Biologie du développement
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Production de souris humanisées pour le système immunitaire : modèle d’étude pour l’immunobiologie, les pathologies humaines et l’évaluation de traitements.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
3 260 souris vont être utilisé·es, dont 2 960 réutilisées dans d'autres procédures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent des cellules souches humaines après irradiation, puis des injections, gavages et prélèvements sanguins répétés jusqu'à huit fois, avec un suivi par imagerie. Il s'agit d'une plateforme produisant à la demande des souris "humanisées" pour le système immunitaire, fournies à des laboratoires pour tester vaccins et traitements. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non-humain et affirme qu'il est le "seul modèle d'hématopoïèse humaine expérimentale".
Objectifs
L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité et/ou leur impact sur le système immunitaire humain.
Bénéfices attendus
Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).
Procédures
irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) ) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) -administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie IVIS (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois)
Impact sur les animaux
Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.
Devenir
Les animaux portant un système immunitaire humain générés dans une procédure pourront être inclus d'autres procédures du même projet (par exemple pour booster certaines cellules humaines, augmenter le nombre de cellules myeloides humaines, valider l’activité d’immuno-modulateurs) ou d'autres projets à la demande des utilisateurs de la plateforme). Les autres souris utilisées pour valider l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort pour analyse des différents organes post-mortem.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.
Réduction
Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).
Raffinement
La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris humanisée présentant un système immunitaire humain (HIS) est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches isolées dans des souriceaux nouveau-nés de moins de 9 jours car les nouveaux nés sont plus permissifs à la greffe dans les premiers jours de vie. Le contrôle qualité par vérification du niveau d’humanisation dans le sang sera réalisé à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines. Ce nombre de semaines correspond au temps minimum nécessaire au développement du système immunitaire humain dans une souris à partir de cellules souches hématopoïétiques. Les souris HIS seront ensuite utilisées entre 12 et 25 semaines de vie. Cet intervalle d’âge correspond à la période pendant laquelle le système immunitaire humain est le plus stable chez la souris.
Réaction de sevrage et susceptibilité aux infections chez les souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont infectées par la bactérie Citrobacter rodentium ou reçoivent du sulfate de dextran sodique qui provoque une colite, avec pertes de poids, atteintes intestinales et parfois la mort, et subissent une imagerie quotidienne sous anesthésie pouvant durer jusqu'à quatorze jours. Le porteur reconnaît que l'infection conduit à la mort d'une partie des animaux et fixe des points limites, dont une perte de poids de 20 pour cent. Il affirme que les organoïdes in vitro ne reproduisent pas la propagation de l'infection à plusieurs organes, ce qui rendrait "essentiel" le recours à la souris.
Objectifs
L'objectif global de ce projet est de comprendre l'interaction entre la formation immunitaire au début de la vie et l'infection. Il aura deux objectifs principaux : (i) comprendre quelles cellules, bactéries, métabolites et molécules immunitaires sont impliqués pendant la réaction de sevrage pour entraîner les réponses à l'infection à l'âge adulte ; (ii) examiner comment l'infection au début de la vie affecte la réaction de sevrage. En fin de compte, nous voulons identifier de nouveaux traitements ou biomarqueurs du microbiote et du système immunitaire au début de la vie pour améliorer la réponse immunitaire à l'infection.
Bénéfices attendus
Le projet peut faire progresser les connaissances scientifiques et profiter à la santé humaine. On sait peu de choses sur la façon dont le microbiote intestinal au début de la vie forme l'immunité à l'infection tout au long de la vie. Ce projet a le potentiel d'ajouter des données importantes au domaine scientifique en fusionnant la microbiologie, l'immunologie et la recherche sur le développement précoce de la vie. Ce projet vise à identifier à la fois les biomarqueurs d'une formation immunitaire saine ou perturbée, ainsi que les composés potentiels qui peuvent restaurer une empreinte immunitaire saine. En recherchant et en testant différentes bactéries, métabolites et composés immunitaires, ce projet a le potentiel d'identifier des agents thérapeutiques qui pourraient être utilisés en médecine humaine comme de nouvelles thérapies de prévention de la dysrégulation immunitaire et des infections.
Procédures
Gavage oral, en une seule fois, de la bactérie, qui durera quelques secondes et échantillons fécaux non invasifs seront prélevés. Anticorps administrés par injection i.p. qui durera quelques secondes, une fois par jour pendant un maximum de 6 jours. Les souris sans germes seront traitées avec des composés dérivés du microbiote (des acides gras à chaîne courte et/ou bactéries filamenteuses administrés respectivement via six injections intrapéritonéale sur 14 jours ou par un unique gavage) de la naissance à 28 jours. Les animaux seront également soumis à une anesthésie à l'isofluorane pendant l'imagerie in vivo de l'infection et durera 5 à 10 minutes. Cela se produira tous les jours jusqu'à 14 jours pendant l'infection.
Impact sur les animaux
Un traitement antibiotique chronique chez les mères entraîne une prise de poids réduite chez les souriceaux qui se rétablit à l'âge adulte après l'arrêt du traitement antibiotique. Ce retard de prise de poids dure donc jusqu'à 4 semaines (0-4 semaines d'âge) chez les souriceaux. L'infection à C. rodentium entraîne une perte de poids, une réduction de l'activité, une pathologie intestinale et la mort. L'infection par C. rodentium sera menée jusqu'à 12 jours (pic d'infection) avec une surveillance quotidienne des souris. Le traitement au sulfate de dextran sodique (DSS) entraîne une perte de poids et une pathologie intestinale chez les souris. Le DSS sera utilisé jusqu'à 7 jours consécutifs à la fois (14 jours au total par souris) avec une surveillance quotidienne.
Devenir
Toutes les expériences nécessitent l'analyse des cellules immunitaires dans les tissus intestinaux et d'autres organes, ainsi que l'évaluation de la propagation de l'infection aux organes périphériques. La seule façon d'évaluer cela est de mettre les animaux à mort à la fin de chaque expérience. Tout sera mis en œuvre pour respecter les principes des 3R.
Remplacement
Aucune alternative non-animale n'est actuellement disponible pour mener cette recherche. Bien que les nouveaux modèles organoïdes tridimensionnels puissent partiellement reproduire in vitro les réponses d'un seul organe à une infection en combinaison avec des cellules immunitaires particulières, ces systèmes ne sont pas en mesure de reproduire la propagation systémique des infections à différents organes, ni le recrutement de la grande variété de cellules immunitaires dans l'intestin ou d'autres sites immunitaires tout au long de la période d'infection. Par conséquent, pour répondre à ces questions concernant la formation par le microbiote de l'immunité au début de la vie et des réponses aux infections, il est essentiel d'utiliser des modèles animaux.
Réduction
D'après la littérature (1, 2), les effectifs par groupe prévus permettent d'atteindre des tailles d'effet compatibles avec la question biologique, en prenant en compte la forte variabilité des données (microbiote) et le caractère doublement emboité du plan d'expérience (via les effets portée et cage). Le calcul de ce nombre tient compte d'un minimum de sang, de cellules et d'organes à prélever pour analyse et inclut pour chaque série d'expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il prend également en compte la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure les artefacts expérimentaux et donc les erreurs d'interprétation. Nous avons utilisé l'outil statistique G*power pour déterminer le nombre minimum de souris à utiliser par groupe pour obtenir des résultats significatifs, en tenant compte de la variabilité inhérente à l'expérience. Ces tests ont été développés à partir d'outils référencés. Les données seront analysées grâce à des modèles d’ANOVA ajustés sur plusieurs facteurs (sexe de l’animal, traitement). Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à prendre en compte grâce à des modèles emboîtés (modèles mixtes) tels que l’effet portée, cage et répétition de l'expérience.
Raffinement
Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles les animaux sont inclus est léger ou modéré. Le degré de souffrance modéré concerne les expériences conduisant à une infection et une maladie inflammatoire, dont la gravité peut être facilement suivie par la perte de poids, l'aspect général et le marqueur d'inflammation et donc la douleur estimée. Dans ces expériences, l'état des souris sera contrôlé quotidiennement par la pesée, l'aspect général et l'inspection des selles. Si la perte de poids dépasse 20%, si la souris présente des signes de détresse clinique grave (léthargie, posture voûtée permanente, piloérection marquée, absence de toilettage), ou si les selles contiennent du sang, l'expérience sera arrêtée et les souris souffrantes seront mises à mort.
Choix des espèces
Ce projet vise à explorer et comprendre les interactions complexes, dans le temps, entre les cellules du système immunitaire et le microbiote. Il est donc impossible de modéliser de telles interactions in vitro ou in silico, d’autant plus que relativement peu de choses sont connues dans ces interactions. Le modèle de choix est la souris, qui se prête idéalement aux expériences concernant le système immunitaire et le microbiote intestinal. Les souris que nous utiliserons seront des souris gestantes, des souris de naissance, des jeunes souris entre la période postnatale et le péri-sevrage (0-4 semaines), et des souris adultes (6-10 semaines). Ce projet étudie l'influence du microbiote intestinal pendant la grossesse et au début de la vie sur les résultats des infections à l'âge adulte. Il est donc nécessaire d'utiliser des souris gestantes et de tester leur progéniture tout au long de la vie jusqu'à l'âge de 10 semaines.
