Biologie du développement

812 rongeurs, 592 souris et 220 rats, vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, les adultes tués à la fin de chaque mise au point et 212 animaux réutilisés. Des femelles gestantes subissent jusqu'à dix anesthésies gazeuses quotidiennes de trente minutes sur les vingt et un jours de gestation, et leurs nouveau-nés sont séparés d'elles jusqu'à quinze minutes pour être échographiés, au risque d'un rejet ou d'une agression au retour dans la cage. Le porteur présente l'échographie comme un raffinement qui remplacerait des dissections chez d'autres équipes, tout en visant un "catalogue de prestations techniques" et la formation d'utilisateurs. L'effectif, lui, n'est adossé à aucun calcul de puissance et correspond au "nombre moyen nécessaire et suffisant" pour évaluer la reproductibilité des mesures.

Objectifs

L’objectif de notre projet vise à prendre en charge la mise au point expérimentale de l’exploration de différents organes et phénomènes biologiques, physiologiques ou pathologiques, par échographie sur le rongeur. Une large partie de cette mise au point sera consacrée à l’exploration cardiaque où la reproductibilité des mesures est primordiale pour étudier les dysfonctions ou le vieillissement cardiaque. L’échographie sera également mise en œuvre pour la détection et le suivi du cancer (foie, pancréas, colon, sein, etc..), l’exploration du muscle (orientation, longueur de fibres, volume), l’étude de la perfusion cérébrale ou encore suivi du développement embryonnaire et du nouveau-né. Nous souhaitons également mettre au point des interventions guidées par échographie (administration et/ou prélèvement de substances dans des organes profonds) susceptibles de remplacer certaines interventions chirurgicales. La mise au point pourra aussi porter sur l’utilisation d’agents de contraste pour l’échographie (microbulles) pour mieux visualiser certaines structures ou étudier la perfusion sanguine dans de nombreuses situations. L’un des systèmes dont nous disposons permet de mesurer des différences de dureté tissulaire à l’intérieur d’un même organe et ainsi mettre en évidence de façon ultra précoce l’apparition de certaines lésions. Si cette application a été bien prise en main par les spécialistes du cancer du pancréas utilisant quotidiennement l’échographie dans le cadre de leurs recherches, nous devons la déployer sur d’autres thématiques pour la rendre accessible à des équipes non spécialistes en échographie. Notre ambition est de mettre en place un catalogue de prestations techniques aussi complet que possible et évolutif pour, in fine, pouvoir former les utilisateurs ou prendre en charge leur projet en tant qu’experts. Nous nous attacherons également à diffuser les méthodologies validées pour en faire un référentiel pour la recherche préclinique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette mise au point de procédures expérimentales robustes et reproductibles d’imagerie non invasive par échographie ou échocardiographie à destination de la communauté scientifique vise à faciliter l’accès au plus grand nombre à une modalité d’imagerie non invasive, peu stressante, ne nécessitant pas d’intervention lourde sur l’animal et permettant leur suivi longitudinal. Nous espérons que cette expertise apportée aux chercheurs permettra d’augmenter le recours à l’échographie en remplacement de méthodes invasives ou terminales (dissections). Ceci aura donc un impact positif sur deux critères de la règle de 3R : 1. Réduction : Suivi d’une même cohorte au cours du temps, détection plus précise (chaque animal étant son propre contrôle) afin de réduire la taille des lots d’animaux 2. Raffinement : Modalité atraumatique, générant un stress limité puisque l’animal est sous anesthésie, détection plus précoce des pathologies pour réduire la dégradation du bien être dans le cadre de modèle chronique. Raffinement de certaines procédures précédemment réalisées par chirurgie (injection de cellules tumorales dans des organes profonds comme le pancréas).

Procédures

Pour la mise au point d’exploration échographie non invasive, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse de 20 minutes maximum et cette anesthésie pourra être répétée 3 fois à 24h d’intervalle minimum. Pour la mise au point de procédures d’échographie avec injection d’agents de contraste, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum avec pose de cathéter veineux (5 minutes) avant début des acquisitions échographiques. Pour la mise au point d’interventions sous contrôle échographique, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum et, durant cette anesthésie, des injections ou des prélèvements seront réalisés (30 minutes). Pour l’optimisation du suivi du développement embryonnaire par échographie, les souris femelles non anesthésiées subiront deux injections d'hormones. Après fécondation, elles subiront une anesthésie générale gazeuse quotidienne de 30 minutes maximum, soit 10 anesthésies maximum sur les 21 jours de gestation. Toutes ces interventions pourront être réalisées alternativement ou successivement (à minimum 24h d'intervalle) dans les établissements utilisateurs (EU) 1 et 2. Les femelles gestantes pourront être transférées d'une EU à l'autre, par voie routière, sauf durant le dernier tiers de la gestation (à partir de 14 jours). Une échographie pourra être réalisée sans anesthésie sur les nouveaux nés (souris et rats) durant leurs premières heures de vie (moins de 48h) mais les nouveaux nés ne seront pas séparés de leur mère plus de 15 minutes. Le suivi pourra se poursuivre jusqu’au sevrage à raison d’une échographie par semaine maximum (soit 2 à 3 échographies par animal de 48 h à 21 jours de vie). Les explorations pourront se faire dans l'EU1 ou l'EU 2 mais aucun transfert ne sera autorisé avant sevrage.

