Biologie du développement

704 rats vont être utilisés, la quasi-totalité tués à l'issue et les 64 mâles reproducteurs transférés vers l'enseignement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes sont gavées de dioxine, une molécule tératogène, et leurs ratons subissent des tests comportementaux d'anxiété, d'activité et de sociabilité, pour étudier l'effet combiné d'une carence en folate et d'un polluant sur le développement cérébral et les troubles du spectre autistique. Le porteur indique un risque de perte de nouveau-nés et de malformations graves, et reconnaît qu'aucune donnée n'existe sur l'effet synergique recherché. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne rend compte des effets liés au sexe ni de ceux sur la descendance et juge l'organisme entier nécessaire.

Objectifs

Selon l’OMS, l’exposition aux perturbateurs endocriniens et la carence en folate (vitamine B9) représentent des problèmes majeurs de santé publique, d’autant plus que cette dernière représente l'une des carences nutritionnelles les plus fréquentes. Selon la dernière étude ESTEBAN publiée par Santé Publique France en 2019, la prévalence du risque de déficit en folates sériques chez les femmes en âge de procréer a quasiment double ces dix dernières années. Les effets délétères de la carence en folate sur le développement du tube neural sont largement décrits et ont conduit aux recommandations de l’OMS visant à supplémenter les femmes en période péri-conceptionnelle en prévention du spina bifida (anomalie de fermeture du tube neural). En accord avec l’hypothèse de la programmation fœtale, la carence précoce en folate a également un impact sur le développement cognitif de l’enfant et l’apparition de troubles du spectre autistique (dont fait partie l'autisme). L’exposition chronique aux polluants environnementaux en période de procréation, de gestation et périnatale joue également un rôle déterminant dans le développement de ces pathologies neurologiques. Les toxiques environnementaux et les perturbateurs endocriniens réduisent l’expression des gènes des transporteurs du folate. Ceci signifie qu’une exposition chronique à de telles molécules (nombreuses et de nature variée) pourrait contribuer à la carence cérébrale en folate par défaut de transport à travers les interfaces sang-cerveau (barrière hématoencéphalique et plexus choroïdes). Notre projet vise à tester l’hypothèse selon laquelle une carence précoce en folate peut être amplifiée par l’exposition à des facteurs environnementaux entraînant une altération du développement cérébral postnatal, en affectant le transport des folates au niveau des interfaces sang-cerveau. Les objectifs sont donc les suivants : 1. Quel est l’impact respectif et combiné d’une déficience précoce en folate et de l’exposition à un polluant (la dioxine) sur le contenu en folate et les intermédiaires de son métabolisme, et la neurogenèse postnatale dans le cerveau ? 2. Cet effet respectif et combiné de la déficience et de l’exposition résulte-t-il d’une altération du transport de folate au niveau des interfaces sang-cerveau ? 3. L’altération du transport de folate peut-elle constituer un test prédictif de toxicité sur le développement cérébral ?

Bénéfices attendus

Notre projet vise à étudier les interactions entre deux facteurs d’exposition : un déficit nutritionnel (déficit en folate) et une exposition à un polluant chimique et leurs conséquences sur le développement cérébral. Il présente un intérêt particulier pour illustrer la pertinence de ces interactions en santé publique dans la mesure où il ouvre la voie à des solutions de prévention des impacts de cette double exposition sur l’apparition de désordre neurologiques, notamment les troubles du spectre autistique.

Procédures

L'ensemble des femelles de la pré-étude et de la phase 2 (soit au total 12+52 animaux) recevront soit de l’huile de maïs neutre, soit de la dioxine diluée dans de l’huile de maïs, par gavage gastrique, à raison d’une prise au 8ème jour et une seconde au 15ème jour de gestation. De plus, les femelles de la phase 2 uniquement (N=52) subiront un unique prélèvement sanguin par une incision au bout de la queue sous anesthésie à l’isoflurane 4%/air, 3 jours avant les accouplements. Le prélèvement ne dépassera pas les 2 minutes par animal. Enfin, les ratons de la série 2 (N=288) réaliseront différents tests comportementaux permettant d’étudier les différents traits des troubles du spectre autistique (hyperanxiété, hyperactivité, stéréotypies et comportement social anormal). La durée des tests n’excèdera pas 30 minutes par raton, et ils seront replacés dans leur cage d’hébergement entre chaque test. Lors de ces tests, une partie est réalisée de manière précoce (avant J14), et dans ce cas, un même raton n'est retiré que 2x maximum par jour de la portée afin de réaliser ces tests (maximum 3h entre les 2 tests). Les animaux seront hébergés à 2 individus par cage à l'âge adulte et les ratons issus de la reproduction seront séparés selon le sexe à l'âge de J30. Seuls les pères seront individualisés dans des cages d'hébergement, après la reproduction. Avant le sevrage, les animaux utilisés pour les tests comportementaux sont retirés au maximum 5 minutes pour les tests, et leur manipulation se fera avec précaution et par du personnel habitué et habilité. Un raton passera au total 120 minutes dans les tests de comportement. Les ratons issus des reproductions de la phase 2 (séries 3 et 4) seront séparés pour leur hébergement selon leur sexe à partir de J30, à raison de 2 animaux par cage.

