrir, se déplacer, et à être accepter par leur mère. Ils ne seront donc pas remis dans leur portée, et par conséquent, euthanasié et leur cerveau prélevé pour éventuellement faire des vérifications histologiques.
Remplacement
L’étude des réseaux corticaux, de par leur complexité d’organisation, de développement et de fonctionnement ne peuvent pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, seules des approches menées chez un modèle animal peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau dont pourra bénéficier à terme les études menées chez l’homme. C’est dans ce contexte que se situent nos travaux dont l’objectif est d'étudier l'organisation morpho-fonctionnelle de la mise en place des activités corticales de l'échelle cellulaire à l’échelle du réseau. REMPLACEMENT: il n'existe pas à l'heure actuelle de méthode de substitution in vitro ou en culture cellulaire pour étudier la mise en place au cours du développement des activités neuronales du réseau hippocampique où informations externes et internes sont impliquées.
Réduction
2) REDUIRE: Les expériences seront réalisées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux. La méthode utilisée d’imagerie calcium in vivo permet l'enregistrement d'un très grand nombre de neurones (plusieurs centaines) par animal, et donc de diminuer le nombre d'animaux utilisés. Une même portée sera utilisée par plusieurs expérimentateurs. Les nouveau-nés non utilisés pour les études développementales seront utilisés plus tard dans le cadre d'études menées chez l'adulte.
Raffinement
RAFFINER: Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Une attention particulière sera portée aux nouveau-nés au cours des chirurgies pour réduire douleur et stress (anesthésie générale et locale, tapis chauffant, suivi strict postchirurgie des nouveau-nés en particulier après leur réintroduction au sein de la portée). Les mères et leur nouveau-nés opérés ou non seront hébergés dans des armoires ventilées, sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi d'igloos cartonnés et de mini-rouleaux de papier foisonnant permettant aux femelles de faire des nids
Choix des espèces
Les raisons de l'utilisation de modèle murin sont multiples (Martinez-Cerdeno et Noctor, Août 2018, J Comp Neurol). Concernant nos expériences, les souris présentent une organisation morpho-fonctionnelle suffisamment complexe et évoluée pour en tirer des conclusions générales sur la mise en place développementale de la dynamique des réseaux corticaux. L'existence de nombreuses et différentes lignées transgéniques permettent de cibler telle ou telle sous-population de neurones. De plus, le modèle murin est couramment utilisé en neuroscience rendant nos résultats intéressants pour une large communauté scientifique et permettant de mieux les confronter aux résultats déjà publiés. Les animaux seront injectés entre P0-P3 dans le ventricule latéral, le cortex, l'hippocampe, le thalamus ou le septum, avec des virus (AAV) permettant l'expression de sondes calciques (GCamP, GECO....), d'outils optogénétiques (channelrhodopsine, halorhodopsine....), d’outils chémogénétiques (DREADD receptors...), de marqueurs fluorescents (GFP, Td-Tomato..), de traceurs rétrogrades transynaptiques. De 3 jours à deux semaines après l’injection, les animaux seront soit : 1) opérés afin de procéder aux expériences in vivo d’imagerie calcique (pose de fenêtre optique) ou d’enregistrements électrophysiologiques (insertion intracérébrale d'électrodes; 2) injectés en sous-cutané (10µl/g d'animal), en chronique ou en aigu, avec un solution de CNO diluée à 1mg/1ml avant d'être opérés pour poser une fenêtre optique et/ou électrode pour l'enregistrement des activités neuronales in vivo ; 3) injection à P5 ou P9 du virus défectif de la rage (SADdeltaG); 4) profondément anesthésiés puis perfusés par voie intracardiaque avec une solution fixative pour l’analyse morphologique.
