Système gastrointestinal

115 souris femelles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tumeurs. Chaque animal reçoit sous anesthésie deux greffes de cellules cancéreuses humaines du foie, une par flanc, puis des injections de molécules empêchant les cellules tumorales de réparer leur ADN. Le projet reste préliminaire et emploie des billes non radioactives, en amont d'une étude ultérieure avec les billes radioactives de la radiothérapie interne. Les bénéfices annoncés pour les patients restent suspendus à ces résultats et à un éventuel passage chez l'être humain.

Objectifs

Aujourd’hui, le cancer du foie est le troisième cancer qui cause le plus de décès. Un des traitements utilisés s’appelle la radiothérapie interne. Il consiste à envoyer de toutes petites billes dans le corps, qui contiennent une substance radioactive. Ces billes détruisent spécifiquement les cellules du cancer en abîmant leur ADN. Ce traitement fonctionne souvent mieux que d’autres, surtout quand le cancer est avancé. Mais il ne marche pas toujours : environ 3 personnes sur 10 ont un cancer qui résiste à ce traitement. Cela peut être parce que les cellules arrivent à réparer leur ADN. Le but de ce projet est de tester de nouvelles substances qui empêchent les cellules de réparer leur ADN, pour rendre le traitement plus efficace. Pour cela, nous implanterons des cellules de cancer du foie sous la peau des souris pour former une tumeur, afin de tester ces nouvelles substances pour voir si elles ralentissent la croissance du cancer. Ces tests sont des manipulations préliminaires, nous utiliserons des billes non radioactives pour comprendre leurs effets associés aux substances avant d’utiliser les vraies billes (lors d’une prochaine étude).

Bénéfices attendus

Nous avons déjà obtenu de bons résultats en laboratoire, sur des cellules tumorales cultivées sur des plaques en plastique en combinant ces billes avec des substances qui empêchent les cellules de réparer leur ADN. Maintenant, nous voulons tester cela chez la souris. Pour cela, nous injecterons des cellules cancéreuses sous la peau des souris pour créer une tumeur. Les cellules tumorales cultivées sur du plastique sont plus simples à utiliser, mais ça ne représente pas vraiment ce qui se passe dans un vrai corps. Par exemple, les cellules poussent à plat et ne sont pas en contact avec le reste d’un organisme. Avec les souris, c’est plus proche de la réalité, car les cellules vivent dans un vrai corps. Cela permet de mieux tester les traitements. Si les résultats sont bons et que les tumeurs diminuent, cela pourrait aider à améliorer les traitements chez les humains et à traiter plus de personnes.

Procédures

On réalise deux injections sous la peau de souris femelles adultes sous anesthésie (1 injection sur chaque flanc de l'animal), de cellules cancéreuses humaines de foie. Les cellules vont s’implanter à l’endroit de l’injection et commencer à croître. Cette injection dure moins de 30 secondes. La taille des tumeurs va être suivie par mesure régulière à l'aide d'un pied à coulisse électronique (appareil permettant de mesurer le diamètre de la tumeur de l’extérieur de la souris). L’ensemble des souris seront alors évaluées 3 fois par semaine quant à leur état général, leur poids et la taille des tumeurs (les lundis, mercredis et vendredis). Ensuite, une injection dans le ventre est effectuée afin d’administrer les molécules qui empêchent la réparation de l’ADN. Cette injection dure également moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

(1) Un stress physique serait une nuisance induite par l’anesthésie lors de l’injection des cellules tumorales humaines sous la peau des souris et lors de l’injection des billes non radioactives et/ou des molécules qui empêchent la réparation de l’ADN dans l’abdomen des animaux, (2) Une douleur modérée peut être engendrée par la croissance des tumeurs sous-cutanées. Les animaux ne subissent pas d'autres stress ou douleurs dans ce projet.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les tissus cancéreux seront prélevés pour analyses post mortem.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte tenu des caractéristiques offertes par ce modèle (développement de vaisseaux entre la tumeur et le reste d’un organisme vivant, mode d’injection des molécules) impossible à reproduire avec des cellules en culture, nous obligeant à travailler à l'échelle d'un organisme entier.

Réduction

Dans le but de répondre à la loi des 3R (Réduire), nous avons sélectionné dans cette étude préliminaire, deux types de cellules tumorales grâce aux résultats obtenus sur les cellules tumorales cultivées dans des boîtes en plastique. Nous avons également déterminé le nombre d'animaux nécessaire et suffisant dans chaque sous-groupe pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Dans le but de réduire le nombre d'animaux par groupe, chaque souris sera implantée de cellules tumorales issues d’un type de cellules tumorales commercialisées sur chaque flanc (droit et gauche) de la souris.

