Système gastrointestinal
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
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Dimorphisme sexuel et rôle du microbiote dans la régulation de la récompense alimentaire par le GLP-1.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Génétiquement modifiées pour marquer de façon permanente leurs neurones activés, 80 souris de lignée FosTRAP vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever cerveau, nerfs et intestin. Elles subissent un jeûne, trois injections sous la peau, et pour la moitié d'entre elles une déplétion du microbiote par antibiotiques dans l'eau pendant quatre semaines. L'étude porte sur l'action de l'hormone GLP-1, utilisée contre l'obésité, et sur ses différences entre mâles et femelles. Le porteur retient ce modèle transgénique parce qu'il permet de comparer deux états successifs chez un même animal, ce qu'il présente comme une façon de réduire le nombre d'animaux.
Objectifs
Les comportements alimentaires ne sont pas uniquement dictés par les besoins énergétiques : ils sont aussi fortement influencés par le plaisir procuré par certains aliments riches en sucres ou en graisses. Cette recherche vise à mieux comprendre les mécanismes biologiques qui régulent cette « alimentation de plaisir », dont les dérèglements peuvent favoriser le surpoids, l’obésité et certains troubles du comportement alimentaire. Le projet s’intéresse à une hormone digestive appelée GLP-1, produite par l’intestin, qui joue un rôle clé dans la régulation de l’appétit et de la sensation de récompense liée à l’alimentation. Les analogues du GLP-1 sont aujourd’hui largement utilisés en médecine pour traiter l’obésité et le diabète. Cependant, leur efficacité varie fortement d’un individu à l’autre, et leurs effets à long terme sur le cerveau restent encore mal compris. Des travaux récents suggèrent que le microbiote intestinal – l’ensemble des micro-organismes vivant dans notre intestin – influence profondément la communication entre l’intestin et le cerveau, notamment en modulant la signalisation du GLP-1. De plus, des différences importantes entre les sexes ont été observées, sans que leurs causes biologiques soient clairement identifiées. L’objectif principal de ce projet est donc de déterminer comment le microbiote intestinal influence l’action du GLP-1 sur les circuits cérébraux de la récompense alimentaire, et d’identifier les mécanismes responsables des différences observées entre mâles et femelles. À l’aide de modèles animaux, le projet cherchera à comprendre si des modifications du microbiote peuvent entraîner une perte de sensibilité du cerveau au GLP-1, favorisant ainsi une consommation excessive d’aliments très appétents, et si ces effets sont réversibles. À terme, ces travaux visent à améliorer la compréhension des interactions entre microbiote, hormones digestives et cerveau, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies nutritionnelles ou thérapeutiques plus personnalisées, tenant compte du sexe biologique, pour prévenir ou traiter les troubles du comportement alimentaire.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes d’action des analogues du GLP-1, largement utilisés chez l’humain dans le traitement de l’obésité. En identifiant le rôle du microbiote intestinal et les différences entre femelles et mâles dans la réponse cérébrale au GLP-1, il permettra de mieux interpréter les variations d’efficacité et les résistances observées en pratique clinique. Les connaissances générées contribueront à orienter le développement de stratégies thérapeutiques plus adaptées et potentiellement plus efficaces, tout en limitant l’exposition inutile à des traitements inefficaces.
Procédures
Les 80 animaux subiront un jeûne court de 5 à 6 heures avant la première session d’injections sous-cutanées. Chaque animal recevra trois injections sous-cutanées au total (deux lors de la première session, puis une injection finale). Quarante animaux recevront une déplétion du microbiote par administration d’un cocktail d’antibiotiques dans l’eau de boisson pendant une durée maximale de 4 semaines.
Impact sur les animaux
Les injections sous-cutanées réalisées dans ce protocole sont des actes de courte durée et faiblement invasif. Elles ne devraient pas entraîner d’inconfort significatif. Néanmoins, les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière des sites d’injection dans les jours suivant l’administration afin de détecter toute réaction locale éventuelle (rougeur, œdème, induration). La déplétion du microbiote intestinal par l’administration d’antibiotiques dans l’eau de boisson est susceptible d’induire un inconfort digestif léger et transitoire. Les animaux seront suivis tout au long de la procédure pour évaluer leur état général, leur comportement, leur hydratation et leur consommation de boisson. En cas d’apparition de signes persistants de mal-être, des mesures adaptées seront mises en œuvre conformément aux procédures de l’établissement.
Devenir
À l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux sera mis à mort de manière réglementaire afin de permettre les analyses biologiques nécessaires à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet. Celui-ci vise à caractériser les effets de la modulation du microbiote intestinal sur la signalisation du GLP-1 et l’activation des circuits de l’axe intestin–nerf vague–cerveau chez la souris adulte. La mise à mort est indispensable pour permettre la collecte et l’analyse de plusieurs organes d’intérêt, incluant l’intestin, les ganglions sensoriels vagaux et le cerveau, en vue de réaliser des approches d’immunohistochimie, d’imagerie fluorescente et de quantification de marqueurs d’activation neuronale (td-Tomato, c-Fos). Ces analyses ne peuvent être réalisées chez l’animal vivant et ne sont pas compatibles avec une réutilisation ultérieure des animaux.
Remplacement
Ce projet repose sur une étude in vivo visant à analyser les interactions complexes de l’axe microbiote–intestin–cerveau. L’objectif est d’étudier des réponses physiopathologiques intégrées impliquant simultanément le tube digestif, le système nerveux périphérique, en particulier le nerf vague, et le cerveau. Ces interactions dynamiques ne peuvent être appréhendées que dans un organisme vivant, où les communications neuro-hormonales, immunitaires et métaboliques sont fonctionnelles et coordonnées. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire de manière pertinente et intégrée les mécanismes reliant l’intestin au cerveau, notamment dans le contexte de la modulation du GLP-1 et de l’activation de circuits cérébraux spécifiques. Les approches in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de rendre compte de la complexité des boucles de rétrocontrôle, de la plasticité neuronale et des interactions systémiques nécessaires à la réalisation des objectifs du projet.
Réduction
Une attention particulière est portée à la réduction du nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant la solidité scientifique des résultats attendus dans le cadre de ce projet visant la production de données robustes. Les effectifs sont déterminés à partir de l’expertise du laboratoire et de données préexistantes issues de projets comparables, intégrant la variabilité interindividuelle inhérente aux études in vivo. Les analyses statistiques prévues, reposant sur des tests adaptés à la distribution des données, permettent d’optimiser la taille des groupes expérimentaux. Ainsi, un effectif limité de 10 souris par sexe et par groupe est retenu, garantissant un équilibre entre puissance statistique et réduction du nombre total d’animaux. Par ailleurs, les protocoles expérimentaux sont conçus afin de maximiser les informations obtenues à partir de chaque animal. Chaque souris fera l’objet d’analyses multiples et complémentaires, incluant des approches neuroanatomiques, physiologiques et moléculaires sur plusieurs tissus (cerveau, structures nerveuses périphériques et intestin). Cette stratégie intégrative permet de limiter le recours à des cohortes supplémentaires et s’inscrit pleinement dans le principe de réduction des 3R.
Raffinement
L’ensemble des procédures expérimentales est conçu afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux, conformément aux exigences éthiques et réglementaires en vigueur. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé et habilité, utilisant des techniques standardisées et maîtrisées. Dans le cadre de ce projet, les interventions se limitent principalement à des injections sous-cutanées, réalisées sur des sites distincts afin de réduire l’inconfort local, ainsi qu’à l’administration d’un cocktail d’antibiotiques via l’eau de boisson. Ces procédures sont associées à une nuisance de faible intensité et de durée limitée. Les animaux sont hébergés en groupes (au minimum deux par cage) et bénéficient d’un enrichissement de l’environnement incluant un tunnel opaque, permettant l’expression de comportements naturels et le maintien du bien-être tout au long de l’étude. Un suivi régulier de l’état de santé et du comportement des animaux est assuré pendant toute la durée du protocole, avec une attention particulière lors de la phase de traitement antibiotique prolongé. Pendant cette phase de déplétion du microbiote, les animaux seront maintenus en conditions sanitaires contrôlées de l’animalerie (pièce spécifique en « A2 like »), en cages ventilées, avec des pratiques d’hygiène adaptées (manipulation sous poste, équipements de protection, matériel dédié, évacuations des déchets suivants un circuit dédié), afin de limiter le risque de contamination opportuniste chez des animaux au microbiote perturbé. En cas de baisse de consommation d’eau, de perte de poids ou de signes digestifs persistants, des mesures de soutien seront mises en œuvre : nourriture humidifiée et accessible, gel d’hydratation si validé par l’établissement, surveillance rapprochée, adaptation voire arrêt du traitement antibiotique, et sollicitation d’un avis vétérinaire. L’évaluation repose sur des critères prédéfinis (poids, apparence générale, pelage, posture, activité, comportement et respiration). En cas d’apparition de signes évocateurs de douleur ou de mal-être, des mesures adaptées seront mises en œuvre, arrêt du traitement antibiotiques (si inconfort digestif) pouvant aller jusqu’à l’administration d’un traitement analgésique approprié ou un analgésique de type central serait administré. Les points limites définis conduiront, s’ils sont observés, a la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
Le projet repose sur l’utilisation de souris transgéniques FosTRAP sur fond génétique C57BL/6J, un modèle de référence en neurosciences, particulièrement adapté à l’étude de l’axe microbiote–intestin–cerveau. Ce modèle permet de marquer de façon permanente et spécifique les neurones activés en réponse à un stimulus périphérique, notamment nutritionnel, avec un contrôle temporel précis (utilisant la technologie CRE et gène rapporteur td Tomato). L’intérêt majeur du modèle FosTRAP réside dans la possibilité d’étudier, chez un même animal, l’activation neuronale induite par un même stimulus appliqué à deux temps distincts, correspondant à deux états physiologiques différents. Cette approche permet de comparer directement la réponse cérébrale à un analogue du GLP-1 avant et après modification du microbiote intestinal, tout en limitant la variabilité interindividuelle. Ce choix méthodologique renforce la robustesse des résultats et contribue au principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant la pertinence biologique et la reproductibilité des données. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, entre 70 et 120 jours d’âge. Ce stade correspond à une période où les systèmes physiologiques et neurobiologiques, en particulier les circuits impliqués dans la régulation de la prise alimentaire, de la récompense et de l’axe intestin–cerveau, sont pleinement matures et fonctionnels. Le recours à des souris jeunes adultes permet d’éviter les biais liés au développement encore incomplet observé chez les animaux plus jeunes, ainsi que ceux associés au vieillissement. Il garantit ainsi des conditions expérimentales stables, une variabilité interindividuelle réduite et une meilleure reproductibilité des résultats. Ce choix est particulièrement adapté aux objectifs du projet, qui vise à analyser les réponses neuronales et comportementales à des signaux périphériques, notamment nutritionnels et hormonaux, dans un contexte physiologique représentatif de l’âge adulte.