Etude des mécanismes physiologiques et pathologiques de la myélinisation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lésion de la moelle épinière est induite chirurgicalement chez chaque animal sous anesthésie, suivie d'injections quotidiennes pendant 10 à 30 jours, pour étudier la réparation de la myéline et une piste thérapeutique contre la sclérose en plaques. Le porteur indique des nuisances liées à la chirurgie, hypothermie, hémorragie et douleurs post-opératoires, avec un point limite à 20 % de perte de poids. Toutes les souris sont euthanasiées pour des prélèvements post-mortem, le porteur décrivant le recours à l'animal comme "indispensable" pour valider les résultats obtenus sur cellules.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’identifier et déchiffrer de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la formation de la gaine de myéline autour des cellules nerveuses du système nerveux central (SNC) et périphérique, en condition physiologique et pathologique. Ce projet vise à étudier le rôle d’un récepteur membranaire, impliqué dans plusieurs mécanismes cellulaires, dans le contrôle de la synthèse de la gaine de myéline du système nerveux central et périphérique au cours du développement et à l’âge adulte, chez la souris. Dans un second temps, ce projet nous permettra aussi de montrer que ce récepteur est une nouvelle cible thérapeutique favorisant la réparation des gaines de myéline du SNC, chez la souris. La validation de cette cible ainsi que des composés sélectionnés sont des études très prometteuses, qui pourraient permettre de repositionner ces molécules actuellement utilisées dans d’autres pathologies, pour le traitement de maladies de la myéline.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’identifier de nouveaux mécanismes régulant la formation de la gaine de myéline autour des cellules nerveuses, lors du développement normal et dans des conditions pathologiques. Notre projet de sélection et de repositionnement de molécules thérapeutiques nous a permis de sélectionner 3 molécules avec un fort potentiel thérapeutique qui seront validées grâce à l’utilisation d’un modèle murin de lésions de la myéline, présentant des similitudes avec les lésions observées chez les patients. A terme, ces études permettront d'améliorer le traitement des lésions de la myéline chez les patients et de démontrer un rôle de ce récepteur dans les lésions de la sclérose en plaques.
Procédures
Nous utiliserons des souris afin de déterminer le rôle d’un récepteur membranaire qui semble impliqué dans le processus de myélinisation du système nerveux. Dans l’objectif d’étudier son rôle, au cours du développement et au cours du processus de réparation de lésions de la myéline, nous induirons de petites lésions de la moelle épinière chez la souris (une lésion par animal, sous anesthésie générale). L’analyse de ces lésions à différents temps permettra d’analyser l’impact de la protéine étudiée sur les différentes étapes du processus de réparation des lésions de la myéline. Nous utiliserons 560 animaux dans cette procédure expérimentale. La durée totale et maximale de cette procédure chirurgicale est de 30 minutes par animal et 30 jours post-chirurgie. Pour le groupe des souris inductibles, une injection d’un produit est nécessaire avant l’induction de la lésion (1X par jour pendant 5 jours par i.p. d’environ 5sec). Le groupe des souris sauvages recevra après la lésion une des molécules sélectionnées ou le véhicule seul (1X par jour par voie i.p, durée d’environ 5sec, ou par voie PO durée d’environ 5sec, pendant 10 à 30 jours). Pour la poursuite de l’étude, et pour tous les animaux, il est nécessaire d’obtenir des échantillons biologiques dans un état le plus proche possible de l’état physiologique. Cela implique d’éviter et de prévenir toute dégradation post-mortem.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont majoritairement liées à la chirurgie : hypothermie, hémorragie, risque anesthésique, douleurs post-opératoires. Un stress peut aussi être observé chez l’animal à cause de la contention quotidienne et de l’injection d’un produit. Il est notamment possible d’observer l’apparition d’hématomes dus à l’injection répétée de ce produit.
Devenir
Les prélèvements et analyses seront réalisés en post-mortem ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Comprendre le rôle d’un récepteur, exprimé par la cellule responsable de la formation de la gaine de myéline, dans le système nerveux central, nécessite l’interaction de plusieurs types cellulaires et un environnement spécifique en fonction du stade du développement. Ainsi, le recours à l’utilisation d’un modèle animal est indispensable afin de valider nos résultats déjà obtenus par des modèles cellulaires en dehors de l’organisme dans l’objectif de comprendre comment l’activité de ce récepteur impacte la myélinisation et la remyélinisation. Concernant la partie validation thérapeutique, une analyse bio-informatique et l’utilisation de lignées de cellules, nous ont permis de réduire notre liste de composés à tester et par conséquent le nombre d’animaux à inclure dans notre étude. Nos résultats préliminaires suggèrent un fort potentiel de remyélinisation des 3 molécules sélectionnées, actuellement en phase clinique dans d’autres pathologies.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables. Nous prévoyons l’utilisation de 560 souris qui vont subir une procédure expérimentale modérée : - 280 pour notre procédure de démyélinisation focale afin d’évaluer l’effet régénératif dans les souris transgéniques. - 280 pour notre procédure de de démyélinisation focale afin d’évaluer la régénération de la myéline après traitement par des molécules pharmacologiques sélectionnées. Certaines variations expérimentales pouvant être observées dans ces deux modèles, le nombre d’animaux de chaque groupe est le minimum requis pour obtenir des données statistiquement significatives.
Raffinement
Les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage, bruit et espace) et les conditions d’enrichissements de l’environnement (maison et matériel papier-coton), d’alimentation et de soins quand nécessaires seront parfaitement contrôlées (directive européenne 2010/63/UE). Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie et analgésie pendant toutes les interventions quand cela s’avérera nécessaire. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désigné. Ils seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie définies par les normes européennes (soit 22°C +/-2° pour la température et entre 45 et 65% d’hygrométrie). De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi : animaux hébergés en groupe, nid en coton. Une alimentation adaptée est proposée aux animaux en croisement pour couvrir les besoins de la gestation et de l’allaitement. -Une période minimale de 7 jours d'acclimatation est respectée. - Plusieurs points limites visant à réduire la souffrance et/ou la détresse de l'animal sont respectés : - Apparence et position anormale : dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le côté, hypothermie au cours de la chirurgie (la température de l’animal étant monitorée durant l’acte) - Comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit, réduction de la mobilité - Perte de poids rapide ou progressive de 20 % (poids de référence pris le jour de la chirurgie) réalisée par pesée tous les jours pendant 5 jours puis 2 fois par semaine avant l'euthanasie - État de choc, léthargie, immobilité - Difficultés respiratoires. L'euthanasie de l'animal sera réalisée si l’on observe l’un de ces critères. Le vétérinaire désigné sera consulté en cas de complications ou effets indésirables constatés lors des procédures ou après celles-ci : présence de signes cliniques d’infection (ex: prostration, suppuration) afin de mettre en place les actions nécessaires.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix puisqu’en tant que mammifère, ses processus physiologiques se rapprochent de ceux décrits chez l’homme. Afin de comprendre le rôle d’un récepteur membranaire du facteur de croissance vasculaire dans la régulation de la myélinisation en condition physiologique et pathologique, il est nécessaire de réaliser des études in vivo, intégrant l’ensemble des interactions entre les différents types cellulaires et leurs environnements. Chez l’homme adulte, quand la gaine de myéline est endommagée ou détruite, un mécanisme de réparation se met en place afin de régénérer une nouvelle gaine de myéline afin de protéger les neurones de la dégénérescence. L’utilisation de modèles animaux, au stade équivalent (souris adulte), reproduisant certains aspects des pathologies démyélinisantes comme la sclérose en plaques, est indispensable pour évaluer la fonction de ce récepteur membranaire en contexte pathologique. Il existe aussi un ensemble d’outils (anticorps, lignées transgéniques permettant de tracer le devenir des cellules gliales) qui ont été développés principalement chez la souris. L’utilisation de la souris pour l’étude de ce récepteur au cours du développement du système nerveux et dans des conditions pathologiques est donc indispensable pour étudier le rôle de ce récepteur et identifier de nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique pour le traitement des pathologies de la myéline. Nous utiliserons des animaux des deux sexes afin d’éviter tout biais potentiellement lié au sexe dans notre étude.
Effet des milieux de culture de la fécondation in vitro sur l’activité métabolique de l’œuf et le phénotype adulte chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 420 femelles donneuses sont tuées pour collecter leurs ovocytes et 180 receveuses subissent une chirurgie de transfert d'embryons d'une heure, pour comparer des milieux de culture de fécondation in vitro. Le porteur indique une douleur modérée liée au transfert chirurgical et un stress léger lié aux manipulations. Toutes les souris sont euthanasiées à l'issue, le porteur affirmant que seuls des animaux peuvent fournir les gamètes nécessaires.
