Biologie du développement
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Influence à long terme d’une infection fœtale au cytomegalovirus sur le devenir d’une tumeur cérébrale ultérieure chez le rat
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des femelles gestantes sont opérées pour injecter le cytomégalovirus dans le cerveau de leurs embryons, les ratons nés subissent des tests sensorimoteurs quotidiens, puis une tumeur cérébrale leur est implantée à deux mois. 1 274 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance majoritairement sévère, tous tués à l'issue. Le porteur décrit chez les ratons des crises d'épilepsie généralisées corrélées à des morts subites. Les femelles sont tuées faute de pouvoir être réutilisées, la descendance pour analyse post-mortem.
Objectifs
Les infections congénitales à cytomegalovirus (CMV) concernent environ 1% des naissances et représentent une cause majeure de troubles du développement cérébral, pouvant notamment causer surdité, paralysie cérébrale, épilepsie, déficience intellectuelle, etc. Une influence sur la survenue ultérieure d'autisme ou de schizophrénie a aussi été évoquée. En dépit de leur fréquence et de leurs conséquences médicales et socio-économiques, les mécanismes des troubles neurologiques liés aux infections congénitales au CMV restent peu étudiés et mal connus. Ainsi, les options préventives et thérapeutiques restent limitées. L’étude de modèles animaux pertinents, notamment chez le rongeur, et utilisant les CMVs spécifiques de ces espèces, représente une approche indispensable pour appréhender ces mécanismes évolutifs, liés aux développements respectifs du système immunitaire cérébral et des réseaux neuronaux, et à leurs interactions réciproques, dans un contexte ou gestation et statut immunitaire maternel doivent aussi être pris en compte. L'objectif principal de ce projet est d'explorer chez le rat l'impact d’une infection précoce anténatale par le CMV sur le développement futur d’une tumeur cérébrale ultérieure, aux niveaux moléculaire et cellulaire, en nous intéressant particulièrement aux cellules immunitaires du cerveau.
Bénéfices attendus
Les infections congénitales par le cytomégalovirus (CMV) sont fréquentes (0.7 à 1% des naissances) et représentent une cause majeure de pathologie neuro-développementale, avec des conséquences médicales sévères et un impact socio-économique important. Cependant, les mécanismes restent mal compris et peu abordés. De ce point de vue, notre projet doit apporter des informations importantes pour apprécier ces mécanismes, en abordant les relations entre infection cérébrale fœtale par le CMV, immunité cérébrale retardée, et développement de tumeur cérébrale.
Procédures
Des femelles gestantes sont opérées sous anesthésie générale, afin d’accéder aux embryons et d’injecter le cytomegalovirus (CMV) dans les cerveaux embryonnaires. Dépendant du nombre d’embryons, la chirurgie dure de 30 à 45 minutes ; le muscle et la peau sont suturés. Au premier jour postnatal, les ratons d’une même portée sont tatoués au niveau des pattes avant et/ou arrière, et suivis quotidiennement pendant les deux premières semaines de vie postnatale (mesures de masse corporelle, réalisation de tests sensorimoteurs (test du réflexe de retournement lorsque l’animal est placé sur le dos, test du réflexe d’éloignement du vide lorsque la tête de l’animal est dans le vide, l’animal étant posé sur une plateforme élevée d’environ 8 cm), observation de la survenue de crises généralisées d’épilepsie) ; chaque session de tests dure environ 2-3 minutes. Après le 60eme jour de vie postnatale (P60), certains animaux sont opérés sous anesthésie générale (durée d’environ 30 minutes) pour implanter des cellules qui provoqueront l’apparition d’une tumeur cérébrale dans le cortex. Les animaux sont euthanasiés à la fin des expérimentations.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes sont opérées sous anesthésie générale pour accéder aux embryons et réaliser des injections dans les cerveaux embryonnaires. L'anesthésie des femelles gestantes peut engendrer des dépressions respiratoires, une hypothermie, une déshydratation. La chirurgie elle-même peut engendrer en post-opératoire sur des temps courts (1 à 3 jours maximum) de rares et faibles hémorragies vaginales, des avortements partiels, des douleurs abdominales, une diminution de la mobilité / inactivité, une perte de poids, une inflammation des sutures Les femelles gestantes sont isolées lors de la période post-opératoire jusqu’à la mise bas. Leur bien-être après chirurgie est évalué quotidiennement par des mesures de paramètres cliniques et comportementaux. La majorité des femelles gestantes (de plus de 97%) récupèrent très bien après la chirurgie et la gestation se poursuit jusqu’à la mise bas. Chez les ratons nés après l’infection cérébrale au CMV in utero, un ensemble de signes cliniques sont attendus. Leur suivi quotidien au cours des deux premières semaines de vie postnatale a mis en évidence la survenue : d'hyperextension des membres inférieurs ; de crises d'épilepsie généralisées tonico-cloniques déclenchées par la manipulation, et correlée à la survenue de mort subite (sudden unexpected death in epilepsy, SUDEP) ; d’un défaut de développement de réflexes sensorimoteurs évalués par le test d'éloignement du vide (cliff aversion test) et le test de retournement (rigthing reflex). Le développement d’une tumeur cérébrale dans le cortex de rat adulte est associé à une dégradation de l’état général des animaux, notamment une perte d’appétit, une perte de masse corporelle, et une diminution de l’activité.
Devenir
Les femelles sont euthanasiés car elles ne peuvent pas être réutilisées. La descendance est mise à mort pour analyses post mortem.
Remplacement
Les mécanismes neurophysiopathologiques des infections congénitales par le CMV reposent de manière inhérente sur des interactions développementales multiples, entre la dynamique de l'infection virale elle-même, celle des réseaux neuronaux, et celle des systèmes immunitaires cérébral foetal et maternel. Il est évident que certains de ces évènements, ainsi que leur complexité, et leurs relations réciproques, ainsi que leurs conséquences à long terme comme envisagé dans le projet, ne peuvent être modélisés in vitro y compris en utilisant des organoïdes cérébraux, et encore moins par bio-informatique. Une partie de nos expériences d'enregistrements des activités épileptiques sera réalisée in vitro (tranches aigues de cerveau), afin de réduire l’expérimentation sur l’animal vivant.
Réduction
Nous avons basé le nombre minimal d'animaux nécessaires sur la base de nos résultats antérieurs, et sur des calculs classiques de puissance statistique pour les tests les plus usuels. Nous optimisons la réduction des animaux utilisés de plusieurs manières : - chaque gestation et tous les embryons injectés in utero sont utilisés. - par ailleurs, le principe de réduction sera appliqué, car les animaux seront suivis au cours de notre projet, depuis les tests neurologiques néonataux, jusqu’aux enregistrements in vitro et aux analyses immunohistopathologiques réalisées chez l’adulte. Ceci aura l'avantage de permettre d'établir d'éventuelles corrélations entre plusieurs anomalies chez les mêmes animaux ayant passé l'ensemble des tests.
Raffinement
Chaque rate et sa portée sont hébergées dans une cage avec nourriture et eau à volonté. Après sevrage (vers le 28e jour), les rats mâles et femelles sont séparés et hébergés à 2-4 par cage. L’environnement est systématiquement enrichi avec du papier foisonnant et un tunnel en carton permettant la confection d’un nid ; les rats adultes auront en plus une buchette à ronger. Avant les chirurgies (gestantes et rats adultes), réalisées sous anesthésie générale, la douleur est systématiquement prise en charge par l’injection sous-cutanée d’analgésique et d’anti-inflammatoire, et par l’application d’analgésiques locaux. Pendant la chirurgie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant, leur rythme respiratoire est surveillé en permanence. Une injection ip de sérum physiologique à 38°C est réalisée en fin d’intervention pour réhydrater les animaux. Après leur réveil, ils sont placés sur un tapis chauffant pendant au moins 30 minutes. Les rats adultes ayant reçu l’injection stéréotaxique sont replacés avec leurs congénères. Un suivi post-chirurgical est réalisé afin de détecter des points-limites précoce et adaptés. Seront surveillés chez les rates gestantes l’absence d'hémorragie vaginale et la date de la mise bas (euthanasie si retard de plus de 24 heures), et chez tous les animaux, la cicatrisation (nettoyage de la plaie et nouvelles sutures si besoin), la perte de poids (euthanasie si plus de 20%), l'hypothermie (froid au touché), l’apparition de signes de douleur (prostration, agressivité, absence de réaction aux stimuli). Si un score de points-limites est supérieur à 3, une injection d'analgésique sera pratiquée : buprénorphine ou anti-inflammatoire non stéroïdien en sous-cutanée toutes les 8 à 12 heures (doses utilisées dans l’ensemble de notre projet). Les ratons sont également suivis, avec une surveillance de la prise de poids, et l’observation de phénotypes caractéristiques de notre modèle (échec aux tests sensorimoteurs, hyperextension des membres inférieurs, crises généralisées tonico-cloniques). Ces mesures seront quotidiennes du 1er au 14eme jour de vie postnatale (P14). Après P14, seul le poids sera mesuré, une fois par semaine jusqu’au sevrage et au-delà.
Choix des espèces
Les animaux que nous utilisons, en l'occurrence les rats, sont des rongeurs de petite taille et d’élevage facile, avec une gestation d'une durée adaptée aux exigences des travaux de recherche. Ils possèdent un système nerveux central dont le développement présente de nombreuses similitudes avec celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est cependant suffisamment complexe pour être représentative. D'une manière générale, ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes pathologiques du développement cérébral. Le rat est particulièrement adapté à des études des propriétés et activités électriques des cellules nerveuses, cognitives et comportementales. Dans le projet présenté ici, le choix de l'espèce est aussi orienté par l'utilisation d'une souche de cytomégalovirus de rat recombinante, car les cytomégalovirus, y compris ceux de rat, sont spécifiques d'espèce. Les rates gestantes seront âgées d'environ 10 semaines à 6 mois. Les infections in utero seront réalisées au 15e jour de développement embryonnaire, donc au début du dernier tiers de gestation, ce stade d'infection tenant compte de l'état de développement cérébral, d'impératifs méthodologiques, et conduisant à reproduire les conséquences neurologiques postnatales rappelant la pathologie humaine modélisée ici. L’étude des activités épileptiformes in vitro et des cellules immunitaires cérébrales sera réalisée entre le 75e et le 90e jour postnatal, période où la tumeur est susceptible d’altérer le fonctionnement cérébral pour déclencher des activités épileptiques et où les cellules immunitaires sont abondantes dans le microenvironnement tumoral.