Rôle de l’interleukine-33 dans la fibrose intestinale chez la Souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Rendues malades par une colite chimique chronique, une partie des 386 souris subit une hypersensibilité viscérale et une perte de poids qualifiées de sévères. Elles reçoivent aussi une déplétion du microbiote par antibiotiques puis un transfert par gavage quotidien pendant sept jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à sévère, toutes tuées à l'issue. Pour les colites induites chimiquement, l'usage décrit par le porteur est de ne donner aucun analgésique, ces molécules risquant d'interférer avec l'inflammation étudiée. L'étude vise l'interleukine-33 comme cible contre la fibrose intestinale, la souffrance sévère de la colite étant assumée sans traitement de la douleur.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin regroupent principalement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique. Ces maladies se caractérisent par la récurrence de poussées inflammatoires, entrecoupées de phases de rémission. Une complication fréquente de ces maladies est la fibrose intestinale. Celle-ci se caractérise par un épaississement de la paroi intestinale lié à une réparation tissulaire chronique. Cela peut conduire à un rétrécissement de la lumière intestinale. Aujourd’hui, aucun traitement spécifique ne permet de prévenir ou d’inhiber le développement de la fibrose intestinale, ce qui conduit les patients à des interventions chirurgicales, d’où l’importance de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir ou inhiber la fibrose intestinale. Nous avons décidé de cibler l’interleukine-33. L’interleukine-33 est une cytokine dont les taux sont plus élevés chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Elle est produite dans des cellules clés dans le développement de la fibrose intestinale comme les fibroblastes, les cellules musculaires lisses, les cellules épithéliales et endothéliales. De plus, des bactéries pathogènes sont retrouvées dans la muqueuse intestinale des patients atteints de la maladie de Crohn et contribuent à l’inflammation. La colonisation par ces bactéries dans des modèles précliniques induit de la fibrose intestinale et implique l’interleukine-33. Comme de plus en plus d’éléments suggèrent le rôle possible du microbiote intestinal ou de ses métabolites dans le développement de la fibrose intestinale, nous souhaitons savoir si les bactéries ou certains de leurs métabolites peuvent influencer la fibrose intestinale via la voie de l’interleukine-33. De plus, l’interleukine-33 est impliquée dans le développement de fibroses extra-intestinales.
Bénéfices attendus
Même si des progrès thérapeutiques notables ont été réalisés dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, il n’existe pas de traitement préventif ou thérapeutique contre le développement de la fibrose intestinale. Comme de plus en plus d’éléments suggèrent le rôle possible du microbiote intestinal ou de ses métabolites dans le développement de la fibrose intestinale, nous souhaitons savoir si les bactéries ou certains de leurs métabolites peuvent influencer la fibrose intestinale via la voie de l’interleukine-33. Ce projet permettra donc de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents sur l’implication de l’interleukine-33 dans le développement de la fibrose intestinale et en particulier le rôle du microbiote intestinal.
Procédures
Transfert de microbiote intestinal et induction de la fibrose intestinale. Les souris seront déplétées de leur microbiote par traitement antibiotique dans l’eau de boisson d’une durée d’une semaine. Puis, le transfert de microbiote intestinal se fera par gavage quotidien pendant 7 jours consécutifs et chaque gavage dure environ 1 minute par souris. Les protocoles de colite chronique induite chimiquement se feront respectivement soit par administration de l’agent chimique dans l’eau de boisson, soit par une injection intra-rectale sous anesthésie/analgésie, 1min par injection, selon la molécule utilisée. Les protocoles d’induction de fibrose sont de 59 jours et 42 jours respectivement. La composition corporelle est mesurée les premier et dernier jours de protocole de façon non invasive et la procédure dure environ 1 minute par souris.
Impact sur les animaux
Les protocoles d’induction de colite chronique sont de 59 jours et 42 jours respectivement. Les modèles de colites peuvent entrainer une hypersensibilité viscérale (modérée pour la colite aigue aux doses testées et sévère pour les modèles de colite chronique induite chimiquement) et une perte de poids corporel chez la Souris. Les souris ont accès de façon ad libitum à la nourriture durant la totalité des procédures mais de la nourriture pourra être donnée directement dans la cage si l’état de la souris ne lui permet pas d’accéder directement à la nourriture. Concernant le transfert de microbiote, les souris seront déplétées de leur microbiote par traitement antibiotique dans l’eau de boisson d’une durée d’une semaine. Puis, le transfert de microbiote intestinal se fera par gavage quotidien pendant 7 jours consécutifs et chaque gavage dure environ 1 minute par souris. Le gavage engendrant un stress chez la souris, avant toute contention ou gavage, l’animal sera acclimaté aux pièces d’hébergement et manipulé fréquemment afin de l’habituer aux expérimentateurs et de réduire son stress.
Devenir
A la fin du protocole, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de pouvoir évaluer différents paramètres physiologiques et marqueurs biologiques et collecter un maximum d’informations à partir de ces séries expérimentales.
Remplacement
Avant d’être testés in vivo, nos hypothèses de travail sont validées dans des modèles cellulaires comme des lignées de fibroblastes intestinaux humains en réponse à une cytokine pro-fibrotique ou des lignées de cellules épithéliales intestinales en réponse à des cocktails de cytokines pro-fibrotique ou pro-inflammatoire. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de rendre compte de la complexité physiologique de la réponse fibrotique ou inflammatoire in vivo. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales.
Réduction
Ce projet s’efforce de réduire le nombre de souris au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante et en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience : (i) données nutritionnelles (composition corporelle, poids des animaux), (ii) inflammation, (iii) fibrose intestinale, (iv) fonction de barrière intestinale et (v) microbiote intestinal. Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon la sensibilité et la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études, d’études pilotes pour valider les doses d’agents chimique et des données de la littérature. Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, plusieurs approches combinées ont été prévues : des modèles de colites intestinales induites chimiquement par deux agents différents à des concentrations faibles mais efficaces d’après la littérature. Nous avons fait le choix d’utiliser une dose faible d’inducteur chimique pour limiter au maximum la mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux utilisés. - L’utilisation d’espèces d’animaux utilisés à des fins scientifique, caractérisés par une faible variation génétique permet de limiter la variabilité de la réponse biologique et par conséquent le nombre d’animaux. - L’effectif de chaque groupe a été déterminé par une approche statistique en prenant comme critère principal le score histologique. - Les données obtenues chez des animaux contrôles seront réutilisées autant que possible. Par exemple, des échantillons de colon sont préservés dans le laboratoire et indiqués dans la base de données communes à notre Unité et peuvent ainsi être réutilisés au cours d’un autre protocole par nous ou une personne de l’Unité.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages standards (4-5 souris/cage), avec enrichissement. Une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera réalisée avant le début des procédures. - Les conditions de soins et les méthodes utilisées viseront à réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée des procédures, afin de déceler tout éventuel signe de souffrance. Pour cela, un scoring basé sur un examen clinique sera réalisé permettant d’évaluer l’état de bien-être de l’animal. Un animal présentant un état de mal être ou de souffrance sera exclu de l'étude et mis à mort en fonction de son score. Pour limiter la douleur des animaux avec colite induite chimiquement, l’usage est de ne pas utiliser d’analgésique en raison de leur interaction potentielle avec le processus inflammatoire. Il existe 3 analgésiques potentiels utilisés dans l’inflammation intestinale, qui présentent tous un risque d’interférence avec notre modèle selon la littérature scientifique. Nous ne pourrons donc pas utiliser ces analgésiques dans nos procédures expérimentales. Cependant, au cours de la procédure 1, nous évaluerons l’impact de l’administration d’une analgésique tel que le butorphanol, sur le développement de l’inflammation et de la fibrose intestinale. Si le butorphanol n’interfère pas avec le développement des paramètres d’intérêt, nous utiliserons par la suite cette molécule, dans l’ensemble des procédures (procédures 2 à 4) décrites dans le projet.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser la colite expérimentale. Cette souche n’est pas résistante à l’induction de colite chronique comme d’autres souches de souris et permet ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. La lignée de souris a été utilisée par notre laboratoire pour la mise en place des techniques de greffe de microbiote intestinal et de déplétion du microbiote endogène des animaux greffés par antibiothérapie. Nous utiliserons des souris d’environ 6 semaines. La réponse à la colite diffère en fonction de l'âge des animaux et le stade de développement choisi correspond à une phase de réponse optimale avec un risque de mortalité réduit.
Caract?risation du r?le de facteurs de virulence d’Escherichia coli au cours de l’infection chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 932 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Chaque animal est mis à jeun une nuit, gavé jusqu'à quatre fois et reçoit jusqu'à huit injections dans l'abdomen, avant d'être tué pour le prélèvement de tissus. Le projet étudie des facteurs de virulence d'Escherichia coli résistants aux antibiotiques et vise à terme de nouvelles cibles thérapeutiques. Le porteur retient la souris parce qu'elle est "permissive" à l'infection sans manipulation génétique et s'appuie sur une littérature abondante pour limiter le nombre d'animaux.
Objectifs
Certains facteurs de virulence des bact?ries Escherichia coli (E. coli) sont impliqu?s dans l?invasion de l??pith?lium intestinal et ou la colonisation du tractus digestif. Une telle capacit? a r?cemment ?t? associ?e ? l??tablissement de populations dites persisters, r?sistantes aux antibiotiques et capables de faciliter des ?changes de g?nes de r?sistance. Le r?le de certaines toxines et facteurs d?adh?rence bact?riens dans l?internalisation des bact?ries par les cellules a ?t? montr? in vitro. Ce projet nous permettra de v?rifier leur implication in vivo chez la souris et de mettre en ?vidence leur r?le dans la colonisation et formation de r?servoirs infectieux dans le tractus digestif. Ce projet comprend l??tude de souches multi-r?sistantes aux antibiotiques. Les r?sultats acquis permettront de comprendre comment certains facteurs de virulence ? l??tude permettent ? plusieurs souche d?E. coli d?entrer en comp?tition pour coloniser le tractus digestif de l?h?te. Nous testerons sur la capacit? de colonisation des souches une petite mol?cule chimique capable de bloquer la croissance intracellulaire des bact?ries. Au final, un tel projet doit permettre d?identifier de nouvelles pistes de ciblage th?rapeutique pour le traitement des infections ? E. coli r?sistants aux antibiotiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compr?hension des m?canismes de colonisation bact?rienne de l?intestin par des souches d?Escherichia coli pathog?nes opportunistes. Nous testerons une approche th?rapeutique innovante ? l?interface bact?rie-h?te ciblant des E. coli multi-r?sistantes aux antibiotiques et des E. coli ?tablissant des r?servoirs intratissulaires, qui sont souvent r?fractaires aux antibiotiques. A terme, nous pourrions identifier une nouvelle strat?gie th?rapeutique cibl?e sur l?h?te pour combattre les infections bact?riennes en ?radiquant le portage asymptomatique de ces souches dans le microbiote intestinal.