Objectifs
Nous enregistrerons par imagerie dès la fécondation les signaux du fonctionnement de l’œuf de souris nécessaires au développement embryonnaire en fonction du milieu de culture dans lequel ils sont incubés. Nous évaluerons après transfert d’embryons dans une souris receveuse les taux de naissance ainsi que les croissances des animaux issus des œuf incubés selon les différents milieux. Ce qui permettra d’établir une correspondance entre le fonctionnement de l’œuf, la croissance des animaux adultes et la composition du milieux de culture utilisé. Les objectifs sont : 1. Enregistrer dès la fécondation, les signaux déclenchés dans l’œuf et liés à son métabolisme qui provoquent le développement embryonnaire. Puisque ces signaux sont connus pour être sensibles à la modification du microenvironnement , nous les utilisons comme des indicateurs du fonctionnement de l'œuf en fonction de la composition du milieu de culture. 2. Obtenir des naissances et enregistrer les taux ainsi que les croissances des animaux jusqu’à l’âge adulte issus d’œufs incubés suite à la fécondation in vitro avec un milieu de culture.
Bénéfices attendus
L'impact à long terme des techniques d'assistance médicale à la procréation (AMP) demeure un sujet de préoccupation de santé publique important car les mécanismes inducteurs, issus des manipulations in vitro, sont encore mal compris. L'unique contrôle qualité des milieux destinés à l'AMP dénommé MEA (Mouse Embryo Assay) consiste à vérifier qu'au moins 80% des embryons de souris cultivés durant 72-96 h dans ces milieux atteignent le stade blastocyste. Nous allons compléter ce contrôle chez la souris en utilisant l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes et en analysant dans ces conditions l’impact sur l’activité de l’œuf au moment de la fécondation et à long terme chez l’animal adulte. Mieux comprendre l’impact de certains composants des milieux de culture afin d’optimiser leur formulation permettra d’augmenter le taux de développement de l’embryon jusqu’au terme et d’obtenir des animaux en bonne santé.
Procédures
Les souris donneuses d’ovocytes (420) auront 2 injections à 48h d’intervalle, durée quelques secondes. Les souris receveuses (180) auront 2 injections, durée quelques secondes. Chaque souris receveuse aura une chirurgie, durée 1 heure.
Impact sur les animaux
Stress léger relatif aux différentes manipulations des souris. Douleur modérée relative au transfert chirurgical d’embryons et douleur légère liée à la piqure lors des injections.
Devenir
La mise à mort des femelles donneuses est nécessaire pour collecter les ovocytes. En fin de procédure, après le sevrage des souriceaux, les souris receveuses ayant mis bas pour la première fois, ne pourront pas avoir un second transfert d’embryons. Elles seront euthanasiées.
Remplacement
Seul des animaux peuvent être utilisés pour fournir des gamètes et donc permettre le formation d’œufs et le développement d’un nouvel individu complet.
Réduction
Dans cette étude nous avons calculé le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des données suffisanteset avoir une bonne estimation statistique de la variabilité des réponses. Afin de réduire au maximum le nombre de receveuses utilisées, les receveuses accouplées qui ne seront pas utilisées seront gardées au repos et réutilisées 10 jours après.
Raffinement
Les méthodes expérimentales ont été choisies pour limiter tout stress et éviter toute souffrance lors des interventions sur les animaux. Avant chaque transfert chirurgical d’embryons, un traitement analgésique sera donné pour éviter toute douleur avant l’intervention. Puis un mélange anesthésique/analgésique sera administré afin de prévenir la douleur durant toute l’intervention chirurgicale. Le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe dans un environnement enrichi (cabane en cellulose et papier de ouate) et l’application de critères d’arrêts de l'expérience permettent de garantir le bien-être des animaux. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance et de mettre en œuvre des traitements appropriés ou de décider d’une euthanasie, en accord avec la cellule bien-être animal de l’installation expérimentale.
Choix des espèces
La souris est l’espèce modèle idéale pour ce projet car la durée de gestation est très courte (19-20 jours) et la croissance des animaux rapide (sevrage à 4 semaines). Cette rapidité permet de mettre en évidence des relations entre des changements qui ont lieu pendant la fécondation et leurs conséquences à l'âge adulte. Les lignées de souris utilisées dans ce projet sont des lignées de référence par rapport à nos précédentes études Les souris seront utilisées dès l’âge de 6 semaines, maturité sexuelle pour les femelles.
Impact du diabète maternel sur la fonction cardiaque
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
6 474 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Un diabète est induit chez les mères par injection sous-cutanée, avec prélèvements sanguins hebdomadaires à la queue pendant la gestation, échographie des descendants sous anesthésie sans réveil puis mise à mort pour prélever les cœurs. Le porteur indique qu'aucun analgésique ni anesthésiant ne peut être administré pendant la gestation car ces molécules perturbent le développement cardiaque, et classe en souffrance sévère les douleurs liées au diabète maternel et à la cardiopathie des descendants. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier une surcharge en glucose sur le cœur en développement et conclut à la nécessité d'un modèle animal.
Objectifs
Le diabète maternel augmente le risque de malformations cardiaques chez l'enfant de 5 fois. Cependant, les mécanismes par lesquels le glucose maternel perturbe le développement cardiaque reste encore largement méconnu. Le but de notre travail est d'acquérir une meilleure compréhension des cardiopathies induites par le diabète en utilisant des souris génétiquement prédisposées aux malformations cardiaques.
Bénéfices attendus
La connaissance des mécanismes impliqués dans les cardiopathies induites par le diabète permettra de mieux prédire les risques afin de personnaliser la prévention et d'identifier des cibles thérapeutiques pour des thérapies individualisées. De plus, nous serons en mesure de présenter une gamme plus large d'outils de diagnostic pour l'identification et la quantification des facteurs environnementaux contribuant aux cardiopathies.
Procédures
L’élevage de souris génétiquement modifiées nécessite de vérifier la présence ou absence de la modification génétique qui est effectuée grâce à une biopsie au niveau de la queue. L’induction du diabète est conditionnelle et inductible. Elle est obtenue via une seule injection sous cutanée d’un composé chimique particulier, qui n’induit pas de toxicité au stade où il est administré. Dans cette étude, nous ne pouvons pas administrer d’analgésiants ni d’anesthésiants, car ces molécules ont un impact sur le développement cardiaque. Les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de la glycémie chez les mères diabétiques, sont limités à un volume de 10 microlitres par animal et réalisés au niveau de la queue, une fois par semaine pendant la durée de la gestation. Les descendants issus de mères diabétiques ou non diabétiques seront échographiés sous anesthésie. Après l’échographie, les souris seront mises à mort afin de prélever les cœurs.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables causées durant les actes expérimentaux sont : 1) des nuisances légères. Tous les animaux issus des croisements sont marqués à l’aide d’une bague d’oreille à 3 semaines de vie. Dès le 7ème jour après l’induction de diabète chez les femelles, le taux de glucose sanguon sera mesurée 1 fois par semaine pendant la durée de la gestation jusqu’au sevrage de la deuxième portée. 2) des nuisances sévères : douleurs liées à 2 types de maladies : diabète maternel et cardiopathie des descendants.
Devenir
Les croisements seront arrêtés lorsque les objectifs du projet seront atteints. Les mères diabétiques et non-diabétiques et les pères prédisposés aux maladies cardiaques seront mis à morts selon la réglementation : les femelles après le sevrage des descendants, et les mâles à l’âge de 7 à 8 mois. Les descendants seront mis à mort selon la réglementation afin de prélever le cœur et de réaliser toutes les analyses moléculaires. L’échographie sera menée intégralement sous anesthésie générale au terme duquel les souris ne reprendront pas conscience. Après échographie, les souris seront mises à mort selon la règlementation afin de prélever les cœurs pour des analyses d’histologie. Les souris n’ayant pas le génotype désirable seront mises à mort selon la réglementation. Les souris ayant le génotype désirable seront gardées et transférées en zone d’expérimentation à l’âge de 8 semaines.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici, car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude d’une surcharge en glucose sur le développement du cœur. Nous ne pouvons pas expérimenter chez l'être humain les maladies cardiaques liées à une dérégulation du métabolisme du glucose. Il est donc nécessaire d'avoir recours à un modèle d'étude de la pathologie. Nous mettrons en croisement deux lignées de souris génétiquement modifiées pour générer un modèle unique permettant une surcharge en glucose chez des femelles susceptibles de donner naissance à des individus prédisposés génétiquement à développer une malformation cardiaque congénitale.
Réduction
Pour la première procédure, le nombre d’animaux utilisé par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour le maintien des différentes lignées et pour générer un nombre suffisant de souris afin de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. L’effectif n requis est basé sur notre expérience, nos statistiques effectuées précédemment ainsi qu’une vérification réalisée à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Pour la deuxième procédure, le nombre d’animaux nécessaire a été calculé grâce à un logiciel d’analyse statistique afin d’obtenir des résultats significatifs. Pour la troisième procédure qui concerne l’élevage d’animaux génétiquement modifié, le nombre d’animaux a été fixé selon les recommandations européennes en lien avec la création de lignée.