Polarité des oligodendrocytes
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène cinq jours de suite pour supprimer le gène Pk2 dans les oligodendrocytes, puis sont anesthésiées pour une perfusion terminale du cerveau. Le porteur indique que ces injections répétées sont un facteur de stress douloureux et que la délétion peut entraîner des troubles locomoteurs, voire des crises d'épilepsie. Il relie ce travail fondamental à l'autisme et à la maladie d'Alzheimer chez l'humain, mais affirme qu'aucun modèle in vitro ni informatique ne peut reproduire ces interactions cérébrales.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont : (1) créer deux lignées de souris dans lesquelles nous pouvons supprimer spécifiquement le gène Pk2 dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire. (2) étudier l'effet de la délétion de Pk2 sur les cellules de la lignée oligodendrocytaire.
Bénéfices attendus
Ce projet étudiera pour la première fois le rôle du gène de polarité Pk2 spécifiquement dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire. Nos expériences visent à comprendre le rôle de ce gène au niveau cellulaire. Chez l'homme, la déficience de Pk2 a été liée à l'autisme et des altérations de Pk2 ont été observées dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. Dans l'autisme, les circuits neuronaux qui sous-tendent certains comportements sont altérés et les oligodendrocytes jouent un rôle dans la stabilisation des circuits neuronaux et la facilitation des connexions neuronales. Notre recherche contribuera donc à évaluer si les oligodendrocytes pourraient être considérés comme une cible putative dans ces pathologies.
Procédures
Les animaux recevront une injection intrapéritonéale de tamoxifène pendant 5 jours consécutifs, après es souris resteront ensuite en vie jusqu'à la fin de la période expérimentale. Pour chaque injection, l’animal sera manipulé par l’expérimentateur entre trente secondes et une minute. L'injection aura lieu pendant ce temps et durera environ 10 à 15 secondes. À la fin de l'expérience, les animaux recevront une injection intrapéritonéale pour induire une anesthésie profonde afin de réaliser une perfusion transcardiaque sous anesthésie. Dans la mesure du possible, les animaux seront anesthésiés par inhalation d'isoflurane à 3 % avant l'injection pour l'anesthésie terminale afin de réduire davantage le stress. L'induction à l'isoflurane prendra environ 3 minutes et l'injection en intrapéritonéal de l’anesthésique prendra 10 secondes. Une anesthésie profonde est obtenue dans les 5 à 10 minutes en fonction de l'induction préalable à l'isoflurane.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale inflige aux animaux des injections intrapéritonéales pendant 5 jours consécutifs. Il s'agit d'un facteur de stress récurrent et d'une procédure qui peut être douloureuse pour les souris. La délétion de Pk2 dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire pourrait avoir un effet négatif sur les souris en entraînant des modifications de l'activité locomotrice et, potentiellement, le knockout pourrait conduire avec une faible probabilité à des crises d'épilepsie.
Devenir
Les souris recevront une injection intrapéritonéale de tamoxifène pour induire une invalidation génique conditionnelle. Les souris resteront ensuite en vie jusqu'à la fin de la période expérimentale. La durée maximale de la période expérimentale est définie comme étant de 8 semaines après la dernière injection (âge maximal de 100 jours ou 14 semaines). Cette période est nécessaire pour s'assurer que la délétion génétique est effective. Après un maximum de 8 semaines, nous serons en mesure d'étudier l'effet cellulaire de l’invalidation génique conditionnelle. À la fin de l'expérience, toutes les souris seront profondément anesthésiées et le cerveau sera préservé par perfusion intracardiaque de fixateur. Une analyse histologique ultérieure sera effectuée au niveau cellulaire. Cette procédure sera effectuée pour tous les animaux afin d'effectuer une analyse biologique et statistique des différentes étapes d'analyse prévues.
Remplacement
Le projet a pour but d'étudier la trajectoire développementale et de signalisation cellulaire de la lignée oligodendrocytaire dans le cerveau murin. La suppression des gènes induite par l'injection de tamoxifène est déterminée par l'âge de développement de l'animal et le stade cellulaire. Cette chronologie complexe ne peut être reproduite in vitro car les voies de signalisation putatives nécessitent des interactions intactes entre les différentes cellules du cerveau. Il n'existe aucun modèle informatique ou "in vitro" capable d'imiter ces processus biologiques tout en respectant la physiologie ; l'utilisation d'animaux est donc nécessaire pour étudier ce mécanisme biologique fondamental.