Procédures
Les souris seront mises ? jeun sur une nuit (1 fois par souris, moins de 16h) ce qui peut induire un stress d? ? l?absence de nourriture pendant cette p?riode. Elles pourront d?velopper une irritation oesophagienne due ? la r?p?tition d?administrations par gavage (4 par souris, dur?e de l?acte inf?rieure ? 30 s). Certaines souris recevront un traitement par injection qui peut provoquer une douleur l?g?re, r?versible et de courte dur?e (maximum 8 par souris, dur?e de l?acte inf?rieure ? 30 s). Les souris seront mises ? mort par une m?thode r?glementaire en fin de proc?dure.
Impact sur les animaux
Les souris seront mises ? jeun sur une nuit (1 fois par souris, moins de 16h) ce qui peut induire un stress d? ? l?absence de nourriture pendant cette p?riode. Elles pourront d?velopper une irritation ?sophagienne due ? la r?p?tition d?administrations par gavage (4 par souris, dur?e de l?acte inf?rieure ? 30 s). Les souris peuvent ressentir une douleur l?g?re de courte dur?e ponctuelle et r?versible lors des injections intrap?riton?ales (7-8 par souris, dur?e de l?acte inf?rieure ? 30 s).
Devenir
Tous les animaux seront mis ? mort pour r?cup?rer des tissus pour des ?tudes mol?culaires et histologiques post-mortem.
Remplacement
Des ?tudes in vitro pr?liminaires sur cellules et organo?des ont permis de mettre en ?vidence l?int?r?t du facteur de virulence bact?rien ?tudi? dans ce projet. Cependant, pour confirmer le r?le de ce facteur dans la capacit? de diff?rentes souches bact?riennes ? coloniser l?intestin, un mod?le animal est n?cessaire pour mimer la complexit? des interactions complexes entre la bact?rie d?int?r?t, le microbiote intestinal et l'Homme.
Réduction
Le nombre de souris utilis?es (7 souris par groupe, pour un total de 1932 souris) sera toujours limit? au minimum n?cessaire pour fournir des donn?es biologiquement et statistiquement significatives. Ce nombre de souris par groupe a ?t? d?termin? sur la base d?exp?riences ant?rieures du laboratoire. Des tests non param?triques seront utilis?s pour comparer les diff?rents groupes. Plusieurs ?chantillons seront pr?lev?s (intestin, colon, ganglions m?sent?riques?) sur toutes les souris utilis?es dans ce projet afin de collecter un maximum d??chantillons et d??viter de relancer des exp?rimentations additionnelles.
Raffinement
Avant de d?buter le projet, les souris seront acclimat?es pendant une semaine en conditions standard d?animalerie avec un acc?s sans restriction ? l?eau et ? la nourriture avec un environnement enrichi (coton). Nous utilisons des sondes de gavage flexibles am?liorant le bien-?tre animal en facilitant le passage dans l??sophage. Pour les souris recevant plusieurs injections intrap?riton?ales, nous veillerons ? alterner les points d?injection pour ne pas injecter deux fois de suite dans la m?me zone. Des crit?res d?arr?t ou points limites ont ?t? d?termin?s pour chaque proc?dure exp?rimentale.
Choix des espèces
La souris est une esp?ce de choix pour l'?tude des facteurs de virulence de E. coli car elle est permissive ? l'infection par ce pathog?ne opportuniste sans n?cessit? de manipulation g?n?tique ou de modification du statut immunitaire des animaux. De plus, la litt?rature concernant ces infections est abondante et les mod?les exp?rimentaux bien ?tablis, ce qui permettra d'obtenir des r?sultats fiables en limitant le nombre d'animaux utilis?s. Enfin, l'exp?rience de l'exp?rimentation animale sur cette esp?ce au laboratoire permettra de limiter au maximum la souffrance des animaux lors de l'?tude. Les souris seront utilis?es au stade de jeunes adultes (environ 9-10 semaines). Il s?agit du stade le plus largement d?crit et valid? dans les publications. A cet ?ge, nous limitons les biais li?s ? l?utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation ais?e.
Etude du r?le de m?tabolites de la flore microbienne intestinale dans le traitement de l’ob?sit? du diab?te et de l’asthme chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
688 souris vont être utilisées, toutes mises à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune enchaînant traitement antibiotique, gavages répétés, inoculations rectales sous anesthésie et tests de tolérance au glucose. Certaines reçoivent en plus l'implantation d'une pompe osmotique sous la peau pendant six semaines et des instillations nasales d'acariens pour induire un asthme. Le projet étudie un métabolite du microbiote intestinal dans l'obésité, le diabète et l'asthme, avec des applications probiotiques adossées à un brevet. Le porteur affirme qu'il reste "nécessaire" de recourir à l'animal vivant, la complexité des interactions entre organes étant difficile à reproduire in vitro.
Objectifs
Ce projet vise ? mieux comprendre comment les bact?ries pr?sentes dans l?intestin influencent certaines maladies chroniques fr?quentes, comme l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme. Ces maladies sont souvent li?es entre elles et partagent des m?canismes communs, notamment une inflammation persistante de l?organisme et un d?s?quilibre du microbiote intestinal (ensemble des bact?ries vivant dans l?intestin). Certaines bact?ries intestinales produisent naturellement des substances appel?es m?tabolites, qui peuvent avoir des effets b?n?fiques sur la sant?. L?un de ces m?tabolite, est produit uniquement par la flore intestinale, mais son r?le exact dans ces maladies reste encore mal connu. L?objectif de ce projet est d??tudier comment ce m?tabolite d'int?r?t et les bact?ries le produisant, influence le m?tabolisme du glucose et des lipides, ainsi que l?inflammation des voies respiratoires. Pour cela, nous utiliserons des mod?les de souris pr?sentant des caract?ristiques proches de celles observ?es chez l?Homme dans l?ob?sit?, le diab?te et l?asthme. Les effets de ce m?tabolite seront ?tudi?s sur le contr?le de la glyc?mie, la prise de poids, l?accumulation des graisses au niveau du foie et l?inflammation des poumons. Ce projet, men? sur cinq ans, respectera strictement les r?gles ?thiques et le bien-?tre animal. Les r?sultats attendus pourraient contribuer au d?veloppement de nouvelles approches pr?ventives ou th?rapeutiques bas?es sur le microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche ouvre des perspectives prometteuses pour le d?veloppement de nouvelles strat?gies th?rapeutiques chez l?Homme fond?es sur des produits probiotiques. L?enrichissement cibl? en bact?ries productrices de m?tabolites b?n?fiques, comme le 4-cr?sol, pourrait non seulement am?liorer l?hom?ostasie glucidique et lipidique, mais aussi att?nuer l?inflammation syst?mique impliqu?e dans l?ob?sit?, le diab?te de type 2 et l?asthme allergique. Le brevet sur lequel ce projet se fonde (Compounds for the prevention and treatment of glucose intolerance related conditions and obesity. Patent Ref. EP 17306326.4 -1466, filed 4 October 2017), et les essais cliniques en cours pour ?valuer l?efficacit? de produits probiotiques, en particulier pour le traitement de la maladie de Crohn, illustrent l?importance des applications th?rapeutiques potentielles des r?sultats des proc?dures exp?rimentales. Les m?canismes sous-jacents, impliquant des interactions complexes entre le microbiote, l'h?te et son environnement, font l'objet de recherches intensives. Bien que des d?fis persistent concernant la s?lection des souches, le dosage ou la variabilit? interindividuelle, ce projet pourrait contribuer ? l??mergence de th?rapies probiotiques de nouvelle g?n?ration en compl?ment ou en alternative aux traitements actuels.
Procédures
Proc?dure 1 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales, r?alis?es chez des animaux vigiles ou sous anesth?sie l?g?re. Ils re?oivent un traitement antibiotique dans l?eau de boisson pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par inoculation de bact?ries non pathog?nes, comprenant un gavage oral trois fois par semaine chez l?animal vigile (contention < 30 s) et une inoculation rectale une fois par semaine sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Le poids et la glyc?mie sont mesur?s une fois/semaine ? partir d?une goutte de sang pr?lev?e ? la queue. Un premier test de tol?rance au glucose par voie intrap?riton?ale (IPGTT, dur?e ? 2 h) est r?alis? ? J15, avec 6 pr?l?vements glyc?miques (< 3 ?l) aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes, et 4 pr?l?vements sanguins suppl?mentaires (10?15 ?l) aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes pour le dosage de l?insuline. Un second IPGTT est r?alis? deux mois apr?s le d?but des inoculations. Un test de tol?rance au pyruvate (PTT, ? 2 h) est r?alis? ? J30 avec 7 pr?l?vements glyc?miques (0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 min). Un test de tol?rance ? l?insuline (ITT, ? 2 h) est r?alis? ? J45 avec 7 pr?l?vements glyc?miques selon le m?me sch?ma temporel. Proc?dure 2 Les animaux subissent une proc?dure chirurgicale unique correspondant ? l?implantation sous-cutan?e dorsale d?une minipompe osmotique, r?alis?e sous anesth?sie ? l?isoflurane et analg?sie pr?ventive. Cette intervention de courte dur?e (? 10 min) permet une perfusion continue de solution saline ou de 4-cr?sol pendant 6 semaines. Deux semaines apr?s l?implantation, les animaux sont soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), r?alis?es chez des animaux vigiles et de tr?s courte dur?e (< 1 min). Proc?dure 3 Les animaux sont soumis ? des interventions non chirurgicales. Ils re?oivent un traitement antibiotique pendant 11 jours, suivi d?un enrichissement de la flore intestinale par gavage oral r?p?t? trois fois par semaine chez l?animal vigile et une inoculation rectale hebdomadaire sous anesth?sie l?g?re ? l?isoflurane. Un suivi clinique hebdomadaire (poids, glyc?mie) est r?alis?. Les animaux sont ?galement soumis ? 4 administrations intranasales d?extraits d?acariens ou de solution saline (J0, J11, J12, J13), chacune de courte dur?e et sans proc?dure chirurgicale.