Raffinement

Les souris vivent par groupes de 5 dans des cages adaptées à leur taille. Leurs cages ont un système spécial avec de l’air propre pour éviter qu’ils attrapent des microbes. Leur nourriture est aussi protégée pour rester propre. Les souris seront observées 3 fois par semaine (le lundi, le mercredi et le vendredi) pour vérifier qu’elles vont bien, en regardant leur apparence, leur masse et leur comportement. 4 fois par an, on vérifie aussi que leur environnement est sain et sans microbes. Pendant l’expérience, on leur donne des objets comme du coton pour faire leur nid et des tubes colorés. Ces objets enrichissent leur milieu en les aidant à se sentir bien et permettent aussi de les manipuler sans induire un stress inutile. Lors d’une manipulation, les animaux sont endormis pour ne pas avoir mal et pour éviter qu’ils stressent. Si un animal a mal ensuite, on peut lui donner un médicament (analgésique) pour le soulager. Les chercheurs surveillent attentivement les animaux pour repérer rapidement s’ils ne vont pas bien, grâce à une liste de signes précis. Enfin, les animaux sont manipulés régulièrement pour qu’ils s’habituent au contact humain et soient moins stressés.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour nos expériences. Cela permet de mettre des cellules cancéreuses humaines sous la peau de la souris sans que son corps ne les rejette. La souris est aussi pratique car elle est petite et les tumeurs y grandissent rapidement. Travailler seulement avec des cellules cultivées sur des plaques de plastique ne suffit pas, car cela ne montre pas comment une tumeur fonctionne et répond à un traitement dans un organisme vivant. Avec la souris, on peut observer la tumeur dans un environnement vivant, ce qui est plus réaliste. Nous utiliserons des souris femelles adultes âgées de 6 semaines. Elles sont déjà assez grandes pour commencer les expériences et cela permet qu’elles restent au même stade pendant toute l’étude. Après leur arrivée, les souris s’adaptent à leur milieu pendant 4 jours pour s’habituer à leur nouvel environnement. Ensuite, nous leur injecterons des cellules cancéreuses, nous suivrons la croissance de la tumeur, puis nous testerons les traitements.

3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réparties sur cinq ans, elles subissent jusqu'à trois prélèvements sanguins, une mise à jeun de seize heures puis un gavage quotidien de calcium pendant un mois, pour étudier le rôle de plusieurs gènes dans le métabolisme phosphocalcique et l'effet d'un composé. Les retombées annoncées pour les patients restent limitées à la compréhension des mécanismes, sans application clinique décrite. Le porteur affirme que les systèmes cellulaires ne reproduisent pas la complexité de l'homéostasie calcique dans un "organisme entier" et conclut à la nécessité de la souris.

Objectifs

Notre étude longitudinale vise à caractériser l’incidence de certains facteurs majeurs impliqués dans le métabolisme calcique, en se concentrant spécifiquement sur leurs effets au niveau de l’intestin, des reins et du sang, afin d’évaluer leur impact sur ce métabolisme et sur l’homéostasie phosphocalcique durant différents stades de développement.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de mieux comprendre l’impact des gênes étudiés dans le métabolisme du calcium et l’efficacité du composé X sur ces troubles.

Procédures

Afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur les animaux à chaque point de la cinétique, un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement, puis injection de sérum physiologique en sous-cutanée) par souris. 360 souris au total dans la 1ere procédure expérimentale, seront gavées une fois, avec une solution de calcium diluée dans de l'eau de boisson, et, dans la seconde procédure expérimentale, une administration quotidienne par gavage (30 secondes par administration) pendant 1 mois. Tous les 2 jours, un suivi du poids corporel (30 secondes par souris) est réalisé. Ces gestes seront réalisés par des manipulateurs expérimentés et compétents, si malgré tout un animal présente des complications expérimentales (extrêmement rare) des signes de souffrance, il sera sorti du groupe et mis à mort.

Impact sur les animaux

Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée. Les animaux ayant une inactivation au niveau de l’intestin, un dysfonctionnement digestif pouvant entrainer des diarrhées. Concernant les gestes subis par les animaux : Les animaux subiront trois prélèvements sanguins, chacun suivi d’une légère compression pour stopper le saignement. Ce geste est effectué par un personnel compétent et formé mais dans de rares cas peuvent conduire à une infection de la zone d'administration. Un groupe de 360 souris subiront une mise à jeun de 16h sans restriction hydrique suivie d’un gavage d’une solution riche en calcium, suivi d’un isolement de 8h afin de récolter les urines. Dans une autre procédure expérimentale, les souris recevront un gavage du composé X pendant un mois. Cela peut entraîner une légère gêne, mais des expériences similaires menées auparavant n’ont pas montré de souffrance particulière chez les animaux, grâce à la compétence des expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour analyses des tissus (histologiques, analyses des transcrits, expression protéiques...).

Remplacement

Les gènes étudiés étant exprimés dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (par exemple intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption).

Réduction

Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Afin de déterminer le potentiel thérapeutique de notre molécule, des analyses histologiques, de l'expression de gènes et de protéines, ainsi que de cytométrie devront être réalisées sur les animaux. Les souris ayant 2 reins, nous pourrons diminuer le nombre de souris par lot. Les deux reins d'un animal ne seront jamais analysés deux fois par la même technique. Des analyses statistiques utilisant les différents lots de souris seront réalisées pour déterminer avec précision les effets thérapeutiques. Ce projet utilisera au maximum 3600 souris au total sur 5 ans.