Impact sur les animaux

L’exploration échographique du rongeur dans le cadre de mises au point techniques nécessite une anesthésie générale d’une durée relativement longue (20 minutes à 1h selon la procédure). La phase d’induction s’accompagne d’une phase d’excitation qui est un stress de faible niveau. La phase de réveil est également un moment critique. Selon la durée de l’anesthésie, l’animal peut voir sa température corporelle chuter. Il peut se déshydrater et perdre un peu de poids. Selon les modèles qui seront mis en œuvre, nous serons amenés à travailler sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) susceptibles d’entrainer stress, gêne respiratoire, difficulté de locomotion et / ou douleur. Les injections intraveineuses d’agents de contraste échographique (microbulles) pourront induire douleur locale et inflammation au niveau du site d’injection. Dans le cadre de suivis gestationnels, l’administration d’hormones (synchronisation de l’œstrus, facilitation de la mise bas) pourra se faire sur animal non anesthésié, sous contention, susceptible d’induire un stress. L’échographie néonatale, impose de séparer le nouveau-né de sa mère et du reste de la portée pour la durée de l’exploration échographique ce qui peut induire des comportements de rejet et / ou d’agressivité de la part de la mère à la réintroduction du nouveau-né dans la cage. L’anesthésie néonatale peut entrainer une dégradation des fonctions respiratoires et cardiaques, de l'hypothermie et une hypoglycémie.

Devenir

Tous les animaux adultes impliqués dans ce projet seront mis à mort à la fin de chaque projet de mise au point expérimentale échographique. Les animaux nés au cours des projets de suivi du développement embryonnaire et/ou mise au point d'injections et/ou prélèvements sous controle échographique et dont l'état général (santé et bien-être) le permettra seront proposés pour réutilisation aux chercheurs propriétaires des lignées en question et titulaires d'une autorisation de projet en cours de validité.

Remplacement

Pour certaines applications, mesure de dureté des tissus en particulier, nous pourrions avoir recours, pour les mises au point très préliminaires, à des objets mimant les tissus vivants (fantômes d’agarose) mais l’échographie est une modalité d’imagerie clinique et préclinique reposant sur les différences d’échogénicités entre les différents organes, fluides et tissus, in vivo, le recours aux animaux reste indispensable y compris dans notre démarche de mise au point expérimentale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre moyen nécessaire et suffisant pour être en mesure d’évaluer la reproductibilité de nos mesures. Ce nombre sera ré-évalué pour chaque nouvelle fonction étudiée, en fonction des spécificités de chaque projet et sur la base de recherches bibliographiques. Afin de réduire le nombre global d’animaux mis en œuvre, les animaux dont l’état de santé et de bien-être général le permet seront, autant que possible, réutilisés lorsque la procédure pratiquée ne remet pas en cause le bien-être et / ou la survie des animaux. Ce sont par ailleurs les mêmes animaux qui seront suivis au cours du temps pour mise au point d’un protocole expérimental donné. Tous les résultats obtenus seront mis à disposition des équipes de recherche pour servir d’études pilotes aux projets de recherches qui s’appuiront sur ces nouvelles méthodes. Ils leur permettront de déterminer la taille de leurs lots d’essais par une approche statistique.

