Biologie du développement

348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le jour de leur naissance elles reçoivent une injection intracérébrale sous anesthésie, subissent à trois semaines un traumatisme crânien présenté comme léger, puis une batterie de tests comportementaux répétés à un, trois et six mois (open field, poutre et échelle, sensibilité tactile de von Frey, labyrinthe surélevé, boîte clair-obscur, labyrinthe de Barnes) et des IRM sous anesthésie. Le porteur choisit des souris de 21 jours pour représenter un enfant de 4 à 6 ans, présenté comme plus vulnérable. Il affirme qu'une fois réveillé l'animal "ne montre aucun signe de douleur" et que les conséquences à long terme ne sont "pas anxiogènes ou douloureuses".

Objectifs

Les études cliniques, et pré-cliniques chez les rongeurs, ont clairement montré que le traumatisme crânien (TC) est suivi d’un processus neurodégénératif dépendant d’une inflammation chronique au niveau du cerveau, entrainant des effets secondaires tels que formation d’œdème, modifications de la perfusion cérébrale, perméabilisation de la barrière hémato-encéphalique et mort neurale. Dans le cadre de cette étude, nous allons chercher à mieux caractériser les processus de neuro-inflammation et de dégénérescence au niveau du système nerveux central en se focalisant sur le rôle neuroprotecteur des cavéolines. Spécifiquement nous testerons l’effet neuroprotecteur de la protéine Cav-1 dans les astrocytes, cette protéine étant impliquée dans la régulation de la perméabilité de la barrière hématoencéphalique. Dans la mesure où les jeunes enfants sont des populations particulièrement vulnérables au TC et plus sensibles à l’inflammation, nous allons mener nos études sur un modèle juvénile de TC léger, réalisé sur des souris 21 jours après la naissance correspondant chez l’humain à un âge de 4 à 6 ans.

Bénéfices attendus

Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu). D’autre part ce projet déterminera si la protéine CAV1 représente une cible thérapeutique intéressante dans le cadre du développement de traitements post-trauma chez l’enfant.

Procédures

Les 348 animaux subiront tous les procédures non-terminales suivantes : 1. injection unique (virus inactivé non-pathogène) intracérébrale le jour de naissance sous anesthésie générale courte (moins de 15 minutes) adaptée à ce stade de développement. 2. traumatisme crânien léger unique sous anesthésie générale courte (5 minutes) pour moitié des animaux et anesthésie générale courte seule pour l’autre moitié (animaux contrôles dits « sham ») à 3 semaines après la naissance. 3. Exploration comportementale sur animal vigile répétée à 1 mois, 3 mois et 6 mois après le trauma. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes (Open Field), 2 tests de coordination motrice sur poutre et échelle (Beam walk et Foot Fault) d’environ 5 minutes chacun, 1 test de sensibilité tactile (Von Frey test) d’environ 5 minutes, 2 tests d’évaluation de l’état anxieux (Elevated Plus Maze et White/Black box) de 5 minutes et un test d’apprentissage spatial (Barnes Maze) qui nécessite des sessions quotidiennes de 5 minutes sur 5 jours. Chaque test sera effectué à un jour différent, ainsi chaque série comportementale comprendra 11 tests quotidiens d’environ 5 minutes répartis sur 2 semaines. 4. Exploration d’imagerie fonctionnelle par IRM réalisée sous anesthésie générale d’environ 1 heure répétée à 1, 3 et 6 mois après le trauma, un jour après le dernier test comportemental.

Impact sur les animaux

Notre projet repose sur l’utilisation d’un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile. Le traumatisme est réalisé chez l’animal anesthésié, et une fois réveillé l’animal ne montre aucun signe de douleur, il reprend immédiatement un comportement normal. Comme il s’agit d’un traumatisme léger, les conséquences à long terme ne sont pas anxiogènes ou douloureuses pour l’animal. Ces conséquences sont principalement des retards/défauts d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de la mobilité de l’animal. De plus, le modèle murin utilisé n’engendre pas de phénotype dommageable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, soit 348 animaux.

