Biologie du développement

L'automutilation, les vocalisations ou l'agression des petits par la mère déclenchent l'arrêt du protocole et la mise à mort. 806 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès les vingt-quatre premières heures de vie, les ratons passent quatorze jours en atmosphère hyperoxique pour reproduire l'hypertension pulmonaire des grands prématurés, leurs mères échangées tous les jours pour épargner à elles seules la toxicité de l'oxygène, avant des échographies cardiaques, des mesures de pression et une pléthysmographie invasive sous anesthésie. Le porteur justifie la cotation modérée par le fait que les animaux ne seront pas soumis à l'effort, seule situation où la gêne respiratoire s'exacerbe selon lui.

Objectifs

La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP) est la principale complication liée à la grande prématurité. La DBP peut se compliquer d’une hypertension pulmonaire (HTP-DBP) responsable d’une mortalité importante dans les 2 ans suivant le diagnostic, par défaillance cardiaque droite. Par ailleurs, les altérations pathophysiologiques présentes pendant la période néonatale persistent dans le temps chez les grands prématurés survivants, augmentant leur risque de développer des maladies respiratoires et cardiovasculaires sévères à l’adolescence et à l’âge adulte. Les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’HTP-DBP sont encore méconnus et il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement préventif ni curatif de cette maladie. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. Ainsi, dans ce projet, nous utiliserons un modèle animal (rats) d’HTP-DBP expérimentale induite par hyperoxie, classiquement décrits dans la littérature et utilisés au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Ces modèles animaux sont les modèles qui reproduisent le mieux la pathologie humaine. Dans ces modèles, nous étudierons de manière longitudinale, l’évolution des altérations pathophysiologiques de l’HTP-DBP à différents âges (J15 etJ60 chez les animaux, ce qui correspond chez l’humain à la période de l’enfance (

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mettre en évidence l’effet thérapeutique de deux molécules pharmacologiques ciblant cible thérapeutique. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs sera comparée ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme avec un rapport bénéfice- risque minimum pour les patients.

Procédures

Un groupe sera exposé à l’air ambiant (groupe contrôle) et un 2ème groupe sera maintenu en hyperoxie dans les 24h suivant la naissance, pour une durée de 14 jours (J). Un échange des mères entre les groupes sera effectué toutes les 24h, afin d’éviter l’effet toxique lié à l’oxygène chez ces mères. Des substances pharmacologiques dirigées vers la cible thérapeutique seront injectées soit en intranasal soit en intrapéritonéal pour le protocole préventif et pour le protocole curatif. Après 14 jours, une partie des ratons sera anesthésiée afin de réaliser des échographies cardiaques (10 minutes/animal), des mesures de pressions cardiaques (10-15 minutes/animal) et des mesures de la fonction respiratoire par pléthysmographie invasive (5-10 minutes/animal) pour diagnostiquer la présence d’une HTP-DBP et en évaluer la sévérité. Tous les animaux auront ces différentes mesures avant l’extraction du tissu. Les animaux seront euthanasiés pour l’extraction du tissu. Des prélèvements de sang pourront être effectués sur certains animaux juste après l’euthanasie et avant de récupérer le tissu. L’échographie, les mesures hémodynamiques et les mesures de fonction respiratoire permettront également d’évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques. L’autre partie des animaux sera placée en normoxie seule, en présence d’une mère allaitante jusqu’au sevrage puis en condition d’hébergement classique jusqu’à l’âge de 60 jours. Durant cette période, les animaux auront une échographie cardiaque sous anesthésie générale aux différents temps d’évaluation, y compris ceux qui poursuivent le protocole jusqu’à J60. Ainsi, les animaux explorés à J60 auront au total 2 échographies cardiaques durant le protocole. A l’issue du protocole, les animaux seront anesthésiés afin de réaliser des échographies cardiaques, des mesures de pressions cardiaques, des mesures de la fonction respiratoire et des prélèvements de sang.