Raffinement

Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, le saignement sera stoppé par pression de la zone de prélèvement qui seront par la suite surveillées et désinfectées jusqu’à cicatrisation complète. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Le gavage sera réalisé par du personnel formé et expert en expérimentation animale, le risque de fausse route au moment du gavage sera également pris en compte en évitant de mettre l'animal sur le dos et en lui délivrant lentement le liquide contenu dans la seringue à l’aide d’une sonde adaptée à la taille de l’animal. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), ), l'inconfort sera évalué en fonction du niveau de douleur observé par une grille de scoring et sera géré si besoin en prenant les mesures appropriées (analgésie), si malgré les mesures d’analgésie l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux.

Choix des espèces

L'utilisation du modèle murin dans ce protocole est justifiée car les souris ont leur génome bien caractérisé et sont des modèles biologiques utiles qui partagent de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec les humains. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 semaines à 6 mois correspondant à des adultes. Ces stades étudiés correspondent aux stades physiopathologiques connus chez le patient.

Scarifiées à la queue pour des prélèvements répétés de gouttes de sang, 1 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations reproduisant un diabète ou des tumeurs du pancréas et reçoivent des injections activant la mutation, des gavages, un régime gras et des tests de glycémie répétés. Certains fœtus sont traités à travers la mère gestante. Le porteur qualifie ces souris de "modèles uniques au monde" et affirme que la mesure de la glycémie ne peut se faire qu'in vivo.

Objectifs

Récemment, une nouvelle mutation d’une protéine pancréatique a été décrite dans plusieurs familles de patients. Cette mutation cause un diabète chez les hommes, et des tumeurs du pancréas chez les femmes. Pour le moment, son mode d’action n’est pas connu. Les hommes touchés développent un diabète particulier différent du diabète de type 1 auto-immun et du diabète de type 2 lié à l’obésité. Les femmes présentent quant à elles des tumeurs particulières du pancréas issues des cellules productrices d’insuline, entrainant une sécrétion excessive et incontrôlée d’insuline qui provoque des hypoglycémies répétées (baisse anormale du sucre dans le sang). L’objectif de ce projet est donc de rechercher les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de ces troubles du pancréas. A plus long terme, ces recherches devraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et ainsi de proposer de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Cette étude présente un grand intérêt pour le traitement à la fois du diabète et du cancer du pancréas puisque les mutations de notre protéine d’intérêt ont été décrites dans ces deux pathologies. Sur le plan clinique, nous prévoyons des retombées potentielles à moyen et à plus long terme. En effet, le diabète est une maladie métabolique complexe qui implique souvent plusieurs gènes. Cette hétérogénéité rend difficile son étude. Il existe aussi certaines autres formes de diabète qui n’impliquent qu’un seul gène. Elles sont présentes soit chez des nouveau-nés, soit chez de jeunes adultes. Dans ce contexte, il est plus facile de comprendre les mécanismes à l’origine de la maladie et ainsi de progresser vers des voies thérapeutiques. C’est le cas du facteur que nous étudions au laboratoire, qui est produit dans le pancréas. Une seule mutation du gène codant pour ce facteur suffit à déclencher un diabète. Nous pensons donc que notre étude chez la souris pourra permettre non seulement de décrire une nouvelle forme de diabète monogénique, mais aussi d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d’élaborer de nouveaux traitements. Le facteur que nous étudions est également associé à l’apparition de tumeurs pancréatiques chez des patients. Son rôle biologique reste toutefois encore mal compris à ce jour. Notre projet permettra d’élucider son implication dans le cancer pancréatique qui représente une cause de mortalité importante.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des souris qui portent des mutations représentatives de celles portées par des patients qui présentent soit un diabète, soit des tumeurs du pancréas. Ces souris seront examinées à différents stades de la vie, allant de la vie fœtale à des stades âgés. Certains des animaux utilisés nécessitent l’injection d’un composé pour activer la mutation étudiée. Les animaux adultes vigiles (éveillés) porteurs de cette mutation inductible, recevront une ou cinq administrations de la substance par injection soit une (ou trois) administrations par voie orale, soit une administration par application d’une solution sur la peau (1 ou 3 fois) (durée de chaque geste inf à 30sec). Des fœtus seront également traités en administrant le composé chez la mère gestante : soit par gavage (1 à 2 doses), soit par injection (1 ou 2 fois) soit dans l’alimentation pendant une semaine (durée de chaque geste inf à 30 sec). Ces mêmes animaux seront ensuite étudiés grâce à des expériences de mesure de la régulation de la glycémie. Pour cela, ils auront un prélèvement, puis ils seront placés à jeun pendant 16 heures, et auront un second prélèvement (durée de chaque prélèvement inf à 10sec). Ils recevront une injection (10 sec) suivie de 5 prélèvements d’une goutte de sang durant les 2h suivantes. Trois jours plus tard, ces gestes seront répétés sur ces mêmes souris. Dans le cadre d’une étude longtudinale, ce lot de souris pourra être soumis à ce type d’injection puis prélèvement au maximum 3 fois lors de ces 2 tests (durée de chaque prélèvement inf à 10sec). Enfin, certaines souris seront exposées à un régime riche en graisse pendant des durées allant de 14 jours à 3 mois. Ces mêmes animaux seront ensuite étudiés grâce à des expériences de mesure de la glycémie, impliquants une injection et 7 prélèvements d’une goutte de sang, Trois jours plus tard, ces gestes seront répétés sur ces mêmes souris (durée de chaque prélèvement inf à 10sec).