Raffinement

L'imagerie échographique permet d’explorer et mesurer les organes, la circulation et la perfusion sanguine sans douleur avec un stress minimal lié à l’induction de l’anesthésie (isolement et perte de connaissance). Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (à l'aide de grilles d’évaluation et de points limites adaptés à chaque modèle) sera strictement respecté et effectué quotidiennement en concertation avec les équipes de zootechnie. Pour ceux qui devront être transférés d’un établissement utilisateur à un autre, le transfert se fera par voie routière (15 à 30 minutes) dans le respect de la charte de transport établie par notre structure. Pour limiter le stress dû au transport les animaux seront transportés dans leur cage d’origine afin qu’ils conservent leurs repères olfactifs. Lors des explorations échographiques, les animaux seront maintenus sur un support d’imagerie chauffant pendant toute la durée de l’anesthésie générale. Dans le cas des nouveaux-nés, une attention particulière sera portée au maintien de l’environnement olfactif : 1/ pendant la procédure pour réduire le stress du nouveau-né et 2/ pendant la phase de réveil pour qu’il ne soit pas rejeté par sa mère après réintroduction dans la cage. Nous travaillerons sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) mais dans le cadre de ce projet la phase la plus critique des mises au point expérimentales se situera dans les phases les plus précoces et ne devrait donc pas induire de nuisance particulière pour les animaux autres que celles en lien direct avec la méthode expérimentale. Si malgré tout nous devions voir apparaitre des signes de souffrances non soulagés par des traitements vétérinaires classiques (réhydratation parentérale, administration d’antidouleur de type morphiniques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens), les animaux seraient mis à mort rapidement. Nous veillerons à limiter autant que possible le stress subi par les animaux en employant des méthodes de manipulation les plus adaptées (préhension sans contention, maintien de l'environnement olfactif pour les nouveaux nés). Tout stress causé aux animaux serait par ailleurs rédhibitoire pour prétendre mesurer des paramètres physiologiques tels que ceux caractérisant la fonction cardiaque. Certaines injections pourront se faire sur animal non anesthésié (injection d'hormones) mais la plupart seront faites sous anesthésie générale, durant la procédure d'échographie.

Choix des espèces

L'objectif de ce projet est de mettre au point et standardiser différentes procédures expérimentales d’échographie, d’échocardiographie et d’écho-élastographie ce qui ne peut se faire que chez l’animal vivant en l’absence de modèles in vitro appropriés. L'utilisation de rongeurs tels que la souris et le rat permet de reproduire les pathologies humaines telles que les maladies cardiovasculaires, les cancers ou les maladies métaboliques ou encore le suivi du vieillissement. Le rat est plus particulièrement utilisé dans des applications de neurobiologie ou l’étude de la nécrose osseuse induite lors de radiothérapie du cerveau en particulier. Les rongeurs (souris et rats), grâce à leur courte durée de gestation (21 jours) sont également des modèles particulièrement adaptés pour mener des études de suivi de développement embryonnaire. L’échographie permet de détecter l’apparition de malformations éventuellement associées à certains génotypes et/ou observer le phénomène de résorption embryonnaire pouvant expliquer l’absence de certains génotypes à la mise bas (mortalité embryonnaire). Les animaux adultes seront âgés de 7 semaines minimum à réception dans nos zootechnies. Ils ne seront utilisés qu’après 5 à 7 jours de quarantaine. Les expériences seront majoritairement conduites chez de jeunes adultes de 8 à 12 semaines mais cet âge pourra varier en fonction de l’objet de l’étude (a minima après sevrage et jusqu’à 1 an). Une des procédures, qui nécessite la mise en œuvre de femelles gestantes. Ces femelles (souris et rates) seront mises en accouplement à partir de l’âge de 8 semaines. Les embryons pourront être objets de prélèvements et / ou injections guidées par échographie à tous les stades de développement donc y compris durant le dernier tiers de gestation. Les souriceaux et ratons issus de ces gestations pourront être imagés par échographie avant sevrage (de 1 à 21 jours).

592 souris et 220 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 212 d'entre eux réutilisés ensuite, les autres tués. Les anesthésies gazeuses se répètent jusqu'à trois fois à un jour d'intervalle, durent jusqu'à une heure quand un cathéter veineux est posé, et atteignent dix séances quotidiennes de trente minutes chez les femelles gestantes suivies pendant les vingt et un jours de gestation. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère jusqu'à quinze minutes, ce qui peut provoquer son rejet ou son agressivité à la réintroduction dans la cage. Le porteur annonce un "catalogue de prestations techniques" destiné à former d'autres équipes, et conclut que malgré des fantômes d'agarose utilisables pour les mises au point préliminaires, le recours aux animaux reste "indispensable".