Programmation et reprogrammation épigénétique du destin cellulaire chez Xenopus Laevis-MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Réutilisées d'une ponte à l'autre après stimulation hormonale, 100 femelles xénopes sont maintenues en vie, tandis que 500 autres xénopes sont tués pour prélever ovaires et testicules. Les animaux relèvent d'un niveau de souffrance sans réveil ou léger, dans un projet de recherche fondamentale sur la reprogrammation épigénétique du destin cellulaire. Chaque semaine, un mâle est tué pour la purification de cellules germinales et une femelle pour ses ovaires. Les autres femelles servent de façon répétée à la ponte, induites tous les six mois, avant d'être à leur tour utilisées.
Objectifs
Le projet vise à décrire les mécanismes épigénétiques permettant la programmation et la reprogrammation du destin cellulaire. Nous abordons trois questions en relation avec cette thématique. 1-Dans quelle mesure les modifications associées aux histones retenues dans le spermatozoïde contribuent a la régulation du développement embryonnaire précoce ? Pour cela nous décrivons le paysage épigénétique du spermatozoïde par des techniques de ChIP-seq quantitative puis évaluons l’effet de perturbation de ces instructions épigénétiques paternelles sur le développement de l’embryon. 2-Quels sont les mécanismes épigénétiques qui stabilisent le destin des cellules somatiques ? Nous réalisons des expériences de clonage au cours desquels un embryon est généré par transplantation du noyau d’une cellule différenciée dans un œuf énucléé. Le développement d’un tel clone est limité par des verrous épigénétiques présent au sein de la chromatine de la cellule donneuse. Pour identifier ces mécanismes de stabilisation du destin cellulaire, nous désactivons des voies épigénétiques de la cellule différenciée et évaluons si cela réduit la résistance a la reprogrammation par les composantes de l’œuf (ce traduisant par une amélioration du clonage). 3-Quels sont les mécanismes moléculaires et cellulaires qui gouvernent les processus de régénération ? Nous tirons bénéfice du fait que les têtards de Xenopus Laevis présentent des capacités de régénération (queue, pattes) qui varient au cours du développement pour réaliser des études comparatives permettant d’identifier les processus moléculaires et cellulaire associées a un bon déroulement de la régénération. Nous focalisons nos études sur l’influence du système immunitaire dans la réponse régénérative. MODIFICATIONS Pour tester la fonction de voies épigénétiques d’intérêt a des stades précoces du développement, les stratégies reposant sur des injections d’ARNm dans des zygotes sont les approches déployées. Cependant les ARNm ne persistent pas suffisamment longtemps pour exercer des effets aux stades tardifs. D’autre part les stratégies reposant sur des injections d’ARNm ne permettent pas de réaliser des interférences spécifiquement dans certains tissus. En conséquence, pour permettre des tests fonctionnels a des stades développementaux tardifs et de façon tissue spécifique nous employons dans ce cas des animaux transgeniques qui nous permettent ce niveau de contrôle spatiaux-temporel.
Bénéfices attendus
Notre recherche fondamentale a pour objectif de mieux comprendre des mécanismes moléculaires et cellulaires dont la compréhension a un fort potentiel pour la santé humaine : 1- Compréhension des mécanismes de transmission d’information épigénétiques entre générations. Une meilleure description/compréhension de ces mécanismes, en particulier de la possibilité que la lignée germinale male puisse transmettre à la descendance l’effet de l’exposition paternelle a l’environnement peut aider à orienter les politiques de santé publique. 2-Compréhension des mécanismes stabilisant le destin cellulaire. Un déséquilibre de ces mécanismes peut contribuer a des pathologies chez l’homme (déstabilisation dans le cas de cancer par Example). 3- Le déchiffrage des processus permettant la régénération, très efficace chez le Xenope, peut identifier des voies moléculaires et cellulaires a cibler pour améliorer les processus régénératifs chez l’homme.
Procédures
Les animaux subissent uniquement des injections d'homones. Pour les femelles il sagit de deux injections en sous-cutannee espacees de 2 a 7 jours , repetees tous les 6 mois. Les animaux sont manipulés pour moins de une minute: prelevement du bac d’elevage pour immobilisation sur paillasse humide suivie d’injection (quelques secondes) puis retour en bac de ponte.
Impact sur les animaux
Les procédures decrites ont des effets modérés sur les animaux. Il s’agit uniquement d’injection sous cutanées d’hormones pour stimuler la ponte. L’injection sous-cutanée ne provoque pas de saignement et n’induit pas de douleurs pour l’animal. Le produit injecté n’est pas toxique pour les animaux. Par précaution les animaux soumis à injection ne sont pas nourris le jour précédant, car les injections provoquent quelques fois des phénomènes de regurgitations
Devenir
Apres stimulation de la ponte les femelles sont mise au repos puis reutilisees ulterieurement pour de nouvelles pontes. Ceci permet d'obtenir regulierement des oeufs de bonne qualite tout en lilitant le nombre d'animaux utilises. Dans le cas des prelevements d'organes, les animaux sont mis a mort.
Remplacement
Il n’y pas d’alternative actuelle a l’utilisation d’animaux pour l’obtention de cellules germinales fonctionnelles. Les efforts actuels, chez la souris en particulier, de production de cellules germinales in vitro à partir de cellules souches ne permettent pas d’atteindre des cellules pleinement différentiées. L’utilisation de dérivés de cellules souches mimant le développement embryonnaire précoce n’est également pas une option car nous nous intéressons a l’influence de l’épigénome de la lignée germinale sur le déroulement du développement embryonnaire précoce. Cependant, les études de la spermatogenèse en cours dans notre laboratoire nous amène a développer un modèle de spermatogenèse Ex-vivo qui pourrait conduire á la mise en place d’un protocole de spermatogenèse in vitro, réduisant ainsi l’utilisation de males.1
Réduction
Les pratiques pour réduire l’utilisation des animaux dans notre laboratoire sont les suivantes : 1-Mutualisation des animaux utilisés : Étant donne l’abondance des œuf/ovocytes produits par une femelle, le matériel produit permet dans la majeure partie des cas la réalisation d’une multitude d’expériences. En conséquence, la planification de l’utilisation des animaux est optimisée pour accommoder les besoins du plus grand nombre possible d’expérimentateurs. 2-Reutilisation des animaux : Les femelles utilisées pour la ponte sont réutilisées suite à une période de repos. 3-Optimisation de l’utilisation des testicules pour les fécondations in vitro. Les testicules issus d’un males peuvent être utilisées pour réaliser plus de 10 fécondations in vitro. La durée de stockage de ces testicules est de 15 jours. En conséquence les expériences impliquant les FIVs sont regroupées dans le temps afin de maximiser l’utilisation des testicules et limiter le nombre de males sacrifiés. 4-De la même façon nous avons optimisé l’utilisation des ovaires en améliorant les conditions de d’utilisation des organes prélevés. Les ovocytes sont dissociés par une solution enzymatique, tries manuellement, puis stockes a 14 degré dans une solution contenant des antibiotiques. Chaque jours, une élimination des ovocytes défectueux et un renouvellement du milieux de culture permet d’étendre la survie de ces cellules au-delà d’une semaine. La détermination du nombre d’animaux utilisés est basée sur les calculs suivants : Nous envisageons l’utilisation de ~350 femelles et de ~ 250 males Xenopus Laevis. L’utilisation se décompose en 3 modes : 1/Animaux réutilisés au cours du projet : Les femelles sont utilisées par lot de 2 pour la ponte. Deux pontes par semaine en moyenne >soit environ 200 pontes par an> 100 femelles (les femelles sont induites pour ponte tous les 6 mois). 2/ Prélèvement d’ovaires. Sacrifice d’une femelle par semaine pour prélèvement d’ovaires > ~ 250 femelles 3/ Prélèvement de testicules. Sacrifice d'un male par semaine pour prélèvement de testicules et purification de cellules germinales > ~250 males
Raffinement
Un nouveau protocole de stimulation de ponte a été testé permettant l’utilisation d’une même femelle pour deux pontes successives espacées de 1 a deux semaines, l’animal étant ensuite mis au repos pour ~3mois. Ce protocole permet d’obtenir deux fois plus d’œufs, de qualité comparable, a partir d’une même femelle, réduisant ainsi le pool d’animaux utilse2 pour la ponte. Pour les expériences de régénération nous avons mis au point une protocole de régénération ex-vivo qui permet de recapituler certaines étapes de la régénération d’un membre. Ce protocole permet d’étudier la régénération après euthanasie, réduisant ainsi la souffrance de l’animal. En outre il permet d’amputer les deux membres d’un animal plutôt qu’un seul lorsque les études sont réalisées in vivo.