Impact sur les animaux

La dioxine (TCDD, 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxine) est classée comme molécule tératogène. Nous estimons que ce traitement peut perturber le devenir des embryons, voire entraîner des malformations à la naissance. La dose utilisée dans le cadre de ce protocole sera inférieure à la dose létale 50 orale estimée à 20 µg/kg chez le rat (fiche de données de sécurité Sigma-Aldrich) et déterminée grâce à la phase 1 (pré-étude) et les recommandations des partenaires du projet CRAFT dans lequel s'inscrit ce protocole, experts reconnus de la mise en œuvre de modèles murins d'exposition chronique à la dioxine. Concernant la carence en folate dont nous avons l'expertise à travers les modèles animaux développés dans notre laboratoire depuis plusieurs années, il existe un très faible risque (moins de 15%) de perte de nouveau-nés et d’apparition de malformations graves. Concernant l'effet synergique de la carence en folate et l'exposition à la dioxine, il n'existe aucune donnée dans la littérature. La phase 1 du projet permet d'anticiper les effets liés à la dose de dioxine administrée aux femelles. La dose la moins toxique et permettant l'activation du AhR et l'induction le CYP1A1 sera utilisée pour la phase 2. Dans le cas où le nombre de ratons dans une portée n'est pas suffisant et que des réadoptions de femelles du même groupe ne sont pas envisageables, nous adapterons le protocole en fonction.

Devenir

L’ensemble des femelles reproductrices et descendants (N=704), hormis les mâles reproducteurs (N=64) qui peuvent être replacés, sont mis à mort à différentes périodes du protocole (J3, J21, J65, J120). Les animaux classés en procédure légère comprennent les mères des groupes contrôles et les petits issus de ces mères (17 mères Ctrl (4 pour la phase 1 + 13 pour la phase 2) + 170 ratons issus de ces femelles (estimation de 10 ratons par portée), soit un total de 187 animaux classés en procédure légère). Le reste des animaux de ce projet sont classés en procédure modérée du fait des effets de la carence en folate et/ou de la dioxine. Cela comprend 2 groupes de 4 femelles de la phase 1 (soit 8 animaux), 3 groupes de 13 femelles de la phase 2 (soit 39 animaux), ainsi que les ratons issus de ces femelles (avec toujours une estimation de 10 ratons par femelle), soit 470 ratons (80 pour la phase 1 et 390 pour la phase 2). Pour la procédure modérée, nous avons donc 517 animaux. Les ratons de la série 3 effectueront des tests de comportement dont les tests précoces qui s’enchaîneront rapidement, ce qui fait que les ratons seront manipulés fréquemment. Un retour à la litière maternelle et du repos entre chaque test est prévu afin de ne pas engendrer de mal-être chez l’animal, et de ne pas influencer les tests de comportement réalisés. Les autres animaux ne subiront aucune procédure (ni tests de comportement, ni prélèvement sanguin). Les femelles des groupes de la phase 2 uniquement auront un unique prélèvement sanguin 3 jours avant l’accouplement grâce à une petite incision au bout de la queue et sous anesthésie à l’isoflurane 4%/air, ainsi que 2 gavages (neutre ou en présence de dioxine), c'est pourquoi elles font partie de la classe modérée. Les mâles reproducteurs n'étant utilisés que pour la reproduction, ils seront replacés à l’issue du protocole.