Objectifs

L’objectif de notre projet vise à prendre en charge la mise au point expérimentale de l’exploration de différents organes et phénomènes biologiques, physiologiques ou pathologiques, par échographie sur le rongeur. Une large partie de cette mise au point sera consacrée à l’exploration cardiaque où la reproductibilité des mesures est primordiale pour étudier les dysfonctions ou le vieillissement cardiaque. L’échographie sera également mise en œuvre pour la détection et le suivi du cancer (foie, pancréas, colon, sein, etc..), l’exploration du muscle (orientation, longueur de fibres, volume), l’étude de la perfusion cérébrale ou encore suivi du développement embryonnaire et du nouveau-né. Nous souhaitons également mettre au point des interventions guidées par échographie (administration et/ou prélèvement de substances dans des organes profonds) susceptibles de remplacer certaines interventions chirurgicales. La mise au point pourra aussi porter sur l’utilisation d’agents de contraste pour l’échographie (microbulles) pour mieux visualiser certaines structures ou étudier la perfusion sanguine dans de nombreuses situations. L’un des systèmes dont nous disposons permet de mesurer des différences de dureté tissulaire à l’intérieur d’un même organe et ainsi mettre en évidence de façon ultra précoce l’apparition de certaines lésions. Si cette application a été bien prise en main par les spécialistes du cancer du pancréas utilisant quotidiennement l’échographie dans le cadre de leurs recherches, nous devons la déployer sur d’autres thématiques pour la rendre accessible à des équipes non spécialistes en échographie. Notre ambition est de mettre en place un catalogue de prestations techniques aussi complet que possible et évolutif pour, in fine, pouvoir former les utilisateurs ou prendre en charge leur projet en tant qu’experts. Nous nous attacherons également à diffuser les méthodologies validées pour en faire un référentiel pour la recherche préclinique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette mise au point de procédures expérimentales robustes et reproductibles d’imagerie non invasive par échographie ou échocardiographie à destination de la communauté scientifique vise à faciliter l’accès au plus grand nombre à une modalité d’imagerie non invasive, peu stressante, ne nécessitant pas d’intervention lourde sur l’animal et permettant leur suivi longitudinal. Nous espérons que cette expertise apportée aux chercheurs permettra d’augmenter le recours à l’échographie en remplacement de méthodes invasives ou terminales (dissections). Ceci aura donc un impact positif sur deux critères de la règle de 3R : 1. Réduction : Suivi d’une même cohorte au cours du temps, détection plus précise (chaque animal étant son propre contrôle) afin de réduire la taille des lots d’animaux 2. Raffinement : Modalité atraumatique, générant un stress limité puisque l’animal est sous anesthésie, détection plus précoce des pathologies pour réduire la dégradation du bien être dans le cadre de modèle chronique. Raffinement de certaines procédures précédemment réalisées par chirurgie (injection de cellules tumorales dans des organes profonds comme le pancréas).

Procédures

Pour la mise au point d’exploration échographie non invasive, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse de 20 minutes maximum et cette anesthésie pourra être répétée 3 fois à 24h d’intervalle minimum. Pour la mise au point de procédures d’échographie avec injection d’agents de contraste, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum avec pose de cathéter veineux (5 minutes) avant début des acquisitions échographiques. Pour la mise au point d’interventions sous contrôle échographique, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum et, durant cette anesthésie, des injections ou des prélèvements seront réalisés (30 minutes). Pour l’optimisation du suivi du développement embryonnaire par échographie, les souris femelles non anesthésiées subiront deux injections d'hormones. Après fécondation, elles subiront une anesthésie générale gazeuse quotidienne de 30 minutes maximum, soit 10 anesthésies maximum sur les 21 jours de gestation. Toutes ces interventions pourront être réalisées alternativement ou successivement (à minimum 24h d'intervalle) dans les établissements utilisateurs (EU) 1 et 2. Les femelles gestantes pourront être transférées d'une EU à l'autre, par voie routière, sauf durant le dernier tiers de la gestation (à partir de 14 jours). Une échographie pourra être réalisée sans anesthésie sur les nouveaux nés (souris et rats) durant leurs premières heures de vie (moins de 48h) mais les nouveaux nés ne seront pas séparés de leur mère plus de 15 minutes. Le suivi pourra se poursuivre jusqu’au sevrage à raison d’une échographie par semaine maximum (soit 2 à 3 échographies par animal de 48 h à 21 jours de vie). Les explorations pourront se faire dans l'EU1 ou l'EU 2 mais aucun transfert ne sera autorisé avant sevrage.

Impact sur les animaux

L’exploration échographique du rongeur dans le cadre de mises au point techniques nécessite une anesthésie générale d’une durée relativement longue (20 minutes à 1h selon la procédure). La phase d’induction s’accompagne d’une phase d’excitation qui est un stress de faible niveau. La phase de réveil est également un moment critique. Selon la durée de l’anesthésie, l’animal peut voir sa température corporelle chuter. Il peut se déshydrater et perdre un peu de poids. Selon les modèles qui seront mis en œuvre, nous serons amenés à travailler sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) susceptibles d’entrainer stress, gêne respiratoire, difficulté de locomotion et / ou douleur. Les injections intraveineuses d’agents de contraste échographique (microbulles) pourront induire douleur locale et inflammation au niveau du site d’injection. Dans le cadre de suivis gestationnels, l’administration d’hormones (synchronisation de l’œstrus, facilitation de la mise bas) pourra se faire sur animal non anesthésié, sous contention, susceptible d’induire un stress. L’échographie néonatale, impose de séparer le nouveau-né de sa mère et du reste de la portée pour la durée de l’exploration échographique ce qui peut induire des comportements de rejet et / ou d’agressivité de la part de la mère à la réintroduction du nouveau-né dans la cage. L’anesthésie néonatale peut entrainer une dégradation des fonctions respiratoires et cardiaques, de l'hypothermie et une hypoglycémie.