Impact sur les animaux

L’HTP-DBP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Nous avons une grande expérience du suivi notamment respiratoire des animaux sous des atmosphères en oxygène variées au laboratoire et nous serons particulièrement attentifs aux points limites qui constitueront un arrêt des protocoles. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la survenue de l’HTP-DBP chez les animaux. Les points d’injection des substances et/ou solvants à tester peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés. Etant donné que les substances pharmacologiques sont déjà utilisées en clinique, on ne s’attend pas à l’observation d’effets secondaires importants. Globalement, les nuisances suivantes seront surveillées par les expérimentateurs ou les animaliers : Anesthésies répétées Concentrations potentiellement toxiques en oxygènes Points d’injections à répétition Prise de poids ralentie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer les tissus pour faire diverses analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’HTP-DBP mais des études pourront être réalisées sur des cellules de poumons humains fœtaux en culture, exposées ou non à l’hyperoxie. Ce remplacement du modèle animal par un modèle in vitro permettra d’élucider certains mécanismes intracellulaires sans utiliser d’animaux. Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in/ex vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. Par ailleurs, cette pathologie implique plusieurs organes et plusieurs types cellulaires pulmonaires qui interagissent entre eux et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes et cellules.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux, une partie des utilisateurs utilisera le poumon droit et l’autre partie le poumon gauche, une planification des expériences sera établie pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal et enfin des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines fœtales en culture exposées à l’hyperoxie in vitro pour simuler l’HTP-DBP. Quatre chercheurs/enseignant-chercheurs statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur le modèle de ratons HTP-DBP donc l’utilisation des animaux contrôles pourra être optimisée en concertation avec tous les utilisateurs lors de nos réunions d’équipe hebdomadaires afin d’utiliser tous les tissus disponibles. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). Nous avons besoin de 6 lots différents par condition car les expériences doivent être réalisées sur différentes lots et nos expériences nécessitent de conditionner les poumons différemment, de plus étant donné la petite taille des poumons, nous avons besoin de plusieurs poumons pour réaliser toutes les expériences avec un nombre d’expériences entre 6 et 9 en fonction des expériences. L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire et en accord avec les données de la bibliographie. Le nombre d’animaux sera ensuite réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs (ou résolument non significatifs) avant la fin de la totalité des séries prévues.

Raffinement

Selon la condition, 12 ratons et 1 rate seront placés soit dans l’enceinte à hyperoxie soit dans une cage classique. L’enceinte à hyperoxie et la cage classique contiendront une couche de litière suffisante pour absorber l’humidité, des éléments de nidification (coton, papier kraft) et du matériel d’enrichissement (un tunnel rouge et buchettes de bois). L’accès à l’eau et la nourriture sera ad libitum. Les paramètres ambiants (hygrométrie, température) seront contrôlés quotidiennement par les expérimentateurs ou les animaliers et conservés sur un registre. Un cycle jour/nuit de 12h sera également appliqué. Les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement. Différents paramètres physiologiques (courbe de poids, piloérection, détresse respiratoire) seront surveillés. Un arrêt de la courbe de croissance ou une baisse de poids corporel prolongé dans le temps et non réversible, un comportement anormal des animaux (vocalisation, comportement malveillant vis-à-vis des bébés, automutilation) ou des signes de détresse respiratoire conduiraient à un arrêt du protocole et à la mise à mort de l’animal. L’enceinte d’hyperoxie sera ouverte tous les jours pour l’échange des mères. A cette occasion, les animaux seront observés et seront pesés tous les deux jours. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. En cas de souffrance ou de détresse persistante une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre. Une grille de scoring pour le suivi des animaux sera mise en place pour chaque animal. L’ensemble des expérimentations in vivo sera réalisé sous anesthésie générale. Pour les mesures hémodynamiques, un tapis chauffant sera utilisé pour préserver la température corporelle constante durant toute la procédure. Le degré d’anesthésie sera vérifié par l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte au pincement. Des modifications des paramètres physiologiques et notamment la fréquence cardiaque indiquant une souffrance ou une détresse de l’animal conduiraient à une procédure d’euthanasie.

Choix des espèces

Le rat est une espèce classiquement utilisée pour le développement de modèles d’HTP-DBP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. De plus, le rat est particulièrement adapté pour modéliser la DBP car au moment de la naissance leurs poumons sont au stade de développement pulmonaire qui correspond au stade de maturation des poumons de nouveau-nés grands prématurés humains et les expérimentations pourront être menées chez des rats nés à terme et ne nécessiteront pas d’induire une naissance prématurée de ces animaux.