Raffinement
Un suivi journalier et un scoring au minimum deux fois par semaine seront réalisés sur les animaux afin d’établir les niveaux de douleurs, de souffrance et d’angoisse éventuellement générés lors du projet. Les souris dont les paramètres physiologiques seront modifiés seront mises à mort. Nous suivrons les descendants issus de mères diabétiques afin d'identifier le plus précocement possible l'apparition de phénotypes délétères (anomalies cardiaques congénitales). Ces cardiopathies sont détectables par échographie, une procédure classée sans réveil. Il est possible d’observer directement certains indices physiologiques de détresses liés à ces cardiopathies. L’accélération du rythme respiratoire, cyanose et perte de poids sont des signes communs de ces états qui peuvent facilement être observés. Si ces signes d’inconfort anormalement élevés étaient observés, l’étude serait limitée à l’analyse cardiaque des nouveau-nés faisant l’objet d’une DAP précédemment autorisée. Nous nous assurerons qu’aucun animal ne présente de signe d’infection (rougeurs, saignements, suintements).
Choix des espèces
Notre sujet de travail porte sur les malformations cardiaques causées par un diabète maternel. A ce jour, les souris génétiquement modifiées sont les seuls modèles animaux permettant de mimer assez fidèlement ces pathologies. En effet, il existe une excellente homologie des gènes cardiaques chez l'humain et chez la souris. Les cœurs humains et murins ont un développement anatomique remarquablement similaire. Par ailleurs, des outils génétiques robustes ont été développés chez la souris ce qui en fait l’un des meilleurs modèles d’étude pour comprendre la formation du cœur. Nous utiliserons des mères reproductrices âgées de 12 à 14 semaines afin d’exclure l’impact de l’âge maternel sur l’apparition d’anomalies cardiaques. Les souris issues de mères diabétiques et de pères susceptibles de transmettre une malformation cardiaque seront analysés à l’âge de 3 mois par échocardiographie. L’identification des souriceaux se fera après le sevrage (vers l’âge de 21 à 28 jours) et les souriceaux ayant le génotype désirable seront utilisés jusqu’à l’âge de 6 à 8 mois.
Elevage de rats GK à phénotype dommageable
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
420 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés en vie pour maintenir la lignée ou dirigés vers d'autres projets. Il s'agit d'élever une souche de rats spontanément diabétiques, la lignée GK, dont les individus développent hyperglycémie, polyurie et complications tardives comme des neuropathies ou des néphropathies. Le titre du projet qualifie lui-même ce phénotype de "dommageable". Le porteur destine la descendance à des recherches sur le diabète, la dysfonction érectile ou le syndrome des ovaires polykystiques, et décrit la souche comme "non remplaçable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de maintenir et faire prospérer une lignée de rat spontanément diabétique afin de pouvoir réaliser les expérimentations indispensables à l’activité du laboratoire en matière d’exploration préclinique dans les domaines de la dysfonction sexuelle mâle et femelle et des pathologies aux troubles métaboliques.
Bénéfices attendus
L’élevage de rats GK au phénotype particulier permettra l’exploration pré-clinique dans plusieurs domaines (métabolique, santé féminine, dysfonctionnement érectile) afin de sélectionner et tester l’efficacité de candidats médicaments afin de traiter ces troubles.
Procédures
La mesure de la glycémie nécessite une goutte de sang, prélevée à la queue du rat ou bien au niveau de la joue, sur une bandelette afin d’être lue dans un appareil de lecture adéquate. Ce prélèvement sera effectué au maximum une fois par mois, pendant une durée de 30 secondes à 1 minute maximum, chez les rats mâles de 9 semaines afin de choisir les reproducteurs.
Impact sur les animaux
Ces rats sont des rats diabétiques non obèses avec une hyperglycémie, une hypoinsulinémie et une polyurie. Ils peuvent aussi développer des complications tardives comme une rétinopathie, une microangiopathie, neuropathie ou une nephropathie, ou encore une inflammation des intestins qui peut mener à des diarrhées.
Devenir
À l’issue de cette procédure d’élevage, les animaux ont la possibilité d’être maintenu en élevage pour continuer de maintenir la lignée ou pourront être réutilisé le cas échéant sur d’autres des projets portant sur des études sur le diabète, mais aussi la dysfonction uro-génito-sexuelles ou le syndrome des ovaires polykystiques.
Remplacement
Le rat GK (Goto-Kakizaki) est une souche de rat présentant un diabète de type 2 sans obésité. Il s’agit d’un modèle précieux pour les études sur le diabète, mais aussi la dysfonction érectile, l’hyperactivité vésicale ou le syndrome des ovaires polykystiques. Dans ce contexte, l’élevage de rats GK permet une recherche préclinique pour pouvoir évaluer l’efficacité et sélectionner des candidats médicaments innovants pouvant présenter un intérêt dans le traitement de ces pathologies liées à l’expression naturelle du diabète de type II chez cette souche de rat. L’érection ou la miction sont des processus physiologiques nécessitant la coordination de plusieurs mécanismes physiologiques, ainsi, un modèle animal est requis pour pouvoir les étudier et évaluer l’érection et l’effet potentiellement bénéfique d’un nouveau médicament. De plus la souche de rat GK a été démontrée comme un modèle reproduisant les caractéristiques du diabète chez l’homme, incluant notamment une dysfonction érectile et une hyperactivité vésicale ayant fait l’objet d’un publication scientifique. De plus, il a été montré récemment que les rates GK développent spontanément un syndrome des ovaires polykystiques. L’éthiologie de cette pathologie est encore inconnue, et un modèle animal spontané est le meilleur outil pour les recherches scientifiques sur cette maladie. Ainsi le rat GK n’est pas remplaçable car il s’agit d’un modèle complexe qui ne peut pas être reproduit à l’aide d’une lignée cellulaire ou de modélisation informatique.
Réduction
Le nombre d’animaux sera maintenu au minimum et ajusté en fonction des demandes des équipes utilisatrices et du bon maintien de la lignée de manière à pouvoir renouveler les reproducteurs sans consanguinité.. De plus, le rat GK étant un modèle de plusieurs pathologies (syndrome des ovaires polykistiques, dysfonction érectile, urologie, diabète), la descendance mâle et femelle pourra être utilisée dans des projets incluants les procédures expérimentales correspondantes.
Raffinement
Une semaine d’habituation minimum est laissée aux animaux avant de pouvoir les regrouper en cages d’accouplement. Ils sont hébergés en groupe sociaux de 2 ou 3 (en fonction de leur poids/croissance,
Choix des espèces
Afin de limiter l’utilisation de gros animaux tels que le chien, les rongeurs et plus particulièrement le rat est l’espèce animale la plus largement utilisée dans le domaine de la médecine uro-génito-sexuelle. L’organisation anatomique des organes participant à l’activité uro-génito-sexuelle ainsi que leur innervation sont comparables chez le rat et chez l’homme. De plus le rat GK est un modèle spontané de diabète de type 2 et des pathologies uro-génito-sexuelles associées, ainsi que du syndrome des ovaires polykistiques. Les animaux mis en reproduction sont agés au minimum de 9 semaines afin d’avoir atteint leur maturité sexuelle. Le sevrage est effectué entre 4 et 5 semaines, selon le nombre et la taille des petits.
Utilisation d’embryons de lapin pour produire des cellules souches pluripotentes et contrôler leur capacité de colonisation embryonnaire.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
635 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tués (565), une partie réutilisée (60) et quelques individus transférés vers un élevage ou une association. Les femelles subissent une superovulation par sept injections d'hormones en quatre jours et des transferts d'embryons sous anesthésie avec interruption de gestation, les adultes des biopsies de peau et prises de sang. Le projet produit des embryons pour en cultiver les cellules souches et étudier leur capacité à coloniser un embryon hôte. Le porteur affirme impossible de remplacer la production d'embryons de lapin et présente la superovulation comme un moyen de réduire le nombre de femelles utilisées.
Objectifs
Les cellules de l’embryon très précoce ont une propriété unique, à savoir la capacité de produire tous les types de cellules d'un organisme adulte. Cette propriété peut être étudiée en injectant les cellules embryonnaires dans des embryons hôtes pour créer des chimères, c’est-à-dire des embryons constitués de cellules de deux origines différentes. Notre projet vise à comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régissent la capacité des cellules embryonaires à produire des embryons chimères chez le lapin. Ce projet nécessite l’utilisation de nombreux embryons et par conséquent de nombreuses lapines superovulées. Le lapin est ainsi choisi comme espèce modèle, d’une part pour sa capacité à produire de grandes quantités d’embryons, et d’autre part pour les caractéristiques communes de son développement embryonnaire avec celui de l’Homme.
Bénéfices attendus
Les cellules de l’embryon précoce représentent un outil extraordinaire à la fois pour la recherche fondamentale et la recherche appliquée, aussi bien en médecine humaine que vétérinaire, grâce à leur capacité à produire tous les types de cellules d'un organisme adulte. Les connaissances fonctionnelles acquises sur les cellules de lapin permettront d’améliorer les conditions d’utilisation des cellules humaines dans le cadre de thérapies cellulaires de maladies dégénératives. Elles permettront également de créer des modèles de maladies humaines, de thérapies cellulaires ou de développement embryonnaire.