Impact sur les animaux

Les modèles générés pour l’étude n’ont pas de phénotype dommageable. Les nuisances attendues sont celles liées aux différentes injections. Ces nuisances correspondent à l’introduction d’une aiguille et donc à des douleurs associées à une injection classique. Celles-ci sont de courte durée, et ces différentes injections ne provoquent aucun autre effet secondaire à l’exception de la nuisance de l’injection. Les souris exposées à régime particulier (riche en graisse) peuvent présenter une prise de poids sans conséquence sur le bien-être des animaux. Après injection, nous nous attendons à observer une légère hyperglycémie (élévation de la glycémie) à la fois chez les mâles et les femelles lorsque des tests métaboliques seront effectués. Sur la base de nos premiers résultats, l’hyperglycémie devrait être moindre chez les femelles. Néanmoins, cette hyperglycémie modérée ne sera probablement que passagère, et une glycémie normale sera rétablie après quelques heures. Pour les mesures de glycémie, le premier prélèvement étant réalisé après une légère scarification de la queue et les suivants après le retrait de la croûte, ce geste entraînera une douleur légère et de courte durée. Cela prend 10 à 20 secondes maximum répétées 5 fois sur 120 minutes, les temps de l’expérience.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Les souris que nous utilisons sont des modèles uniques au monde. Les paramètres physiologiques, c’est à dire les mesures de glycémie et d’insulinémie ne peuvent être effectuées que in vivo. De plus, il existe un dialogue entre les différents organes de la souris. Cette interaction entre les différents organes impliqués dans le métabolisme glucidique de la souris -le foie, le muscle et le tissu adipeux- ne peut être analysée que dans un organisme entier vivant. Néanmoins, pour limiter les investigations in vivo, un maximum d’informations proviendra d’analyses sur des tissus fixés et d’analyses bio-informatiques in silico à partir de prélèvement post-mortem. Nous effectuerons également des expériences in vitro quand cela est possible pour limiter les expériences in vivo. Par exemple, la culture d’îlots de Langerhans prélevés sur des souris post-mortem, un animal pouvant générer environ 100 îlots qui sont ensuite stimulés in vitro..

Réduction

Nos modèles représentent des modèles uniques au monde pour étudier les pathologies trouvées chez l’homme. En effet, ce sont le seul moyen d’étudier les effets d’une mutation, qui chez l’homme, déclenche un diabète ou un insulinome. Les stratégies d’accouplement ont été optimisées afin de réduire le nombre d’animaux.. D’après la littérature, nous avons défini la taille de nos groupes pour permettre des résultats concluants et faire des analyses statistiques. Pour réduire le nombre de souris utilisées, une étude pilote sera réalisée pour certains modèles de souris avant de définir les conditions optimales. Une approche Go/No Go sera ensuite appliquée afin de déterminer si les inductions pour activer la mutation étudiée se feront au stade fœtal ou adulte. Cela signifie que nous ferons un choix de la méthodologie utilisée selon les résultats préliminaires obtenus. Si nous constatons que l’activation de la mutation est satisfaisante pendant le développement foetal, nous choisirons plutôt cette méthode et nous n’activerons pas la mutation au stade adulte.

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine du diabète et de la cancérologie, les animaux seront suivis régulièrement afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées avant la souffrance des animaux. Une grille de score sera également mise en place. Dans le cadre des procédures, toutes les manipulations seront réalisés pour garantir le meilleur confort à l’animal. En particulier, lors des expériences impliquant des injections, les animaux seront observés de façon quotidienne, de manière à surveiller l'état général de la souris. Pour rappel, nous n’attendons pas de nuisance particulière, hormis une légère hyperglycémie chez les mâles après injection. De plus, les animaux aux stades fœtal et nouveau-né seront utilisés uniquement pour des prélèvements d’organes après injection. Aux stades plus tardifs, les tests réalisés ne nécessitent pas d’utiliser des analgésiques pour ces tests.

Choix des espèces

Nos modèles murins sont uniques et la souris est le seul organisme existant qui puisse permettre d’étudier l’effet de mutations de notre protéine d’intérêt. Etant donné son cycle de reproduction et sa parenté biologique avec l’homme, la souris constitue un modèle de choix pour mener nos expériences. De plus, il est accepté et validé par la communauté internationale que la souris est pleinement appropriée pour les études du métabolisme que nous proposons. Les stades de développement étudiés sont les suivants : fœtus (E18,5), 1 mois, adultes de 3 mois, 6 mois, 12 mois, 18 mois, et 24 mois. En effet, on sait que notre protéine d’intérêt peut jouer un rôle dans la différenciation des cellules pancréatiques pendant la vie fœtale, mais aussi sur leur prolifération pendant la période postnatale jusqu’à un mois.. Nous souhaitons donc déterminer si la mutation étudiée affecte ces cellules à ces stades. Plus tard, cette mutation pourrait déclencher un diabète ou une tumeur pancréatique, selon le stade de la vie de la souris. En effet, on sait que ce type de phénotype est très dépendant du métabolisme et de l’âge de la souris). C’est pour cette raison qu’il est impératif d’étudier le phénotype des souris à ces différents stades de la vie adulte.