425 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles reçoivent un traitement de superovulation, subissent une anesthésie de trois minutes avec un risque d'hypothermie, puis sont tuées pour que leurs ovules soient récoltés. L'objectif déclaré est de comprendre le rôle d'un gène de la méthylation de l'ADN dans le développement embryonnaire précoce, dont l'absence réduit le réservoir ovarien et rend les femelles stériles. Le porteur affirme qu'aucun protocole ne permet d'étudier ce développement in vitro à partir d'ovules fécondés.

Objectifs

La méthylation de l'ADN est une modification chimique pouvant réguler l’expression des gènes sans modifier la séquence d’ADN. Ces modifications chimiques sont des groupements « méthyles » qui peuvent être ajoutés sur l’ADN et qui peuvent modifier la manière dont est perçu l’information génétique. Nous pourrions comparer la méthylation de l’ADN à la ponctuation d’une phrase. Prenez par exemple la phrase : « On va manger, mami ! ». Si vous enlevez la virgule et remplacer le « ! » par une « . » la phrase n’a plus du tout la même signification (On va manger mami.). Chez les mammifères, la méthylation de l’ADN peut induire une répression stable des gènes de façon réversible. En effet, il est important d’exprimer les gènes embryonnaires au bon stade du développement et pas à l’âge adulte. Ainsi, cette modification a des fonctions régulatrices importantes au cours du développement embryonnaire et gamétique et est transmise à travers les générations. Une altération de ces profils de méthylation est observée dans les cadres de cancers et autres maladies. L’objectifs de ce projet est de mieux comprendre le rôle d’un nouvel acteur de la méthylation de l'ADN sur le développement embryonnaire précoce. En effet, des résultats préliminaires démontrent que son l’absence de ce gène conduit à une hypofertilité chez les femelles avec une réduction du réservoir ovarien ainsi qu’une stérilité (pas de naissance). Les données obtenues au cours de ce projet pourront avoir des retombées pour mieux comprendre l’infertilité humaine puisque ce gène est conservé chez l’être humain.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre le rôle d'un gène dans le développement des ovocytes et de mettre en évidence de nouveaux mécanismes moléculaires qui régulent la fertilité et le développement embryonnaire chez la souris. L’objectif final de ce projet est de transposer nos résultats à l’homme dont les problèmes d'infertilité sont en constante augmentation et constituent un enjeu de santé publique majeur. En effet, ce gène étant conservé chez l’être humain, il serait envisageable d’utiliser ce dernier soit comme outils de diagnostic, soit comme nouvelle cible thérapeutique dans le cadre de la procréation médicalement assistée pour des maladies tel que l’IOP (Insuffisance ovarienne prématurée, prévalence de 1/10 000 chez les femmes de moins de 20 ans, 1/1 000 chez les femmes de moins de 30 ans et 1% chez les femmes de moins de 40 ans).

Procédures

Les animaux recevront deux injections espacées de 48h sous anesthésie. L'injection dure environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Il y a un risque d’hypothermie des animaux bien que l’anesthésie soit de courte durée (~3min).

Devenir

Les animaux seront mis à mort dans le but de récolter les ovules.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas de protocole pour étudier le développement embryonnaire in vitro à partir d’ovules fécondés. C’est pourquoi nous effectuerons nos expériences sur des échantillons primaires isolés de souris.

Réduction

Le protocole de superovulation permet de stimuler la production d'ovocytes et donc de réduire le nombre de femelles utilisées. L’utilisation du protocole de culture in vitro d’embryons à la suite du protocole de superovulation permet d'étudier tous les stades de développement embryonnaire précoce et tardif simultanément pour un nombre significatif d’embryons. Ceci limite fortement le nombre de femelles utilisées par rapport à une approche in vivo qui nécessiterait de sacrifier des femelles à chaque stade de développement embryonnaire.