Procédures
Trois types d’interventions sont prévues : 1. Prélèvements de peaux et de sang sur animaux vigiles adultes avec anesthésie locale : une fois par animal, durée de l'expérimentation 10 minutes (40 minutes avec le temps d'action de la pommade anesthésiante), 5 mâles et 5 femelles. 2. Traitement de superovulation sur lapines : une fois par lapine, 7 injections d’hormones sur 4 jours, 411 femelle. 3.Transferts embryonnaires sur lapines anesthésiées : 1 fois par lapine, durée de l'opération 1h15 jusqu'au réveil, 214 lapines prévues.
Impact sur les animaux
Les lapines subiront de courts désagréments liés aux injections d’hormones ou de produits anesthésiants. Elles éprouveront un léger stress lors de la réalisation d’inséminations artificielles et de faibles douleurs lors des chirurgies de transfert embryonnaire. Les lapins sentiront aussi un léger stress et une faible douleur lors de la réalisation de biopsies au niveau des oreilles.
Devenir
La plupart des procédures nécessitera la mise à mort des animaux (lapines productrices d'embryons et lapines receveuses d’embryons avec interruption des gestations). Les animaux adultes utilisés pour des prélèvements de peau et de sang seront réutilisés : les mâles pour fournir du sperme pour les reproductions et les femelles pour produire des embryons. Les femelles ayant subi un transfert embryonnaire avec un développement à terme pourront être réutilisées pour des productions d'embryons. Les mâles inféconds seront proposés à l'association GRAAL.
Remplacement
Du fait de la nature intrinsèque du projet, à savoir la compréhension de la capacité des cellules embryonnaires à créer des embryons chimères, il est impossible de remplacer la production d’embryons de lapin. Ces embryons seront utilisés pour mettre leurs cellules en culture ou pour tester les propriétés de celles-ci. Cependant, une fois les cellules embryonnaires en culture, différents tests cellulaires et moléculaires permettront de définir la qualité de ces cellules, afin d’étudier in vivo, uniquement celles montrant un réel potentiel à produire des embryons chimères.
Réduction
Le recourt aux superovulations permettra de diminuer d’un tiers le nombre de lapines utilisées pour produire les embryons, avec 20 à 30 embryons obtenus en moyenne par femelle au lieu de 8 à 12. De plus, nous utiliserons pour produire et transplanter des embryons, des lapines ayant déjà donner naissance à des lapereaux, dont on connait ainsi le potentiel reproducteur, afin d’éviter d’employer des lapines stériles. Le nombre d’embryons nécessaire pour les tests de colonisation embryonnaire (50 embryons par lignée cellulaire) a été choisi pour pouvoir valider les résultats d’un point de vue statistique et assurer la pertinence de l’effet biologique, à savoir l’existence d’une réelle différence dans les taux de colonisation entre cellules testées et cellules contrôles. De plus, ces tests seront progressifs avec un arrêt du développement des embryons injectés à 4, 6 ou 10 jours et une évaluation du niveau de colonisation obtenu, afin de ne poursuivre les analyses que des lignées cellulaires présentant de forts potentiels de colonisation embryonnaire et donc limiter au maximum le nombre de lapines utilisées.
Raffinement
Les animaux seront nourris deux fois par jour, avec le matin une dose de croquette appropriée à leur état et leur âge et une grosse poignée de foin et avec l'après-midi des légumes frais (choux, salade, persil, carottes, radis...). Les lapins seront surveillés tous les jours par des animaliers qualifiés, et régulièrement placés pendant 24h à 48h dans une aire de récréation de 1,2 m2 comportant du foin, différents jouets (bâton à mâcher, balle, chaîne pendue) et objets pour se cacher (carton, banc, tunnel) et leur permettant de courir et de bouger plus facilement. Le choix des animaux à placer en récréation dépendra du temps qu’ils resteront à l’animalerie, les mâles étant prioritaires car ils seront gardés environ 2 ans, ainsi que les femelles receveuses et/ou gestantes qui seront sur places pendant un à deux mois.
Choix des espèces
Le but de notre projet étant de comprendre les mécanismes qui permettent aux cellules de l’embryon très précoce de coloniser un embryon hôte et de donner toutes les cellules composant un organisme adulte, le lapin est un animal modèle intéressant à plusieurs titres. Il présente de nombreux avantages en élevage, tels que sa taille moyenne, sa prolificité, son intervalle de génération court et sa forte production embryonnaire. De plus, le lapin est plus apparenté aux primates que ne l’est la souris, et présente un développement embryonnaire et un mode d’implantation dans la muqueuse utérine identiques à ceux des primates. Ainsi les cellules de l’embryon très précoce de lapin permettraient de développer différents modèles d’étude de maladies humaines, de thérapie cellulaire ou de développement embryonnaire. Tous les animaux seront utilisés en âge de reproduction, soit entre 5 et 30 mois pour les mâles et entre 9 et 36 mois pour les femelles ayant déjà eu une mise-bas.
Evaluation de nouveaux traceurs d’imagerie dans un modèle murin de glioblastome sous-cutané chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une tumeur de glioblastome est greffée sous leur peau, puis elles reçoivent un traceur d'imagerie par voie intraveineuse sous anesthésie avant une séance d'imagerie de trois heures. Le porteur signale que la tumeur peut entraîner une perte de poids et des signes de souffrance comme le poil hérissé ou la prostration, une perte de plus de 15 % du poids déclenchant la mise à mort. Toutes sont tuées pour des analyses d'immunohistochimie, le porteur affirmant qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'"animal entier" pour étudier la biodistribution.
Objectifs
Nous travaillons sur le développement de nouveaux traceurs d’imagerie qui permettront d’explorer in vivo les 2 enzymes clés intervenant dans le métabolisme du tryptophane. Chez l’humain des perturbations de ce métabolisme, présent dans un grand nombre de tissus et cellules, sont associées à une très large diversité de pathologies, du cancer aux affections du système nerveux central. Ces perturbations se traduisent le plus souvent par une augmentation de l’expression de ces enzymes. Leur détection in vivo a donc un fort potentiel d’applications cliniques telles que la détection de tumeurs ou le développement de stratégies thérapeutiques visant à moduler cette expression. Des radiotraceurs dérivés du tryptophane utilisables en imagerie ont déjà été proposés pour de telles applications, mais leur utilisation est limitée notamment pour des raisons de complexité du radiomarquage. Une alternative est de développer de nouveaux traceurs issus non pas du tryptophane mais de composés (petites molécules) se liant aux enzymes impliquées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier de nouveaux traceurs d’imagerie capables de se lier spécifiquement à deux enzymes majeures du métabolisme du tryptophane. Après une caractérisation plus précise de leurs propriétés, ces traceurs pourraient être proposés pour le diagnostic, le suivi et le traitement de nombreuses affections cancéreuses ou neurologiques.
Procédures
injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse suivi d’une imagerie de 3h, 1 fois par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables peuvent être des dommages liés au développement de la tumeur sous-cutanée, soit une perte de poids de 15% , soit une modification de la physiologie ou du comportement . Dommages pouvant être liés à l’imagerie : chute de la température corporelle (diminution de 2°C et inférieur à 35°C), la respiration, les battements cardiaques des animaux. Un hématome peut se former suite à la cathéterisation de la veine caudale de l'animal. Des signes de souffrance (poils hérissés, prostration, …).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des études d'immunohistochimie complémentaires aux études d'imagerie.
Remplacement
L’objectif du projet étant de développer un traceur d’imagerie utilisable chez l’humain, aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donnée la complexité des processus mis en jeu, et ne permet d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude de la biodistribution/ciblage de nouvelles sondes d'imagerie.
Réduction
L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo au cours de ce protocole va permettre de réduire le nombre d’animaux utilisé qui est néanmmoins dicté par les groupes expérimentaux réquis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. La première étude permet grâce à l’imagerie d’évaluer la cinétique du radiotraceur de manière continue. Les moyennes de captation du traceur dans la tumeur et les différents tissus seront comparés entre les 3 groupes d’animaux en utilisant des tests statistiques appropriés au projet . Nous prévoyons d’inclure un total de 14 animaux/groupe (3 groupes), afin de garantir un nombre minimum exploitable de 10/groupe en raison de la probable hétérogénéité de la taille des tumeurs entre les animaux au sein d’un même groupe, et les difficultés imprévues pouvant survenir au cours des sessions d’imagerie (par exemple injection i.v. du traceur, problème d’anesthésie). Nous envisageons donc d'inclure 8 animaux/ traceur pour définir la cinétique puis 50 animaux/ traceur pour mesurer l'accumulation dans les tumeurs. Nous estimons à 5 le nombre de traceurs testés au cours de ce projet soit un total de 250 animaux.