Impact sur les animaux
Compte tenu de notre exp?rience dans les proc?dures mises en ?uvre dans ce projet, toutes optimis?es et publi?es, nous ne pr?voyons pas de nuisances ou d?effets ind?sirables conduisant ? une mise ? mort anticip?e. Induction de l?ob?sit? et du diab?te par r?gime HFD (Proc?dure?1) : l?ob?sit? induite reste mod?r?e et n?entrave ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture ; les troubles associ?s correspondent ? une nuisance l?g?re. Enrichissement de la flore par des bact?ries productrices de 4?cr?sol (Proc?dures?1&3) : l?inoculation par gavage, n?cessitant une contention br?ve (10?% avec diarrh?e, une injection sous-cutan?e de s?rum physiologique est r?alis?e. Tests de tol?rance au glucose et ? l?insuline (Proc?dure?1) : les volumes sanguins pr?lev?s sont minimes et espac?s d?une semaine. La micro-coupure distale de la queue induit une douleur mod?r?e ? cicatrisation rapide (nuisance mod?r?e). Administration chronique de 4?cr?sol par minipompes osmotiques (Proc?dure?2) : l?implantation sous?cutan?e dorsale est r?alis?e sous analg?sie par bupr?norphine (0,03?mg/ml, vol. = poids ??6, i.p.) et 30 min plus tard sous isoflurane 3,5?% induction, 1,5?% maintien. Cette proc?dure induit une nuisance mod?r?e avec douleur postop?ratoire transitoire, soulag?e par m?loxicam (5 mg/kg). Les minipompes implant?es pendant 6?semaines sont bien tol?r?es, sans rejet ni infection, et n?entravent ni les mouvements ni l?acc?s ? la nourriture (Brial et al., Cell Reports?2020 ; Gut?2021). Induction de l?asthme par administration intranasale d?extrait d?acariens (HDM) (Proc?dures?2&3) : l?administration intranasale est peu invasive et induit une nuisance l?g?re et transitoire. Les administrations aux jours 0, 11, 12 et 13 (Wypych et al., Nature Immunology, 2021) conduisent ? l?installation progressive d?un mod?le d?asthme allergique exp?rimental avec inflammation des voies a?riennes, sans crise aigu? imm?diate, correspondant ? une nuisance mod?r?e. Les animaux peuvent pr?senter une respiration l?g?rement plus rapide ou superficielle mais conservent activit? normale et acc?s ? nourriture et eau. Une surveillance quotidienne (respiration, activit?, poids) est r?alis?e, et toute aggravation s?v?re, notamment perte de poids >15?%, entra?nera une mise ? mort anticip?e.
Devenir
Les 688 animaux de la proc?dure seront euthanasi?s ? la fin de la proc?dure.
Remplacement
Le contr?le du m?tabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux, avec la contribution de produits du microbiote intestinal, en permanence pour informer l'organisme des besoins ?nerg?tiques et contr?ler les flux ?nerg?tiques en fonction des besoins. Il est tr?s difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des mod?les animaux vivants est encore n?cessaire.
Réduction
Pour r?duire le nombre d'animaux, nous avons effectu? un travail en amont qui nous a permis d'identifier les bact?ries, non virulentes et qui peuvent cro?tre dans des conditions compatibles ? la souris, gr?ce ? des analyses in vitro et in silico. Ainsi cette s?lection, effectu?e en partenariat avec l'?quipe de microbiologie, a abouti ? ne retenir que les bact?ries candidates les plus fiables et ce sont elles qui seront test?es in vivo, r?duisant ainsi le nombre d'animaux n?cessaires ? l'?tude. Les ?chantillons pr?lev?s chez chaque animal permettront de g?n?rer un grand nombre d?informations sur des marqueurs mol?culaires. De plus, nous avons estim? la taille des ?chantillons (n=8) permettant une analyse statistique efficace gr?ce aux donn?es de la litt?rature.
Raffinement
Les animaux feront l?objet d?une observation quotidienne durant les phases d?induction exp?rimentale, notamment lors de l?induction de l?asthme allergique. Un suivi du poids corporel sera ensuite r?alis? trois fois par semaine afin de d?tecter pr?cocement tout signe de mal-?tre ou de d?tresse respiratoire. Toute souris atteignant un point limite pr?d?fini, notamment une perte de poids sup?rieure ? 15 % ou des signes respiratoires s?v?res, sera imm?diatement euthanasi?e conform?ment aux proc?dures en vigueur. Afin de r?duire le stress et l?inconfort, l?enrichissement de la flore intestinale par voie rectale sera r?alis? sous anesth?sie l?g?re apr?s induction ? l?isoflurane. Les sondes utilis?es seront souples et de diam?tre adapt? ? la taille de l?animal afin d??viter toute l?sion. L?inoculation par voie orale sera r?alis?e chez l?animal vigile, cette m?thode ?tant mieux tol?r?e et ne n?cessitant qu?une contention de courte dur?e. Lors des tests de tol?rance au glucose, le volume de sang pr?lev? sera strictement limit? au minimum n?cessaire au dosage de l?insuline (5 ?l de plasma), afin de r?duire la contrainte li?e aux pr?l?vements r?p?t?s. Apr?s l?implantation des minipompes osmotiques, les animaux seront surveill?s attentivement et une analg?sie appropri?e (m?loxicam (5 mg/kg)) toutes les 12h pendant 2 jours sera syst?matiquement mise en place pour pr?venir la douleur postop?ratoire. Enfin, les animaux seront pr?alablement habitu?s ? la contention et au gavage avant le d?but des inoculations, afin de limiter le stress li? aux manipulations r?p?t?es.
Choix des espèces
Les mod?les murins pr?sentent de fortes homologies physiologiques et immunologiques avec l?Homme et constituent des outils indispensables pour ?tudier les m?canismes de r?gulation de l?hom?ostasie ?nerg?tique, incluant les m?tabolismes glucidique, lipidique et inflammatoire. La majorit? des lign?es isog?niques de souris d?veloppent une prise de poids, une hyperglyc?mie et une st?atose h?patique en r?ponse ? un r?gime riche en graisses, reproduisant des caract?ristiques cl?s de l?ob?sit? et du diab?te de type 2 humains. Les voies mol?culaires impliqu?es dans ces pathologies sont largement conserv?es entre la souris et l?Homme. La souris est ?galement le mod?le de r?f?rence pour l??tude de l?asthme allergique. L?exposition intranasale ? des allerg?nes tels que les extraits d?acariens permet de reproduire les principales caract?ristiques de l?asthme humain, notamment l?inflammation des voies a?riennes, le recrutement de cellules immunitaires et les r?ponses de type 2. Les m?canismes immunopathologiques sous-jacents sont fortement conserv?s, justifiant l?utilisation de ce mod?le. Nous utiliserons des souris C57BL/6J ?g?es de 2 ? 6 mois. Cet ?ge a ?t? choisi pour plusieurs raisons. Tout d'abord, ? cet ?ge, le microbiote intestinal est relativement stable, ce qui permet de minimiser les variations interindividuelles et de mieux contr?ler les effets de la manipulation exp?rimentale. De plus, les souris ont atteint leur maturit? physiologique, ce qui est essentiel pour ?tudier les m?canismes sous-jacents ? la question scientifique. Enfin, cet ?ge a ?t? largement utilis? au laboratoire dans des ?tudes pr?c?dentes sur le m?me mod?le, en particulier dans des protocoles de perfusion de 4-cresol avec des minipompes osmotiques (Brial et al. Cell Reports 2021), ce qui peut r?duire le nombre de souris en retirant le besoin d?exp?riences exploratoires, et facilite la comparaison de nos r?sultats avec la litt?rature existante.
Impacts d’une exposition chronique périnatale à deux additifs alimentaires inorganiques riches en aluminium sur les fonctions intestinales, immunitaires, métabolique chez la souris de la vie in utéro à l’âge adulte.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
3 504 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Exposées à l'aluminium dès la gestation à travers leur mère, elles subissent des gavages, des prises de sang et, pour une partie, une colite provoquée par un produit chimique entraînant diarrhées sanglantes et perte de poids. Le projet évalue l'effet d'additifs alimentaires sur l'intestin et le risque de maladies chroniques. Le porteur annonce une fourchette large, de 1 200 à 3 504 animaux, sans préciser ce qui fixe le nombre réellement utilisé.
Objectifs
Les études montrent que l’aluminium (Al) peut être neurotoxique et immunotoxique. L’alimentation constitue la principale source d’exposition : si les denrées brutes contiennent de l’Al d’origine naturelle, les aliments ultra‑transformés en apportent les plus fortes quantités via des additifs renfermant de l’Al comme composé principal ou impureté. L’autorité européenne de sécurité des aliments estime que les consommateurs les plus exposés à ces additifs dépassent la dose hebdomadaire tolérable de 1 mg d’Al/kg pc/semaine, tout en soulignant le manque de données toxicologiques spécifiques pour l’Al qu’ils contiennent, notamment en cas d’expositions précoces susceptibles d’engendrer des effets à long terme. Des particules d’Al ont été observées dans le placenta humain et le méconium, démontrant une exposition dès la vie fœtale. Après ingestion, l’Al s’accumule dans divers organes, dont le foie, acteur clé du métabolisme. Au niveau intestinal, des particules d’Al ont été détecté dans la barrière intestinale. Celle‑ci, constituée de l’épithélium, du microbiote et du système immunitaire intestinal, dépend de l’équilibre entre ces trois composantes pour maintenir l’homéostasie. Toute altération d’un de ces acteurs est associée au développement de maladies chroniques, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin et le diabète de type 2. Compte tenu de l’immunotoxicité de l’Al, nous posons l’hypothèse qu’une exposition dès la gestation à des additifs riches en Al pourrait perturber la barrière intestinale et favoriser l’émergence de ces pathologies. Ce projet vise à explorer chez la souris exposée dès la gestation à deux additifs riches en Al, i) la biodistribution de l’Al et ii) les impacts sur les fonctions métaboliques et intestinales des descendants. Des femelles seront exposées à ces additifs via l’alimentation pendant la gestation et la lactation. Après le sevrage, une partie des descendants poursuivra le même régime jusqu’à l’âge adulte afin d’analyser l’impact sur le métabolisme, la barrière intestinale et la susceptibilité à la colite.
Bénéfices attendus
Ce projet chez la souris nous permettra d’approfondir nos connaissances sur l’impact d’une exposition orale chronique à deux additifs contenant de l’Al sur la barrière intestinale et ses conséquences sur le développement de maladies chroniques comme les maladies inflammatoires chronique de l’intestin et le diabète de type 2. Les données obtenues dans ce projet réalisé à des doses d’exposition humaine permettront également d’aider les agences de sécurité alimentaire et les responsables des politiques publiques à formuler des recommandations sur les limites de teneur en Al des additifs alimentaires pour une utilisation sans danger pour la femme enceinte, le nouveau-né, l’enfant et l’adulte.