Raffinement

Les souris seront élevées en groupe dans des cages aux normes européennes et enrichies (maison, tube en carton, bâton en bois, frisures en carton pour la nidification…). Les enrichissements permettront : -de réduire le stress des animaux au cours de l’élevage en répondant à leur besoin de nidification et de cachette (maison, tube, frisures en carton) -de combler leur besoin de ronger/user leur dent afin de palier à la croissance continue de leurs incisives (bâton en bois) L’environnement et le bien-être des animaux seront vérifiés quotidiennement. Nous avons également établi des points limites afin d’atténuer la souffrance ou/et le stress des animaux. Dès lors que nous observerons un point limite, en fonction du degré de sévérité et de sa durée, soit nous soignerons l’animale, soit nous le mettrons à mort.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est justifié par les éléments suivants : (i) La méthylation de l’ADN est absente chez les modèles invertébrés tels que la levure, la drosophile (mouche du vinaigre) et le nématode (ver), (ii) les fonctions biologiques sont très conservées entre la souris et l’homme. (iii) la souris offre de nombreux modèles génétiques déjà existant, ce qui justifie son utilisation comme modèle d’étude. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris femelles âgées de 4 semaines pour la récolte d’ovules car il s’agit de l’âge auquel les femelles répondent le mieux à la stimulation hormonale.

Toutes tuées pour prélever leurs organes, 800 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit l'ablation de l'extrémité de la queue pour établir son génotype, puis une injection quotidienne pendant sept jours. Le porteur indique que les souris de plus de 90 jours développent des signes de douleur et choisit pour cette raison d'étudier les stades qui précèdent, à 30, 60 et 90 jours, quand l'atteinte s'installe sans encore se voir. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires ne reconstituent pas la diversité des neurones moteurs et des fibres musculaires associées.

Objectifs

Le système neuromusculaire permet de respirer, marcher, manger, sourire. Les muscles squelettiques et les neurones associés s’atrophient au cours du vieillissement, lors d’hospitalisation prolongée, au cours du cancer, et dans nombreuses myopathies d’origine génétique. Dans ce dernier cas les interactions entre les neurones et les fibres musculaires se détériorent conduisant à des défauts de contraction des myofibres. Différents modèles de souris génétiquement modifiées permettent de mieux comprendre les propriétés des différents types de fibres musculaires et de neurones et de leur environnement, et du dialogue entre les neurones et les fibres musculaires. L’objectif principal de cette étude sera de caractériser les interactions nerf-fibres musculaires, d’identifier les mécanismes mis en jeu dans le maintien de l’axe neuromusculaire.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les bases du système neuromusculaire, et d’en comprendre ses atteintes est un enjeu majeur. Cette étude sur la vulnérabilité neuromusculaire devrait aussi permettre de mieux comprendre les bases moléculaires qui contrôlent la formation de l’appareil neuromusculaire, en fonction des muscles étudiés. En effet mieux comprendre les interactions entre neurones et fibres musculaires dans le but de caractériser, grâce à des approches techniques innovantes, de nouveaux gènes qui contrôlent son intégrité est essentiel pour un jour permettre de guérir les malades atteints de défauts nuromusculaires. En conclusion, les études menées amélioreront nos connaissances sur les propriétés de l’axe neuromusculaire, en prenant en compte les neurones, et la fibre musculaire.

Procédures

Sur animaux vigiles : le prélèvement unique d'une biopsie de l'extrémité de la queue pour génotypage (5 secondes). L'injection quotidienne sur 7 jours, durée de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une douleur légère et de courte durée est occasionnée lors de la biopsie de l’extrémité de la queue des animaux en vue de leur génotypage. Une douleur passagère et de courte durée est occasionnée lors des contentions et injection en IP, geste qui dure 30 secondes. Avant 90 jours, les douleurs observées chez les souris sont souvent discrètes et difficiles à évaluer objectivement. À ce stade, l’atteinte motrice initiale peut s’accompagner de légers inconforts musculaires, mais la douleur n’est pas un symptôme majeur ou invalidant.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour des analyses.

Remplacement

Le modèle de souris mime les interactions entre neurones et muscles chez l'homme, et renseigne de manière unique sur le dialogue et les les propriétés de l'interaction nerf-muscle. Les modèles cellulaires ne permettent pas à ce jour de comprendre la diversité de ce dialogue et ne permettent pas de reconstituer la diversité des types de neurones moteurs permettant le mouvement et des fibres musculaires associées.