Raffinement
Dès leur arrivée, les souris seront hébergées en portoir ventilé afin d’empêcher le phénotype dommageable lié à l’immunodéficience. Elles seront hébergées en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Elles seront observées une à 2 fois par jour et des points limites prédictifs (perte de poids >15% du poids initial, nécrose de la tumeur, détérioration de l'aspect général, de la physiologie clinique ou de la locomotion) nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance avant la session d’imagerie. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort. Avant l'imagerie, les animaux auront une phase d'habituation à l'environnement de la pièce pour éviter le stress lors de l'imagerie. Pour l’imagerie, les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse: cuve d’induction puis maintien pendant toute la durée de l'imagerie . Une protection occulaire sera appliquée pendant toute la durée de l’imagerie (3 h). Nous appliqerons également une crème anesthésiante sur la queue de l’animal lors de l’installation du cathéter à la veine caudale. L’animal sera maintenu durant toute l’expérimentation sur un tapis chauffant. Nous assurerons une surveillance continue du rythme respiratoire et de la température corporelle de l’animal et le surveillerons jusqu’à son réveil complet.
Choix des espèces
Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imagerie in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la biodistribution/le ciblage de nouvelles sondes d'imagerie. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Évaluation des vésicules sur la protection du cerveau du nouveau-né lors d’un accouchement avec complications
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
286 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. À 12 jours de vie, les ratons sont séparés de leur mère, subissent une incision au cou pour isoler la carotide puis 90 minutes d'hypoxie qui provoque une hyperactivité proche de crises d'épilepsie, avant une injection de vésicules extracellulaires, le porteur signalant 10 % de mortalité. Tous sont ensuite tués pour prélever leur cerveau. L'effet neuroprotecteur espéré chez le nouveau-né humain reste une hypothèse à démontrer, et le porteur affirme qu'un organoïde cérébral in vitro, mené en parallèle, ne peut pas remplacer l'animal in vivo.
Objectifs
Deux nouveau-nés pour mille présentent des lésions cérébrales d’origine vasculaires induites lors de leur naissance difficile. Ces affections sont à l’origine de troubles neurologiques moteurs et cognitifs complexes à traiter. Des prises en charge sont connues, comme l’abaissement de la température cérébrale du nouveau-né. Ce procédé n’est que partiellement efficace, 50% des nourrissons traités développent encore des troubles neurologiques. Il y a aussi l’utilisation de cellules souches fœtales. Mais cette prise en charge présente certains obstacles : variabilité des cellules lors de leur préparation au laboratoire, rejet de greffe possible, problèmes de sécurité et d’éthiques liés à l’injection de cellules souches fœtales vivantes provenant de prélèvement en fin de grossesse. Il existe des cellules souches générées au laboratoire, qui lèvent ces obstacles. Elles sont dotées de qualités similaires aux cellules souches embryonnaires, elles peuvent être produites en grande quantité et sont immortelles. En plus, il est possible de récolter les vésicules extracellulaires des cellules souches. Ces vésicules extracellulaires sont de très petits sacs contenant des molécules thérapeutiques intéressantes pour soigner les lésions cérébrales, elles servent à communiquer avec des cellules cibles présentes dans leur microenvironnement pour en moduler le fonctionnement, de plus, leur contenu peut être modifié en incorporant des protéines connues pour leur effet bénéfiques. Les vésicules extracellulaires sont connues pour favoriser la récupération fonctionnelle notamment dans un modèle d’hémorragie intra-cellulaire chez le rat, ou lors de la protection des fonctions cérébrales dans un modèle chez le mouton. L’objectif de ce projet est de tester la neuro-protection des vésicules extracellulaires grâce à un modèle de lésion cérébrale chez le raton à 12 jours de vie (correspondant à un nouveau-né humain). Le contenu des vésicules extracellulaires sera modifié par l’enrichissement ou l’appauvrissement de la protéine d’intérêt connue pour contrôler l’inflammation et atténuer les lésions cérébrales. Nous montrerons que la protéine d’intérêt est plus efficace lorsqu’elle est administrée avec les vésicules extracellulaires. Nous procéderons à un ensemble de technique permettant d’évaluer les lésions cérébrales ainsi que les différentes populations de cellules du cerveau.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons montrer dans ce projet que l’injection de vésicules extracellulaires naïves (c’est à dire naturelle, sans ajout de molécules) peuvent diminuer les lésions cérébrales, et donc avoir un effet neuro-protecteur. Les vésicules extracellulaires représentent une alternative sûre à l’injection de cellules souches vivantes et permettent d’éliminer les risques liés à la transplantation de cellules vivantes, tels que les rejets immunitaires, les problèmes éthiques, la transformation des cellules souches en diverses cellules non cérébrales. Par ailleurs, nous allons montrer, qu’en modifiant le contenu des vésicules extracellulaires en leur ajoutant la protéine d’intérêt, que l’effet neuro-protecteur des vésicules extracellulaires naïves peut être augmenté. Comme le suggèrent des données pilotes, il est peu probable que la protéine d’intérêt soit le seul facteur naturel responsable des effets bénéfiques des vésicules extracellulaires. Cependant, les effets de l'injection de la protéine d’intérêt seule détermineront si la protéine d’intérêt doit être dans des vésicules pour être active. Les résultats obtenus vont permettre de valider l’effet neuro-protecteur des vésicules extracellulaires enrichies en protéine d’intérêt dans un modèle de lésion cérébrale chez le rongeur avant d’être validé dans un modèle plus gros (cochon), en tant que données préliminaires pour une étude clinique chez l’humain.
Procédures
La chirurgie des ratons se fera à 12 jours de vie sous anesthésie générale. Cette intervention dure 10 minutes. Puis l’hypoxie se fera pendant 90min. Vingt-quatre heures après la chirurgie, les ratons recevront une injection de vésicules extracellulaires, cette administration dure quelques secondes. L’ensemble du projet se fera donc sur 4 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - Le jour de la chirurgie : du stress, de la faim et de l’hypothermie sont causés par l’isolement d’avec la mère. Une douleur au niveau de l’incision du cou pour isoler la carotide. Au moment de l’hypoxie on observe une hyperactivité ressemblant à des crises d’épilepsie. - Nous observons une stagnation de la prise de poids pendant 24h après la chirurgie - Les ratons peuvent avoir une douleur locale lors des injections intra-péritonéal ou sous-cutanées - La mortalité observée dans ce modèle est de 10% - Les ratons des groupes hypoxie ischémie prennent moins de poids que ceux des groupes contrôle (SHAM).
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à la fin du projet pour prélever leurs cerveaux afin de réaliser des analyses histologiques, ce qui correspond à l’analyse du tissu cérébral.
Remplacement
En parallèle de ce projet, une méthode alternative sera menée avec un modèle validé de cevreau humain fabriqué in vitro (appelé organoïde cérébral). Le but est de réaliser les mêmes traitements que sur les ratons pour ainsi comparer les résultats et d’élucider avec précision les mécanismes d’action des vésicules dans un contexte cellulaire humain. Toutefois, ce modèle récent a ses limites et ne peut remplacer totalement le modèle animal. Il n’y a pas d’alternative parfaite à un modèle in vivo pour étudier les effets de la réduction du flux sanguin/oxygène cérébral sur le cerveau et les anomalies du développement qui en découlent. La relation poumon/cerveau/circulation sanguine ne peut être modélisable in vitro. L’effet potentiellement neuro-protecteur des vésicules ne peut se faire que sur un organisme entier car il est difficile de reproduire in vitro la diminution du flux sanguin et une diminution de l’oxygène circulant.
Réduction
Nous utiliserons des données publiées dans les revues scientifiques afin de ne pas reproduire des expériences non utiles. Nous savons que la mortalité du modèle est de 10% nous compenserons en conséquence. Par ailleurs, compte tenu de l’hétérogénéité du modèle (réaction différentes selon les ratons), les groupes seront de 20 individus (10 mâles et 10 femelles pour mettre en évidence un éventuel effet sexe) pour obtenir des données analysables pour chaque point d’analyse (à quatorze et quinze jours de vie). Vingt animaux sont prévus pour transmettre le modèle à 2 nouvelles personnes. Si l’apprentissage se fait bien, nous en utiliserons moins. Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés.Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés. En conséquence, le nombre d’animaux dans notre étude sera maintenu au minimum nécessaire (286 ratons) afin d’obtenir des résultats analysables par les tests statistiques.