4608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des régimes gras et sucrés pendant six à douze mois pour reproduire une stéatose évoluant vers un cancer du foie, avec échographies sous anesthésie tous les quinze jours et, pour certaines, une chirurgie terminale. Une prise de poids importante, l'anesthésie répétée et le développement tumoral peuvent altérer leur état général. Le porteur justifie ce total de 4608 animaux par un calcul de puissance sans en détailler le résultat, sur un projet qui reste une caractérisation de mécanismes.

Objectifs

Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire. (MODIFICATION) L'ajout des prélèvements sanguins nécessite une modification du projet sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnosticet pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris) (MODIFICATION: et trois prélèvements sanguins seront réalisés sur ces animaux au cours du projet (3 fois, 1 minutes, animal vigile)]. Une autre partie des animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). (MODIFICATION :Un prélèvement sanguin de plus grand volume sera réalisé sur animal anesthésié et analgésié en fin de projet (1 fois, 2 minutes)). Une partie des animaux sera sujette à un transport entre centres de recherche. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection sous-cutané et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général. (MODIFICATION : De la douleur légère de courte durée peut être ressentie au point de prélèvement pour les prélèvements sanguins. Dans de très rares cas une perte de sang hémorragique peut être observée).Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs impliqués peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (4608).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.

Réduction

4608 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.

L'objet réel du projet est de mettre au point un modèle de cancer du côlon réutilisable dans d'autres études, présenté comme un "outil fiable" pour de nombreuses équipes. 180 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, classées en souffrance modérée et toutes tuées pour analyse. Un polype est induit dans le côlon par une sonde rectale ou par injection chirurgicale sous anesthésie, avec apparition de tumeurs sur 16 à 24 semaines. La finalité affichée est la production d'un modèle animal servant à d'autres travaux, en amont de toute avancée thérapeutique.

Objectifs

Dans le cancer du côlon chez l’homme, les tumeurs commencent souvent par de petits amas de cellules appelés polypes, qui se forment dans le côlon. Mais dans les souris utilisées habituellement pour la recherche, ces polypes se développent surtout dans l’intestin, et très peu dans le côlon. Cela rend l’étude du cancer du côlon plus difficile. Nous cherchons donc à mettre au point une méthode qui permettrait de créer un polype précisément dans le côlon de la souris, pour que ce modèle ressemble davantage à la maladie humaine. Grâce à ce modèle, les chercheurs pourront comprendre comment les cellules du côlon se transforment en cellules tumorales, étudier comment le polype interagit avec son environnement dans le côlon et observer les premières étapes de la formation d’une tumeur. Une fois mis au point, ce modèle pourra être réutilisé dans plusieurs projets de recherche sur le cancer colorectal, ce qui évitera de recommencer tout le travail de mise au point à chaque fois. Il deviendra un outil fiable, pratique et utile pour de nombreuses équipes de recherche.

Bénéfices attendus

Notre projet consiste à créer chez la souris un modèle de cancer du côlon qui ressemble vraiment à ce qui se passe chez l’être humain. Cela permettra aux chercheurs d’étudier comment un simple polype (une petite excroissance dans le côlon) peut évoluer et devenir un cancer. Nous voulons aussi comprendre le rôle de tout ce qui entoure la tumeur, appelé microenvironnement : ce sont les cellules, les tissus et les molécules autour du polype, qui peuvent aider ou freiner son développement. Grâce à ce modèle, nous espérons découvrir ce qui se passe au tout début de la maladie et peut-être trouver des marqueurs qui permettraient de mieux diagnostiquer ou suivre le cancer du côlon chez l’homme. Ce projet est très important, car les premières étapes du cancer colorectal sont encore mal connues et difficiles à étudier sans un bon modèle.

Procédures

Les animaux auront soit une administration unique par voie rectale à l’aide d’une sonde de cathéter (moins de 10 minutes) ou une injection unique directement dans le côlon nécessitant une intervention chirurgicale. Les actes s’effectueront sous anesthésie générale gazeuse (moins de 30 minutes). Ils recevront une dose d’analgésique 30 minutes avant l’anesthésie, 8h après l’intervention et deux dose le lendemain (moins d’une minute).