Procédures
Dans le cadre des mesures d'intolérance au glucose et de la perméabilité intestinale, les animaux recevront une administration orale de glucose ou d'un marqueur de perméabilité intestinale (geste rapide d'environ 15 secondes) et des prélèvements sanguins seront également réalisés au niveau de la queue, après application d'une crème anesthésiante locale (10 secondes/prélèvement). Des prélèvements de fèces seront aussi effectués deux fois par semaine tout au long de l’expérience. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages sans sciure pour permettre de récolter les fèces. Dans le modèle de colite, la dilution à 2% d'un composé chimique pendant 7 jours permettra d'induire progressivement une inflammation intestinale.
Impact sur les animaux
La réalisation des mesures d'intolérance au glucose ou de mesure de perméabilité seront génératrices d'inconfort notamment lié à la mise à jeun des animaux ainsi qu’à l'administration orale par gavage avec un risque possible de fausse route. L’administration de glucose entrainera une hyperglycémie transitoire nécessaire pour évaluer la tolérance au glucose des animaux. Les prélèvements de sang engendreront un stress lié à la contention et la piqure. Une fois les mesures terminées, une légère inflammation des tissus de la zone prélevée pourra se mettre en place. Enfin la procédure visant à provoquer une inflammation intestinale, entrainera une perte de poids plus importante que dans les autres procédures ainsi que des troubles intestinaux, avec apparition de selles molles ou de diarrhée, avec ou non présence de sang. Dans l’ensemble des procédures, les animaux seront exposés à des doses d’additifs correspondant aux niveaux d’exposition humaine pour lesquels aucun effet clinique n’a été rapporté à ce jour. Dans un contexte d’inflammation intestinale, les propriétés immunotoxiques et adjuvantes de l’aluminium laissent supposer que l’exposition aux additifs riches en Al pourrait aggraver la colite avec une perte de poids et une diarrhée plus importante. Enfin le prélèvement de fèces pourra générer un stress lié à l’isolement.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort et des prélèvements seront effectués post mortem pour des analyses biochimiques, histologiques et de biologie moléculaire pour évaluer l’impact d’une exposition orale chronique à deux additifs contenant de l’Al sur la barrière intestinale et ses conséquences sur le développement de maladies chroniques comme les maladies inflammatoires chronique de l’intestin, le diabète.
Remplacement
Les impacts directs des additifs alimentaires riches en aluminium sur l’épithélium intestinal, le microbiote et les cellules immunitaire peuvent être évalués par des approches in vitro ou ex-vivo à l’aide respectivement d’organoïdes intestinaux, de lignées cellulaires immunitaires ou de digesteurs artificiels. Ces approches sont actuellement mises en place pour ce projet et nous permettra d’obtenir des informations sur l’expression des gènes impliqués dans les fonctions de la barrières intestinales ou encore sur la composition et l’activité du microbiote. Toutefois elles ne permettent pas aujourd'hui de reproduire les échanges entre la mère et le fœtus ou la complexité des dialogues microbiote-intestin-foie-système immunitaire, ni même d’évaluer la distribution des particules d’Aluminium dans l’organisme.
Réduction
Nous avons conçu nos expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé à l’aide de test statistiques adapté. Sur l’ensemble du projet, au minimum 1200 animaux et au maximum 3504 animaux seront nécessaires.
Raffinement
Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local sur la queue une heure avant les prélèvements sanguin comme préconisé par le fabricant. Lors du modèle d’inflammation intestinale une grille d'évaluation sera utilisée pour évaluer le degré de l’inflammation avec des points limites spécifiques appliqués. L’accès à l’alimentation et l’eau sera facilité en disposant un aliment hydraté dans une boite de petri directement sur la sciure de la cage. Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance, il sera retiré de l'étude et des soins adaptés pratiqués. Le cas échéant une euthanasie sera pratiquée par le responsable du projet sur les conseils du vétérinaire référent.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote, l’intestin, le foie. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte afin qu'elles soient capables de procréer et les descendants seront utilisés avant la mise bas (fœtus), au sevrage ou à l’âge de 5 mois selon les procédures. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition périnatale ou à long terme sur les fonctions intestinales et métaboliques en prenant en compte un potentiel effet sexe.
Rôle d’une protéine de stress dans la maladie du foie gras non alcoolique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1012 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime gras destiné à provoquer une maladie du foie gras, avec perte de poids et baisse d'activité possibles, et pour 72 d'entre elles une biopsie du bout de la queue. Le projet étudie une protéine de stress exprimée dans le foie malade, comme cible thérapeutique éventuelle. Tous les animaux sont tués pour prélever le foie et en analyser l'inflammation et le métabolisme.
Objectifs
La maladie du foie gras non liée à l’alcool touche de plus en plus de personnes et peut évoluer vers une inflammation et une fibrose du foie, appelée MASH, avec un risque important de carcinome. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine fortement exprimée dans le foie des personnes atteintes par cette maladie métabolique grave. Pour cela, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées afin de déterminer comment cette protéine influence le foie, dont l’inflammation et le renouvellement des cellules immunitaires. Ces travaux permettront de mieux comprendre la maladie et de déterminer si cette protéine peut être un candidat important comme future cible thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la progression de la maladie du foie gras sévère. Les résultats vont contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ralentir ou inverser l’évolution de la maladie.
Procédures
Une injection par jour (environ 5 secondes) pendant 3 jours successifs sur 192 animaux. Pour 72 animaux, un prélèvement unique de 2mm de l’extrémité de la queue (environ 5 secondes x 1 par animal), sera réalisé.
Impact sur les animaux
Une légère douleur de courte durée et de faible intensité peut survenir au moment du prélèvement de la biopsie au niveau de la queue. Les régimes alimentaires utilisés pour provoquer la maladie du foie gras chez les souris peuvent entraîner une perte de poids progressive, une baisse d’activité ou des changements dans le comportement alimentaire. Les animaux seront surveillés chaque jour pour détecter ces signes et des seuils d’alerte ont été définis afin d’intervenir rapidement et d’éviter toute souffrance prolongée. Les injections peuvent provoquer une inflammation temporaire ou un fonctionnement hépatique altéré. Les animaux feront l’objet d’un suivi attentif pendant les 72h suivant l’injection pour détecter toute anomalie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, et seront ensuite utilisés afin de récupérer prélever le foie pour des analyses biochimiques, immunohistochimiques, transcriptionnelles et protéomiques afin d’évaluer l’inflammation, le métabolisme lipidique, l’expression des gènes et des protéines, ainsi que la composition cellulaire.
Remplacement
Les interactions entre les cellules du foie et le système immunitaire sont très complexes. Pour les étudier correctement, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal. La souris est l’espèce la plus adaptée, car son fonctionnement biologique est proche de celui de l’être humain
Réduction
Nous avons calculé le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables tout en utilisant le moins d’animaux possible. Pour garantir que nos conclusions soient pertinentes pour les deux sexes, chaque expérience sera réalisée à la fois sur des mâles et des femelles. Pour chaque souris, plusieurs analyses seront réalisées (sur le métabolisme, les cellules et les tissus), ce qui permet d’obtenir un maximum d’informations sans utiliser d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Les animaux seront observés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de malaise. Une grille d’évaluation permettra au personnel formé de suivre leur état de santé et d’agir si nécessaire. Toute modification visible de leur apparence ou de leur comportement sera notée. Les animaux concernés seront alors suivis chaque jour et peuvent éventuellement recevoir un traitement contre la douleur. Si certains signes de mal-être persistent plus de 48 heures, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien établi pour étudier les maladies du foie, car son organisme fonctionne de manière similaire à celui de l’être humain. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies dont la maladie du foie gras. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes, dont le foie et le système immunitaire sont pleinement développés, afin d’obtenir des résultats fiables.
Recueil de cellules du foie et de la vésicule biliaire pour l’étude de l’homéostasie hépatobiliaire
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Anesthésiées puis perfusées pour prélever le foie, 100 souris sont tuées sans reprise de conscience, dans des procédures classées sans réveil. La perfusion, d'une durée de dix à vingt minutes, sert à isoler les cellules du foie et de la vésicule biliaire chez des souris modifiées pour ne plus produire une protéine appelée EBP50. Le bénéfice avancé se limite à mieux comprendre le rôle de cette protéine. Le porteur indique vouloir comparer les cellules isolées sur animal vivant et sur animal mort, et s'engage à ne procéder qu'après la mort si la qualité s'avère identique.
Objectifs
EBP50 est une protéine très présente dans le foie. À l’échelle des cellules, elle joue un rôle important en contrôlant l’activité de certains transporteurs impliqués dans la sécrétion des substances produites par les cellules épithéliales. Cependant, EBP50 pourrait aussi avoir des fonctions dans d’autres types de cellules du foie qui participent aux défenses immunitaires et à la réparation des tissus. Le rôle d’EBP50 dans ces différents types cellulaires reste encore mal connu. Pour mieux comprendre les fonctions d'EBP50 dans l’ensemble des cellules du foie et de la vésicule biliaire, nous allons isoler les différentes sous-populations cellulaires de ces organes chez des souris génétiquement modifiées pour ne plus exprimer EBP50. Cela nous permettra de mieux cerner la contribution spécifique de cette protéine à la fonction hépatique et biliaire.
Bénéfices attendus
Le bénéfice réside en une meilleure compréhension du rôle de la protéine d’échafaudage EBP50 dans les différents types cellulaires du foie.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et une perfusion du foie afin d’isoler les différents types cellulaires du foie seront réalisés (durée des intervention 10-20 min).
Impact sur les animaux
En condition physiologique, l’absence de la protéine EBP50 n'a pas d'effet délétère sur l'animal, n'induisant pas d'anomalies embryonnaires, les souris à leur naissance sont viables. Les nuisances sont celles liées à l’anesthésie et à la chirurgie: détresse respiratoire, hypothermie profonde et hémorragie.
Devenir
Le prélèvement du foie entier ou pour isolement cellulaire ne permet pas la survie des animaux. Les animaux seront donc tous euthanasiés à la fin de la procédure P1 et P2 pour perfusion ou explantation du foie qui est requis pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
Il existe des lignées de cellules hépatiques murines, mais celles-ci ne sont pas représentatives des populations cellulaires auxquelles nous faisons référence dans ce projet. Aussi ces cellules ne peuvent être étudiées qu'en culture primaire et à partir de plusieurs animaux compte tenu de leur faible proportion dans le foie. La spécificité des cellules en culture primaire est d'être isolé à partir d'un organe entier dans le but de développer des modèles de culture ex vivo représentatif du tissu, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés.