Réduction

Nous prélèverons le maximum de tissus sur les animaux mis à mort, pour éviter l’utilisation ultérieure de nouveaux lots d’animaux. Les effectifs sont déterminés et les résultas analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Le milieu est enrichi d’une roue d’activité. Les animaux sont surveillés 2 fois par semaine par le porteur du projet. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les animaux de plus de 90 jours développent des signes de douleur, aussi nous nous intéresserons aux stades de dévelopement qui précèdent P90, stades asymptomatiques avant que les animaux développent des signes de douleur. Cette période est instructive car c’est pendant cette période que se met en place progressivement un phénotype. Néannmoins si nous observons des signes de souffrance chez les animaux avant ce stade P90, les animaux recevront une analgésie pendant 48h. Des points limites ont été définis, et en absence d'amélioration les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les muscles et les nerfs moteurs humains sont bien conservés chez la souris, qui est de ce fait un bon modèle. Le modèle de souris permet d’accéder à tous les acteurs qui contrôlent la formation des muscles et des nerfs moteurs associés, sa diversité et sa physiopathologie. Les souris à 30 jours (1 mois), 60 jours (2 mois) et 90 jours (3 mois) sont utilisés pour mieux comprendre le dialogue entre les différents muscles et leurs nerfs moteurs associés.

Plus petites, dotées d'un cerveau plus petit, les souris double mutantes de ce projet peinent à se déplacer et à communiquer avec le reste de la portée, et leur mortalité augmente vers trois semaines de vie. 942 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le cerveau, à des stades allant de l'embryon à vingt jours de vie. Le porteur écrit pourtant qu'elles "ne subiront aucune procédure expérimentale". Tout animal délaissé par sa mère ou sans poche à lait visible pendant vingt-quatre heures est tué, et les collectes s'arrêtent à vingt jours pour devancer la mortalité.

Objectifs

Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Des mutations dans de nombreux gènes ont été identifiées chez des patients avec des troubles du neurodéveloppement. Notre objectif est de comprendre le rôle de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques associés à ces maladies. Plusieurs patients avec des troubles du neurodéveloppement présentent une mutation dans le gène d’intérêt. La protéine issue de ce gène (gène 1) forme un complexe avec une autre protéine (encodée par le gène 2). Ce complexe est indispensable au décodage de certains gènes. Notre collaboration avec des généticiens et d’autres équipes de recherche a permis de mettre en avant l’importance du gène d’étude dans le développement du cerveau. La technique utilisée lors de ces précedentes études nous a permis de moduler l’expression dans une partie des cellules de cortex (environ 1%) et de visualiser un défaut de migration. Nous souhaitons à présent moduler cette expression dans toutes les cellules du cortex pour comprendre les mécanismes impliqués dans les troubles du neurodeveloppement. Afin d’avoir toute la population de cellules du cortex à analyser (et non 1% comme les expériences précédentes), nous avons étudié des souris cKO (Knock-Out conditionnel, c’est-à-dire que le gène d’intérêt est absent uniquement dans le cortex des souris) soit pour le gène 1 soit pour le gène 2. Ces souris ne présentent aucune anomalie au niveau du cerveau. Nous souhaitons à présent étudier les souris cKO pour les deux gènes du complexe (perte de l’expression des gènes 1 et 2 simultanément), ici encore en limitant l’excision des gènes au cortex cérébral des souris. Cette étude permettra de comprendre par quels mécanismes moléculaires le complexe influe sur le développement du cortex.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de comprendre la fonction du complexe étudié dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquels sa déplétion conduit à des troubles du neurodéveloppement, plus précisément au niveau moléculaire.

Procédures

Ils ne subiront aucune procédure expérimentale.

Impact sur les animaux

Les animaux mutants sont plus petits et ont un cerveau plus petit. Ils pourront avoir du mal à se déplacer et à communiquer avec le reste de la portée, notamment dans le cas des études post-natales. Vers 3 semaines après la naissance, les animaux présentent une mortalité qui semble augmentée d’après nos premières données préliminaires. Dans ce projet, nous n’étudions pas les animaux agès de plus de 3 semaines.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet afin de prélever les cerveaux et de réaliser les analyses sur ceux-ci.

Remplacement

L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral en développement qui ne peut pas totalement être recréé par des approches in vitro. Nous incluons d’ailleurs dans cette étude des méthodes de culture cellulaire, mais qui nécessitent tout de même des embryons « donneurs ». Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération de gènes sur le développement embryonnaire cortical.