Impact sur les animaux

La drogue utilisée n’est pas dangereuse aux doses utilisées, mais elle peut parfois provoquer une petite irritation. L’introduction d’une sonde rectale peut entraîner un léger inconfort. Après une intervention chirurgicale, les animaux peuvent ressentir une sensibilité et une petite inflammation autour de la zone opérée. Des petits amas de cellules (polypes) apparaitrons dans le côlon après traitement. Nous avons estimé les effets indésirables attendus sur les animaux en fonction du temps : 16 à 20 semaines après traitement : inconfort léger, parfois un peu moins d’activité ou un pelage moins soigné. 20 à 24 semaines après traitement : inconfort modéré, avec possible sensibilité abdominale, baisse d’énergie ou petites perturbations du transit.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et les organes d’intérêts seront récupérés pour une analyse histologique post mortem.

Remplacement

Ce projet vise à développer un modèle murin du cancer colorectal., afin de mieux comprendre comment débute le cancer colorectal. Pour étudier ces mécanismes, il est nécessaire d’utiliser des organismes vivants complets, car ils possèdent l’ensemble des interactions naturelles présentes dans un corps (circulation sanguine, système immunitaire, environnement cellulaire complexe…). Les modèles murins utilisés dans ce projet reproduisent de manière fidèle les premières étapes de la formation des tumeurs intestinales. À ce jour, aucun modèle en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permet de reconstituer toutes les composantes d’un tissu vivant dans son intégralité. C’est pourquoi l’utilisation de ces modèles animaux reste indispensable pour répondre aux questions scientifiques posées dans ce projet.

Réduction

Nous avons choisi le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir des résultats fiables, en nous appuyant sur des données scientifiques et des méthodes statistiques. Nous utilisons des animaux des deux sexes afin de limiter le nombre total d’animaux élevés et utilisés. Nous commencerons par la méthode qui est moins invasive. Si elle fonctionne, la méthode plus lourde ne sera pas utilisée, ce qui réduira encore le nombre d’animaux nécessaires. Une fois la meilleure technique validée, elle pourra servir dans d’autres projets, évitant de répéter les mêmes étapes et contribuant à diminuer l’utilisation d’animaux à long terme.

Raffinement

Nous avons mis en place toutes les mesures nécessaires pour assurer le bien-être des animaux. Leur état sera vérifié chaque jour, et les procédures seront réalisées sous anesthésie pour éviter la douleur et réduire le stress. Les animaux seront maintenus au chaud jusqu’à leur réveil. Nous surveillerons attentivement tout signe de malaise (perte de poids, diarrhée, saignement, isolement…). En cas de problème, des actions rapides seront mises en place pour soulager l’animal, comme une alimentation plus facile à consommer, des améliorations de l’environnement ou l’administration d’antidouleurs en complément si besoin.

Choix des espèces

Ce projet nécessite un modèle animal proche de l’humain sur le plan physiologique. La souris utilisée ici reproduit très fidèlement les premières étapes du cancer colorectal, car elle développe les mêmes types de polypes que ceux observés chez l’homme. Aucune autre espèce ou modèle de laboratoire ne permet d’étudier aussi précisément le début de cette maladie. C’est pourquoi ce modèle de souris génétiquement modifié est indispensable pour mener à bien ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de 2-3 mois d'âge selon le protocole établi dans la littérature ou lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g.

76 souris mâles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de sang intracardiaque et de tissus. Pendant douze semaines, elles reçoivent des régimes riches en gras et en sucre, des prélèvements sanguins répétés à l'entaille de la queue, des gavages de glucose et de lipides et des injections d'insuline et d'héparine. Le porteur note que les prises de sang répétées sur douze semaines peuvent générer un stress modéré malgré l'espacement des tests. L'étude cherche à mesurer l'effet d'une féverole fermentée sur le métabolisme et le microbiote, et n'inclut que des mâles.

Objectifs

Ce travail s’inscrit dans une démarche globale d’exploration des bénéfices potentiels de la substitution partielle de protéines animales par des protéines végétales fermentées, dans le cadre d'un programme qui promeut le développement et la valorisation des protéines végétales dans l’alimentation humaine. La féverole (FB) (Vicia faba) est une légumineuse cultivée en Europe et reconnue pour sa forte teneur en protéines (25–30 %). Elle représente une piste majeure pour diversifier les sources protéiques et réduire la dépendance aux protéines animales dans un contexte de transition agroécologique. Sur le plan nutritionnel, elle est riche en acides aminés essentiels, en fibres fermentescibles et en composés bioactifs. Toutefois, la présence de facteurs antinutritionnels peut limiter sa digestibilité. La fermentation lactique des concentrats de féverole constitue une approche prometteuse pour améliorer ses qualités nutritionnelles en augmentant la digestibilité, en réduisant les composés antinutritionnels et en modulant favorablement les populations bactériennes intestinales. Dans ce contexte, ce projet vise à déterminer dans quelle mesure la substitution d’une partie des protéines animales par des protéines de (FB) fermentées peut influencer la santé cardio-métabolique et les composition/fonction du microbiote intestinal. L’étude des effets métaboliques d’une consommation de concentrats protéiques fermentés chez la souris après le sevrage, permettra d’évaluer l’impact de différents régimes (protéines animales, FB non fermentée, FB fermentée) sur la croissance, le métabolisme lipidique, la tolérance au glucose, l’inflammation de bas grade ainsi que la santé intestinale et la composition du microbiote. Des approches métabolomiques et transcriptomiques permettront d’identifier les voies biologiques modulées par ces régimes. L’impact de ces régimes sur le microbiote intestinal sera analysé en caractérisant sa composition taxonomique et fonctionnelle. Nous rechercherons si la fermentation des protéines de FB modifie favorablement la structure et les fonctions microbiennes intestinales. Ce projet vise à apporter des connaissances nouvelles sur le rôle d’ingrédients fermentés issus de légumineuses dans la prévention des pathologies métaboliques, sur les mécanismes impliquant le microbiote intestinal, et sur le potentiel de leur intégration dans l’alimentation humaine dans un objectif de santé publique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à générer des connaissances essentielles sur l’impact de protéines végétales fermentées issues de la féverole (Vicia faba L.) sur la santé cardio-métabolique d’un mammifére et sur son microbiote intestinal. Les résultats attendus présentent un double intérêt, à la fois scientifique et sociétal. Ce projet permettra d’améliorer la compréhension des effets des protéines végétales fermentées sur la santé cardio-métabolique, en évaluant leur impact sur le métabolisme glucidique et lipidique ainsi que sur l’inflammation de bas grade. Il contribuera également à identifier des signatures métaboliques et microbiennes associées aux régimes à base de féverole, offrant de nouveaux biomarqueurs pour les recherches futures. Les résultats soutiendront le développement d’aliments plus durables et plus sains, en cohérence avec les objectifs du programme scientifique, et pourraient contribuer à la prévention des pathologies métaboliques chez l’humain.