Choix des espèces
Les espèces ont été choisie en raison de l’abondance, de l’accessibilité du matériel biologique étudié (ovocytes, spermatozoïdes, embryons). Ce modèle permet la réalisation a grande échelle d’expériences de clonage, d'• Injection Intracytoplasmic de spermatozoide (ICSI), et de production d’embryons haploïdes. Enfin il présente des caractéristiques uniques de la spermatogenèse (remodelage partiel des nucléosomes) permettant des analyses épigénétiques qui ne sont pas possibles dans d’autres modelés animaux tel que souris, zebrafish, drosophille, ou le nématode Caenorhabditis Elegans. Une autre caractéristique cruciale de ce tétrapode est l’existence d’une période étendue (8 division cellulaire) entre la fécondation et l’initiation de la transcription du génome zygotique. Cette caractéristique est cruciale pour l’étude de la transmission des caractères epigenetiques dérivés de la lignées germinales. En effet cette fenêtre temporelle de 8 cycle cellulaires permet par example de perturber la transmission des marques epigenetiques derivées du spermatozoide et d’en etudier l’impact sur l’activation des genes zygotiques. Enfin l’abondance des œufs permets la production d’extrait qui peuvent etre utiliser pour identifier les facteurs maternelles impliques dans la reconaissance/propagation des signaux epigenetiques issus du spermtozoide. Les animaux sont sexuellement matures, soit >= 1 an chez Xenopus Laevis
Multifonctionnalité de la surface de la tête prothétique – une innovation dans l’implantologie dentaire : Etude pilot de raffinement
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Extraction des molaires puis pose immédiate d'implants dentaires, suivie pour 15 rats d'injections destinées à provoquer une infection autour de l'implant : 27 rats vont être utilisés, tous tués, dont 15 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Ces gestes servent à valider des conditions d'imagerie et un modèle d'infection avant une étude plus large sur des surfaces d'implants nanotexturées. Le porteur reconnaît que "la douleur est inévitable" après la chirurgie buccale. Présentée comme une "étude pilote de raffinement", cette phase inflige à plus de la moitié des rats le niveau de souffrance le plus élevé, et justifie l'effectif par la seule puissance statistique.
Objectifs
Nous souhaitons dans le cadre d'un projet de developpement de nouveaux implants nous voulons vérifier les propriétés adhésives et anti bactériennes de surfaces nanotexturées de mini-implants adaptés pour les rats. Pour réaliser cet objectif, nous devons dans un premier temps valider les poses d’implants chez le rat par des imageries au scanner rayons X et nous souhaitons mimer les conditions infectieuses en injectant de faibles doses de molécules infectantes proche de la zone implantée. C’est pour vérifier les conditions optimales d’imagerie et d’infections que nous sollicitons cette étude pilote de raffinement avant la procédure complète de tests de diverses combinaisons de surface nano texturées. Les objectifs sont : 1. Réaliser l’implantation dentaire immédiatement après l’extraction d’une molaire chez le rat selon le concept "One abutment-one time", Les mini-implants (la dimension est réduite afin adapter à l'anatomie de rat) consistent en une tête prothétique intégrée avec la tige de l'implant, qui se met en place lors de la première intervention chirurgical et à ne plus changer par la suite. 2. Etablir le modèle infectieux péri-implantaire (mucositite péri-implantaire et péri-implantitite) chez le rat en injectant des solutions infectantes. 3. Valider des techniques d'imagerie in vivo et ex vivo pour la détection des tissus mous et durs à l’aide du microscanner à rayons X et l’imagerie photonique (microscopie confocale et light sheet).
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet pilote établissent les conditions d’imageries pour une vérification optimale de la position des implants ; les conditions doses et durée du modèle infectieux péri-implantaire chez le rat, et les modalités pour les imageries longitudinales et ex vivo innovantes. Toutes ces conditions seront reprises pour l'étude finale de performance osseuses et gingivales des nanotextures.
Procédures
1. Extraction bilatérale des premières molaires dans le maxillaire et implanter les implants dentaires immédiatement dans les avéoles, qui reproduit l'osséointégration et la cicatrisation des tissus mous autour de l'implant: 30 min/ rat sous l’anesthésie chimique, appliquer sur 27 rats divisent en 2 procédures. 2. Etude longitudinale appliquée à 27 rats par microscanner à rayon X sur l'osséointégration suite à l'implantation dentaire (12 rats – procédure 1) et le déclenchement de maladies péri-implantaires suite à l'infection (15 rats – procédure 2) sous l’anesthésie gazeuse. Durée 20 min/ fois, à J0, 14, 28 jours pour les 12 rats dans procédure 1. Durée 20 min/ fois, à J28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 pour les 15 rats dans procédure 2 sous anesthésie gazeuse. 3. Etablissement des maladies/inflammation péri-implantaire : injection sur 15 rats de procédure 2 sous l’anesthésie gazeuse rapide. 4. Evaluation des attaches et des étanchéités fonctionnelles de l'épithélium jonctionnel et du tissu connectif péri-implantaires, appliquer sur 27 rats à la fin de procédure (avant la mise à mort).
Impact sur les animaux
1. Les rats subiront la chirurgie d'extraction dentaire bilatérale et la pose d'implant immédiate. La douleur est inévitable, mais nous veillerons à combiner tous les mesures médicamenteuses (analgésie, anesthésie, myorelaxant), physiques (environnement d'hébergement confortable adapté pour les animaux post-opératoire et nourriture molle), et humaines (soins et surveillance rigoureusement par les personnels habilités) pendant l'étude afin de détecter toutes anomalies à résoudre de suite. La consommation de nourriture et d'eau seront mesurées régulièrement. 2. En plus, les rats passeront par des anesthésies gazeuses répétées lors des sessions d'imagerie qui ne donne pas de douleur particulière et non invasive. Nous utiliserons la couette de survie pour assurer la température corporelle. Après les manipulations, les rats seront posés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. 3. L'administration de molécule infectante sous l'anesthésie rapide donne de douleur très peu, nous ferons très attention à l'hypothermie des animaux en utilisant le tapis chauffant pendant la manipulation. Après les manipulations, les rats seront posés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil.
Devenir
Les mises à mort seront réalisées sur tous les rats (27) par une personne habilitée à la fin de chaque procédure. Nous devons mettre à mort tous les animaux afin de collecter les hemi-maxillaires avec implants pour les expérimences ex vivo d'imageries multimodales et innovantes incluant le microscannaire à haute résolution avec produits contrastants, l'imagerie photonique et l'immunohistochimie. Ces techniques permettent de visualiser et quantifier l'attache péri-implantaire et parodontale et l'étanchéité que les examens cliniques n'arrivent pas à évaluer.
Remplacement
Nos questions scientifiques sont centrées sur l'effet de la nano-texturation de la surface des têtes prothétiques sur l'attache des tissus péri-implantaires dans les conditions physiologiques incluant métabolisme osseux, vascularisation, système immunitaire que les modèles in vitro ne peuvent pas mimer. Les expérimentations animales avec une physiologie intégrée sont donc primordiaux. De nombreuses combinaisons de topographie de surface peuvent être efficaces in vitro sur l'adhérence de l'épithélium jonctionnel, par contre il est impossible de toutes les tester dans des modèles « de plus gros animaux tels que beagles ou mini-pigs » qui sont les gold-standard en préclinique implantaire à cause de leur cout. Il nous semble donc essentiel de proposer un modèle chez le rongeur pour tester 2 ou 3 nano-texturations et choisir la plus performante à valider en phase en phase clinique.
Réduction
Nous avons estimé la taille des échantillons afin d'assurer la puissance statistique lors du traitement des données.
Raffinement
Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérés grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes harmonieux (minimum de 2); dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin d’éviter de fragiliser les implants au cours de la cicatrisation à cause de batônnet à ronger, mais afin de respecter les activités chez le ronger, nous utiliserons en alternative des batônnets très fins et les rouler en coton pendant 4 semaines post-op. Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition "ad libitum". Lors des procédures, nous devons utiliser l'anesthésie car ce sont des manipulations qui doivent être faites in vivo afin de surveiller la cinétique de cicatrisation dans les conditions physiologiques.
Choix des espèces
Les rats constituent un bon point de départ pour tester la faisabilité des nouveaux implants dentaires dans la recherche préclinique en raison de sa similarité avec l'homme en termes de structure osseuse, d'anatomie buccale. En plus, les rats sont privilégiés pour le coût, la facilité de logement et la manipulation. Les rats Wistar sont encore considérés comme l'un des meilleurs modèles. A l'âge adulte (16 semaines), les rats arrivent à la maturité squelettique et dentaire et atteignent environ 400 g, ce qui rend la facilité des manipulations chirurgicales (extraction dentaire et implantation immédiate). La taille de fabrication des implants est adapté pour l’os maxillaire du rat. Ce sont des mini-implants qui ne transpercent pas les sinus lors de la pose, principale cause de rejet ou de problèmes sanitaires pour les animaux.
Formation et croissance du cœur chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
20900 souris vont être utilisées sur cinq ans, dont 20000 pour un simple prélèvement au bout de la queue destiné au génotypage, dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Les 900 restantes sont des fœtus et des nouveau-nés porteurs d'anomalies génétiques, sur lesquels des tissus sont prélevés. Ces anomalies provoquent souvent la mort dès le premier jour par insuffisance respiratoire ou cardiaque, et les animaux développant une hydrocéphalie sont tués. Toutes sont mises à mort à l'issue, et pendant l'élevage les souris qui ne portent pas le génotype recherché ou devenues non fertiles le sont aussi.
Objectifs
La forme d'un organe est étroitement liée à sa fonction. Pour le coeur, l'architecture du myocarde conditionne la fonction de contraction, et l'alignement des chambres cardiaques la double circulation sanguine. Notre projet de recherche vise à mettre en évidence les mécanismes qui permettent aux cellules cardiaques de se coordonner pour positionner les chambres cardiaques et au muscle de grandir et ainsi permettre la contraction efficace du cœur. Afin de répondre à ces questions chez le mammifère, nous étudions des modèles de souris déficients pour des voies de signalisation spécifiques. Nos travaux ont des applications potentielles dans le domaine médical, pour la compréhension des malformations congénitales du cœur.
Bénéfices attendus
Nos travaux ont un impact fondamental sur la compréhension de l’acquisition de la forme du cœur. Ils ont également des applications potentielles dans le domaine médical, pour la compréhension des malformations congénitales du cœur.