Réduction
Notre approche expérimentale nous permettra d'aborder les questions expérimentales avec les meilleures expériences possibles. Le nombre d'animaux sera réduit au minimum, tout en permettant des tests statistiques robustes et des expériences contrôle suffisantes. La production de souris sera optimisée en mettant en place un programme d'élevage qui correspond étroitement à la demande et qui est mis à jour tous les 3 mois. Nous élèverons le nombre minimum d'animaux nécessaires pour réaliser les expériences.
Raffinement
L'approche expérimentale est affinée par l'utilisation d'une délétion génétique conditionnelle qui minimise les effets indésirables sur les organes et les cellules non concernés. Ainsi, la délétion du gène Pk2 dans l'oligodendrocyte ne se produit qu'après l'injection d'un modulateur (tamoxifène). Cette injection est effectuée à des moments expérimentaux précis au cours du développement de la souris. Nous mettrons en œuvre les meilleures pratiques pour garantir le bien-être des animaux en ajoutant un enrichissement aux cages, en traitant si nécessaire les douleurs survenues, en limitant tout risque d'infection et en limitant la souffrance des animaux lorsque les objectifs expérimentaux sont atteints.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. Par définition, pour nos études intégrées évaluant l’impact d’une mutation d’un gène sur le cerveau et les troubles du comportement, l'utilisation de techniques in vitro ou d'organismes d'une plus faible sensibilité neurophysiologique (invertébrés par exemple) n'est pas appropriée pour les questions auxquelles nous cherchons à répondre. En outre, la création de modèles animaux est très importante. Par conséquent, nous pensons qu'il n'existe pas de remplacement disponible qui permettrait d'atteindre les objectifs scientifiques du travail proposé. Pour le maintien de l'élevage, nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines ou plus. L’invalidation génique chez les souris expérimentales sera induit à différents moments. Pour supprimer le gène Pk2 dans les cellules précurseurs des oligodendrocytes, des injections de tamoxifène auront lieu entre les jours postnatals 2 et 7 et entre les jours postnatals 28 et 40. Pour le ciblage des oligodendrocytes, les injections de tamoxifène auront lieu entre les jours postnatals 11 et 21 et 28 et 40. Toutes les analyses seront effectuées lorsque les souris seront âgées de 3 semaines à 14,5 semaines. L'analyse à ces différents moments est nécessaire d'un point de vue scientifique car nous analyserons le rôle de la Pk2 dans le développement des cellules de la lignée oligodendrocytaire et dans le maintien des oligodendrocytes chez l'animal adulte.
Etude des capacités pluripotentes d’un nouveau type d’iPs dans le cadre du développement embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
80 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque femelle reçoit une injection de blastocystes par voie vaginale, sans chirurgie ni anesthésie, avant d'être tuée pour prélever les embryons, afin d'évaluer la capacité de nouvelles cellules souches induites à participer au développement embryonnaire. Le porteur souligne avoir choisi une méthode d'implantation "non douloureuse" évitant la chirurgie. Il affirme qu'un "modèle in vivo est indispensable" car le développement embryonnaire complet ne peut être reproduit in vitro.