Remplacement

Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données (PubMed, Web of science, …) permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.

Réduction

Le projet concerne 348 souris mais permet de réduire le nombre d'animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet en effectuant un suivi longitudinal non invasif par imagerie. Nous planifions des groupes expérimentaux correspondant au nombre minimal permettant l'utilisation de tests statistiques visant à comparer les différents groupes : analyses multi-ANOVA avec répétition / analyses de régression entre les différents paramètres mesurés pour des tests comportementaux / IRM (voir annexes pour le plan expérimental).

Raffinement

Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme, en s'appuyant sur la mise en place d'une démarche de suivi des animaux permettant de limiter et traiter la souffrance éventuelle des animaux, et en employant les méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. L'ensemble des procédures mises en place dans le projet sera assuré par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales en adéquation avec les directives européennes. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. La procédure chirurgicale d’injection stéréotaxique chez le nouveau-né sera réalisée avec des protocoles d’anesthésie/analgésie permettant de supprimer toute douleur durant et après la procédure. Les traumatismes crâniens seront réalisés sur animal anesthésié en utilisant des impacts calibrés. De plus, la cage de réveil est placée sur un tapis chauffant afin de prévenir toute hypothermie. Lors de la réalisation des tests comportementaux, les animaux ne se retrouveront isolés que peu de temps : 5mn pour la plupart des tests et 1h au maximum. Les protocoles expérimentaux s'appuient notamment sur l'utilisation d'un agoniste opioïde, la Buprénorphine, afin de prévenir ou traiter la manifestation de douleurs.

Choix des espèces

Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. Dans ce projet, les souris seront injectées en intracérébral le jour de la naissance afin de permettre une transfection robuste 3 semaines plus tard. Les traumatismes crâniens seront donc réalisés sur des souris juvéniles à 21 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un TC en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 6 mois après le TC afin d’évaluer les conséquences à moyen terme.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un gène de l'autophagie est invalidé, puis les animaux passent des tests d'interaction sociale et d'ultrasons avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie ou une dislocation cervicale. Le porteur indique que les nuisances tiennent à une période d'isolement, au stress des tests et aux contentions. Il affirme que l'étude d'un défaut d'autophagie sur le comportement "ne peut se faire autrement" qu'in vivo, la retombée contre les troubles du neurodéveloppement restant renvoyée au long terme.

Objectifs

Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 54 aux Etats-Unis pour l'année 2014 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. Par ailleurs l’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autre les capacités d’interaction sociale et d’ultravocalisations, à différents âges, chez des souris pour lesquelles un gène de l’autophagie a été invalidé. Les échantillons prélevés à l’issue des tests nous permettront d’étudier les mécanismes d’autophagie et de mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant ce mécanisme cellulaire pour atténuer la survenue de ces troubles.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests de comportement non invasifs. Ils sont ensuite soumis à un protocole de quelques minutes (perfusion intracardiaque sous anesthésie se finissant par l’euthanasie de l’animal).

Impact sur les animaux

A notre connaissance, cette souris n’a jamais été étudiée d’un point de vue de son développement cérébral ou de son comportement. Le phénotype n’est à ce jour pas connu comme étant dommageable. Dans la procédure du présent projet, les animaux subissent des tests non invasifs de comportement, jusqu’à la perfusion intracardiaque (n = 120), pour laquelle un protocole d’anesthésie est mis en place ou jusqu’à l’euthanasie par dislocation cervicale (n = 120). Des nuisances et effets indésirables classés comme modérés sont attendus, en lien avec notamment la mise en place d’une période d’isolement pour les animaux, le stress induit par les tests de comportement, la réalisation de contention et d’injection de molécules anesthésiques.

Devenir

La procédure décrite dans ce projet sera réalisée sur des souris. C’est une procédure modérée qui concerne les 120 animaux issus de la lignée (animaux résidents) et les 120 animaux naïfs (visiteurs WT). L’ensemble des animaux sera euthanasié en fin de procédure.

Remplacement

L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.

Réduction

Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 240 souris. Le nombre d’animaux est réduit en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. D'une manière générale, conçu les lots sont conçus pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.