Remplacement

Pour la partie « Carence en folate », il existe des modèles cellulaires basés sur l'utilisation de milieux de culture spécifiques. Cependant, ce type d’expérimentation ne permet pas de discriminer les effets liés au sexe des individus, ni de voir de potentiels effets sur le développement de la descendance (effets transgénérationnels). Il en va de même pour les modèles cellulaires traités à la dioxine. Il serait tout à fait envisageable de combiner les 2 modèles cellulaires afin de voir l’effet combiné des 2 traitements, et c’est ce qui est réalisé en parallèle du modèle animal. En revanche, il ne nous permet toujours pas d’apprécier les différences liées au sexe, ni les effets transgénérationnels. Compte-tenu des traitements des femelles, il n’existe pas actuellement de modèle de remplacement mimant la carence en folate combinée à l’exposition à la dioxine sur organisme entier et de manière transgénérationnelle.

Réduction

Afin de limiter l’utilisation des animaux à des fins scientifiques, les mâles reproducteurs de ce protocole seront replacés à des fins d’enseignements. Enfin, il s’agit ici d’une phase de caractérisation du modèle, nous permettant de vérifier les effets de la carence sur une nouvelle souche et de réaliser l’ensemble des analyses biochimiques, de biologie moléculaire sur les prélèvements tissulaires et les microvaisseaux cérébraux isolés. Ce protocole contient également des tests de comportement qui permettront d’apprécier les traits des troubles du spectre autistique (hyperactivité, hyperanxiété, stéréotypies et comportement social anormal). L’effectif total des animaux inclus dans ce projet a été calculé pour que les résultats atteignent la puissance statistique de 0.8 classiquement utilisée dans ce type d’étude. Les ratons d’une même portée n’étant pas considérés comme des sujets indépendants, c’est la portée qui sera dès lors considérée comme unité expérimentale ainsi que la littérature le préconise.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux sont acclimatés pendant 10 jours à leur nouveau lieu d’hébergement. Ce dernier est en alternance jour/nuit de 12h. Les animaux sont hébergés à 2 animaux par cage et auront des buchettes en bois pour entretenir leurs réflexes de rongeurs (sauf pour les ratons, puisqu’ils feront des tests comportementaux). Les pesées des animaux se font toutes les semaines au moment du change des cages d’hébergement et un suivi quotidien du bien-être est également réalisé. À la suite des prélèvements sanguins, les soins primaires sont effectués par le technicien en expérimentation animale (nettoyage de l'incision avec un savon antiseptique et désinfection à la chlorhexidine). Aucune de nos procédures expérimentales n’est censée provoquer de blessure ou de douleur. Si des signes de souffrance apparaissent, une surveillance accrue sera réalisée, et une petite coupelle contenant du lait concentré et du méloxicam sera donnée. À la suite des accouplements et à la détection de la fécondation, les femelles sont séparées et du matériel pour la nidification sera déposé dans la cage. De plus, à la suite du traitement des mères (carence et/ou administration de dioxine), il est préférable de limiter la portée pour le bien-être de la mère et des ratons. Un nombre trop élevé pourrait mener à une absence de lien mère-raton et générer un mal être chez ses animaux. Sur toute la duréée du projet, des points limites appropriés et précoces ont été élaborés, à savoir la perte de poids (ou l'absence de prise de poids pour les femelles en période de gestation) pour l'ensemble des animaux, ainsi que l'aspect des selles pour les femelles traitées.

Choix des espèces

Le projet de recherche fait appel à des analyses histologiques, biochimiques et moléculaires en lien avec des régimes nutritionnels spécifiques et l’exposition à un polluant chimique. Il se concentre notamment sur le développement cérébral qui est altéré à la suite d’une carence nutritionnelle en folate, et qui pourrait l’être encore davantage avec une exposition à un polluant. L’effet synergique de ces 2 facteurs d’exposition pourrait être à l’origine de l’apparition de désordres neurologiques. Les conséquences de cette interaction seront analysées sur le cerveau des descendants, le foie, les reins et les surrénales, la graisse et sur le plasma de tous les animaux impliqués dans l’étude. Ces observations ne peuvent pas être réalisées à l’aide de modèles cellulaires, et dans la littérature scientifique, l’utilisation des rats est reconnue comme étant un bon modèle pour ce type d’études. De plus, il s’agit du modèle précédemment utilisé pour l’étude des conséquences des carences gestationnelles en folate au sein du laboratoire. Les femelles adultes sont utilisées à l’âge de 2 mois car elles seront soumises à des régimes spécifiques 1 mois avant l’accouplement, pendant la gestation, et jusqu’à la période de sevrage des ratons. Le traitement à la dioxine se fait uniquement pendant la gestation. Les mâles reproducteurs seront replacés pour d’autres protocoles ou des travaux pratiques, car non nécessaires aux analyses biochimiques. Les ratons quant à eux, seront utilisés à l’âge de 3 jours (J3, période de forte plasticité cérébrale), 21 jours (J21, période de sevrage) et 65 jours (J65, période de maturité cérébrale), car il s’agit des périodes les plus adaptées pour étudier toutes les structures cérébrales qui sont encore en phase de développement et de maturation neuronale en période post-natale, notamment le cervelet.