Procédures
Prélèvement de biopsie de queue pour génotypage lors de l'identification par tatouage. Le prélèvement caudal ne dure que quelques secondes : 20000 animaux sur 5 ans Prélèvement de tissus sur foetus et nouveaux-nés présentant un phénotype dommageable : 900 animaux sur 5 ans
Impact sur les animaux
Les prélèvement caudaux causent du stress et une douleur légère de courte durée. Les phénotypes dommageables provoquent pour la plupart la mort au premier jour de la naissance, en raison d’insuffisances respiratoire ou cardiovasculaire. Dans de rares cas, certains mutants peuvent développer des hydrocéphalies entre P7 et P12, l'apparition du phénotype entraînera alors la mise à mort des animaux concernés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Au cours de l'élevage, si les animaux ne présentent pas le génotype d'intérêt ou s'ils sont veillissant/non fertiles Avant prélèvements de tissus d'intérêt.
Remplacement
Notre laboratoire mène des expériences de modélisation informatique pour évaluer des mécanismes possibles de formation du coeur. Cependant elles dépendent des hypothèses que l’on pose et doivent nécessairement être validées par des expériences in vivo. De même le processus de croissance d’un tissu intègre une multitude de signaux et d’interactions cellulaires, sur des échelles de temps parfois longues, que les systèmes de culture ne permettent pas de reproduire complètement. Par exemple, il n’existe pas de modèle de culture 3D pertinent pour reproduire la croissance du myocarde sur l’ensemble de la gestation.
Réduction
Les effectifs sont déterminés grâce à un test de puissance et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Le sperme des lignées précieuses sera congelé pour conservation à long terme.
Raffinement
En cas de signes de souffrance, une grille de score et des mesures de raffinement (traitement antalgique, isolement de l'animal, signalement SBEA) seront utilisées. Nous appliquerons des points limites stricts et spécifiques au projet. En cas d'échec de réduction de la douleur ou d'apparition d'un phénotype dommageable, l'animal sera mis à mort. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
La souris est un modèle classique de Mammifère, pour lequel de nombreux outils génétiques sont disponibles. Ce modèle est particulièrement pertinent pour l’étude du développement cardiaque chez l’humain, puisque celui-ci présente une structure anatomique très proche. Le temps de génération est court et les portées de grande taille, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’embryons. Les animaux utilisés en procédure 1 sont des animaux d'élevage, mâles et femelles fertiles (20-30g), afin de produire principalement des embryons (
Rôles des sous-types de neurones corticaux dans l’intégration de l’information sensorielle et de l’état cérébral
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Injectées dans le cerveau dès la naissance, équipées plus tard d'une fenêtre optique posée par une chirurgie du crâne de deux heures, puis soumises à des séances d'imagerie de trois heures avant une perfusion intracardiaque finale: 864 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. La pose de la fenêtre et la craniotomie peuvent enflammer les tissus autour du cerveau et provoquer des douleurs. Le projet vise à décrire les fonctions respectives des dizaines de sous-types de neurones du cortex. À la fin, chaque animal est tué et son cerveau prélevé pour les analyses neuroanatomiques.
Objectifs
Notre cerveau se compose de divers types de neurones, qui remplissent respectivement diverses fonctions. Cette diversité de fonctions s’appuie sur leurs diverses propriétés neuronales (morphologie, excitabilité, connectivité, neurotransmetteur utilisé etc.). Dans le cortex cérébral, une région du cerveau importante pour des fonctions cognitives avancées (comme la mémoire, le langage, le traitement sensoriel etc.), on dénombre plusieurs dizaines de sous-types différents de neurones, que l’on peut diviser en 2 grandes catégories : inhibiteurs et excitateurs. Les données récentes de génétique nous permettent d’avoir une vue exhaustive de la diversité de ces types neuronaux, les données les plus récentes donnant environ 90 types de sous-types neuronaux différents dans le cortex cérébral, qui sont définis via leur signature moléculaire. Cette grande diversité pose plusieurs questions fondamentales en neurosciences : Tous ces sous-types remplissent-ils des fonctions différentes ? Quelles sont leurs fonctions respectives ? Comment ces différents sous-types contribuent-ils aux fonctions cognitives ? Ces questions sont primordiales, car non seulement elles nous avancent dans la compréhension du fonctionnement du cerveau, mais elles offrent également des pistes importantes pour le traitement des pathologies cérébrales, dans l’optique de pouvoir cibler certains sous-types spécifiquement pour compenser les symptômes de ces pathologies, plutôt que d’affecter le cerveau entier. L’objectif de notre projet est donc de définir quels sont les rôles respectifs des différents types de neurones corticaux. Plus particulièrement, notre projet s’intéresse aux rôles de ces sous-types dans l’encodage des informations sensorielles. Nos travaux récents ont montré que la diversité des neurones inhibiteurs corticaux est directement liée à l’encodage de la vigilance. Une hypothèse clé de notre projet est donc que les différents sous-types de neurones corticaux inhibiteurs suivent l’état cérébral (comme l’état d’éveil, de vigilance) et répercutent ces signaux sur le traitement des informations sensorielles, qui sont encodées par les neurones excitateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet est essentiel pour notre compréhension des circuits neuronaux du cortex cérébral, une région nécessaire à la cognition et impliquée dans de nombreuses pathologies cérébrales. A court terme ce projet permettra de déterminer avec précision et haute résolution quelles sont les fonctions jouées par les divers types de neurones corticaux, et comment ces fonctions évoluent en fonction du stade développemental. Ce projet pose les bases fondamentales nécessaires pour pouvoir comprendre : 1) quels sont les types de neurones critiques pour assurer le traitement sensoriel en fonction de l’état de vigilance 2) si des pathologies affectent certains types de neurones en particulier. Les deux aspects clés de notre projet que sont l’étude de la vigilance et l’étude du traitement sensoriel sont directement importants pour la compréhension de pathologies comme les troubles de l’attention ou la schizophrénie. De plus, en étudiant comment ces types de neurones se développent, nous pourrons acquérir des connaissances clés pour comprendre ce qui dysfonctionne dans les pathologies neurodéveloppementales telles que les Troubles du Spectre Autistique (TSA).
Procédures
Notre procédure comporte 4 interventions sur les animaux: 1) A la naissance, les animaux seront identifiés et genotypés grâce à un tatouage sous-cutané et a une biopsie du bout de la queue. Cette identification sera immédiatement suivie d’une courte injection dans le cerveau. Cette première procédure chirurgicale ne durera pas plus de 15min durant laquelle les animaux seront sous anesthésie générale. 2) Plus tard (stades juvénile ou adulte), les animaux seront soumis à une seconde procédure chirurgicale, consistant a l’implantation d’une fenêtre optique sur le crâne. Cette intervention durera environ 2h et sera réalisée sous anesthésie générale. 3) Au minimum deux jours plus tard, les expériences d'imagerie in vivo débuteront et se poursuivront sur plusieurs jours. Chaque session d’imagerie n’excèdera pas 1h30 pour les animaux plus jeunes et 3h pour les autres animaux. 4) A la fin de ce protocole, les animaux subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie et analgésie générale, qui sera sans réveil.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sur les animaux sont principalement liés à la douleur potentiellement causée par la craniotomie, ou à l’implantation d’une fenêtre d’imagerie sur le crâne. Ces deux opérations sont faites sous anesthésie générale. Bien que le cerveau lui-même ne soit pas sensible à la douleur, les tissus l’entourant (crane, dure-mère) peuvent s’inflammer et produire de la douleur. De notre expérience, l’implant et la craniotomie ne génèrent pas de douleur excessive en dehors de la chirurgie proprement dite.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis a mort et leur cerveau sera prélevé et préparé pour les études neuroanatomiques d’intérêt.
Remplacement
Répondre à notre objectif nécessite de pouvoir étudier le cerveau vivant, éveillé et en comportement. En ce sens, seules des approches menées sur un modèle animal peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau, ciblées par notre projet et dont pourront bénéficier à terme les études menées chez l’homme. En effet, les méthodes alternatives comme les organoïdes cérébraux ne permettent pas d’étudier des réseaux neuronaux fonctionnellement connectés et matures, et nous ne possédons pas encore les connaissances suffisantes pour établir des modèles purement informatiques (dits 'in silico') de ces réseaux corticaux complexes. C’est d’ailleurs un des aspects clés de notre projet : nous visons à établir une description fonctionnelle précise de ces réseaux de neurones, en se concentrant sur les différents types cellulaires, avec l’espoir que dans le futur cela rende possible des modèles in silico de ce type.
Réduction
Notre méthode principale, qui consiste à pouvoir enregistrer et déterminer l’activité de tous les sous-types présents dans le cortex dans un animal est une avancée majeure en termes de réduction du nombre d’animaux utilisés. En effet, pour la majeure partie de ce projet, nous utiliserons notre méthode de transcriptomique spatiale (une méthode innovante permettant de quantifier l’expression de plusieurs centaines de gènes en même temps en gardant l'information spatiale) pour identifier chaque sous-type a posteriori, alors que les méthodes préexistantes auraient requis un animal par sous-type (par exemple nous pouvons étudier l’activité des 5 classes de neurones inhibiteurs dans un même animal, alors que l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés requerrait 5 animaux différents pour un résultat moindre, car ne donnant pas accès aux corrélations entre populations). Pour l’instant, cette méthode ne permet que l’enregistrement de population spécifique et non la manipulation, c’est la raison pour laquelle nous devons tout de même utiliser ces lignées transgéniques pour les stimulations à l’aide de l’optogénétique. L’optogénétique permet de contrôler l’activité des neurones grâce à la lumière, en stimulant des molécules photosensibles. Dans notre cas, nous exprimeront ces molécules photosensibles dans des populations spécifiques grâces aux lignées transgéniques.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Une attention particulière sera portée aux nouveau-nés et juvéniles au cours des chirurgies pour réduire douleur et stress (anesthésie générale et locale, tapis chauffant, conditions d'asepsie strictes, protection des yeux, réhydratation, suivi strict postchirurgie et en particulier pour les nouveau-nés après leur réintroduction au sein de la portée). Les animaux seront hébergés dans des armoires ventilées, sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi d'igloos cartonnés et de mini-rouleaux de papier foisonnant permettant aux femelles de faire des nids. Durant les enregistrements, les animaux seront réchauffés, à l’aide d’une lampe chauffante, pour compenser la déperdition de chaleur induite par la sortie de l’animal de sa cage.