Réduction

Notre projet est composé de trois études dont la première a pour but de déterminer les stades clés pour les études suivantes, afin de limiter le nombre de stades étudiés en détail et de limiter le nombre d’animaux générés. De plus, nous allons combiner les analyses de protéines et d’ARN sur une même portée (1 hémisphère pour chaque étude au lieu du cerveau entier). Nous utilisons les test statistique adaptés afin d’évaluer différents paramètres chez les animaux portant la mutation par rapport aux contrôles (embryons non porteurs de la mutation de la même portée). Nous avons aussi adapté le nombre de portées à analyser en fonction des expériences à réaliser.

Raffinement

Nous prenons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal, notamment avec l’ajout de nid et de tunnel dans les cages d’hébergement. La mise à mort est faite par du personnel qualifié. Pour les animaux à 3 semaines de vie (21-22 jours après la naissance), bien qu’ils soient plus petits et aient un cerveau plus petit, nous n’avons jusqu’à présent pas détecté de signe de détresse ou de souffrance. Aucun point limite (maigreur, absence de lait maternel dans l’estomac) n’a été constaté dans les premières portées. Nous faisons toutefois nos collectes les plus tardives à 20 jours de vie, avant l’apparition de la mortalité. Nous effectuons le prélèvement pour le génotypage en post-mortem pour éviter une douleur inutile. En post-natal, pour les animaux étudiés le jour de la naissance ou à 6 jours de vie : nous comptons les nouveaux nés à la naissance et nous nous assurons qu’ils sont bien en groupe dans le nid, attestant que la mère s’occupe de tous ses petits. Tout animal délaissé sera euthanasié pour éviter hypothermie et hypoglycémie. 3 fois par semaine, nous apportons une attention particulière aux points limites suivants : i) l’absence de prise alimentaire par observation de la poche à lait : tout animal sans poche à lait visible pendant 24h est euthanasié ; ii) cyanose: les animaux étant glabres jusqu’à 6 jours de vie, nous observons la couleur de la peau : tout animal cyanosé est euthanasié. Entre 6 et 20 jours de vie: Nous surveillons l’attitude de la mère et tout animal délaissé sera euthanasié pour éviter hypothermie et hypoglycémie. L’apparence du pelage des petits est également un bon indice du soin apporté par la mère. Nous avons noté une taille des nouveaux nés double mutants plus petite (mais de corpulence normale, c’est-à-dire qu’ils ne sont pas anomalement maigres), des cerveaux plus petits et des animaux moins vifs. Le point limite étant une perte anormale de poids, les animaux sont pesés 3 fois par semaine. Si une perte de poids ou un état de maigreur est observé, l’animal est euthanasié. Les animaux ne réagissant pas à une stimulation lors de l’ouverture du nid sont euthanasiés.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour étudier les gènes impliqués chez des patients souffrant de troubles neurodéveloppementaux. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris, ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neurodéveloppementales chez l’homme. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par portée est couramment modifié génétiquement, ce qui nous permet de mimer les mutations observées chez l’homme. De plus la culture de cellules souches neurales et la culture primaire de neurones à partir de cortex murins sont des techniques bien établies au laboratoire. Selon nos études préliminaires, les très jeunes embryons mutants (avant 2/3 de gestation) ne présentent aucune différence avec les embryons sauvages. A la naissance, nous notons une taille légèrement inférieure et juste avant le sevrage, cette taille ainsi que la taille du cerveau, sont très inférieures chez les double cKO. A deux semaines de vie, on observe également une diminution de la taille (corps et tête) chez les animaux avec une seule copie d’un des deux gènes. Nous souhaitons dans un premier temps étudier tous les stades du développement du cerveau afin de déterminer précisement la dynamique d’apparition des phénotypes et d’identifier le timing précis auquel réaliser la caractérisation moléculaire qui permettra de comprendre les mécanismes qui mènent à l’apparition des phénotypes : stades embryonnaires 14.5 jours, 15.5 jours, 16.5 jours et 18.5 jours post-fécondation et stades postnataux jour de la naissance et 6, 14 et 20 jours de vie. Dans les études suivantes, nous étudierons plus en détail uniquement les stades clé.