Réduction
Nous avons calculé le nombre minimal d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités entre animaux et entre procédures d’isolement cellulaire, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Nous nous efforcerons d’isoler plusieurs types cellulaires à partir des mêmes animaux. Le test statistique sera Two-Way ANOVA.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été optimisé afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie). Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Afin de rafiner d'avantage la procédure, nous réaliserons des isolements cellulaires par perfusion du foie sur animal vigile (ante-mortem) et non vigile (post-mortem), dans le but de comparer la qualité des cellules isolées. Si la qualité des cellules s'avérait identique en ante-et post-mortem, nous nous engageons à procéder par la suite à des isolements exclusivements post-mortem.
Choix des espèces
Les animaux sont indispensables pour mettre en place nos cultures primaires et éviter les tests sur les animaux. Les souris seront utilisées à l'âge adulte: - 2 - 6 mois. Description de l’identification : Pour les animaux transgéniques qui nécessitent une identification individuelle et un génotypage, le choix de la méthode d'identification est le tatouage aux phalanges avec une biopsie de bout de la queue pour le génotypage selon la DAP générique de l'animalerie numéro #54314.
Evaluation de l’implantation de différentes souches bactériennes au sein du microbiote intestinal murin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Réutilisées ensuite dans d'autres procédures légères ou sans réveil, 40 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est hébergé seul quatre semaines, reçoit un gavage de bactéries porteuses de gènes de résistance aux antibiotiques et, pour la moitié, deux injections sous la peau. Le projet compare des souches bactériennes fluorescentes pour choisir la plus détectable, étape préalable à une future étude sur le stress. Le porteur qualifie la procédure de sans dommages, alors qu'il la classe lui-même en gravité modérée.
Objectifs
La résistance aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique. Elle est à la fois liée à une mauvaise utilisation des antibiotiques mais également à la capacité d’autres facteurs à stimuler les transferts de gènes de résistance entre bactéries, notamment au sein du microbiote intestinal. Notre thématique de recherche vise à évaluer comment un stress chronique pourrait augmenter la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques au sein du microbiote intestinal. Pour cela, nous utilisons un modèle de stress chez des souris à qui nous avons administré des bactéries non pathogènes portant des gènes de résistance aux antibiotiques. Afin d’étudier l’effet du stress sur les transferts génétiques, nous devons utiliser une souche de bactérie qui soit d’une part capable de s’implanter de façon durable dans le microbiote de la souris et d’autre part qui soit facilement détectable et quantifiable par des techniques basées sur des marqueurs fluorescents. L’objectif de ce projet est de comparer deux espèces bactériennes différentes et possédant des marquages fluorescents différents pour le suivi de leur capacité à persister dans le microbiote intestinal de la souris. Nous comparerons ainsi les performances de leur détection selon les molécules fluorescentes utilisées. Ce projet est une étape préliminaire indispensable pour choisir la meilleure souche de bactérie qui permettra de caractériser l’impact du stress chronique sur la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques dans le microbiote intestinal
Bénéfices attendus
Les résultats attendus ici permettront de conclure quant à la colonisation des différentes souches donneuses. Parmi les quatre souches testées, celle qui présentera la meilleure persistance ainsi que la meilleure détection en termes de signal fluorescent sur l’ensemble des 21 jours de protocole sera sélectionnée.
Procédures
L'ensemble des animaux subira un gavage (durée du geste = 30 secondes) de bactéries, et certains d'entre eux (n=20) auront en plus deux injections sous la peau (durée du geste = 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les souris seront hébergées individuellement pendant une durée de 4 semaines. Elles subiront un gavage de bactéries, et certaines d'entre elles auront en plus deux injections sous la peau.
Devenir
Les animaux dans ce projet sont utilisés dans une procédure modérée n'entrainant pas de dommages. Ils seront ré-utilisés en fin de procédure uniquement sur des procédures légères (telles que des travaux pratiques) ou des procédures sans réveil.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier les processus de colonisation dans un milieu complexe tel que l’intestin. En effet la colonisation est liée aux caractéristiques de l’hôte et de la bactérie donneuse de gènes de résistance aux antibiotiques. Les caractéristiques intestinales de l’hôte sont complexes et ne peuvent être à ce jour reproduites sur des modèles alternatifs in vitro ou informatiques. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est donc pas possible dans ce contexte.
Réduction
L'effectif total des animaux de ce projet a été déterminé par une analyse statistique permettant la réduction maximale du nombre de sujets tout en garantissant une fiabilité forte des résultats.
Raffinement
Les cages seront munies d’éléments d’enrichissement (buchettes, sizzlenet), permettant d’offrir aux animaux la possibilité d’évoluer en espaces clos, type de milieu préférentiel chez des rongeurs. L’état des animaux sera évalué quotidiennement par observation de tout comportement pouvant suggérer la présence de mal être chez les animaux de cette étude. Des points limites adaptés ont été définis.
Choix des espèces
Les expériences précédentes du laboratoire sur le transfert de gènes d’une bactérie donneuse au sein du microbiote intestinal ont été optimisées sur les souris mâles de 8 semaines. De plus ces souris sont majoritairement utilisées et caractérisées dans les études liées au microbiote. En particulier, la dose de bactéries donneuse à administrer a été précédemment déterminée dans des souris.
Impact du microbiote intestinal sur le comportement social chez la souris : identification des mécanismes impliqués
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Livrées à trois semaines, les souris reçoivent une greffe de microbiote fécal par gavage jusqu'à quatre fois par jour, des injections d'anticorps, six prélèvements de sang à la queue et, pour une partie, une section chirurgicale du nerf vague reliant l'intestin au cerveau. 1 734 souris vont ainsi être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le projet cherche à savoir si le microbiote intestinal influence les interactions sociales et l'autisme, en transférant à des souris saines la flore de donneurs au comportement social altéré. Le porteur évoque des tests évaluant le "phénotype social", dont un maintien de 72 heures, sans préciser lesquels, et conclut que la souris est un "modèle de choix" faute d'alternative reproduisant la complexité de l'axe intestin-cerveau.
Objectifs
De nombreuses études récentes montrent que les micro-organismes vivant dans l’intestin, appelés microbiote intestinal, peuvent influencer le comportement via une communication entre l’intestin et le cerveau. Chez la souris, il a été démontré que le transfert de microbiote intestinal d’un animal à un autre, appelé transfert de matière fécale (FMT), permet non seulement de transmettre les bactéries intestinales du donneur, mais aussi certains traits comportementaux. Par exemple, des souris recevant le microbiote de donneurs présentant des troubles des interactions sociales développent à leur tour des difficultés à interagir avec leurs congénères. Des résultats similaires ont été observés lorsque le microbiote provient de patients atteints de troubles du spectre de l’autisme. D’autres travaux ont montré que l’exposition prolongée à une substance produite par certaines bactéries intestinales, le p-crésol, peut modifier la composition du microbiote et entraîner des altérations du comportement social chez la souris. Le microbiote de ces souris suffit ensuite à transmettre ces troubles comportementaux à des souris saines. Ces observations suggèrent que le microbiote intestinal joue un rôle important dans le comportement social. Toutefois, les mécanismes précis reliant l’intestin au cerveau restent mal compris. Plusieurs voies de communication sont envisagées, notamment le système immunitaire, certaines substances produites par les bactéries, ou encore une voie nerveuse directe reliant l’intestin au cerveau, appelée nerf vague. Les objectifs de ce projet sont : 1. Disséquer le rôle de ces voies de communications dans les effets du microbiote sur les comportements sociaux 2. Identifier les cibles thérapeutiques potentielles pour les troubles des interactions sociales.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal influence les interactions sociales et les comportements associés à l’autisme. Les résultats attendus offriront de nouveaux éclairages sur l’axe microbiote-intestin-cerveau, en identifiant des cibles pouvant moduler les symptômes comportementaux. À terme, cette recherche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre l’autisme ou les troubles du comportement.
Procédures
•Anesthésie à l’isoflurane pour identification: durée 10 min ; fréquence 1 fois dans la vie de l'animal • Injection d’anticorps (250 μL) : durée 10s ; fréquence deux fois dans la vie de l’animal. •Test de comportements évaluant le phénotype social: durée 10min et 72h en fonction des tests ; 3 tests de 10 min + 1 test de 72h/animal, le tout une fois dans la vie de l’animal• Prélèvement de sang de 20μL après incision de l’extrémité de la queue : durée 10min ; fréquence 6 fois dans la vie de l’animal. • Gavage : durée 5s ; fréquence allant d’une seule fois par jour pendant 4 jours à 4 fois par jour pendant 1 jour en fonction de la procédure. •Vagotomie sous anesthésie générale: durée 1h ; fréquence une fois dans la vie de l’animal.
Impact sur les animaux
Transfert de microbiote fécal (FMT) par gavage oral : Cette procédure peut engendrer un stress lié à la contention et au passage de la sonde, parfois une légère irritation buccale ou œsophagienne. Le gavage répété peut générer une perte de poids ou des troubles digestifs, selon la composition du microbiote transplanté. Transfert de microbiote fécal (FMT) par gavage oral (durée 5 sec): Cette procédure peut engendrer un stress lié à la contention et au passage de la sonde, parfois une légère irritation buccale ou œsophagienne. Le gavage répété peut générer une perte de poids ou des troubles digestifs, selon la composition du microbiote transplanté. Administration d’anticorps (durée 10 sec): Elle expose à un inconfort transitoire lors de l’injection, parfois à une douleur légère ou à un risque d’irritation locale ; des réactions inflammatoires ou allergiques sont rares. Prélèvements de sang dans la veine de la queue (durée 10 min): Risques mineurs tels que douleur à la ponction, formation d’hématome ou saignement local. Le prélèvement peut engendrer un stress lié à la contention. L’identification par puce RFID (durée 10 sec) sous anesthésie générale peut provoquer une légère hypothermie. Analyse comportementale (3 tests de 10 min + 1 test de 72h/ animal): Peut engendrer un stress transitoire lié à l’isolement ou aux manipulations, généralement modéré et temporaire. Les souris génétiquement altérées peuvent présenter une susceptibilité accrue aux infections opportunistes, associée à un risque augmenté de morbidité en cas de contamination. La vagotomie bilatérale sous anesthésie générale peut provoquer douleur et inconfort post-opératoires.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement d’organes nécessaires à la réalisation d’analyses biologiques. Ces analyses sont indispensables pour approfondir la compréhension des mécanismes impliqués dans notre contexte d’étude.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal agit sur le comportement social. Ce projet nécessite donc l’utilisation d’animaux. En effet, les alternatives non animales comme les expériences in-vitro ou les modélisations informatiques (in silico) ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité du microbiote ni les interactions avec le système digestif, le système immunitaire et le système nerveux ainsi que l’impact sur le comportement social. Par ailleurs, les études de perte de fonction ne peuvent être menées que chez un animal vivant.