Choix des espèces
Le modèle souris est particulièrement adapté pour répondre à nos objectifs scientifiques : 1) Les sous-types d’interneurones corticaux ayant été démontrés comme étant largement conservés entre humain et souris, le modèle de souris représente un excellent modèle pour étudier ces sous-populations de neurones. 2) Nous avons une expérience et une connaissance étendue du modèle pour les deux méthodes principales du projet : l’imagerie in vivo, et la transcriptomique spatiale (méthode permettant de quantifier l’expression de plusieurs centaines de gènes en même temps en gardant l'information spatiale). 3) Il existe de nombreuses lignées de souris transgéniques nécessaires pour le projet, qui permettent de cibler certaines populations de neurones pour pouvoir notamment manipuler leur activité. Un tiers des animaux sera utilisé à l’état de jeunes non-sevrés, un tiers des animaux sera utilisé à l’état de jeune non-sevré puis sevré et un tiers sera utilisé à l’âge adulte. Tous les animaux seront préalablement injecté à la naissance (nouveau-né).
Etude du rôle d’une protéine pancréatique dans l’apparition de troubles de la régulation de la glycémie et/ou de tumeurs du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Scarifiées à la queue pour des prélèvements répétés de gouttes de sang, 1 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations reproduisant un diabète ou des tumeurs du pancréas et reçoivent des injections activant la mutation, des gavages, un régime gras et des tests de glycémie répétés. Certains fœtus sont traités à travers la mère gestante. Le porteur qualifie ces souris de "modèles uniques au monde" et affirme que la mesure de la glycémie ne peut se faire qu'in vivo.
Objectifs
Récemment, une nouvelle mutation d’une protéine pancréatique a été décrite dans plusieurs familles de patients. Cette mutation cause un diabète chez les hommes, et des tumeurs du pancréas chez les femmes. Pour le moment, son mode d’action n’est pas connu. Les hommes touchés développent un diabète particulier différent du diabète de type 1 auto-immun et du diabète de type 2 lié à l’obésité. Les femmes présentent quant à elles des tumeurs particulières du pancréas issues des cellules productrices d’insuline, entrainant une sécrétion excessive et incontrôlée d’insuline qui provoque des hypoglycémies répétées (baisse anormale du sucre dans le sang). L’objectif de ce projet est donc de rechercher les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de ces troubles du pancréas. A plus long terme, ces recherches devraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et ainsi de proposer de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Cette étude présente un grand intérêt pour le traitement à la fois du diabète et du cancer du pancréas puisque les mutations de notre protéine d’intérêt ont été décrites dans ces deux pathologies. Sur le plan clinique, nous prévoyons des retombées potentielles à moyen et à plus long terme. En effet, le diabète est une maladie métabolique complexe qui implique souvent plusieurs gènes. Cette hétérogénéité rend difficile son étude. Il existe aussi certaines autres formes de diabète qui n’impliquent qu’un seul gène. Elles sont présentes soit chez des nouveau-nés, soit chez de jeunes adultes. Dans ce contexte, il est plus facile de comprendre les mécanismes à l’origine de la maladie et ainsi de progresser vers des voies thérapeutiques. C’est le cas du facteur que nous étudions au laboratoire, qui est produit dans le pancréas. Une seule mutation du gène codant pour ce facteur suffit à déclencher un diabète. Nous pensons donc que notre étude chez la souris pourra permettre non seulement de décrire une nouvelle forme de diabète monogénique, mais aussi d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d’élaborer de nouveaux traitements. Le facteur que nous étudions est également associé à l’apparition de tumeurs pancréatiques chez des patients. Son rôle biologique reste toutefois encore mal compris à ce jour. Notre projet permettra d’élucider son implication dans le cancer pancréatique qui représente une cause de mortalité importante.
Procédures
Dans ce projet, nous utiliserons des souris qui portent des mutations représentatives de celles portées par des patients qui présentent soit un diabète, soit des tumeurs du pancréas. Ces souris seront examinées à différents stades de la vie, allant de la vie fœtale à des stades âgés. Certains des animaux utilisés nécessitent l’injection d’un composé pour activer la mutation étudiée. Les animaux adultes vigiles (éveillés) porteurs de cette mutation inductible, recevront une ou cinq administrations de la substance par injection soit une (ou trois) administrations par voie orale, soit une administration par application d’une solution sur la peau (1 ou 3 fois) (durée de chaque geste inf à 30sec). Des fœtus seront également traités en administrant le composé chez la mère gestante : soit par gavage (1 à 2 doses), soit par injection (1 ou 2 fois) soit dans l’alimentation pendant une semaine (durée de chaque geste inf à 30 sec). Ces mêmes animaux seront ensuite étudiés grâce à des expériences de mesure de la régulation de la glycémie. Pour cela, ils auront un prélèvement, puis ils seront placés à jeun pendant 16 heures, et auront un second prélèvement (durée de chaque prélèvement inf à 10sec). Ils recevront une injection (10 sec) suivie de 5 prélèvements d’une goutte de sang durant les 2h suivantes. Trois jours plus tard, ces gestes seront répétés sur ces mêmes souris. Dans le cadre d’une étude longtudinale, ce lot de souris pourra être soumis à ce type d’injection puis prélèvement au maximum 3 fois lors de ces 2 tests (durée de chaque prélèvement inf à 10sec). Enfin, certaines souris seront exposées à un régime riche en graisse pendant des durées allant de 14 jours à 3 mois. Ces mêmes animaux seront ensuite étudiés grâce à des expériences de mesure de la glycémie, impliquants une injection et 7 prélèvements d’une goutte de sang, Trois jours plus tard, ces gestes seront répétés sur ces mêmes souris (durée de chaque prélèvement inf à 10sec).
Impact sur les animaux
Les modèles générés pour l’étude n’ont pas de phénotype dommageable. Les nuisances attendues sont celles liées aux différentes injections. Ces nuisances correspondent à l’introduction d’une aiguille et donc à des douleurs associées à une injection classique. Celles-ci sont de courte durée, et ces différentes injections ne provoquent aucun autre effet secondaire à l’exception de la nuisance de l’injection. Les souris exposées à régime particulier (riche en graisse) peuvent présenter une prise de poids sans conséquence sur le bien-être des animaux. Après injection, nous nous attendons à observer une légère hyperglycémie (élévation de la glycémie) à la fois chez les mâles et les femelles lorsque des tests métaboliques seront effectués. Sur la base de nos premiers résultats, l’hyperglycémie devrait être moindre chez les femelles. Néanmoins, cette hyperglycémie modérée ne sera probablement que passagère, et une glycémie normale sera rétablie après quelques heures. Pour les mesures de glycémie, le premier prélèvement étant réalisé après une légère scarification de la queue et les suivants après le retrait de la croûte, ce geste entraînera une douleur légère et de courte durée. Cela prend 10 à 20 secondes maximum répétées 5 fois sur 120 minutes, les temps de l’expérience.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Les souris que nous utilisons sont des modèles uniques au monde. Les paramètres physiologiques, c’est à dire les mesures de glycémie et d’insulinémie ne peuvent être effectuées que in vivo. De plus, il existe un dialogue entre les différents organes de la souris. Cette interaction entre les différents organes impliqués dans le métabolisme glucidique de la souris -le foie, le muscle et le tissu adipeux- ne peut être analysée que dans un organisme entier vivant. Néanmoins, pour limiter les investigations in vivo, un maximum d’informations proviendra d’analyses sur des tissus fixés et d’analyses bio-informatiques in silico à partir de prélèvement post-mortem. Nous effectuerons également des expériences in vitro quand cela est possible pour limiter les expériences in vivo. Par exemple, la culture d’îlots de Langerhans prélevés sur des souris post-mortem, un animal pouvant générer environ 100 îlots qui sont ensuite stimulés in vitro..
Réduction
Nos modèles représentent des modèles uniques au monde pour étudier les pathologies trouvées chez l’homme. En effet, ce sont le seul moyen d’étudier les effets d’une mutation, qui chez l’homme, déclenche un diabète ou un insulinome. Les stratégies d’accouplement ont été optimisées afin de réduire le nombre d’animaux.. D’après la littérature, nous avons défini la taille de nos groupes pour permettre des résultats concluants et faire des analyses statistiques. Pour réduire le nombre de souris utilisées, une étude pilote sera réalisée pour certains modèles de souris avant de définir les conditions optimales. Une approche Go/No Go sera ensuite appliquée afin de déterminer si les inductions pour activer la mutation étudiée se feront au stade fœtal ou adulte. Cela signifie que nous ferons un choix de la méthodologie utilisée selon les résultats préliminaires obtenus. Si nous constatons que l’activation de la mutation est satisfaisante pendant le développement foetal, nous choisirons plutôt cette méthode et nous n’activerons pas la mutation au stade adulte.
Raffinement
En accord avec les recommandations internationales dans le domaine du diabète et de la cancérologie, les animaux seront suivis régulièrement afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées avant la souffrance des animaux. Une grille de score sera également mise en place. Dans le cadre des procédures, toutes les manipulations seront réalisés pour garantir le meilleur confort à l’animal. En particulier, lors des expériences impliquant des injections, les animaux seront observés de façon quotidienne, de manière à surveiller l'état général de la souris. Pour rappel, nous n’attendons pas de nuisance particulière, hormis une légère hyperglycémie chez les mâles après injection. De plus, les animaux aux stades fœtal et nouveau-né seront utilisés uniquement pour des prélèvements d’organes après injection. Aux stades plus tardifs, les tests réalisés ne nécessitent pas d’utiliser des analgésiques pour ces tests.