14 250 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Le porteur leur électropore des plasmides dans les cellules souches neurales sous anesthésie, les expose à des traitements dans l'eau et en irradie une partie aux rayons X pour provoquer de la mort cellulaire. Tous sont mis à mort pour prélever le télencéphale, le porteur reconnaissant un manque de données sur les analgésiques efficaces chez cette espèce. Il affirme que la culture cellulaire détruit l'organisation de la niche et que les cellules isolées montrent des comportements "aberrants" absents in vivo.

Objectifs

Notre but est de comprendre quels mécanismes moléculaires et cellulaires contrôlent la perte des cellules souches neurales adultes dans le cerveau des vertébrés.

Bénéfices attendus

Dans son ensemble, ce projet permettra de caractériser les deux mécanismes principaux de perte de CSNs dans le cerveau adulte en conditions physiologiques : la division symétrique neurogénique, et la transdifférenciation. Ces mécanismes seront des candidats intéressants de dysfonction en conditions pathologiques de perte de CSNs, comme le vieillissement ou certains troubles du comportement.

Procédures

Procédures 2, 3, 4, 6 et 9 : les animaux seront soumis, une fois dans leurs vies et sous anesthésie, à une procédure d’electroporation de plasmides dans les cellules souches neurales. Cette manipulation prend environ 1 à 2 min par poisson. Procédures 5 et 7 : les animaux seront donc soumis à un traitement administré dans l’eau de nage. Cette manipulation prend moins d’une minute par lot de poisson car il s’agit ‘juste’ de les transférer d’un bac a un autre (dans lequel a déjà été dilué le traitement). Il y a ensuite la durée du traitement mais sans action car les poissons sont libres de nager dans leurs bacs. Procédure 10 : les animaux seront soumis à une relativement faible irradiation aux rayons X de 80Gy afin d’induire une légère augmentation des évènements de mort cellulaire. Cette manipulation se passe en plusieurs ‘étapes’ : le transfert des poissons dans des bacs isothermes (moins d’une minute pour transférer les poissons dans un aquarium avec 3cm de hauteur) et le traitement dans l’irradiateur des poissons (dans leur aquarium) qui dure un maximum de 57 min pour une dose de 80Gy.

Impact sur les animaux

Nous ne prévoyons aucun effet indésirable ou nuisance sur les animaux. Si un effet indésirable inattendu apparait nous arrêtons cette expérience et mettrons a mort les animaux.

Devenir

Tous les animaux doivent être mis à mort afin de prélever le télencéphale pour l’analyser.

Remplacement

Nous souhaitons comprendre un aspect fondamental de la biologie des cellules souches neurales (CSNs), à savoir comment ces cellules peuvent être perdues dans le cerveau adulte. Le travail sur CSNs en culture, bien que techniquement possible, a révélé que les CSNs isolées montraient des comportements aberrants jamais observés in vivo, notamment concernant leur mode de division. Ce paramètre impacte de façon directe le maintien ou la déplétion des populations souches. Par ailleurs, à l’heure actuelle, la transdifférenciation, pourtant importante in vivo n’a pas été observée in vitro. Enfin, par imagerie intravitale, il a été démontré que les choix de destins des CSNs sont contrôlés à l’échelle de la population et impliquent une coordination spatio-temporelle entre cellules au sein de leur niche. Toute approche in vitro détruit cette niche et cette organisation spatiale.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, nous limiterons précisément le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Concernant les procédures de traçage et d’électroporation, différents articles publiés ces dernières années montrent que le comptage d’environ 150 cellules sur un minimum de 10 animaux est suffisant pour rendre compte des choix effectués, de façon comparable à un comptage de la population globale. Ces valeurs suffisent à mesurer une différence statistiquement significative du nombre (test de Student) et de la proportion (test de Fischer) des choix de destin entre des CSNs contrôles et manipulées. Nous travaillerons donc dans chaque cas avec 10 animaux et uniquement si besoin certaines expériences seront répétées (maximum 3 répétitions). Concernant l’utilisation d’inhibiteur pharmacologique, nous travaillerons avec 10 animaux par condition ce qui suffit à mesurer une différence statistiquement significative du nombre (test de Student) et de la proportion (test exacte de Fisher) de CSNs activées versus non-activées entre des animaux contrôles et des conditions de blocage des voies de signalisation.