Raffinement
Afin de limiter le stress d’un nouvel environnement, nous procéderons à l’apprivoisement de la rate avant la mise bas. Nous l’habituerons à nous et aux bruits de déplacement dans la salle de chirurgie. Nous procéderons à l’enrichissement de l’hébergement avec du papier doux absorbant pour la fabrication du nid. Au moment de la naissance, si le comportement de la rate est anormal, c’est à dire qu’elle n’a pas fabriqué de nid et qu’elle ne s’occupe pas des petits, nous procéderons à une adoption par une autre rate. L’adoption se fera avec une rate qui pourra recevoir un nombre de ratons de manière raisonnable. L’adoption se fera en frottant doucement le raton avec la sciure de la nouvelle cage. Trente minutes avant la chirurgie, les ratons recevront une dose d’antidouleur, puis les ratons seront séparés de leur mère par groupe de 5 afin d’éviter un isolement trop long de toute la portée. Cinq ratons seront hébergés dans un environnement enrichi (sciure de la cage d’hébergement, papier doux absorbant et température contrôlée) pendant 1h. La chirurgie se fera sous anesthésie générale ainsi qu’une anesthésie locale sur un coussin chauffant. Dès que les ratons seront réveillés ils seront remis à leur mère pour recevoir ses soins et se nourrir. Pour finir, les ratons seront mis dans la couveuse reliée à la bouteille de mélange gazeux à 8% d’oxygène. On surveillera l’état général des ratons dans le nid à l’aide d’un document appelé « arbre décisionnel ». Il permet d’observer les ratons dans la portée sans les déranger à nouveau car le jour de la chirurgie les soins apportés par la mère sont importants. Dès qu’un animal ne va pas bien il est vite repéré car il est blanchâtre et/ou immobile. Une surveillance sera effectuée à +24h après la chirurgie afin de s’assurer de la bonne cicatrisation de la plaie et de la prise de poids. On surveillera la mobilité, la présence de lait dans l’estomac du raton. Les injections intra-péritonéales et sous cutanées seront réalisées avec une aiguille adaptée au raton (courte et fine) et par du personnel formé. Elles seront réalisées en même temps que la surveillance des points limites à 13 jours de vie afin de ne pas déranger plusieurs fois la portée.
Choix des espèces
Les revues scientifiques indiquent que les rats fournissent des informations pertinentes et qu’ils se remettent bien de la chirurgie. Le raton de 12 jours correspond à un nouveau-né à terme, au développement du cerveau et la maturation des cellules du système nerveux.
Rôle de l’inflammation périnatale dans les troubles neurodéveloppementaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
3 433 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent pendant leurs cinq premiers jours de vie des injections d'une cytokine inflammatoire qui provoquent déshydratation, retard de croissance et, dans cinq à dix pour cent des cas, la mort, puis subissent une série de tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature. Le projet étudie le rôle des microglies dans les troubles neurodéveloppementaux liés à l'inflammation périnatale, chez les mâles et les femelles. Le porteur affirme que ces mécanismes ne peuvent être étudiés que sur l'animal vivant et fixe pour objectif le transfert des résultats à l'humain.
Objectifs
Les troubles neurodéveloppementaux ont des causes multiples y compris environnementales. Un lien entre des épisodes inflammatoires pendant la vie périnatale et une augmentation du risque de développer des troubles neurodéveloppementaux chez le descendant ont été démontrés. Récemment, le rôle des microglies (cellules immunitaires du cerveau) dans ces troubles a été mis en évidence chez la descendance mâle. Cependant, aucune donnée sur la descendance femelle, ni sur les troubles cognitifs de la descendance n'ont été générées. Ce projet se base sur un modèle d'inflammation périnatale. L’objectif est d'étudier le rôle des microglies dans les troubles cognitifs neurodéveloppementaux chez le mâle et la femelle sur modèle murin.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'établir le rôle des microglies dans la mise en place des troubles cognitifs à l'âge adulte des descendants mâles et femelles après inflammation gestationelle. Cette étude permettra d'obtenir des données concrètes sur les deux sexes, ce qui n'est actuellement pas disponible, mais également sur la sphère cognitive, très peu documentée à ce jour. L'approche par l'utilisation d'une drogue permettant la recolonisation microgliale permettra par ailleurs d'établir une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement des troubles neurodéveloppementaux.
Procédures
Tests comportementaux à la période juvénile et à l'âge adulte (6 tests en juvénile et 5 à l'âge adulte) – quelques minutes par test. Injections intrapérionéales pendant les premiers jours de vie - quelques secondes
Impact sur les animaux
Les injections réalisées sur les souriceaux durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation avec leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Les injections de cytokine inflammatoire induisent une inflammation, par conséquent les souriceaux peuvent montrer des signes de déshydratation, ont un retard de croissance, et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris injectées avec une solution neutre. Ces effets perdurent environ jusqu’au quinzième jour de vie. Les injections en général peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie abdominale interne chez les souriceaux, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entraîner des nuisances modérées notamment durant les tests sur les réponses émotionnelles, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.
Remplacement
L’étude des microglies (cellules immunitaires du cerveau) au cours du développement nécessite des modèles non humains. L'étude des effets de l’inflammation maternelle ne peut se faire de manière fine chez l'homme et nécessite de fait l'utilisation d'animaux vivants. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser ces étapes du développement cérébral et la recherche bibliographique indique que la réponse inflammatoire correspondant à nos modèles n'est pas développée in vitro à ce jour. La proximité des microglies humaines et des souris permettra un transfert à l'homme à la suite de ce projet, ce qui reste notre priorité et notre objectif scientifique premier : comprendre chez l'homme le développement des microglies durant les phases développementales.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, nous avons choisi un nombre minimal permettant d'observer des différences menant à des conclusions statistiques. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre de destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer sur une population cellulaire triée à partir de structures cérébrales. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude.
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientifique.
Choix des espèces
Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Leurs données préliminaires ont été générées chez la souris et l'accrétion de données nouvelles sur modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. De plus, les microglies de la souris et de l'homme partagent de nombreux gènes en commun et permettent de conduire à une valorisation des données chez l'animal par transfert chez l'homme, rendant cette étude pertinente au vu du choix du modèle animal. Les analyses seront conduites au cours de la période post-natale pour le comportement juvénile (P3-P16) et à l'âge adulte (après P60) pour l'évaluation comportementale et les études biologiques subséquentes.
Etude des effets de manipulations nutritionnelles sur l’intégrité de la synapse glutamatergique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
2 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Certaines reçoivent une injection à un jour de vie, puis les animaux passent sept tests comportementaux, dont un test de peur conditionnée avec choc électrique et des tests de mémoire spatiale, avant d'être tués pour prélever leurs structures cérébrales. L'objectif est de comprendre comment une carence en oméga-3 pendant le développement modifie les réseaux de neurones, à l'aide de souris transgéniques convertissant les oméga-6 en oméga-3. Le porteur qualifie le recours à l'animal de "nécessité" expérimentale et affirme n'avoir trouvé aucune méthode de substitution dans les bases de données.
Objectifs
Le but général de ce projet est de comprendre l'impact de manipulations des lipides oméga-3 et oméga-6 sur le développement de réseaux de neurones et l'activité d'autres cellules du cerveau. Pour ce faire, nous utiliserons deux modèles de souris transgéniques permettant la conversion des oméga-6 en oméga-3 dans toutes les cellules pour le premier modèle ou spécifiquement dans les neurones ou les microglies du cerveau pour le deuxième modèle.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de comprendre comment le statut cérébral en omégas influence le développement de sous-réseaux neuronaux et les fonctions cognitives associées.
Procédures
Certains animaux subiront 1 injection unique en sous-cutané d'une molécule à 1 jour post partum. L'injection ne dure que de 3 à 5 secondes. A la fin des expériences, les animaux seront mis à mort, préalablement injectés avec une solution analgésique puis une solution anesthésique. Les injections d'analgésique et anesthésique ne dure que de 3 à 5 secondes. Les animaux seront soumis à sept tests comportementaux, d'une durée de 5 à 15 min, à la fréquence d'un test tous les deux jours, visant à mesurer les comportements émotionnels et la mémoire spatiale.
Impact sur les animaux
L’injection de la molécule à 1 jour post partum peut induire un ralentissement du développement de la descendance avec pour conséquence un poids diminué par rapport aux animaux non traités à cette molécule, poids qui est retrouvé à l'âge adulte. Le temps d’injecter toute la portée, les petits sont séparés de leur mère pendant un cours moment et sont manipulés par l’Homme, ce qui peut créer un léger stress. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux. Le test de peur conditionnée n'induit pas de généralisation de comportement de peur chez l'animal, indiquant seulement un niveau d'inconfort lié au choc modéré. Aucun signe de perte de poids ou d'altération général de la santé de l'animal n'est induit avec ce choc.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.
Remplacement
L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en omega-3 sur le fonctionnement du neurone et de la microglie chez la souris pendant le développement. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également à récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les analyses biochimiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien.
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.
Choix des espèces
L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence en oméga 3 pendant le développement sur la mise en place du système nerveux central. Pour ce faire, nous utilisons des modèles souris. Une partie de nos hypothèses ont été formulées sur la base de données obtenues in vitro. Cependant dans la cadre d’une étude faisant le lien entre la nutrition et le cerveau, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Enfin, les modèles génétiques que nous voulons utiliser pour nos études ont été construits chez la souris. Les animaux reçoivent un régime alimentaire (carencé ou équilibré en omega 3) durant toute la durée de leur développement périnatal (gestation et allaitement). Nous nous intéressons à l'effet d'une approche transgénique permettant de convertir les oméga 6 en oméga 3 sur cette altération nutritionnelle durant le développement sur l'inflammation microgliale et la mise en place de l'architecture neuronale à la fin du développement post natal à 3 semaines (au sevrage) mais également l'impact de cette carence durant la période périnatale et la période de l'adolescence sur le jeune adulte (10 semaines).