Raffinement

Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une grille de suivi (annexe) est en place. Paramètres environnementaux : humidité comprise entre 45 % et 65 %, température constante entre 20 à 24 °C. L’éclairage est circadien (8h/20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Le milieu est enrichi avec du matériel de construction de nid. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Un aliment enrichi et de l’eau sont mis à disposition directement dans la cage pour les animaux apathiques, surveillés 1 ou 2 fois/ jour. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans la procédure expérimentale (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture, perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids normal attendu selon la courbe de croissance standard de la souche C57BL/6Ncrl), alors il sera euthanasié. Pour le protocole de perfusion intracardiaque suivi des prélèvements de tissus, un protocole d’anesthésie adéquat est mis en place. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur. Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 240 souris.

Choix des espèces

L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique, ici Irgm1, est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle Irgm1 KO existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la mutation sur l’élagage synaptique et sur la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, seront étudiés : jeune (test à 20 jours de vie), adolescent (test à 33 jours de vie) et adulte (tests avant 90 jours de vie).

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par un cytomégalovirus, reçoivent jusqu'à six injections et deux irradiations aux rayons X, avant prélèvement des organes. Le porteur indique que les effets de l'irradiation, stress, douleur et baisse d'alimentation, ne pourront pas être atténués par un analgésique, celui-ci modifiant les réponses immunitaires étudiées. Il décrit une grille de score de la douleur menant à l'euthanasie au-delà d'un seuil et présente la souris comme le "modèle de référence en immunologie".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier les mécanismes contrôlant la génération et le renouvellement de cellules du système immunitaire au cours d’une infection virale : les cellules innées lymphoïdes de type 1 (ILC1). Les ILC1 jouent un rôle important dans le contrôle précoce d’une infection virale et du développement tumoral. Cette efficacité repose sur le développement de fonctions effectrices adéquates, mais également sur le maintien, l’expansion, et le renouvellement du nombre de cellules effectrices disponibles. Notre laboratoire étudie le développement des cellules du système immunitaire à l’état basal, notamment des ILC1, dans le but d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de moduler l’activité de ces populations cellulaires. Nous souhaitons maintenant étudier les mécanismes contrôlant la taille de la population d’ILC1 en conditions pathologiques. Pour mener cette étude nous utiliserons le modèle classique et couramment utilisé d’infection par le cytomégalovirus murin (MCMV), bien caractérisé sur le plan physiopathologique.

Bénéfices attendus

Les données obtenues dans le cadre de ce projet vont générer des retombées importantes dans plusieurs domaines. En termes de recherche fondamentale, elles vont permettre d’approfondir nos connaissances sur le développement de ce lignage cellulaire. Elles vont également nous fournir de précieux éléments nécessaires à la compréhension de la réponse immunitaire. En termes de recherche appliquée, ce projet s’inscrit dans le cadre de travaux visant à identifier de nouvelles cibles (cellulaires et/ou moléculaires) dont l’activité pourrait être manipulée à des fins thérapeutiques, tels que le développement de vaccins ou de traitements anticancéreux.

Procédures

Selon la procédure expérimentale, les animaux pourront recevoir une injection intraveineuse, plusieurs injections intra-péritonéales (jusqu'à 6 dans le cas d'un traitement au tamoxifène et d'une infection), être soumises à un prélévment de sang, et à 2 irradiations aux rayons X de 3.5 Gy chacune. Les injections et prélèvements intraveineux sont réalisés sous anesthésie générale. Le temps total de manipulation d’une souris ne dépasse pas 5 minutes. 80 animaux auront 1 injection intraveineuse et 1 prélèvement de sang. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur animaux vigiles. Le temps de manipulation d’une souris ne dépasse pas 1 minute. La totalité des animaux (280) recevront entre 1 et 6 injections. Le temps de manipulation nécessaire à une irradiation au rayon X (comprenant l’irradiation elle-même) ne dépasse quelques dizaines de minutes. Les 2 irradiations sont espacées de 6h. 80 animaux suivront ce traitement.