Devenir

Tous les animaux adultes impliqués dans ce projet seront mis à mort à la fin de chaque projet de mise au point expérimentale échographique. Les animaux nés au cours des projets de suivi du développement embryonnaire et/ou mise au point d'injections et/ou prélèvements sous controle échographique et dont l'état général (santé et bien-être) le permettra seront proposés pour réutilisation aux chercheurs propriétaires des lignées en question et titulaires d'une autorisation de projet en cours de validité.

Remplacement

Pour certaines applications, mesure de dureté des tissus en particulier, nous pourrions avoir recours, pour les mises au point très préliminaires, à des objets mimant les tissus vivants (fantômes d’agarose) mais l’échographie est une modalité d’imagerie clinique et préclinique reposant sur les différences d’échogénicités entre les différents organes, fluides et tissus, in vivo, le recours aux animaux reste indispensable y compris dans notre démarche de mise au point expérimentale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre moyen nécessaire et suffisant pour être en mesure d’évaluer la reproductibilité de nos mesures. Ce nombre sera ré-évalué pour chaque nouvelle fonction étudiée, en fonction des spécificités de chaque projet et sur la base de recherches bibliographiques. Afin de réduire le nombre global d’animaux mis en œuvre, les animaux dont l’état de santé et de bien-être général le permet seront, autant que possible, réutilisés lorsque la procédure pratiquée ne remet pas en cause le bien-être et / ou la survie des animaux. Ce sont par ailleurs les mêmes animaux qui seront suivis au cours du temps pour mise au point d’un protocole expérimental donné. Tous les résultats obtenus seront mis à disposition des équipes de recherche pour servir d’études pilotes aux projets de recherches qui s’appuiront sur ces nouvelles méthodes. Ils leur permettront de déterminer la taille de leurs lots d’essais par une approche statistique.

Raffinement

L'imagerie échographique permet d’explorer et mesurer les organes, la circulation et la perfusion sanguine sans douleur avec un stress minimal lié à l’induction de l’anesthésie (isolement et perte de connaissance). Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (à l'aide de grilles d’évaluation et de points limites adaptés à chaque modèle) sera strictement respecté et effectué quotidiennement en concertation avec les équipes de zootechnie. Pour ceux qui devront être transférés d’un établissement utilisateur à un autre, le transfert se fera par voie routière (15 à 30 minutes) dans le respect de la charte de transport établie par notre structure. Pour limiter le stress dû au transport les animaux seront transportés dans leur cage d’origine afin qu’ils conservent leurs repères olfactifs. Lors des explorations échographiques, les animaux seront maintenus sur un support d’imagerie chauffant pendant toute la durée de l’anesthésie générale. Dans le cas des nouveaux-nés, une attention particulière sera portée au maintien de l’environnement olfactif : 1/ pendant la procédure pour réduire le stress du nouveau-né et 2/ pendant la phase de réveil pour qu’il ne soit pas rejeté par sa mère après réintroduction dans la cage. Nous travaillerons sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) mais dans le cadre de ce projet la phase la plus critique des mises au point expérimentales se situera dans les phases les plus précoces et ne devrait donc pas induire de nuisance particulière pour les animaux autres que celles en lien direct avec la méthode expérimentale. Si malgré tout nous devions voir apparaitre des signes de souffrances non soulagés par des traitements vétérinaires classiques (réhydratation parentérale, administration d’antidouleur de type morphiniques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens), les animaux seraient mis à mort rapidement. Nous veillerons à limiter autant que possible le stress subi par les animaux en employant des méthodes de manipulation les plus adaptées (préhension sans contention, maintien de l'environnement olfactif pour les nouveaux nés). Tout stress causé aux animaux serait par ailleurs rédhibitoire pour prétendre mesurer des paramètres physiologiques tels que ceux caractérisant la fonction cardiaque. Certaines injections pourront se faire sur animal non anesthésié (injection d'hormones) mais la plupart seront faites sous anesthésie générale, durant la procédure d'échographie.