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés les semaine 1, semaine 6, semaine 9, semaine 10, semaine 11 et semaine 12 du protocole sur animal vigile pour effectuer les tests de tolérance au glucose et aux lipides. Aprés administration des solutions (glucose, lipide) par biberonage ou gavage, des préevements sanguins seront effectués pour des dosages. Ils sont effectués par incision superficielle de l’extrémité de la queue, après désinfection et application préalable de lidocaïne et sont réalisés à 1 semaine d’intervalle minimum. Chaque goutte de sang correspond à un volume d’environ 5µL et le recueil ne dépassera pas 70µL par session sauf pour le test de tolérance aux lipides où le volume devra être de 180 µL au total. L’hémostase au niveau de la queue sera assurée par compression locale pendant 60 secondes à chaque prélèvement. Seulement en cas de nécrose de la queue, le prélèvement de sang sera réalisé par ponction de la veine caudale latérale après réchauffement de la queue de la souris sur un pad chauffant, ou bien un prélèvement dans la veine faciale submandibullaire.

Impact sur les animaux

Pour les souris incluses dans ce projet, les nuisances induites par la procédure seront limitées aux manipulations pour l’administration de lipide par gavage, de glucose par gavage ou biberonage, l’injection d’insuline, l’injection d’héparine, les prises de poids, les prélèvements sanguins ainsi que la mise à mort des animaux. Les prélèvements de sang réalisés à l’extrémité de la queue peuvent provoquer une gêne passagère, un stress léger et une douleur brève au moment de l’incision. Le test fonctionnel de tolérance au glucose implique l’administration d’une solution de glucose par biberonnage volontaire des souris ou bien par gavage gastrique, pouvant générer un stress transitoire lié à la contention et à la manipulation, de courte durée. Il en est de même pour le test fonctionnel de tolérance aux lipides qui implique un gavage en contention douce de l’animal, provoquant ainsi un stress transitoire. L’injection intrapéritonéale d’insuline générera un inconfort transitoire lié à la manipulation et à la procédure invasive. L’injection unique d’héparine en fin de protocole est également susceptible d'entraîner une gêne momentanée. L’ensemble de ces effets indésirables est attendu comme léger à modéré, transitoire, et limité par des pratiques de raffinement (contention douce, personnel formé, surveillance des animaux, arrêt anticipé en cas de signe clinique anormal). Cependant les prises de sang répétees sur la durée de 12 semaines d'expérimentation, bien que espacées d'au moins 1 semaine entre 2 tests peut générer un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude afin de permettre la réalisation des analyses biologiques finales sur prélèvements de sang intracardique et de tissus, indispensables aux objectifs scientifiques du projet. Aucun animal n’est maintenu en vie à la fin du protocole.