Raffinement

Les manipulations, invasives ou nécessitant une immobilisation temporaire seront conduites sur animaux anesthésiés. Les inductions (tamoxifène, doxycycline) seront administrées dans l’eau de nage. Les animaux sont toujours maintenus en groupe afin de garantir leurs bien-être. Nous suivrons quotidiennement les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une mise à mort. Chez Danio rerio, il y a un manque d’information sur les effets et la spécificité des produits « classiques » analgésiques. Cependant, une étude récente suggère l’utilisation de lidocaine 2-5 mg/ml dans le bain de réveil. Nous suivrons cette procédure aussi souvent que possible.

Choix des espèces

Nous avons choisi le poisson téléostéen Danio rerio. Le cerveau adulte de Danio rerio, à la différence des modèles « classiques » mammifères, maintient un grand nombre de CSNs. Utiliser cette espèce permet donc d’avoir accès à un beaucoup plus grand nombre de CSN par animal. Ces cellules sont également organisées en une monocouche superficielle au lieu d’être profondes, permettant des approches in toto qui évitent de perdre des cellules comme lorsqu’un organe est analysé sur coupes. Ces deux points répondent au principe de « réduction ». Par ailleurs, les CSNs de Danio rerio sont identiques aux cellules souches des mammifères (cellules gliales, quiescentes, capables d’auto-renouvellement et de multipotence, et dont l’état d’activation est contrôlé par la voie de signalisation Notch). Les résultats obtenus seront donc directement transposables aux mammifères. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte jeune (3 mois post-fécondation [mpf]), car nous travaillons sur la biologie des CSNs adultes. Les premiers signes de ralentissement de l’activité des CSNs sont observés in vivo à environ 5-6 mpf, et il est important également de nous placer avant ce stade.

468 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Porteuses d'une mutation liée à l'autisme, elles sont soumises à des tests comportementaux d'apprentissage, de mémoire spatiale et de mémoire sociale, et des femelles gestantes subissent une chirurgie abdominale pour injecter un marqueur fluorescent dans le cerveau des embryons. Les prélèvements se font après mise à mort, les animaux modifiés n'étant pas replacés pour éviter la dissémination de la mutation. Le porteur affirme que le développement du cortex ne peut être entièrement modélisé in vitro et exclut un modèle invertébré.

Objectifs

Les maladies neurodéveloppementales telles que les troubles de l’autisme, l’épilepsie, certains retards mentaux ou encore déficits cognitifs (ex : la mémoire) résultent de la perturbation du développement cérébral chez l’embryon et pendant la petite enfance. De récentes études ont révélé qu’un certain nombre de mutations sont impliquées dans le développement de ce type de pathologies. Ce projet a pour but d’étudier un gène qui joue un rôle central dans le développement des terminaisons des cellules nerveuses (les axones) dans le système nerveux central. Des mutations dans ce gène sont associées à la pathologie autistique. L’absence de ce gène chez la souris entraîne des anomalies du développement cérébral et du comportement (notamment des altérations de la mémoire sociale et des défauts de mémoire spatiale à long terme). Cependant les mutations de ce gène et retrouvées chez les patients autistes n’ont jamais été étudiées chez la souris. Ce projet est divisé en 3 procédures et se déroulera sur 3 ans : -La première procédure consistera à caractériser le nouveau modèle de souris possédant la mutation du gène d’intérêt identifiée chez l’homme. Cette caractérisation reposera sur la comparaison de souris contrôles (non mutées) et de souris porteuses de la mutation liée à l’autisme par une analyse systématique de la viabilité et de la croissance des premières portées. -La seconde procédure visera à analyser le développement des neurones et la formation des circuits du cortex cérébral grâce à une technique chirurgicale sur des femelles gestantes. Cette méthode permet de marquer des neurones pour observer les conséquences de la mutation dans le cortex cérébral de la souris. -La troisième procédure aura pour but de tester les conséquences des mutations du gène étudié sur les fonctions cognitives à l’aide d’une série de tests comportementaux en regardant notamment l’apprentissage, la mémoire spatiale et la mémoire à long terme. Nous aborderons, en plus des déficits cognitifs, d’autres symptômes associés aux troubles du spectre autistique, tels que les troubles de la communication et de la mémoire sociale.