Choix des espèces

L'objectif de ce projet est de mettre au point et standardiser différentes procédures expérimentales d’échographie, d’échocardiographie et d’écho-élastographie ce qui ne peut se faire que chez l’animal vivant en l’absence de modèles in vitro appropriés. L'utilisation de rongeurs tels que la souris et le rat permet de reproduire les pathologies humaines telles que les maladies cardiovasculaires, les cancers ou les maladies métaboliques ou encore le suivi du vieillissement. Le rat est plus particulièrement utilisé dans des applications de neurobiologie ou l’étude de la nécrose osseuse induite lors de radiothérapie du cerveau en particulier. Les rongeurs (souris et rats), grâce à leur courte durée de gestation (21 jours) sont également des modèles particulièrement adaptés pour mener des études de suivi de développement embryonnaire. L’échographie permet de détecter l’apparition de malformations éventuellement associées à certains génotypes et/ou observer le phénomène de résorption embryonnaire pouvant expliquer l’absence de certains génotypes à la mise bas (mortalité embryonnaire). Les animaux adultes seront âgés de 7 semaines minimum à réception dans nos zootechnies. Ils ne seront utilisés qu’après 5 à 7 jours de quarantaine. Les expériences seront majoritairement conduites chez de jeunes adultes de 8 à 12 semaines mais cet âge pourra varier en fonction de l’objet de l’étude (a minima après sevrage et jusqu’à 1 an). Une des procédures, qui nécessite la mise en œuvre de femelles gestantes. Ces femelles (souris et rates) seront mises en accouplement à partir de l’âge de 8 semaines. Les embryons pourront être objets de prélèvements et / ou injections guidées par échographie à tous les stades de développement donc y compris durant le dernier tiers de gestation. Les souriceaux et ratons issus de ces gestations pourront être imagés par échographie avant sevrage (de 1 à 21 jours).

Mises au régime enrichi en graisses dès l'âge de cinq semaines, accouplées huit semaines plus tard, les femelles restent sous ce régime jusqu'à leur mise à mort. 343 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, avec une pesée hebdomadaire et trois mesures de glycémie obtenues en coupant le bout de la queue. Le porteur affirme n'avoir observé, lors d'études précédentes, ni souffrance ni perte de poids continue, et ajoute des bâtonnets de bois dans les cages pour entretenir "le besoin de grignotage". Les femelles sont tuées à 8,5 jours de gestation pour que leurs embryons soient prélevés, l'objet étant de comprendre comment l'obésité maternelle perturbe la formation du cœur.

Objectifs

L'obésité est un problème de santé publique majeur associée à de nombreuses comorbidités et dont l'incidence ne cesse d'augmenter. Les comorbidités associées aux maladies cardiovasculaires sont largement représentées et une augmentation significative de la prévalence des malformations cardiaques congénitales est observée dans les cas d’obésité maternelle. Les cellules progénitrices cardiaques sont présentes très tôt chez l’embryon et nous avons démontré que l'obésité maternelle induite par une alimentation enrichie en graisse affecte la contribution de ces cellules au développement du cœur embryonnaire offrant alors un terrain favorable au développement de malformations cardiaques. Une nette augmentation de la prévalence de ces malformations et de mort prématurée des embryons obtenus de mères obèses est observée. Les études chez la souris ont permis de définir l'impact de l'obésité maternelle sur le développement cardiaque embryonnaire précoce. Nous nous intéressons à présent au processus biologiques par lesquels l’embryon transforme la matière et l’énergie obtenu de la mère normale et obèse pour son développement normal ou défectueux. Nos résultats sont encourageants et prometteurs. Il apparaît que le statut métabolique et bioénergétique des cellules progénitrices cardiaques joue un rôle important pour le développement normal du cœur. Jusqu'alors l'impact de l’obésité maternelle sur le développement cardiaque embryonnaire n'avait jamais été exploré. L'objectif de notre étude à long terme est d’identifier des cibles pertinentes pour le diagnostic et la prévention précoce des pathologies cardiaques congénitales dans un contexte d’obésité maternelle chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Jusqu’à présent les recherches fondamentales sur les pathologies secondaires à l’obésité ne rendaient pas compte de l’impact de l’obésité maternelle sur le développement de l’enfant en devenir. Les connaissances relatives au développement cardiaque embryonnaire ne permettent pas de déterminer quels sont les évènements biologiques défaillants. Ce projet à pour objectif d’exploiter les connaissances acquises et de développer de nouvelles connaissances relatives au métabolisme énergétique et aux voies de signalisation requises pour le développement normal du cœur. Ces recherches ont pour objectif de mettre à mal le spectre des pathologies cardiaques congénitales dans le cas d’obésité maternelle. Nous envisageons que l’identification des molécules et des réseaux altérés permettront d'envisager des cibles thérapeutiques afin de prévenir le développement des pathologies cardiaques congénitales chez l’Homme.