Choix des espèces
Nos modèles murins sont uniques et la souris est le seul organisme existant qui puisse permettre d’étudier l’effet de mutations de notre protéine d’intérêt. Etant donné son cycle de reproduction et sa parenté biologique avec l’homme, la souris constitue un modèle de choix pour mener nos expériences. De plus, il est accepté et validé par la communauté internationale que la souris est pleinement appropriée pour les études du métabolisme que nous proposons. Les stades de développement étudiés sont les suivants : fœtus (E18,5), 1 mois, adultes de 3 mois, 6 mois, 12 mois, 18 mois, et 24 mois. En effet, on sait que notre protéine d’intérêt peut jouer un rôle dans la différenciation des cellules pancréatiques pendant la vie fœtale, mais aussi sur leur prolifération pendant la période postnatale jusqu’à un mois.. Nous souhaitons donc déterminer si la mutation étudiée affecte ces cellules à ces stades. Plus tard, cette mutation pourrait déclencher un diabète ou une tumeur pancréatique, selon le stade de la vie de la souris. En effet, on sait que ce type de phénotype est très dépendant du métabolisme et de l’âge de la souris). C’est pour cette raison qu’il est impératif d’étudier le phénotype des souris à ces différents stades de la vie adulte.
Caractérisation du lien de l’axe intestin-cerveau et un syndrome neurodéveloppemental chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Modulation du microbiote par gavage et régime gras et sucré, avec des traumatismes de l'œsophage possibles : 1 669 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Après le traitement, les animaux passent quatre semaines de tests comportementaux avant le prélèvement de leurs tissus. Le projet cherche à relier le microbiote intestinal à des comportements liés à l'autisme. Le résumé reste extrêmement succinct, réduisant l'objectif à une phrase et ne justifiant ni l'effectif de 1 669 souris ni le détail des tests appliqués.
Objectifs
Il s'agit d'une étude pour mieux comprendre, à l'aide de modèles murins, si la modulation de la composition bactérienne dans les intestins affecte les comportements relevant pour l’ autisme.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des données anatomiques, biochimiques et fonctionnelles cruciales pour appréhender les mécanismes mis en jeu dans les troubles neurodéveloppementaux et le spectre de l'autisme et pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
Procédures
Traitement modulateur du microbiote intestinal pendant jusqu'à 2 mois de vie ou pendant 3 semaines à partir de deux mois de vie. Les animaux recevront un traitement, soit par administration dans l'eau de boisson, soit dans certains cas par gavage. Après le traitement, les animaux seront soumis à une série de tests comportementaux pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux utilisés peuvent induire un stress léger. Une éventuelle réduction de consommation d'eau potable contenant des antibiotiques peut être observée, résultant dans une perte de poids ou une déshydratation. Pendant le gavage, des traumatismes oesophagiens et gastriques peuvent survenir. Un régime riche en graisses et en sucres peut entraîner l'obésité et des problèmes métaboliques associés, notamment une stéatose hépatique. Des irritations cutanées peuvent également survenir.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience pour le prélèvement du tissu à analyser.
Remplacement
Cette étude nécessite une approche comportementale et n'est donc possible qu'au niveau de l'organisme entier, il est nécessaire de faire appel à des modèles animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum nécessaire permettant une analyse statistique robuste des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Les résultats seront évalués par des tests statistiques a posteriori pour nous assurer de leur validité statistique.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux seront soulagés avec des analgésiques ou par la mise à mort anticipée en cas de points limites atteints.
Choix des espèces
Les modèles murins utilisés sont déjà disponibles. Les souris seront utilisées de 2 mois jusqu'à 4-5 mois afin d'évaluer les changements comportementaux dans l’âge adulte à la suite d'un traitement préalable. Des femelles gestantes seront traiter avec des modulateurs du microbiome intestinal in utero.
Fonction des facteurs de transcription de la famille Ikaros dans les cellules souches hématopoïétiques.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris mutantes de ce projet développent une anémie sévère quinze jours après les injections, mais sont tuées dès le cinquième jour, quand l'anémie reste modérée. 472 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Chaque animal reçoit une injection quotidienne pendant cinq jours avant sa mise à mort. L'étude porte sur des facteurs de transcription de la famille Ikaros dans les cellules souches du sang, souvent mutés dans des leucémies humaines, avec l'objectif affiché de mieux cibler des thérapies anti-leucémiques.
Objectifs
Les cellules du sang assurant l’oxygénation des tissus et la défense immunitaire se développent dans la moelle osseuse (MO) à partir d’un petit nombre de cellules appelées : cellules souches hématopoïétiques (CSH). L’ensemble des mécanismes biologiques qui maintiennent le pool de CSH au cours de la vie ainsi que la différenciation de ces CSH en cellules matures du sang ne sont pas totalement élucidés. D’autre part la perturbation ou le dysfonctionnement de ces mécanismes participe au développement de maladies auto-immunes et de leucémies chez l’homme. Aussi une meilleure compréhension de la biologie de ces cellules permettra de développer des cibles et des stratégies thérapeutiques pour traiter les pathologies humaines. Nous nous intéressons plus particulièrement, à une famille de facteurs de transcription. Les gènes codant pour ces facteurs sont fréquemment mutés dans des pathologies hématopoïétiques humaines notamment dans certaines leucémies. Notre activité de recherche est centrée sur les facteurs de transcription qui sont fortement exprimés dans les CSH.
Bénéfices attendus
Les facteurs de transcription sont fréquemment impliqués dans les leucémies humaines. Des traitements visant à dégrader ces facteurs sont utilisés en thérapie chez les patients leucémiques. Une meilleure compréhension du rôle respectif de ces facteurs de transcription ainsi que les conséquences de leur dégradation dans les CSH est nécessaire. Ces expériences proposent de répondre à ce besoin et permettront d'apporter des nouvelles connaissances sur la biologie des CSH pour permettre de développer des thérapies anti-leucémiques plus adaptées.
Procédures
472 animaux seront injectés (pendant quelques secondes) et quotidiennement durant 5 jours et mis à mort 5 jours après la dernière injection.
Impact sur les animaux
Les injections réalisées durant 5 jours induiront une douleur légère de courte durée. Les expériences conduites précédemment ont permis d'observer une anémie 15 jours après la dernière injection chez les animaux. Cependant les expériences conduites dans ce projet seront réalisées dès 5 jours après la dernière injection et induiront une anémie de sévérité modérée au maximum chez les animaux mutants.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
Bien que l’étude de la différenciation des CSH peut se faire en culture ex-vivo, la localisation des CSH au sein de la MO, leurs interactions avec les cellules de la niche, leur migration ainsi que la quiescence des CSH ne peuvent être étudier qu’à l’aide d’organismes vivants tel que les animaux car leurs maintiens nécessitent une niche particulière dans la MO. Les souris sont des animaux modèles de choix facilement modifiables génétiquement, pour lesquels nous disposons d’un grand nombre d’outils moléculaires (ex : Anticorps, cytokines…) permettant l’étude des cellules hématopoïétiques et dont le système hématopoïétique est transposable à celui de l'homme.
Réduction
Le but de ce projet sera de récupérer la MO afin d’étudier la biologie des CSH ex-vivo. Nous prélèverons l'ensemble des os plats et longs (fémurs, tibia, os illiaques et le sternum) pour chaque animal afin de collecter un maximun de CSH et le plus d’informations au cours d’une procédure. Au cours de notre expérimentation, nous nous réservons, cependant, la possibilité d’employer des méthodes alternatives et des modèles in vitro, dès que cela est possible. Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour comparer les groupes expérimentaux tout en respectant le principe de réduction. Le protocole prévoit la comparaison de groupes d’individus (individus contrôles et mutés). Le nombre d’animaux par groupe a été estimé sur la base des données de résultats préliminaires et conduisent à un effectif total de 472 animaux pour l’ensemble des expériences sur 5 ans.
Raffinement
Les souris mutantes développent une anémie sévère 15 jours après la dernière injection. Néanmoins, dans ce projet les animaux seront utilisés 5 jours après la dernière injection donc bien avant l'apparition de l'anémie. Les zootechniciens et nous évalueront quotidiennement l’état clinique des animaux. Les points limites expérimentaux ont été définis et seront appliqués.
Choix des espèces
Nous voulons identifier les fonctions spécifiques des gènes dans les CSH. Ces cellules sont naturellement nichées dans la moelle osseuse source de tous les facteurs de croissance et les interactions cellulaires nécessaires à leurs fonctions. Pour identifier le rôle de ces gènes sur les fonctions des cellules souches hématopoïétiques in vivo, nous sommes amenés à utiliser des animaux vivants. La souris est un animal modèle de choix car un grand nombre d'outils génétiques permettant d'étudier ces gènes in vivo ainsi qu'un grand nombre de réactifs pour identifier les CSH sont disponibles. Les animaux sont utilisés à partir de 8 semaines correspondant au stade de maturité adulte du système hématopoïétique et jusqu'à 30 semaines avant que le système hématopoïétique ne montre des signes de vieillissementDe plus, les CSH murines sont très similaires aux CSH humaines ce qui permettra de comprendre également les fonctions de ces gènes chez l'homme.
Différenciation cellulaire chez l’embryon précoce de souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
La plupart des 517 souris femelles sont tuées pour collecter leurs embryons, tandis que les femelles non gestantes issues de superovulation retournent à l'élevage pour être réaccouplées. Elles subissent des injections et, pour l'une des procédures, une ovariectomie de vingt-cinq minutes, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. L'étude vise la différenciation des toutes premières cellules de l'embryon, avant l'implantation, à l'aide de souris génétiquement modifiées. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit ces étapes précoces, y compris les embryons synthétiques, ce qui rend selon lui la souris "indispensable".
Objectifs
Notre recherche cherche à comprendre comment les toutes premières cellules d’un embryon de souris se transforment pour former différents types de cellules, juste après la fécondation, avant que l’embryon ne s’accroche à l’utérus. Au tout début du développement, les cellules de l’embryon commencent à se spécialiser pour former : 1) celles qui construiront le futur corps de l’animal, 2) celles qui formeront des tissus de soutien, 3) celles qui deviendront le futur placenta. Ces étapes se passent pendant les trois premiers jours chez la souris, ce qui correspond à environ six jours chez l’humain. Comprendre ce qui contrôle cette transformation est très important, car cela aide à mieux connaître les débuts de la vie, à améliorer la fécondation in vitro, et développer des traitements médicaux utilisant des cellules souches pour réparer des organes ou des tissus. Comme on ne peut pas encore reproduire ces étapes précoces du développement en laboratoire, l’étude sur la souris reste indispensable. Pour cela, nous utilisons des souris génétiquement modifiées : cela nous permet de tester le rôle de certains gènes en les supprimant ou en les activant, afin de voir comment cela influence la formation des premières cellules de l’embryon.