Réduction
Pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, nous utiliserons des tailles d’échantillon garantissant une puissance statistique suffisante pour l’analyse des résultats comportementaux, le nombre de souris ayant été réduit autant que possible. Des calculs de puissance réalisés avec un logiciel dédié (GPower) ont permis de déterminer les effectifs de groupe nécessaires pour observer des effets de taille moyenne avec les tests statistiques adéquats : en cas de distribution normale, nous utiliserons des tests paramétriques (t-test pour comparer 2 échantillons, ANOVA pour comparer n échantillons). En cas de distribution non normale, nous utiliserons des tests non-paramétriques (tests de Mann-Whitney ou de Kruskall Wallis), même si ceux-ci sont moins sensibles. Les résultats seront analysés avec le logiciel GraphPad Prism. Au total, 1734 animaux sont requis pour l’ensemble du projet, ce chiffre ayant été réduit au strict nécessaire en respectant les principes de la règle des 3R. Toutes les étapes expérimentales seront réalisées dans un ordre prédéfini, chaque intervention dépendant des résultats obtenus précédemment. Ainsi, toute procédure non pertinente au vu des données déjà recueillies au cours de procédures précédentes ne sera pas réalisée.
Raffinement
Plusieurs stratégies de raffinement seront mises en œuvre: • Utilisation systématique de l’analgésie pour toutes les procédures invasives, afin de réduire la douleur. • Application de techniques de manipulation respectueuses et de contention douce pour limiter le stress avant, pendant et après les interventions. • Administration d’un volume réduit pour minimiser l’impact de l’injection. • Prélèvement d’un volume très faible de sang• Une phase d’habituation aux dispositifs expérimentaux précèdera les tests comportementaux et ceux-ci seront espacés de 2 jours pour favoriser la récupération des animaux. • Le réveil post-opératoire après la chirurgie de vagotomie se fera dans une chambre de réveil chauffée spécifiquement dédiée. •Surveillance attentive des souris pour détecter rapidement tout signe de douleur, de détresse ou de complication, et intervenir avec euthanasie de l’animal si atteinte de point limite conformément aux recommandations si nécessaire. •La surveillance sera biquotidienne et renforcée pour les souris génétiquement altérées et ces souris seront hébergées dans une armoire d’animalerie ventilée permettant un environnement contrôlé et une atténuation de l’expression éventuelle du phénotype dommageable. Afin de limiter le risque infectieux chez ces souris, l’ensemble des équipements utilisés lors des tests comportementaux (arènes, objets, surfaces de contact) sera nettoyé à l’éthanol 70% entre chaque animal ou chaque groupe, selon les procédures en vigueur.
Choix des espèces
L’autisme entraîne d’importants troubles du comportement, et ces altérations peuvent être reproduites chez le rongeur à l’aide de batteries de tests comportementaux adaptés. La souris constitue un modèle de choix, car son système nerveux et le développement de son cerveau présentent de nombreuses similitudes avec ceux de l’humain, contrairement à d’autres espèces. Par ailleurs, les études de perte de fonction ne peuvent être menées que chez un animal vivant, et la souris offre un excellent compromis entre complexité biologique et faisabilité expérimentale. Ce choix de modèle permet donc d’investiguer les mécanismes impliqués dans les effets du microbiote intestinal sur le comportement de manière pertinente et dans un modèle bien caractérisé. Les souris arrivent au laboratoire à l’âge de 3 semaines (21 jours d’âge). Elles restent d’abord 1 semaine sur place pour s’habituer à leur nouvel environnement. Les expériences commencent lorsqu’elles ont 4 semaines (28 jours d’âge). À cet âge, nous réalisons un transfert de microbiote intestinal (c’est-à-dire que nous leur administrons des bactéries dans leur intestin). Leur comportement sera ensuite étudié lorsqu’elles seront adultes, à 8 semaines d’âge (56 jours d’âge). Certaines souris subissent une intervention chirurgicale qui consiste à sectionner une partie du nerf (le nerf vague) qui relie l’intestin au cerveau. Dans ce cas, les souris arrivent à l’âge de 5 semaines (35 jours d’âge) puis sont utilisées dès la semaine suivante après 1 semaine d’habituation au nouvel environnement. La chirurgie sous anesthésie générale sera réalisée sur la souris âgée de 45 jours. Une période de repos de 2 semaines après la chirurgie permettra une récupération optimale. Après récupération, les souris subiront un transfert de microbiote intestinal à l’âge de 8-9 semaines (56-63 jours d’âge). Trois semaines après le transfert de microbiote intestinal, le comportement sera analysé (77-84 jours d’âge).
Exposition à long terme de deux additifs alimentaires riches en aluminium, le carbonate de calcium E170 et le pigment nacré d’aluminosilicate de potassium (INS176ii) sur les fonctions immunitaires et métabolique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Nourries pendant environ trois mois avec des additifs riches en aluminium, le carbonate de calcium E170 et un pigment nacré d'aluminosilicate de potassium, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Les gestes qu'elles subissent restent décrits en termes vagues, des "mesures réalisées ponctuellement" et des "prélèvements biologiques" effectués "de manière encadrée", sans que le texte précise lesquels ni à quelle fréquence. Une étape destinée à induire une réponse inflammatoire est annoncée avec une baisse de poids "plus marquée", elle aussi sans détail. Les bénéfices annoncés visent l'évaluation des risques et l'aide aux politiques publiques, quand le protocole imposé aux souris reste, lui, sans description précise.
Objectifs
Différentes études ont montré que l’aluminium peut avoir des effets délétères sur le système nerveux et le système immunitaire. La population générale y est principalement exposée par l’alimentation, en raison de sa présence naturelle dans l’environnement mais aussi de son utilisation dans de nombreux produits du quotidien. L’aluminium est notamment présent dans certains aliments transformés, du fait de son utilisation lors de leur fabrication ou de leur conditionnement. Étant donné que l’alimentation constitue la principale voie d’exposition à l’aluminium, ce projet vise à étudier le devenir de substances alimentaires riches en aluminium, administrées seules ou en combinaison. Nous chercherons à déterminer si une exposition à l’âge adulte à ces substances peut favoriser l’apparition d’altérations de la barrière intestinale et de dysfonctionnements du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale sur l’exposition à l’aluminium de sources alimentaires afin d'aider les politiques publiques. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin de réguler l'exposition humaine.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention nutritionnelle correspondant à une exposition prolongée à certaines substances alimentaires intégrées à leur alimentation, sur une période d’environ trois mois à l’âge adulte. Au cours de l’étude, différents paramètres liés au métabolisme et au fonctionnement intestinal seront évalués à l’aide de mesures réalisées ponctuellement. Des prélèvements biologiques seront effectués de manière encadrée afin de permettre ces analyses, dans des conditions visant à limiter au maximum l’inconfort et le stress des animaux. Par ailleurs, des échantillons fécaux seront collectés régulièrement tout au long de l’expérience afin de suivre l’évolution des paramètres d’intérêt.
Impact sur les animaux
La mise en œuvre de l’étude pourra entraîner un stress ou un inconfort modéré chez les animaux. Celui-ci sera limité par une habituation régulière aux manipulations et par un suivi attentif tout au long de l’expérience. Certaines évaluations pourront occasionner un inconfort transitoire, notamment lors de l’administration de substances ou de la réalisation de prélèvements biologiques. Des mesures adaptées seront systématiquement mises en place afin de limiter la douleur associée à ces gestes. Enfin, une des étapes de l’étude visant à induire une réponse inflammatoire légère pourra s’accompagner d’une diminution du poids corporel plus marquée que lors des autres phases, qui fera l’objet d’une surveillance renforcée.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer différents prélèvements de tissus nécessaires pour l'étude.
Remplacement
Les modèles alternatifs ne permettent pas aujourd'hui d’étudier la répartition des particules d’Aluminium dans l’organisme ni de recréer la complexité des dialogues Microbiote-intestin -foie -cerveau.
Réduction
Nous avons conçu nos expériences pour répondre à nos questions scientifiques tout en utilisant le moins d’animaux possible. Le nombre d’animaux a été choisi avec soin afin d’obtenir des résultats fiables, sans en utiliser plus que nécessaire. D’après nos études précédentes, le nombre le plus adapté est de 10 mâles et 10 femelles (et donc un total de 20 animaux par groupe). Les résultats obtenus seront ensuite analysés à l’aide de méthodes scientifiques reconnues, afin de vérifier que les différences observées sont réelles et non dues au hasard.
Raffinement
Durant l'étude l'angoisse sera atténuée par des manipulations hebdomadaires lors du suivi de poids ou d'observations. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local sur la queue avant les prélèvements sanguin. L’identification des animaux à l’aide d’un poinçon d’oreille permettra de réaliser un suivi individuel (observations, contrôles de prise de poids des animaux). Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance, il sera retiré de l'étude et des soins adaptés pratiqués. Le cas échéant une euthanasie sera pratiquée.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote, l’intestin et le foie. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte (6 semaines) afin d’être mature sexuellement. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition à l’âge adulte sur le développement des fonctions intestinales, métaboliques et immunitaires.
Étude du renouvellement intestinal au cours du développement et en conditions inflammatoires chez la souris – MODIFICATION
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Séparés de leur mère, gavés de lait artificiel quatre fois par jour et exposés à un manque d'oxygène dix minutes trois fois par jour pendant trois jours, des souriceaux de huit jours comptent parmi les 699 souris de ce projet, toutes tuées, dont 371 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les adultes reçoivent pendant cinq jours, sur trois cycles, un composé dans l'eau de boisson sucrée qui provoque une inflammation intestinale, une perte de poids et des diarrhées, ou un gavage unique après quatre heures de jeûne. Le porteur qualifie le gavage d'inconfortable mais non douloureux, et les épisodes d'hypoxie de sources de stress bien que courts. L'objectif reste fondamental, comprendre le rôle des cellules souches dans le renouvellement de l'intestin, les applications pour les patients étant qualifiées de potentielles.
Objectifs
La régénération et le renouvellement tissulaire sont orchestrés par les cellules souches, qui se différencient et s'auto-renouvellent. L'équilibre entre l'auto-renouvellement, la prolifération et la différentiation dépend du microenvironnement des cellules souches. Ici, nous utilisons un tissu à fort renouvellement, l'intestin et ses cellules souches résidentes, comme modèle pour étudier la régénération.