10 660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à trente-cinq injections sur animal vigile, une biopsie d'oreille, trois tests de mémoire épisodique, trois tests de mémoire spatiale et un test d'épilepsie de deux heures. Certaines molécules administrées provoquent un état cataleptique et épileptique, et les souris mutantes développent une mâchoire proéminente qui allonge les dents, coupées si besoin. Le projet porte sur un gène du nanisme et sur des molécules candidates, sans qu'aucun élément n'explique comment un effectif de 10 660 individus a été arrêté.

Objectifs

Le nanisme, caractérisé par une petite taille disproportionnée et des difficultés d'apprentissage, est dû à une mutation dans un gène appartenant à une famille de récepteur. L'objectif de ce projet est d'étudier le rôle de ce gène au cours du développement squelettique, du vieillissement et son implication sur la cognition afin de mieux comprendre la pathologie humaine et de tester in vivo des molécules "médicament candidat".

Bénéfices attendus

Les principaux bénéfices attendus pour ce projet sont de proposer aux patients une solution thérapeutique pour traiter le nanisme et de déchiffrer la fonction du gène d'intérêt au cours de la croissance, du vieillissement et son implication dans la cognition.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : injection sur animaux vigiles (35 fois max; 30sec), prélèvement de tissu à l'oreille (1 fois; 5sec), test mémoire épisodique (3 fois;5-10 et 15 minutes),test mémoire spatiale (3 fois;5-10 et 15 minutes), test épilepsie (1 fois;2heures).

Impact sur les animaux

Les injections induisent une douleur légère et brève. La biopsie à d'oreille entraine une douleur légére et brève. Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent provoquer egalement un stress chez l’animal. Certaines molécules causent un état cataleptique et épileptique. Les souris mutantes peuvent avoir une proéminence anormale de la mâchoire vers l’avant avec pour conséquence des dents longues. Les tests de comportement peuvent induire du stress également.

Devenir

Chaque souris sera mise à mort et de nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques.

Remplacement

L'objectif étant de comprendre la physiopathologie du nanisme et d'identifier des molécules susceptibles de corriger un défaut de croissance, seuls les modèles animaux peuvent apporter des réponses à nos hypothèses de travail. La souris est un modèle largement utilisé et pertinent en raison de ses similitudes physiologiques et génétiques avec l'humain. Pour les tests de comportement, il n'existe pas d'alternative à l'utilisation d'animaux décrite actuellement dans la littérature.

Réduction

Chaque souris fournira des données détaillées sur plusieurs aspects de la physiopathologie. En effet, de nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Les effectifs ont été déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Le nombre de souris par groupe a été déterminé afin de pouvoir réaliser une analyse statistique en tenant compte de la variabilité intra-groupe.

Raffinement

Pour les tests de comportement les souris auront 3 jours minimum entre chaque test pour réduire le stress. Les souris seront sous surveillance quotidienne et des points limites ont été établis. Elles vivront en groupe avec des matériaux pour construire un nid. Elles seront anesthésiées avec des produits adaptés. Afin de limiter l'impact de l'avancement des dents, les souris seront observées tous les trois jours et une coupe des dents sera réalisée si nécessaire. La grille des scores est remplie tous les trois jours pour les souris 16,24 et 32 jours et hebdomadaire pour les souris 3,12,18 et 24 mois.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix pour étudier le développement squelettique. En effet, les processus d’ossification chez l’homme et la souris sont similaires. Le modèle de souris de nanisme utilisé reproduit assez fidèlement la pathologie osseuse et est un modèle de choix pour tester des molécules à visée thérapeutique. Le phénotype squelettique est évolutif au cours du développement d'où la nécessité d'étudier des moments bien précis du développement. Le phénotype osseux sera étudié au cours de la période post-natale à différents stades de la vie des souris (16-24-32 jours et 3 -12-18 et 24 mois). Etude de la plaque de croissance à 16 jours. Etude de l'ossification secondaire à 24 jours. Etude de l'os trabéculaire et cortical à 32 jours. Etude de la formation et résorption osseuse à 3 et 12 mois.- Etude du vieillissement à 2 différents temps: 18 mois et 24.