Etude de la régulation des divisions méiotiques de l’ovocyte chez le xénope
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
92 xénopes femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque femelle subit une ou plusieurs ovariectomies partielles par laparotomie sous anesthésie, jusqu'à trois fois avec six mois de repos entre chaque, avant d'être tuée une fois ses ovaires entièrement prélevés, le tout étalé sur cinq ans. Les ovocytes prélevés servent à étudier in vitro les mécanismes de la division méiotique, une recherche fondamentale sur le cycle cellulaire. Le porteur affirme qu'aucune cellule ne se différencie en ovocyte in vitro et que l'animal ne peut donc pas être remplacé.
Objectifs
Le développement, la croissance et la reproduction des organismes vivants sont assurés par la division de leurs cellules. Les cellules somatiques en prolifération se divisent par la mitose. Les cellules germinales mâles et femelles, ovocytes et spermatozoïdes, se divisent par une division particulière, la méiose, qui consiste en la succession de deux divisions, la méiose I et la méiose II, sans duplication de l’information génétique. Ce processus réduit de moitié l’information génétique parentale et permet de former un nouvel individu à la fécondation par la fusion des gamètes mâle et femelle. Chez la femelle, la formation d’un ovocyte fécondable se fait dans l’ovaire lors de l’ovogénèse. Les ovocytes prolifèrent, débutent la méiose puis se bloquent en début de méiose I (Prophase I). Ils subissent alors une phase de croissance pour accumuler les acteurs développement embryonnaire et acquérir la capacité à reprendre la méiose. Au moment de l'ovulation, les ovocytes qui ont finalisé leur croissance, les stades VI chez le xénope, reprennent la méiose en réponse à une hormone, la progestérone. Ils progressent alors jusqu’en métaphase de méiose II (métaphase II) et se bloquent à ce stade pour attendre la fécondation chez les vertébrés. La progression de la prophase à la métaphase II est la dernière étape de l’ovogénèse et est fondamentale pour la reproduction sexuée. Le but de ce projet est d’élucider les mécanismes moléculaires qui régulent la méiose femelle et qui permettent donc la formation d'embryon viable après fécondation. Pour cela, nous utilisons comme modèle expérimental l’ovocyte d’un amphibien, le xénope. Les régulations méiotiques sont conservées avec les mammifères. Les ovaires de cette espèce contiennent des milliers d'ovocytes à tous les stades de l'ovogénèse. Ils sont collectés par laparotomie puis mis en culture pour analyser la méiose femelle in vitro. Notre projet est ainsi au cœur du domaine de la reproduction sexuée, du cycle cellulaire et de la fertilité chez les vertébrés. Pour ce projet, 92 animaux seront utilisés dans le respect de la règle des 3Rs.
Bénéfices attendus
L'ovocyte est un modèle de référence pour l'étude de la division cellulaire. Les découvertes de ce projet bénéficieront à la communauté scientifique internationale qui étudie la reproduction sexuée sur le court-terme. Les régulations de la méiose femelle sont conservées entre vertébrés, y compris chez les mammifères. La dérégulation des complexes Cdk1 et des Cyclines est associée à des problèmes de stérilité chez la femme. En ce sens, notre recherche pourrait avoir des retombées dans le domaine de la procréation médicalement assistée en élucidant les mécanismes de formation d’un ovocyte parfaitement fonctionnel sans lequel il n'y a pas de reproduction. A plus long terme, notre projet bénéficiera également à la communauté scientifique internationale qui travaille sur le contrôle de la division cellulaire. En effet, la méiose femelle partage des acteurs et des mécanismes communs avec ceux de la mitose, le mode de division qui assure le renouvellement des tissus et des organes. Si dérégulées, la kinase Cdk1 et les Cyclines conduisent à une prolifération cellulaire anarchique à l’origine de processus cancéreux dans l'espèce humaine. Notre recherche pourrait ainsi avoir des retombées dans le domaine du cycle cellulaire et révéler des mécanismes insoupçonnés de contrôle de la division méiotique et mitotique.
Procédures
Le prélèvement de lobes ovariens (laparotomie) est effectuée par une opération chirurgicale de quelques minutes, maitrisée depuis plus de 20 ans. Elle est réalisée sous anesthésie générale. Un animal est opéré toutes les semaines (43/an). Les ovaires de Xénope ayant la capacité de régénérer les ovocytes, les femelles peuvent être opérées jusqu'à 3 fois, avec une période de repos de 6 mois entre chaque chirurgie. Un total de 92 animaux sera utilisé sur 5 ans.
Impact sur les animaux
Chaque xénope sera soumis à une ovariectomie partielle sous anesthésie générale pour une durée totale de 30 minutes. L’anesthésie n’a que peu d’effets indésirables et les animaux sont surveillés pendant toute la procédure. Pendant l'ovariectomie, les risques d’infection sont très faibles. Les instruments utilisés sont stériles et à usage unique. La chirurgie pouvant induire de la douleur post-opératoire de quelques jours, l’animal est isolé dans un aquarium et surveillé quotidiennement, y compris le week-end, pour s’assurer de son bien-être et de sa bonne cicatrisation pendant 14 jorus. Si l’animal montre des signes de souffrance (difficultés à nager ou à manger, comportement d’évitement) ou une mauvaise cicatrisation (nécrose, gonflement, hyperinflammation), il sera mis à mort.
Devenir
Les animaux sont mis à mort une fois que la totalité des ovaires est prélevée.
Remplacement
Notre équipe de recherche fondamentale étudie la méiose de l’ovocyte de vertébré en utilisant comme modèle expérimental, Xenopus laevis. Cette étude est élargie à celle plus générale des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire des eucaryotes. Notre matériel de base est donc l’ovocyte. Chez les vertébrés, les ovocytes reprennent la méiose au moment de l’ovulation et se divisent dans le tractus génital de la femelle, ce qui les rend difficile d'accès. Enfin, aucune cellule ne se différencie en ovocyte in vitro. Nous sommes donc amenés à prélever et à cultiver in vitro des ovocytes de Xénope de la prophase à la métaphase II pour étudier les différents stades de la méiose femelle. L’animal ne peut donc pas être remplacé dans le cadre de notre projet et requière l’utilisation d’animaux vivants.
Réduction
Dans le respect de la règle des 3Rs et afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, l'ovariectomie partielle (laparotomie) est planifiée chaque semaine et coordonnée avec l’ensemble des membres de l’équipe. Une veille bibliographique hebdomadaire est également conduite pour ne pas reproduire des expériences déjà réalisées. Les femelles Xénope peuvent être opérées plusieurs fois en respectant une phase de repos de 6 mois entre chaque chirurgie pour que l'ovaire renouvelle son stock d’ovocytes bloqués en prophase, et cela pendant plusieurs années. Cela permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs du projet et un total de 92 animaux sera utilisé sur 5 ans.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux sont acclimatés à leur nouvel environnement pendant 2 semaines. Les femelles sont surveillées tous les jours, week-end inclus, et sont maintenues dans des conditions d'hébergement parfaitement adaptées à leur bien-être (cycles jour/nuit de 12h, 19°C, eau déchlorée, filtrée et renouvelée en totalité deux fois par semaine). Leur milieu est enrichi dans les aquariums par la présence de nénuphars en plastique et de gouttières de PVC de taille différente et adaptées à la taille des animaux, ce qui leur permet de s'isoler et de se cacher. La procédure expérimentale se déroule sous anesthésie générale et l’euthanasie. elles sont pratiquées au sein de l’animalerie dans une pièce dédiée à l'expérimentation afin de ne pas stresser les animaux hébergés. L'état de santé des animaux est surveillé pour intervenir dès le moindre signe de souffrance. Une grille de score et l'utilisation de points limites adaptés (mauvaix état de la peau, desquamation, amaigrissement excessif, défauts de nage, blessure) sont prévus afin de prendre en compte d'éventuels effets inattendus et de décider de la mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
L’ovocyte de Xénope est un modèle employé depuis des décennies pour analyser les mécanismes biochimiques qui régulent le cycle cellulaire et la division. Chaque ovaire contient des milliers d’ovocytes. Les ovocytes collectés sont de très grande taille (1.2 mm de diamètre) et sont manipulés individuellement pour réaliser des expériences de gain et de perte de fonction par micro-injection. Ils sont très riches en protéines pour des approches de biochimie sur cellule unique ou large échelle. Ce modèle est donc particulièrement adapté à notre thématique de recherche. De plus, les résultats ne peuvent être obtenus qu’à partir d’ovocytes bloqués en prophase qui sont localisés dans l'ovaire. Seules les femelles adultes ayant atteint leur maturité sexuelle (2 ans) sont utilisées afin d’obtenir les ovocytes bloqués en prophase de stade VI, seuls capables de réaliser la méiose femelle in vitro.