Bénéfices attendus

Il est important de comprendre comment les gènes, lorsqu’ils sont mutés, entraînent des maladies, pour améliorer le diagnostic et le conseil aux familles, et imaginer des pistes thérapeutiques. La création d’un nouveau modèle de souris permet de suivre quelles étapes du développement embryonnaire sont affectées et conduisent à l’installation de la maladie. Ceci ne peux pas être réalisé chez l’homme car ces mutations sont détectées après le diagnostic, quand la maladie est déclarée. Ce projet étudiera donc un nouveau modèle murin qui mime mieux la pathologie humaine et permettra 1) de valider le caractère pathologique des mutations de ce gène dans les troubles du neurodéveloppement et plus largement 2) une meilleure connaissance des causes des pathologies neurodéveloppementales.

Procédures

L’essentiel des expériences seront observationnelles afin de caractériser la lignée. Les animaux seront de plus soumis à des tests d’exploration des fonctions comportementales, non invasifs, et non douloureux, mais qui nécessiteront de manipuler régulièrement les animaux. Pour pouvoir étudier les défauts de formation des réseaux de neurones liés à la mutation génétique, les animaux subiront une chirurgie avec réveil (procédure 2). Cette procédure chirurgicale est rapide et consiste à injecter un marqueur fluorescent dans le cerveau des embryons. La chirurgie sera réalisée chez les femelles gestantes, sous anesthésie gazeuse (isoflurane) et en respectant les règles d’analgésie et d’asepsie chirurgicale. La durée de la chirurgie n’excèdera par 30 minutes et sera réalisée une seule fois.

Impact sur les animaux

Les nuisances les plus sévères qui aient jamais été observées pour le gène d'intérêt chez la souris sont un retard de croissance, des défauts modérés de connectivité cérébrale et une perturbation de la mémoire à long terme. Dans ce projet, nous nous attendons à des manifestations moins sévères car la mutation étudiée n’abolit qu’une partie des fonctions du gène. La procédure d'élevage nécessite l’identification et la biopsie des animaux en vue de la réalisation du génotypage, selon la procédure en vigueur dans l’établissement utilisateur. Des animaux reproducteurs pourront être hébergés isolément afin d’éviter les comportements d’agression tout particulièrement suite aux accouplements. Cet isolement sera dans la mesure du possible limité dans le temps. Une procédure chirurgicale (procédure 2) implique une ouvertude de la cavité abdominale. Cette procédure est bien maîtrisée par les expérimentateurs. Elle sera réalisée sous anesthésie générale avec analgésie péri- et post-opératoire, ainsi qu’un suivi post-opératoire adapté. Dans de très rares cas, cette technique peut entraîner une difficulté à la mise bas ou une mortalité intra-utérine d’embryons.

Devenir

Les animaux inclus dans ce projets sont des animaux génétiquement modifiés pour porter une mutation retrouvée chez des patients atteints de troubles autistiques. Il n'est pas envisageable de replacer les animaux à l'issue de ces procédures pour s'assurer que la mutation introduite ne dissémine pas hors du laboratoire. Par ailleurs ce projet nécessite la réalisation de prélèvements post-mortem pour atteindre ses objectifs scientifiques.

Remplacement

Ce projet a pour objectif de mieux caractériser les altérations comportementales dans un modèle murin possédant la mutation de novo d'un gène d'autisme et d’identifier des défauts dans les circuits neuronaux soulignant ces altérations cognitives. En préalable à ce projet, nous avons réalisé des expériences in vitro prouvant que la mutation étudiée altère la fonction du gène d'intérêt, ce qui nous permet de nous assurer que l’étude est pertinente. Néanmoins dans l’état actuel des connaissances scientifiques, les étapes de développement du cortex cérébral et la mise en place des circuits neuronaux ne peuvent être modélisés entièrement in vitro. L’approche in vivo est une nécessité afin d’aborder des troubles complexes de la cognition et du comportement. L’étude de circuits corticaux nécessite d’avoir recours à un animal possédant une structure corticale et par conséquent empêche le remplacement par un modèle invertébré.