Bénéfices attendus
Les découvertes issues de ce projet de recherche fera progresser significativement notre compréhension de la biologie intestinale et d'offrir des applications translationnelles potentielles pour améliorer les résultats pour les patients dans divers contextes médicaux.
Procédures
Les souris seront soumises à un traitement dans l'eau de boisson sucrée pendant 5 jours sur 3 cycles, une seule courte injection d'un composé chimique pendant 15 secondes ou un seul gavage d'une minute d'un composé chimique après un jeun de 4 heures. Une petite quantité de sang sera prélevée quelques minutes avant la fin de la procédure sous analgésie et anesthésie générale Les jeunes souris seront nourries de lait artificiel par gavage 4 fois par jour (1 minute) pendant 3 jours consécutifs et exposées à de l'hypoxie (10 min) 3 fois par jour pendant 3 jours.
Impact sur les animaux
La séparation de la mère et les épisodes d'hypoxie bien que courts peuvent être source de stress pour les souris. Le gavage par sonde adaptée à la taille de l'animal est considéré comme inconfortable mais non douloureux. Les souris seront soumises à un protocole induisant une légère perte de poids et des potentielles diarrhées. L'injection peut engendrer une douleur modérée mais locale. Le sang sera prélevé sous analgésie et anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d'intestin et analyses dans le cadre de notre étude.
Remplacement
L'intestin est un organe complexe impliquant de nombreux composants : bactéries, circulation sanguine et lymphatique, neurones, muscles et système immunitaire. Le but de ce projet est d'identifier le rôle des cellules souches dans l'homéostasie, le développement et la régénaration de l’intestin. Réduire le projet à un système in vitro pourrait nous priver de découvertes pertinentes liées à la complexité des interactions systémique présentes dans l'intestin et il est donc essentiel d'étudier les cellules dans leurs conditions physiologiques.
Réduction
Nous utilisons autant que possible des animaux de mêmes portées afin de limiter la variabilité. Chaque souris fera l'objet de multiples analyses et les tissus prélevés seront exploités pour plusieurs types d'expériences, maximisant ainsi les données obtenues par animal. Nous utilisons des modèles cellulaire qui permettent de reproduire partiellement l'intestin en culture. Enfin, des outils statistiques seront systématiquement appliqués pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaire et assurer la signification statistique de nos résultats.
Raffinement
L'introduction par voie orale de composé chimique ou de lait est fait avec une sonde et un volume adapté à la taille de l'animal. Les injections sont faites avec une aiguille adaptée à la taille de l'animal. Le sang sera prélevé sous analgésie et anesthésie générale. Pour limiter la perte de poids, les souris ont à disposition de la nourriture humidifiées pendant toute la durée du traitement. Les jeunes souris sont gardées dans un incubateur pour maintenir leur température corporelle à 37°C. Les épisodes d'hypoxie sont courts et limités au minimum et se font en présence de poches de gel chaudes. Les animaux sont gardés en groupe dans un environnement enrichi, surveillés et pesés tous les jours et manipulés par des zootechniciens et manipulateurs formés. Une grille de score pour évaluer l'état général des souris est mise en place et en cas d'atteinte de points limites irréversible, l'animal sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
La souris de laboratoire est un modèle largement reconnu et particulièrement avantageux pour nos recherches car des protocoles mimant la régénération tissulaire et les maladies inflammatoires de l'intestin ont été établis et validés. Enfin, la grande similarité génétique, métabolique et immunitaire de la souris avec l'Homme, notamment au niveau de son système intestinal, en fait un excellent modèle translationnel, promettant des avancées inestimables pour la compréhension des fonctions intestinales en santé comme en maladie. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 14 semaines pour étudier les maladies chroniques intestinales affectant les adultes et des jeunes souris de 8 jours pour étudier les maladies inflammatoires touchant les jeunes enfants.
Mécanismes d’adaptation pour améliorer la résilience de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) dans le contexte du changement climatique
- Enseignement supérieur
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rendre l'élevage de truites plus résistant aux canicules : 270 truites arc-en-ciel juvéniles sont soumises pendant 18 jours à un manque d'oxygène, à des températures proches de leur limite physiologique, ou aux deux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont ensuite anesthésiées puis tuées par surdosage de tricaïne pour prélever leur système digestif. Le porteur annonce une léthargie initiale et une baisse de prise alimentaire de 15 à 20 %, qu'il présente comme temporaire, et n'attend aucune mortalité. Il justifie ces conditions en indiquant qu'elles correspondent à ce que les poissons rencontrent dans le milieu naturel, et rappelle que la truite arc-en-ciel est l'espèce piscicole la plus produite en France.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer les mécanismes de réponse cellulaire du système digestif de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) soumis à un stress thermique et à une diminution de la disponibilité en oxygène dans le milieu (hypoxie).
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est la production de données expérimentales solides sur les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la réponse du système digestif de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) soumise à un stress thermique et hypoxique. Ces connaissances apporteront des éléments essentiels pour identifier les cibles physiologiques et moléculaires clés permettant des interventions nutritionnelles adaptées, nécessaires pour renforcer la résilience des poissons face aux épisodes de canicule, dont la fréquence augmente avec le changement climatique.
Procédures
Les animaux seront soumis, pendant une durée de 18 jours, à des contraintes spécifiques, en fonction du groupe de traitement : • Traitement 2 : exposition à des conditions hypoxiques. • Traitement 3 : exposition à des contraintes de température. • Traitement 4 : exposition à des contraintes combinées de température et d’hypoxie. • Traitement 5 : exposition à des contraintes de température. • Traitement 6 : exposition à des contraintes combinées de température et d’hypoxie. À la fin de la période expérimentale, les poissons seront capturés par du personnel formé et expérimenté, anesthésiés dans un bain de tricaïne méthanesulfonate, puis euthanasiés par surdosage de tricaïne.
Impact sur les animaux
Le stress thermique et hypoxique auquel les animaux seront soumis est susceptible d’induire une léthargie au début, le temps que les poissons s'habituent, mais cette gêne sera temporaire. Par ailleurs, la prise alimentaire diminuera, mais cette réduction sera faible (de 15 à 20% retour d’expérience sur des expérimentations similaires), car l'impact global reste limité en raison de l'exposition à des températures proches de la limite physiologique des poissons. Aucune mortalité n’est attendue, du moins pas en conséquence de la manipulation des animaux, des conditions expérimentales ou des modifications physiques de leur environnement.
Devenir
Tous les poissons impliqués (270 animaux) seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour les analyses biologiques et biochimiques essentielles aux objectifs du projet.
Remplacement
L’objectif de cette étude est d’examiner les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la réponse digestive de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) lorsqu’elle est exposée à un stress thermique et hypoxique. Ces processus physiologiques reposent sur des interactions complexes et intégrées entre plusieurs tissus du système digestif, qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des approches in vitro (culture cellulaire) ou in silico (modélisation informatique). Par conséquent, le recours à des animaux vivants est indispensable afin d’obtenir des données précises et biologiquement pertinentes sur les impacts physiologiques de ces facteurs de stress environnementaux dans des conditions expérimentales contrôlées.
Réduction
Le plan expérimental a été soigneusement conçu pour utiliser un nombre minimal de poissons, tout en garantissant la rigueur scientifique et la reproductibilité des résultats. L’étude comprend six traitements (un témoin et cinq conditions de stress), chacun répliqué dans trois bacs, soit un total de 18 bacs, avec 15 truites arc-en-ciel juvéniles par bac, pour un total de 270 poissons. Cette taille d’échantillon et ce niveau de réplication ont été déterminés afin de fournir une puissance statistique suffisante pour détecter les effets des traitements sur les réponses moléculaires, tout en évitant une surreprésentation inutile. Les poissons seront répartis aléatoirement dans les bacs et acclimatés avant le début des traitements expérimentaux, afin de minimiser la variabilité et de maximiser les informations obtenues de chaque individu. De plus, le choix des conditions de stress et de la réplication des bacs a été guidé par l’expérience préalable et la littérature scientifique, dans le but de réduire le nombre d’animaux tout en maintenant la robustesse et la fiabilité des résultats.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, plusieurs mesures seront mises en œuvre afin d’améliorer le bien-être animal et de minimiser la douleur, la souffrance et le stress : • Les conditions d’hébergement seront optimisées en termes de nutrition, densité de peuplement, qualité de l’eau et photopériode. • Les stress thermiques et hypoxiques appliqués dans l’étude correspondent à des conditions naturellement rencontrées par les animaux dans le milieu naturel, ce qui limite l’introduction de facteurs de stress artificiels. • Une surveillance continue des animaux sera assurée afin de détecter précocement tout signe de détresse et de permettre la mise en place rapide de mesures correctives. Ces mesures garantissent que les procédures expérimentales sont conduites conformément aux principes de raffinement, en priorisant le bien-être des animaux tout en maintenant la validité scientifique de l’étude. Le bien-être animal sera évalué quotidiennement à l’aide d’une grille de scoring basée sur des points limites prédéfinis. Les critères pris en compte incluront : comportementaux : prostration ou isolement prolongé, anomalies de nage, diminution marquée de la prise alimentaire, positions inhabituelles dans la colonne d’eau ; physiques : altérations de l’état corporel, lésions cutanées, signes de pathologies ou dégradation de l’aspect général. En cas d’atteinte d’un seuil critique (score ≥3 pour l’un des critères), l’animal concerné sera euthanasié sans délai, conformément aux procédures réglementaires en vigueur, afin de prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est l’espèce piscicole la plus produite en France et présente une importance agronomique et commerciale majeure. Cependant, cette espèce est de plus en plus confrontée à la fréquence et à l’intensité croissantes des vagues de chaleur liées au changement climatique. Ces épisodes thermiques peuvent avoir des effets sévères sur sa physiologie, sa croissance et sa survie. Ainsi, l’identification de stratégies d’atténuation efficaces constitue une priorité pour assurer à la fois la durabilité de l’aquaculture et le bien-être des animaux. Pour développer de telles stratégies, il est essentiel de comprendre comment la température et la disponibilité en oxygène influencent le métabolisme cellulaire du système digestif de la truite arc-en-ciel. Les poissons auront un poids moyen compris entre 20 et 40 g au début de l’expérience, ce qui indique qu’ils seront au stade juvénile. Cette taille permettra de réaliser les expériences dans des conditions optimales au sein de l’unité expérimentale, tout en étant suffisamment grande pour prélever des échantillons de tissus digestifs en quantité adéquate pour les différentes analyses moléculaires ultérieures.