Bénéfices attendus
Ce projet se propose d'étudier des différenciations cellulaires présentes uniquement chez les mammifères. Ces analyses sont inédites et permettront à non seulement d'accroître nos connaissances en embryogénèse (à court terme) mais aussi d'apporter des améliorations de conditions de cultures (à long terme) lors de fécondations in vitro humaines ou cultures de cellules souches embryonnaires humaines au gros potentiel thérapeutique. A l'heure actuelle, il n'y a pas de solution de remplacement par des cultures cellulaires (malgré l'avènement des blastoïdes) sur les types/différenciations cellulaires que nous étudions.
Procédures
Pour toutes les procédures des injections seront pratiquées. Une seule procédure comprend un acte chirurgical, une ovariectomie, d'une durée de 25 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont de la douleur légère associée aux injections et potentiellement des douleurs modérées post-opératoires pour une des procédures.
Devenir
Pour toutes les procédures, les femelles seront mises à mort pour collecter les embryons. Les femelles non gestantes issues des expériences de superovulation seront remises avec le pool commun de femelles de même génotype et réaccouplées après un délai de 15 jours.
Remplacement
Pour certains projets se déroulant après l'implantation de l'embryon dans l'utérus, nous avons mis en place des modèles de différenciation cellulaire in vitro à base de cellules souches embryonnaires ES. Ceci réduit drastiquement le nombre de souris utilisées. Néanmoins, pour les projets portant sur des analyses avant l'implantation, l'utilisation de souris est indispensable car à ce jour aucun modèle cellulaire ne peut récapituler ces différenciations, même depuis l'avènement des embryons synthétiques produits à partir de cellules ES car nous étudions des différenciations cellulaires qui surviennent avant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum afin obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Nous utilisons des combinaisons génétiques qui permettent d'obtenir le génotype voulu avec une plus grande efficacité (systèmes inductibles).
Raffinement
Nous utilisons des animaux avec des systèmes inductibles pour réduire les contraintes. Ces modifications génétiques n'occasionnent aucun stress ni douleur. Les animaux seront observés quotidiennement afin de suivre leur état général (perte de poids, comportements anormaux) et seront mis à mort en cas de points limites atteints et après consultation de la SBEA ou une dose supplémentaire d'analgésique pourra être administrée dans le cas d'acte chirurgical. Dans le cas d'injections répétées, le côté de la piqûre sera alterné. Lors des ovariectomies, la souris sera traitée en amont avec un analgésique et elle sera placée sur un matelas chauffant lors de l'acte chirurgical
Choix des espèces
Nous travaillons sur les premières différenciations cellulaires chez les mammifères qui ne peuvent être effectuées dans des modèles d'autres classes de vertébrés. La souris est le choix idéal principalement pour les outils génétiques qui y ont été développés.
Régulation de l’autophagie, inflammation et axe microbiote-intestin-cerveau chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Ce projet prévoit 4 896 souris, un effectif parmi les plus élevés du corpus, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Dès l'âge de huit jours, les souriceaux reçoivent des injections de composés pro-inflammatoires, sont séparés de leur mère, subissent des prélèvements de sang et de fèces puis quatre tests comportementaux, avant le prélèvement de leurs tissus. Le modèle vise à relier autophagie, inflammation et troubles du neurodéveloppement, les retombées thérapeutiques étant annoncées comme un simple "point de départ" pour de futurs tests précliniques. Le porteur justifie l'ampleur du dispositif par la combinaison de plusieurs approches sur une même lignée, sans détailler ce qui fonde le total de 4 896 individus.
Objectifs
La complexité des troubles neurodéveloppementaux (TND) suggère l’implication d’une combinaison de type « gènes × environnement ». De plus en plus de données indiquent que ces troubles sont influencés par l’axe microbiote-intestin-cerveau, via des interactions complexes entre l’inflammation, l’autophagie (système de recyclage intracellulaire) et le développement neuronal. La littérature a permis de mettre en évidence le rôle de l’autophagie dans certains de ces troubles. L’autophagie est un mécanisme par lequel les cellules immunitaires cérébrales éliminent les connexions neuronales surnuméraires au cours du développement, et son dysfonctionnement peut influencer la communication entre intestin et cerveau, contribuant aux TND. Par ailleurs, la littérature scientifique indique qu’une exposition précoce à des composants environnementaux pro-inflammatoires est impliquée dans la survenue de TND. Dans ce contexte, et sur la base de résultats préliminaires obtenus sur des populations de patients TND, nous avons choisi de travailler sur l’un des gènes impliqués dans l’autophagie et dans l’inflammation. L’utilisation de modèles murins de déficience du système autophagique a permis de conclure à un lien entre l’autophagie et la survenue d’anomalies comportementales. Le modèle de souris présente des perturbations des réponses inflammatoire et autophagique. Ce modèle est donc pertinent dans l'étude du processus autophagique, de la régulation de l’inflammation et de la susceptibilité génétique aux composés pro-inflammatoires, tout en permettant d’étudier les mécanismes influençant l’axe intestin-cerveau. Ces données originales permettront d’enrichir la caractérisation de la lignée au niveau de l’axe microbiote-intestin-cerveau, un axe central dans lequel l’inflammation et les dysfonctionnements de l’autophagie peuvent contribuer à l’apparition et à la sévérité des TND. Cette approche intégrative permettra d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes liant autophagie, inflammation et TND.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central, la survenue de troubles du neurodéveloppement, et l'implication de l'axe intestin-cerveau dans ces troubles, qui sont en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour réduire la survenue ou atténuer la sévérité de ces troubles.
Procédures
Une injection unique de composé pro-inflammatoire (durée du geste d’environ 10 secondes, animaux vigiles) ou deux injections répétées sur un maximum de quatre jours (durée du geste d’environ 5 minutes, sous anesthésie générale). Deux prélèvements sanguins au niveau de la veine mandibulaire pourune partie des animaux (durée du geste environ 10 secondes, animaux vigiles). Deux prélèvements parsemaine des fécès pendant 3 semaines après sevrage lors des pesées (durée du geste environ 1 à 2 minutes, animaux vigiles). Au total, les animaux sont soumis à 4 tests de comportements réalisés tous les deux jours (2 heures maximum au total).
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables classés comme modérés sont attendus, en lien avec notamment la séparation de quelques minutes entre la mère et les petits lors des injections (stress pour la mère), l’anesthésie générale (chute de la température corporelle et détresse respiratoire), le stress induit par les tests de comportement, la réalisation de contention et l'injection de molécules anesthésiques, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile.
Devenir
L’ensemble des 4896 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt pour traitement par biologie molécule ou histologie.
Remplacement
Notre étude a pour but la compréhension des mécanismes impliqués dans les interactions gène x environnement dans l’apparition des troubles neurodéveloppementaux après une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires chez une lignée murine déficiente en autophagie. Ces explorations nécessitent une évaluation sur l’individu. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle animal, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 4896 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, un même animal est utilisé pour différentes études de biologie moléculaire et-ou la réalisation de séries de coupes pour les cerveaux prélevés, ce qui nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés plusieurs fois par semaine et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les paramètres environnementaux sont contrôlés conformément à la règlementation en vigueur. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification (coton) et d’une maison rouge. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements anormaux, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant 12h, à l’aide d’une grille de suivi. Si l’état général de l’animal atteint les points limites (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés immédiatement. Le stress induit par la séparation maternelle au moment de l’injection des animaux à 8, 10, 13, 14, 15 ou 17 jours est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation avec la mère. Les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter tout stress lié à la température. Les animaux seront particulièrement observés après les injections. Afin d’éviter une souffrance, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins notre modèle existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement et ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Les injections de composés pro-inflammatoires seront réalisées à 8, 10, 13 et 14 jours ou 15 et 17 jours de manière à modéliser l’exposition de l’enfant à ses composés, pendant sa première année de vie. Les injections de molécules pro-inflammatoires (modèle classique de stimulation pro-inflammatoire) seront réalisées à 8, 20, 34 et 89 jours, de manière à nous rapprocher des précédents projets mis en place sur cette thématique et à couvrir différents stades de la vie de l’animal : néonatal (injection à 8 jours de vie), jeune (injection à 20 jours de vie), adolescent (injection à 34 jours de vie) et adulte (injection à 89 jours de vie).
Modèle de vieillissement chez le rongeur : outils d’évaluation préclinique de thérapies ralentissant le vieillissement
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Rats : 800
Pour tester des thérapies censées ralentir le vieillissement, 1600 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes. Chaque animal reçoit des traitements par injection ou par gavage et subit des prélèvements sanguins répétés, tandis que le protocole laisse la santé se dégrader avec l'âge, avec tumeurs, déclin moteur et perte de poids. Les bénéfices avancés pour la médecine gériatrique restent renvoyés au conditionnel et au moyen terme. Sur le remplacement, le porteur affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la complexité d'un "organisme entier" et conclut au recours aux rongeurs.
Objectifs
Le vieillissement en bonne santé est devenu un enjeu crucial avec l'augmentation de la population gériatrique dans le monde entier. Le vieillissement est un processus biologique complexe qui entraîne un déclin progressif des fonctions physiologiques de l'organisme. Il résulte d'une combinaison de changements cellulaires et moléculaires qui s'accumulent au fil du temps, tels que les dommages à l'ADN, le dysfonctionnement mitochondrial et l'accumulation de cellules sénescentes. Ce processus est très individuel, ce qui fait que l'âge biologique diffère souvent de l'âge chronologique. Ce projet a pour objectif d’apporter des éléments de réponse à des questions comme Quelle est la fenêtre d'intervention thérapeutique optimale pour inverser ou ralentir le déclin ? ou encore La solution améliore-t-elle les fonctions physiologiques intégrées ou se contente-t-elle de modifier un marqueur moléculaire ?