Impact sur les animaux

Stress lié à la manipulation. Douleurs ponctuelles liées aux injections. Stress, douleur et altération de l’alimentation suite à une irradiation (< 2 semaines). Ces effets ne pourront être atténués par un traitement analgésique. Les analgésiques modifient les réponses immunitaires antivirales et peuvent influer sur l’histoire naturelle de la maladie, donc sur la finalité expérimentale. Il est important de noter ici que bien que certaines procédures incluent l’utilisation de produits référencés comme toxiques (tamoxifène et toxine diphtérique (DT)), ou des infections virales (MCMV), mais leur utilisation et/ou mise en œuvre n’ont pas de conséquences attendues sur le bien-être animal dans les conditions utilisées dans ce projet.

Devenir

Toutes les procédures utilisées dans ce projet aboutissent à des prélèvements d'organes, et par conséquent à la mise à mort de la totalité des animaux

Remplacement

La multiplicité des populations cellulaires impliquées, le rôle de multiples tissus et structures tissulaires, ainsi que la complexité des interactions cellulaires et moléculaires dans le temps et l’espace, ne permettent pas le recours à des modèles in vitro pour l’étude du développement de la réponse immunitaire. Le recours à un modèle animal est donc essentiel à la réalisation de notre projet de recherche.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux requis pour ce projet : i) une étude préalable de la littérature a été réalisée pour éviter le recours à des expériences de mise au point, ii) nous utilisons des modèles de souris congéniques réduisant considérablement la variabilité inter-individus. L'utilisation de modèles statistiques applicables à des petits échantillons nous permettra d'évaluer la significativité et la robustesse des résultats sur des groupes d’animaux restreints et un faible nombre de répétitions, iii) nous utiliserons des techniques d’analyses à haut et très haut débits afin de maximiser l’acquisition de données pour chaque expérience.

Raffinement

Les souris seront élevées dans des animaleries conventionnelles et de niveau 3, exemptes d'organismes pathogènes spécifiques (EOPS). Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles (jusqu’à 5 animaux/cage), et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant leur entrée dans les procédures. Ils disposeront d’un environnement enrichi incluant du matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Les doses infectieuses utilisées seront des doses non-létales n’entraînant pas de signes de souffrance chez des souris de type sauvage (contrôles). Toutefois, certains animaux génétiquement modifiés sont plus sensibles aux infections. Pour les procédures où ces animaux seront utilisés, l’accès à la nourriture et à l’eau sera favorisé en positionnant de la nourriture humidifiée au fond de la cage. Il ne sera pas possible de remédier à leur souffrance dans la mesure où les analgésiques modifient également les réponses immunitaires étudiées, et donc, influent sur l’histoire naturelle de la maladie et sur la finalité expérimentale. Cependant, dans toutes les procédures décrites, une grille d’évaluation de la douleur sera appliquée (ci dessous) pour détecter, quantifier et suivre tout signe de souffrance, stress et anxiété relatifs à l’expérimentation en cours. Tout animal dépassant un niveau modéré sera immédiatement euthanasié. Perte de poids : 0 à 10% = +1, 10 à 20% = +2, >20% = +11. Apparence physique : normale = 0, absence de toilettage, signes de barbering et perte de poils = +1, pelage hirsute, lésions de peau minimes peu évolutives, écoulement oculo-nasal = +2, pelage très ébouriffé, lésions de peau évolutives, dos rond, yeux mi-clos = +3. Modification du comportement non provoqué (à distance) : normal = 0, changement mineurs, boiterie, hyperactivité = +1, mobilité réduite, isolement, léthargie = +2, automutilation, prostration, tremblements = +3. Modification du comportement après stimulation (à la manipulation) : normal = 0, prostration transitoire = +1, tremblements ou convulsions intermittents = +2, tremblements ou convulsions persistants = +3. Masses : aucune = 0, petite, non évolutive, sans gêne associée = +1, grosse, modérément ulcérée = +2, nombreuses, évolutives, largement ulcérée, gêne la marche ou l'alimentation = +3. Score total 10 : euthanasie