Remplacement

Le recours au modèle murin est indispensable pour répondre aux objectifs du projet. Les interactions entre alimentation, métabolisme, microbiote intestinal et inflammation impliquent des mécanismes physiologiques complexes qui ne peuvent être reproduits ni par des modèles in vitro, ni par des simulations in silico. Les paramètres étudiés (tolérance au glucose, sensibilité à l’insuline, régulation lipidique, réponses inflammatoires systémiques, modifications du microbiote) nécessitent un organisme entier dans lequel les systèmes digestif, immunitaire et métabolique et microbien, interagissent. Aucun modèle alternatif ne permet aujourd’hui de refléter fidèlement cette intégration physiologique. Le recours aux animaux est donc justifié scientifiquement et constitue la seule approche pertinente pour répondre à la question posée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’obtenir une puissance statistique suffisante tout en respectant l’objectif de minimiser l’utilisation d’animaux. Une analyse de puissance satistiques indique qu’un effectif théorique de 12 animaux par groupe serait nécessaire. Nous choisissons d’utiliser 14 animaux par groupe, cet effectif correspond au standard utilisé dans l’unité pour les études nutritionnelles et métaboliques, où il permet régulièrement d’obtenir des résultats robustes malgré la variabilité biologique qui est relativement faible pour des animaux consanguins. Par ailleurs, toutes les mesures physiologiques (poids, prise alimentaire, glycémie, insulinémie, prélèvements sanguins, collectes fécales) sont réalisées longitudinalement sur les mêmes individus, ce qui maximise la quantité de données obtenues par animal et évite la constitution de groupes supplémentaires. Pour tester l'appétit des souris (procédure 1) nous utilisons un effectif minimal (6 animaux) puisque le but est juste de vérifier que les animaux mangent et ne perdent pas de poids. Ainsi, le design expérimental adopté permet de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire, tout en garantissant la validité et la robustesse des résultats. Nous ne testerons les effets des régimes que sur des souris de sexe mâle.

Raffinement

Les procédures ont été conçues pour limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Les manipulations (pesées, collecte fécale, distribution des aliments) sont non invasives et réalisées avec une contention minimale, rapide mais sans brusquerie, par un personnel compétent et entraîné. Le stress généré par la pesée des animaux et des prélèvements sanguins seront limités du fait de leur mise en oeuvre dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale et des recommandations relatives aux volumes de sang prélevés. Les tests métaboliques (OGTT, ITT, OFTT) sont effectués par du personnel expérimenté, avec des jeûnes courts (4h à 12h) pour réduire le stress. Les animaux sont hébergés par 2 dans des cages enrichies à l’aide de matériau cellulosique pour le nid et de tunnels et font l’objet d’une surveillance quotidienne. L’absence de nuisance durable sur le bien-être animal sera néanmoins vérifiée par observation des animaux lors des visites qui seront effectuées quotidiennement et les observations seront recueillies dans un fichier de suivi des souris (Annexe 1). Tout animal présentant une perte de poids supérieure à 20 %, une léthargie marquée, un refus persistant de s’alimenter, une respiration anormale ou un comportement anormalement agressif persistant sera immédiatement retiré du protocole en accord avec le resposnable SBEA. Toute souffrance est anticipée par des points limites stricts (Annexe 2) ce qui conditionnera les éventuelles décisions d’administration d’analgésique sous-cutané dans le cas d’observation de signes attestant d’une souffrance ou si score de point limite supérieur à 22 (Annexe 2) a mise à mort sera proposée par le responsable SBEA et réalisée sous anesthésie générale profonde, garantissant l’absence de douleur.

Choix des espèces

Le modèle murin C57BL/6J est une lignée de souris est largement utilisé en recherche métabolique et nutritionnelle car il développe de manière reproductible une obésité, une altération de la tolérance au glucose, ainsi qu’une résistance à l’insuline lorsqu’il est exposé à un régime riche en sucre et graisse. Par ailleurs, le microbiote intestinal de la souris est l’un des plus étudiés en recherche préclinique, avec des signatures microbiennes bien référencées, ce qui en fait un modèle pertinent pour examiner les interactions nutrition–microbiote. Aucun modèle in vitro, ex vivo ou alternatif ne permet actuellement de reproduire l’ensemble des interactions physiologique entre digestion, microbiote, immunité et métabolisme. Ce choix est donc scientifiquement justifié, cohérent avec les standards internationaux en nutrition/microbiote, et indispensable pour répondre aux objectifs du projet. Les animaux à leur arrivée à l’animalerie auront 28 jours. À cet âge, les souris sont pleinement autonomes : elles ont achevé la transition alimentaire vers le solide, régulent correctement leur température corporelle et ne dépendent plus des soins maternels. A 35 jours de vie nous leur apporterons les différents régimes alimentaires à tester. A cet âge la croissance somatique des souris est presque stable et leur poids proche du plateau physiologique. Les régimes seront appliqués pendant 12 semaines. Les variations pondérales que nous observerons au cours du protocole reflèteront essentiellement des modifications de la composition corporelle — notamment l’accumulation de masse grasse induite par les différents régimes — et non la croissance physiologique normale des animaux. Ce stade post-sevrage avancé constitue également une période pertinente pour étudier la maturation du microbiote intestinal, qui est suffisamment structuré pour permettre l’analyse des interactions nutrition–microbiote, tout en restant sensible aux modifications alimentaires. Par ailleurs, les tests métaboliques tels que tolérance aux sucres et aux ainsi que les suivis physiologiques (poids, mesures des lipides plasmatiques) présentent à cet âge une fiabilité et une reproductibilité reconnues. L’utilisation d’animaux plus âgés ne permettrait pas d’évaluer l’impact des régimes durant les fenêtres critiques de maturation métabolique, tandis que l’utilisation d’animaux plus jeunes exposerait inutilement à des contraintes supplémentaires et obligerait à prendre en compte la croissance.