Objectifs
Tous les organismes vivants proviennent à l’origine d’une seule cellule, dite « cellule souche pluripotente », car celle-ci a la capacité de générer tous les tissus composant un individu. Néanmoins, ces cellules souches pluripotentes disparaissent extrêmement rapidement au cours du développement de l’embryon. Elles sont remplacées par des cellules souches aux capacités beaucoup plus limitées qui ne peuvent produire qu’un nombre limité de types cellulaires. Actuellement, des méthodes de production de cellules souches pluripotentes in vitro existent, mais les cellules ainsi obtenues soit ne permettent pas de générer la totalité des tissus composant un organisme, soit nécessitent des traitements longs et difficiles à mettre en œuvre. Un des défis de la science est de réussir à créer facilement des cellules souches pluripotentes in vitro permettant de reproduire la totalité d’un embryon. Or, à l'aide de nouveaux traitements innovant, notre laboratoire a réussi à produire in vitro de grandes quantités de ces cellules souches. Le but de ce projet est d’évaluer la capacité de cette nouvelle lignée de « cellules souches pluripotentes induites » (iPS) à contribuer au développement embryonnaire, confirmant ainsi leur statut de cellules souches pluripotentes.
Bénéfices attendus
La maîtrise de la production in vitro d’iPS vraiment pluripotente permettrait d'éviter d'avoir recours à des cellules-souches embryonnaire. En effet, ces dernières ont des propriétés qu'on ne peut pas intégralement reproduire chez les iPS. On pourrait ainsi éviter des problèmes éthiques mais également pratiques en simplifiant la production d'une grande quantité de cellules-souches totipotentes tout en se passant d'embryon. Les recherches utilisant des cellules-souches totipotentes sont particulièrement importantes pour la médecine régénérative, car elles pourraient permettre, à terme, de générer des tissus in vitro pour des transplantations ou réparer des dommages corporels après accident ou maladie, mais également de modéliser la progression de maladies, faire de tests toxicologiques et développer la médecine personnalisée (en testant des traitements sur des tissus provenant des iPS du malade).
Procédures
Injection d'une suspension de blastocystes par voie basse (passage par voie vaginale) a l'aide d'une pipette adaptée. L'injection, qui ne dure que quelque seconde, se fera une seul fois, sur animaux vigile, et concernera la totalité des souris.
Impact sur les animaux
La méthode d’implantation choisie est non douloureuse et aussi peu invasive que possible car elle ne requiert ni chirurgie ni anesthésie. En effet, les femelles CD-1 seront simplement implantées par voie basse à l'aide d'une pipette adaptée.
Devenir
Le prélèvement des embryons nécessitera l'euthanasie des souris.
Remplacement
Un modèle in vivo est indispensable car il n’est pas possible de récapituler la totalité du développement embryonnaire in vitro, ce qui est critique dans notre projet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été calculé en se basant sur les pourcentages de réussite connus et publiés
Raffinement
Nous avons choisi une technique d’implantation ne nécessitant ni chirurgie ni euthanasie, préservant ainsi au mieux le bien-être des souris. 1) les animaux seront observés quotidiennement et leur état de santé évalué à l’aide d’une grille de score standard utilisée par notre équipe et les zootechniciens de l’animalerie (annexe 2). 2) Des points limites ont été définis afin d’anticiper toute souffrance à l’animal. En effet, les souris, comme tout être vivant peuvent développer des pathologies ou se blesser indépendamment des procédures menées. 3) Par soucis de respect de la hiérarchie de l’espèce, les groupes expérimentaux seront formés au moment du sevrage, et conservés intacts jusqu'à ce que les animaux soient utilisés pour la reproduction. 4) Les cages sont enrichies à l’aide de matériaux permettant l’expression des besoins comportementaux et physiologiques de l’espèce (morceau de bois, nestlets, lab nest, maison en carton,...).
Choix des espèces
Les modèles murins, et notamment la souche CD-1, sont parmi les modèles les plus répandus pour étudier le développement embryonnaire et pour pratiquer des implantations de blastocystes. De plus, les iPs ont été obtenus originellement à partir de cellules murines transgéniques. Enfin, les souris présentent les avantages d'être des mammifères avec un cycle de vie, et notamment une période gestation, très court, facilitant ainsi le déroulement de l'expérience. Les souris femelles CD-1 devront avoir atteint leur maturité sexuelle et peser au moins 26g. Nous estimons donc que 8 semaines est un âge adéquat.