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence en immunologie. Le choix de ce modèle repose sur la proximité de son système immunitaire avec celui de l’homme, les conditions d’élevage peu coûteuses, un temps de génération court, ainsi qu’un nombre important d’individus par portée. La facilité et la rapidité de génération de souches mutantes, la très large disponibilité de souches mutantes préexistantes, le très grand nombre d’outils et de techniques d’analyses dédiées permettent également de limiter le nombre d’animaux nécessaire à un projet. Notre projet utilisera des souris adultes âgées de 6 à 15 semaines ayant un système immunitaire mature. Pour réaliser des chimères hématopoïétiques à l’aide de cellules souches de foie fœtal nous utiliserons des fœtus dans le dernier tiers de gestation, au stade embryonnaire 18.5 (e18.5). A ce stade, le foie contient des cellules souches spécifiques n’étant pas retrouvées chez des souris adultes.

2 178 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une plaie cutanée dans le dos sous anesthésie, puis des injections quotidiennes d'anticorps et de molécules activant ou inactivant leurs fibres nerveuses sensorielles, avant le prélèvement des ganglions nerveux, de la moelle osseuse et de la peau. L'objet est de décrire le dialogue entre nerfs sensoriels et cellules immunitaires pendant la cicatrisation, avec des retombées pour les grands brûlés renvoyées au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut se substituer à la souris, qu'il juge "incontournable".

Objectifs

En Europe, plus d’1,5 millions de personnes sont aujourd’hui traitées pour des lésions graves de peau (brûlures, coupures, ulcères). Dans la majorité des cas, ces lésions sont associées à une douleur chronique, une immobilité, une possible défiguration et très souvent des infections, pouvant entraîner des complications médicales graves, voire la mort…Les blessures ne guérissent pas car la couche profonde de la peau, le derme, ne se régénère pas. Le derme est une structure essentielle car il permet d’apporter les nutriments et l’oxygène nécessaire au bon fonctionnement de la peau. Il sert également de support mécanique à l’épiderme et aux structures annexes de la peau : les follicules pileux, les glandes sudoripares, ou encore les vaisseaux sanguins. Les stratégies mises en place pour régénérer le derme fonctionnel ainsi que ses appendices sont un enjeux sociétal majeur. En effet, la régénération dermique permettrait de rétablir la qualité de vie des patients. On sait aujourd’hui que l’innervation et les cellules immunitaires jouent un rôle important dans le maintien de l’intégrité de la peau, en condition physiologique. Cependant, leurs interactions n’ont pas été étudiées dans un contexte lésionnel. Nous proposons, dans ce projet, d’étudier le dialogue entre les cellules nerveuses de la peau et les cellules immunitaires après une lésion de la peau. Nos études préliminaires montrent qu’une dénervation est néfaste pour la réparation tissulaire. C’est pourquoi nous souhaitons désormais étudier de manière plus approfondie comment les cellules nerveuses contrôlent exactement l’arrivée de cellules immunitaires dans la peau pour améliorer la régénération. L’ensemble de ce travail va permettre de comprendre comment améliorer la régénération de la peau et devrait à terme permettre le développement des traitements qui pourraient bénéficier à des millions de patients souffrant de lésions cutanées graves telles que les brûlures et les traumatismes cutanés.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait mettre en évidence pour la première fois les dialogues entre nocicepteurs et cellules immunitaires au cours de la régénération cutanée. Cela pourrait etre bénéfique pour des milliers de patients souffrant de brulures graves ou de lésions traumatiques importantes.