Bénéfices attendus
À court terme, les modèles rongeurs permettent une validation rapide des hypothèses. En quelques mois, on peut : (i) Établir une preuve de concept : on peut rapidement tester si une molécule ou un régime alimentaire a un effet sur les marqueurs du vieillissement. (ii) Évaluer la sécurité et la toxicité d’un traitement potentiel pour ses effets secondaires indésirables avant d'envisager des études plus longues ou plus complexes. (ii) Obtenir des données préliminaires À moyen terme, ces modèles permettent une compréhension plus profonde des mécanismes du vieillissement et de l'efficacité d'un traitement. (i) Étudier les effets à long terme : La durée de vie relativement courte des rongeurs permet d'étudier l'impact d'une intervention sur la longévité et la santé. On peut observer si un traitement retarde l'apparition de signes caractéristiques du vieillissement. (ii) Élucider les mécanismes d'action : En analysant des échantillons de tissus et de fluides à différents âges, on peut identifier les voies moléculaires et cellulaires par lesquelles une thérapie fonctionne. (iii) Optimiser les traitements : on peut ajuster les doses, la fréquence et la voie d'administration d'un traitement pour trouver le protocole le plus efficace. Les bénéfices à long terme de ces modèles sont d'une importance capitale pour la médecine translationnelle et la santé publique. (i) Développement de thérapies cliniques : Les données solides obtenues sur les rongeurs sont essentielles pour justifier le passage aux essais cliniques chez l'humain. Elles réduisent les risques et augmentent les chances de succès des futurs médicaments. (ii) Identification de nouveaux biomarqueurs : La recherche sur les rongeurs peut révéler de nouveaux marqueurs biologiques du vieillissement, qui pourraient ensuite être utilisés pour évaluer le "vrai" âge biologique ou la réponse aux traitements chez l'humain. (iii) Amélioration de la compréhension du vieillissement humain : Les découvertes faites sur ces modèles contribuent à une meilleure compréhension des maladies liées à l'âge et peuvent mener à de nouvelles stratégies de prévention. En fin de compte, l'objectif est d'améliorer la qualité de vie et de prolonger la période de bonne santé chez les personnes vieillissantes.
Procédures
Dans ce modèle in vivo de vieillissement, les rongeurs sont soumis à très peu d'interventions, principalement pour l'administration des traitements et la collecte d'échantillons. Des efforts sont faits pour limiter l'impact de ces interventions en suivant des protocoles de réduction de la douleur et du stress. L'anesthésie avec l'isoflurane induit un stress de courte durée (15 secondes). Les piqûres d’aiguille pour traiter les animaux entraînent une douleur légère de courte durée (2 secondes). Les traitments seront administrés en intrapéritonéal 10 sec, en sous-cutané 15 sec, ou par gavage 20 sec sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Effets liés au vieillissement : La principale source de nuisance est la détérioration progressive de la santé de l'animal. Cela inclut : déclin cognitif, diminution de la mobilité, pathologies liées à l'âge (apparition de tumeurs), altérations physiologiques. Les animaux peuvent également souffrir d'une perte de poids liée à l'âge. Nuisances liées au protocole expérimental: L'administration de substances par voie orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée peut causer de la douleur ou du stress à l'animal. Les injections répétées, en particulier, peuvent induire un inconfort. Les prélèvements sanguins peuvent causer un inconfort physique. Des efforts sont faits pour limiter ces impacts en suivant des protocoles de réduction de la douleur et du stress. L’ensemble de ces effets sera suivi attentivement par un monitoring clinique rigoureux, afin de détecter rapidement toute altération significative de l’état des animaux et de mettre en place, le cas échéant, des mesures correctives ou un arrêt anticipé de l’expérimentation.
Devenir
A la fin de la procédure tous les animaux sont mis à mort, afin d’en prélever les organes et fluides biologiques afin de quantifier des biomarqueurs divers et valider l'efficacité de la thérapie analysée.
Remplacement
Le protocole prévu dans ce projet ne peut pas être transposé efficacement dans un système in vitro. Il existe plusieurs alternatives non animale pour investiguer le processus de vieillissement, mais elles ne peuvent pas remplacer totalement les tests sur les animaux utilisés dans ce projet. 1. Modèles in vitro : Les cultures cellulaires humaines ou animales permettent d’étudier des interactions cellulaires et les réponses inflammatoires. Cependant, elles ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier, notamment les interactions multicellulaires complexes et la réponse immunitaire systémique. 2. Modèles ex vivo : Les tissus humains ou animaux (biopsies, explants) permettent d’étudier des processus biologiques en conditions plus réalistes, mais il manque des interactions entre plusieurs systèmes organiques. 3. Modèles organoïdes et organes sur puce : Ces systèmes imitent des organes pour étudier les réponses biologiques. Cependant, ils ne peuvent pas reproduire la réponse systémique d'un organisme complet. 4. Modélisation informatique : Les simulations informatiques ne peuvent pas simuler toutes les réactions biologiques complexes d'un organisme vivant. Ces alternatives ne peuvent pas complètement remplacer les animaux, car les modèles non animaux ne peuvent pas reproduire la complexité d’un organisme vivant complet, limitant leur capacité à simuler des réponses biologiques globales et interconnectées.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux sera mise en oeuvre par l’estimation du nombre minimal d’animaux permettant de garantir l’interprétabilité des résultats. De façon systématique des analyses statistiques sont effectuées afin de déterminer le nombre d’animaux optimal afin de produire des résultats robustes pour chaque point de mesure.
Raffinement
La fréquence de surveillance des animaux est essentielle pour garantir leur bien-être. Les signes de détérioration de l’état de santé, tels que la perte de poids, fièvre, modifications de la mobilité, ou respiration laborieuse, sont particulièrement surveillés par l'observation de points limites en raison des effets du vieillissement. Si des signes de stress apparaissent, nous actionnerons des actions correctives. Des critères d'arrêt sont définis pour éviter la souffrance excessive des animaux. L’objectif est de garantir que l’état de l’animal est constamment suivi et que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux.
Choix des espèces
Les rongeurs partagent une grande similarité génétique et physiologique avec les humains. Leurs organes et systèmes fonctionnent de manière similaire, ce qui facilite l'extrapolation des résultats à l'homme. Les rongeurs développent de nombreuses pathologies liées à l'âge qui ressemblent à celles observées chez l'humain. Leur courte durée de vie est un atout majeur. La souris est privilégiée pour les phases précoces et de large criblage : Son faible poids corporel réduit la quantité de principes actifs nécessaires. C'est un avantage majeur lorsque les molécules testées sont coûteuses à synthétiser ; Sa petite taille permet la manipulation de grands effectifs, garantissant des résultats statistiquement robustes. Le rat est souvent choisi pour les phases de validation avancées et les études pharmacologiques. La taille du rat permet d'effectuer des prélèvements biologiques répétés d’un plus grand volume que chez la souris, sur le même individu tout au long de sa vie. Les animaux utilisés seront des animaux adultes.
Maintien de lignées de souris pour l’étude de cellules embryonnaires impliquées dans le développement de différents tissus
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Pour maintenir neuf lignées de souris transgéniques, 11 040 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, avec une biopsie de la queue et un tatouage des coussinets réalisés sur l'animal vigile. L'objectif déclaré est de disposer d'assez d'animaux au bon génotype pour étudier des cellules embryonnaires liées à des maladies humaines. Le RNT ne précise pas comment ce chiffre de 11 040 se répartit entre les neuf lignées. Les souris au génotype recherché rejoignent d'autres projets, celles au génotype non voulu ou ayant servi à la reproduction sont tuées.
Objectifs
Ce projet a pour objectif le maintien des lignées de souris transgéniques permettant de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent le développement de tissus ou types cellulaires formés à partir d’une structure embryonnaire transitoire nommée la crête neurale. Des anomalies de développement ou de maintien de ces cellules conduisent à un certain de nombre de pathologies chez l’homme, dont les bases génétiques et physiopathologiques sont incomplètement caractérisées. Le maintien de neuf lignées transgéniques différentes permettra d’obtenir un nombre suffisant d’animaux d’intérêt pour mieux comprendre les bases génétiques de ces maladies et améliorer le diagnostic chez les patients.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est d’avoir un nombre suffisant d’animaux d’intérêt pour augmenter la connaissance scientifique sur la formation de tissus ou types cellulaires dérivés d’une structure appelée la crête neurale en condition physiologique ou pathologique.
Procédures
Les souriceaux seront identifiés par tatouage aux coussinets digitaux réalisé avec un système de micro-tatouage. La biopsie sera réalisée sur animaux vigiles en même temps que le tatouage (procédure qui dure moins de 30 secondes).
Impact sur les animaux
La contention, la biopsie et le tatouage peuvent provoquer un stress chez l’animal. La biopsie et la piqure du coussinet lors du tatouage peuvent provoquer une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort si leur génotype n’est pas celui attendu ou après accouplement, les autres seront utilisés dans des projets scientifiques.
Remplacement
Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est indispensable afin de comprendre comment les mutations d’intérêts impactent le développement, le maintien des cellules et leurs interactions dans chaque organe.
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon nos expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour réaliser au mieux nos expériences.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des cages contenant des enrichissements et en groupe social. Les souriceaux sont séparés de leur mère pendant 5 minutes maximum et sont surveillés après l’intervention pour vérifier qu’ils sont bien acceptés par leur mère.
Choix des espèces
Les mécanismes analysés sont très conservés entre l'homme et la souris. Le modèle animal permet donc d'étudier la fonction de chacun des gènes d'intérêt au cours du développement et dans des organes de choix (nerf sciatique, peau, intestin). De plus, il existe un ensemble d’outils qui ont été développés quasiment exclusivement chez la souris. Le tatouage des coussinets des phalanges est réalisé sur des souriceaux entre 7 et 10 jours. Le prélèvement caudal est fait en même temps pour permettre un génotypage avant le sevrage.