Réduction

Les accouplements seront optimisés afin de produire strictement le nombre nécessaire d’animaux pour la caractérisation initiale du modèle (procédure 1). Une partie des animaux issus de la procédure 1 pourra être utilisés pour les tests comportementaux pour compléter les cohortes (procédure 3), nous évitant ainsi de générer de nouveaux individus. Le nombre d’animaux utilisés en procédure 3 est limité au minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats, ce qui sera analysée au moyen d'un test statistique adapté. Pour le test de sociabilité, utilisant en plus des congénères étrangers, nous aurons recours si possible à des animaux déjà présents dans l’animalerie, dans le but de ne pas commander d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Les animaux étant élevés et hébergés dans une animalerie agréée, les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins seront appropriées en fonction de leur âge et de leur sexe selon les procédures en vigueur à l’animalerie dans le respect du bien-être animal. La procédure chirurgicale (procédure 2) est bien maîtrisée par les expérimentateurs et sera réalisée uniquement par un chercheur expérimenté. Un recours à l’analgésie péri-opératoire, ainsi qu’à une analgésie post-opératoire (calibrée par rapport à une grille d’évaluation de la douleur) nous permettra de limiter le stress et la douleur subis par les mères. Concernant les évaluations comportementales (procédure 3), les animaux sujets aux tests de comportement seront acclimatés à la salle de test au préalable afin de réduire le stress causé par un nouvel environnement. Les différents tests seront réalisés les uns à la suite des autres, avec un temps de pause d’au moins une semaine entre chaque test pour limiter un stress éventuel des animaux. A noter que les tests de comportement ne sont pas invasifs et ne portent pas atteinte à l’intégrité de l’animal.

Choix des espèces

L'architecture du cerveau de la souris est très proche de l'architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales telles l'autisme et:ou les déficiences mentales. Par ailleurs, des études précédentes nous ont permis de décrire que le gène d'intérêt est associées à la pathologie autistique et que son inactivation perturbe le développement cérébral et le comportement chez la souris. Puisque ce projet vise à établir un nouveau modèle murin de trouble du neurodeveloppement/autisme, il est nécessaire de suivre les animaux depuis la naissance jusqu'à un stade adulte, afin de caractériser l'évolution des phénotypes chez la souris. Une procédure se déroulera sur des femelles gestantes car les perturbations du développement cérébral surviennent dès l'embryon.

1366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1128 femelles reçoivent un traitement hormonal par deux injections pour produire des embryons, 178 autres subissent une chirurgie de réimplantation au niveau de l'oviducte et 60 mâles une vasectomie, l'ensemble servant à fabriquer de nouvelles lignées génétiquement modifiées à la demande d'équipes de recherche. Les mâles vasectomisés sont tués six à douze mois après l'opération, les femelles au moment du sevrage des portées. Le porteur affirme que seul un "organisme intégré" permet d'étudier les interactions entre cellules et tissus et présente ces souris transgéniques comme des "modèles indispensables".

Objectifs

Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste à développer de nouvelles lignées de souris transgéniques pour permettre aux chercheurs d’avoir les outils les plus adaptés à leurs études. La première étape de ce projet est de vérifier que cette lignée de souris transgéniques n’est pas disponible dans une banque internationale ou dans un laboratoire académique. En cas d’indisponibilité, le modèle de souris transgénique est alors créé dans notre service par transgénèse aléatoire ou par la technologie CRISPR/Cas9.

Bénéfices attendus

Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes (Bradley et al., 2012, Meehan et al., 2017).

Procédures

Pour obtenir un grand nombre d’embryons, les 1128 femelles donneuses reçoivent un traitement hormonal qui consiste en 2 injections intra-péritonéales à 48h d’intervalle. Ces injections sont réalisées sur animal vigile. Les embryons sont ensuite manipulés génétiquement puis réimplantés dans 178 femelles receveuses (=mères porteuses) au niveau de l’oviducte qui est un conduit reliant l'ovaire à l’utérus, Ces femelles receveuses sont produites en accouplant des femelles avec des males vasectomisés c’est-à-dire rendus stériles. Pour obtenir ces mâles vasectomisés, 60 males subissent une chirurgie qui consiste à couper les canaux qui permettent aux spermatozoïdes de sortir du testicule. La réimplantation et la vasectomie requièrent une chirurgie qui est réalisée sous une anesthésie générale induite par une injection intra-péritonéale d’un complexe anesthésique. L’anesthésie de ces 238 animaux (178 femelles receveuses + 60 mâles vasectomisés) dure en moyenne 20 minutes. Une prise en charge de la douleur est systématiquement effectuée par une injection intra-péritonéale d’un anti-inflammatoire non stéroïdien Pour une récupération de meilleure qualité après l’anesthésie et la chirurgie, une injection sous cutanée d’une solution de réhydratation est réalisée sur les animaux opérés. Pour éviter l’hypothermie, le réveil se fait sur un tapis chauffant. Un apport de graines de tournesol et d’une nourriture enrichie en matières grasses permet d’augmenter les bien-être des femelles opérées. Il favorise ainsi un meilleur développement des gestations et une lactation de meilleure qualité pour la prise en charge des nouveaux nés L’ensemble de ces approches technologiques permettent de générer des modèles de souris transgéniques pour l’étude de mécanismes impliqués dans le développement embryonnaire, le cancer ou dans des maladies immunitaires, par les équipes de recherche.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont : 1- ceux liés à l’injection intrapéritonéale d’hormone. La durée des effets indésirables est limitée au moment de l’injection. 2- ceux liés à des petites chirurgies abdominales. La durée des effets n’excédera pas 24 heures.