Procédures

Lésion cutanée sous anesthésie gazeuse (Environ 30 minutes) : 1 par animal Injection : anticorps bloquant, 1 fois par jour par animal Injection: différentes sondes, 1 fois par jour par animal Injection de molécules permettant l'activation ou l'inactivation des fibres nerveuses sensorielles deds souris transgéniques: 1 fois par jour par animal Injection sérum physiologique et anti-inflammatoire: 15 min avant la chirurgie puis 24h après chirurgie, 1 fois par jour par animal (Toutes les injections se feront également sous anesthésie gazeuses flash ( 1 min / animal))

Impact sur les animaux

La lésion cutanée effectuée est locale (peau du dos) et transitoire. Généralement, la lésion est totalement fermée (ré-épithélisation) après 12-14 jours. Aucune infection n’a été reportée. En revanche, il est important de noter que les souris peuvent avoir une mobilité réduite pendant 48 à 72h et avoir des difficultés à se suspendre sur les grilles qui contiennent les croquettes. C'est pourquoi nous placerons des croquettes hulidifiées au sol, ainsi que de l'hydrogel. De plus, les souris recevront deux doses de metacam afin de réduire la douleur associée à cet acte chirurgical. Les différents produits injectés ne sont pas douloureux; cependant les souris seront anesthésiées pour recevoir ces injections car la préhension des souris ne sera pas possible en raison de la lésion. L'injection des produits se fera donc sous anesthésie et les injections des différents produits se feront lors d'une seule (et flash) anesthésie par jour.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures les animaux seront sacrifiés afin de prélever les organes, majoritairement les ganglions de la racine dorsale, la moelle osseuse et la peau afin d'étudier les intercations entre les cellules immunitaires, les fibroblastes et les neurones sensorielles.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les dialogues entre nocicepteurs et les neutrophiles au cours des processus de cicatrisation cutané. Il n'existe à ce jour aucun modèle cellulaire ou explant in vitro qui pourrait se substituer à l'utilisation d'un modèle animal. En effet, les nocicepteurs ayant leur corps cellulaire (Dorsal Root ganglion, moelle épinière) à distance de leur terminaison nerveuse (peau), leur étude ne peut se faire que sur des modèles animaux. De ce fait, les modèles de souris sont des éléments clés et incontournables pour étudier les dialogues entre Nocicepteurs-Neutrophiles-fibroblastes, in vivo. Les neuropeptides ou cytokines identifiées dans les processus de réparation tissulaire, seront testées sur des modèles d'explants de peaux humaines.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'étude nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle (12 souris par groupe et par temps pour les experiences de scRNA seq, ou 4 souris par goupe / temps / conditions pour l'immunofluorescence, par exemple). Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et de l'expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées).

Raffinement

Moins de 0,5% de mort ont été reportés par le porteur du projet au cours de ces processus de lésion de la peau. Lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera surveillé tous les jours. Après lésion cutanée, les souris seront monitorées deux fois par jour pendant les 24 premières heures, puis tous les deux jours jusqu'à ré épithélisation. De l’hydrogel sera placé dans le compartiment inférieur de la cage. De plus, nous analyserons les paramètres suivants : poids, température, signes extérieurs de stress tels que le comportement, la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Si lors d’une procédure expérimentale nous détectons une perte de poids importante ou bien un comportement apathique, les animaux seront alors euthanasiés.

Choix des espèces

Afin d'étudier les interactions entre les nocicepteurs et les neutrophiles, nous avons besoin d'utiliser des outils transgéniques permettant de suivre les nocicepteurs / neutrophiles ainsi que des outils permettant une inhibition des nocicepteurs. Pour cela, l'espece animale la plus adaptée est la souris. En effet, de nombreuses souris transgéniques sont d'ores et deja disponibles (dans le laboratoire) pour la modulation des nocicepteurs (activation, inhibition et depletion). Ainsi, la souris nous semble être la meilleure espèce animale pour étudier les interactions entre nocicepteurs / neutrophiles et fibroblastes au cours de la cicatrisation cutanée. Enfin, il a été montré que ce modele particulier de lésion se rapprochait le plus de mode de cicatrisation chez l'homme - en comparaison avec le simple modèle de punch de 8 mm ou 12 mm, qui cicatrise par contraction. Les animaux seront utilisés à l'age adolescent et adulte (30-35 jours après la naissance). Dans ce modèle, la régénération n'a été étuddiée qu'entre 28 et 35 jours après la lésion. Des données non publiées - à ce jour - tendent à montrer que la régénération du tissus cutanné diminue à partir de 6 mois d'âge.