Procédures

L'obésité maternelle est obtenue par une alimentation enrichie en graisse en amont de l'accouplement et tout au long de la gestation. Les femelles âgées de 5 semaines seront soumises à un apport nutritionnel riche en acides gras qui sera maintenu pendant 8 semaines avant accouplement et jusqu'à l’euthanasie de l’animal. Pour chaque individu, un contrôle hebdomadaire de la prise de poids sera réalisé. Un contrôle de glycémie sera effectué lors du changement de régime alimentaire puis toutes les 4 semaines, trois prélèvements seront donc réalisés. Les mesures seront réalisés en moins d'une minute à l'aide d'un glucomètre.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont les suivants : 1- La modification du régime alimentaire des jeunes femelles. Les souris seront soumises à une alimentation enrichie en graisse au stade de 5 semaines pendant 8 semaines puis jusqu’au moment du sacrifice. Il n’y a pas de procédure invasive au changement d’alimentation. Les mâles reproducteurs seront eux soumis à une modification du régime alimentaire sur une fenêtre temporelle limitée à la période d’accouplement. Dans nos études précédentes nous n’avons pas observé de souffrances des animaux par une sous-alimentation qui puisse amener à une perte de poids continue ou un comportement inattendu. Lors de la modification du régime alimentaire les cages sont enrichies en batônnets de bois afin d’entretenir le besoin de grignotage des animaux. Besoin observé lors de notre précédente étude. 2- La mesure de la glycémie sera réalisée au moment du changement de régime alimentaire puis à 4 et 8 semaines après cette modification. Le dosage de la glycémie sera réalisé à l'aide d'un glucomètre. Une goutte de sang sera prélevée au niveau de la queue. La coupure très limitée du bout de la queue est couramment appliquée, en raison de la simplicité de la technique et de la riche vascularisation de la queue du rongeur. Le prélèvement sera réalisé au moment de la pesée hebdomadaire.

Devenir

Notre intérêt porte sur le développement embryonnaire. Les femelles seront donc mises à mort pour le prélèvement aux différents stades embryonnaires étudiés.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est requise car il n’existe pas de méthode alternative. Les évènements qui nous intéressent se manifestent au cours du développement embryonnaire qui sont propres à l’organisme entier et vivant. In situ l’existence de nombreux facteurs produits par les tissus situés à proximité des cellules progénitrices ne permet pas la réalisation de cette étude en culture de cellules. Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico car elles ne sont pas adaptées aux objectifs de cette étude. En effet, les organes-on-chips, les organoïdes ou les gastruloïdes ne permettent pas de reconstituer le développement du cœur embryonnaire. Pour cela il faudrait maîtriser parfaitement l'apport maternel à l'embryon au cours de la gestation dont les modifications de la composition du liquide amniotique dans lequel baigne l’embryon et de l'apport nutritionnel via le placenta.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit de façon à obtenir suffisamment de données statistiquement significatives pour atteindre l’objectif scientifique fixé en respect du principe de réduction et de raffinement. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux en expérimentation nous effectuerons à l’issu de chaque génotypage, lorsque celui-ci est requis chez les embryons obtenus des parents transgéniques, un tri sélectif des génotypes des embryons afin de les utiliser pour les différentes approches expérimentales envisagées.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet sont élevées en groupes sociaux dans des environnements enrichis par des dômes en cartons ou des lanières de papier kraft ainsi que des batônnets de bois. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé, 3 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. Tout au long de l’expérimentation nous nous attacherons à reconnaître la douleur, la quantifier et agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis s'avèrent être atteints.

Choix des espèces

Nos recherches sont réalisées chez la souris, un modèle d'étude pour lequel les connaissances acquises sur le développement embryonnaire sont importantes et approfondies. Ce projet vise à étudier le développement des embryons obtenus de mères obèses induites. Nous nous intéressons aux cellules progénitrices cardiaques présentes aux stades précoces du développement à 8,5 jours de gestation, la gestation est de 21 jours chez la souris. Nous utiliserons des souris sauvages et génétiquement modifiées. Les animaux transgéniques sont des modèles requis pour l'identification, le suivi et l'étude des cellules progénitrices et de leurs dérivés cardiaques aux différents stades du développement embryonnaire. Ce projet permettra d’évaluer l'impact de l'obésité maternelle sur les évènements fondamentaux du développement cardiaques, les processus cellulaires et moléculaires, le métabolisme, etc. Les résultats doivent permettre des avancées majeures pour la prévention et le traitement de ces pathologies chez l’Homme.

Modifiés génétiquement, mais sans phénotype dommageable déclaré, des poissons zèbres sont triés pour constituer des groupes reproducteurs. 18 000 d'entre eux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit, sous anesthésie et analgésie, le prélèvement de 10 % de sa nageoire caudale, geste qui lèse des terminaisons nerveuses et dont le porteur attend un retour à une nage normale en cinq minutes. 16 200 poissons resteront en vie comme reproducteurs et 1 800 seront tués faute de porter les caractéristiques génétiques recherchées, leurs embryons étant ensuite étudiés avant cinq jours de développement, stade auquel la réglementation sur l'expérimentation animale ne s'applique pas.

Objectifs

Ce projet vise à identifier certains poissons zèbre porteurs de caractéristiques génétiques spécifiques, sans qu’ils présentent de phénotypes dommageables. L’objectif est de former des groupes de poissons reproducteurs, capables de produire régulièrement des embryons, en fonction des besoins des chercheurs. Les études porteront ensuite sur les toutes premières étapes du développement des embryons (avant 5 jours). À ce stade, la loi ne considère pas ces recherches comme de l’expérimentation animale. Pour maintenir les lignées de poissons utiles à ces recherches, il est indispensable de prélever fragment de leur nageoire caudale, qui nous permettra de repérer les animaux d’intérêts.