Devenir

Vasectomie : Les mâles sont conservés pendant la période de leur plus forte activité sexuelle et seront euthanasiés 6-12 mois après leur vasectomie (selon leur aptitude d’accouplement scorée). Après 8 accouplements sans bouchon vaginal, le mâle est euthanasié. Superovulation des femelles donneuses Les femelles superovulées qui présentent un bouchon vaginal sont euthanasiées pour la récupération des embryons Toutes les femelles sans bouchon vaginal sont réutilisées pour une deuxième injection d’hormones, 2-3 semaines plus tard. Réimplantation d’embryons L’ensemble des femelles réimplantées sont euthanasiées au moment du sevrage des naissances.

Remplacement

Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de des bases de données (études in silico ) et des modèles in-vitro ( culture de cellules , organoïdes…) . En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)

Réduction

Les nouveaux outils technologiques tel que l’électroporation combinée à des nucléases toujours plus performantes et des ARN guides commerciaux plus stables (IDT ; Synthego) ont permis de diminuer par un facteur 2 le nombre de séances nécessaires à l’obtention de modèles Knock-Out et de petits Knock-In. Le nombre de naissance a été augmenté en changeant notre approche pour la réimplantation. Une réimplantation bilatérale sur une femelle unique est désormais effectuée en routine (Mahabir E et al 2018) Pour les grands Knock-In, un test d’efficacité de coupure des ARN guides est effectué sur un test in-vitro. Une analyse sur blastocyste unique est réalisée et permet d’éviter d’avoir recours à des femelles réimplantées et des naissances. À la suite de ces tests, une séquence d’ARN guide est choisie. Le plasmide donneur sera alors élaboré en fonction des résultats de ce test. L’expérimentation in-vivo (Injection des embryons avec mélange contenant le plasmide donneur / ARN guides / Cas9) sera alors réalisée avec réimplantation des femelles pseudogestantes.

Raffinement

L’ensemble des procédures nécessitant de la chirurgie se fait sous anesthésie générale. Injection IP d’un mélange Xylazine (7.5mg/kg), kétamine (40 mg/kg) et flunitrazépam (0.5 mg/kg) dans du NaCl 0.9%, à raison de 50 μL pour 10g. Ce mélange permet une anesthésie assez longue et profonde ce qui permet de réaliser l’opération dans de bonnes conditions pour l’animal. L’effet analgésique de la Xylazine est utilisé pour soulager la douleur. En complément à la Xylazine, une injection de Rimadyl est effectuée pour une meilleure prise en charge de la douleur. A la fin de l’intervention avant de refermer la paroi musculaire, du Carprofène (Rimadyl) est administré dans la cavité abdominale à raison de 1mg/ml dans NaCl 0.9% à raison de 100µl pour 20g de souris.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée (superovulation efficace et embryons faciles à injecter) Nous n’utilisons que des souris adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. En fond mixte B6D2 (C57BL6 x DBA/2), les femelles donneuses ont 8 semaines ce qui permet une quantité et une qualité optimale des embryons. En revanche pour un fond pur C57BL6/J ou N, les femelles ont 4 semaines pour l’obtention d’un plus grand nombre d’embryons avec une qualité correcte. Nous utilisons femelles pseudogestantes NMRI entre 8 et 24 semaines. Les mâles stériles NMRI (vasectomisés) utilisés pour les accouplements ont entre 2 mois et 12 mois.