Bénéfices attendus

Ce projet de prélèvements de tissus pour génotypage permet une sélection des animaux d’intérêt et ainsi d’optimiser la gestion et l’élevage des modèles animaux génétiquement altérés qui seront utilisées comme reproducteurs pour la production d’embryons dont l’étude (réalisée avant 5 jours de développement) ne relève pas de la législation de l’expérimentation animale. La méthode de génotypage utilisée dans la présente procédure présente deux bénéfices majeurs : Premièrement elle est parfaitement fiable, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux et le nombre de manipulations de ceux-ci. Deuxièmement, elle est sans incidence sur le bien-être de l’animal, celui-ci reprenant un comportement de nage parfaitement normal dès les premières minutes suivant le réveil d’anesthésie.

Procédures

Un prélèvement par animal de 10% (~2 mm2) de la nageoire caudale sera réalisé sur animal anesthésié et analgésié. L’ensemble de la procédure de prélèvement dure environ 5 minutes (2 min endormissement, 1 min prélèvement, 2 min réveil) et 5 minutes après le réveil les animaux présentent à nouveau un comportement de nage normal.

Impact sur les animaux

La biopsie entraîne la lésion de terminaisons nerveuses au niveau de la nageoire caudale. Les poissons ayant subi un prélèvement de nageoire doivent se réveiller rapidement (2 minutes) après la sortie de l’anesthésie et reprendre un comportement de nage normal au bout de 5 minutes. Dans le cas (extrêmement rare) d’un individu pour lequel la surveillance post-prélèvement indique un problème de réveil ou des altérations de la nage qui perdurent plus que 15 minutes, l’animal sera mis à mort par surdose d’anesthésique.

Devenir

Animaux gardés en vie pour l'utilisation continue en tant que reproducteurs (16200). Les animaux présentant des caractéristiques génétiques sans intérêt pour le travail expérimental ou le maintien des lignées seront mis à mort (1800).

Remplacement

Une alternative au génotypage par biopsie de nageoire adulte est le prélèvement de fragments de nageoire sur embryons. Celui-ci est réalisé entre 3 et 5 jours de développement et ne relève donc pas de la législation sur l’expérimentation animale. Cette approche de remplacement sera utilisée tant que possible, mais son utilisation reste limitée au vu de la petite quantité de matériel biologique et du temps limité (moins de 48h) disponible pour l’analyse.

Réduction

Les identifications seront adaptés et réduit aux mieux afin de répondre aux stricts besoins des projets de recherche sans surproduction. La procédure réalisée devra permettre l’identification de populations d’adultes reproducteurs permettant de i) répondre au besoin grégaire des animaux, ii) être sûr que chaque population compte aussi bien des mâles que des femelles, iii) avoir un nombre de reproducteurs suffisant pour la réalisation des expériences tout en permettant d’assurer des périodes de repos régulières aux reproducteurs.

Raffinement

Plusieurs mesures seront prises pour minimiser l’impact du prélèvement sur le bien-être des animaux : i) Les prélèvements seront réalisés sur animaux anesthésiés, afin d’éviter tout stress associé à la manipulation. ii) L’anesthésie sera de courte durée pour assurer un réveil rapide (

Choix des espèces

Plus de 80% des gènes associés à des pathologies humaines sont retrouvés chez le poisson zèbre. Son utilisation est pertinente pour deux raisons : Premièrement, la transparence de ses embryons, qui permet par exemple de visualiser des altérations du système cardiovasculaire sur l’animal vivant. Cette transparence permet de réaliser des études sur un organisme vertébré proche de l’homme sans que celles-ci relèvent de la législation sur l’expérimentation animale tant qu’elles sont réalisées au cours des 5 premiers jours de développement. La fécondation du poisson zèbre a lieu de manière externe ce qui veut dire que les embryons peuvent être produits par simple accouplement naturel d’adultes reproducteurs dont l’identification est l’objet de la présente demande. Le second avantage du poisson zèbre est la possibilité de réaliser des études génétiques. Ces études nécessitent de réaliser des prélèvements de fragments de nageoire sur animal adulte (>3 mois) pour d’identifier les animaux d’intérêt. Les animaux seront génotypés à l’état adulte (>3 mois) vu que i) l’objectif de la procédure est d’identifier des adultes reproducteurs et que ii) la nageoire adulte est suffisamment grande pour pouvoir effectuer un prélèvement qui est à la fois suffisant pour le génotypage est assez petit pour être sans incidence sur le bien-être du poisson.