Système gastrointestinal
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
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- Système musculosquelettique
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- Système urogénital
Modèles nutritionnels pour l’induction de désordres métaboliques chez la souris, le rat et le hamster-MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Rats : 500
Hamsters dorés : 1500
Les animaux qui perdent plus de 20 % de leur poids en trois jours, avec prostration et dos courbé, sont mis à mort. 4 750 souris, rats et hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever foie, sang et tissus. Ils reçoivent des régimes gras et sucrés, parfois additionnés d'éthanol, pendant jusqu'à 60 semaines, avec un ou deux gavages par jour, des tests de tolérance au glucose, des séjours de 40 heures en cage individuelle sans enrichissement et des courses de 20 minutes sur tapis roulant. Le porteur retient le hamster parce qu'il consomme spontanément l'alcool, et rattache ce choix à la hausse de la consommation humaine depuis les confinements liés au COVID-19.
Objectifs
L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.
Bénéfices attendus
L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.
Procédures
Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. POUR MESURER LA FORCE MUSCULAIRE, NOUS TESTERONS L'AGRIPPEMENT SUR GRILLE (2 MINUTES DE FACON HEBDOMADAIRE) ET LA DUREE DE COURSE SUR TAPIS ROULANT EN MESURANT LES ECHANGES GAZEUX (20 MINUTES TOUS LES 15 JOURS). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. Cela consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.
Impact sur les animaux
Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)
Remplacement
Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.
Réduction
Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.
Raffinement
Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.
Nouvelles molécules impliquées dans le dialogue entre intestin et son microbiote : rôle dans le maintien de la santé intestinale à long terme.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
3 600 souris vont être utilisées, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour collecter leurs organes. Les expérimentateurs leur provoquent une colite par traitement chimique, qui entraîne diarrhées et perte de poids, et leur administrent des microARN par gavage une fois par semaine pendant douze semaines. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ne peut reproduire les interactions entre microbiote, système immunitaire, génétique et environnement, et renvoie les applications thérapeutiques contre les maladies inflammatoires de l'intestin à un usage futur. Dans un volet du projet, les expérimentateurs gavent chaque jour des souriceaux de sept à dix jours, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress supplémentaire liée à la contention de nouveau-nés.
Objectifs
Le côlon, comme l’ensemble du tube digestif, héberge une vaste communauté de micro-organismes appelée microbiote intestinal, qui joue un rôle essentiel dans la santé. Des études récentes ont montré que les conditions de colonisation de l’intestin juste après la naissance influencent fortement le développement futur de l’individu. Un déséquilibre précoce du microbiote, ou dysbiose, est ainsi associé à un risque accru de troubles intestinaux à l’âge adulte, notamment dans le cadre des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI), comme la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique. Les mécanismes par lesquels le microbiote agit à long terme sur la santé restent encore largement inconnus. Parmi les éléments impliqués, les microARN (miARN) — de petites molécules capables de modifier la lecture des gènes — jouent un rôle de plus en plus reconnu. Ils sont présents dans de nombreux compartiments biologiques, notamment les selles et le contenu intestinal, et sont associés à la régulation de fonctions clés de l’intestin. Plusieurs miARN ont été impliqués dans l’apparition de dysbiose et dans l’inflammation intestinale. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle des miARN dans le fonctionnement de l’intestin, en particulier dans leur interaction avec le microbiote. Il consiste en particulier en l’étude des effets des miARN à l’âge adulte dans différents modèles de colite (soit une inflammation du colon) expérimentale, tout en ajoutant un nouvel axe centré sur la période néonatale, qui est une étape critique dans l’établissement du microbiote. Nous explorerons comment des interventions sur les miARN pendant cette phase précoce peuvent modifier durablement la santé intestinale, et si ces modifications ont des effets à long terme sur l’équilibre du microbiote et la santé intestinale. Pour cela, nous utiliserons différents modèles murins, dans lesquels des miARN spécifiques seront administrés par voie orale, à différentes étapes de la vie, notamment chez le nouveau-né. Les conséquences seront évaluées à court et long terme, en observant notamment les modifications du microbiote et les réponses intestinales associées. Le projet s’étalera sur 5 années et nécessitera 3600 souris, âgées de la naissance jusqu’à 16 semaines, issues d’un fournisseur agréé. Toutes les procédures seront réalisées dans le strict respect des normes réglementaires, avec une euthanasie programmée à la fin de chaque expérimentation.
Bénéfices attendus
Ces travaux contribueront à la compréhension des mécanismes par lesquelles les miARN et le microbiote dialoguent et nous permettront de mettre en évidence de nouveaux outils thérapeutiques, les miARN, pour le traitement des maladies humaines associées à un problème d’inflammation chronique, comme c’est le cas des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI).
Procédures
Les animaux seront soumis à une ou plusieurs de ces interventions ayant pour but soit de créer une inflammation du colon chez les souris soit de la traiter, ou alors de suivre l’évolution de la colite et du microbiote chez chaque animal : - Les selles seront récoltées en disposant les animaux dans des petites boîtes en plastique pendant 30 à 60 min. Après que les animaux aient fait naturellement leurs besoins, ils seront replacés dans leur cage d’origine. - Un ou des gavages (selon la procédure : de miARN, d’anti-miRNA) seront effectués à l’aide d’une sonde souple non traumatique sur souris adultes éveillées, une fois par semaine pendant 12 semaines. Chaque gavage dure environ 10 secondes. - 1 gavage par jour sera effectué à l’aide d’une sonde souple non traumatique sur des souriceaux de soit 7 à 10 jours, soit 14 à 21 jours. Chaque gavage dure environ 20 secondes. - Les prélèvements de sang seront réalisés uniquement sur des animaux anesthésiés soit 15 jours avant l’euthanasie soit juste avant d’être euthanasié soit un seul prélèvement par animal. Ce geste dure environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Des nuisances seront générées chez les animaux soumis à un traitement chimique, qui induit la colite. Les effets de la colite chez la souris sont l’apparition de diarrhées et une perte de poids. Il est aussi reconnu que les gavages utilisés par ailleurs dans certaines procédures, peuvent induire un stress chez les animaux. Le gavage des souriceaux dans la procédure 2 est reconnu comme pouvant occasionner un stress supplémentaire aux souriceaux lié à la manipulation et la contention de nouveaux nés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de collecter les organes en post-mortem pour analyse ultérieure.
Remplacement
L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet car les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin sont des maladies très complexes. Elles sont influencées par plusieurs éléments : le système immunitaire, les bactéries qui vivent dans l’intestin (microbiote), la génétique et l’environnement. Elles touchent plusieurs organes et provoquent une inflammation à la fois dans l’intestin et dans tout le corps. Pour comprendre comment l’environnement, le microbiote intestinal et le patrimoine génétique de l’animal interagissent, les souris de laboratoire sont le modèle le plus adapté. Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative (comme des cultures de cellules) capable de reproduire ces interactions complexes entre les différents organes et facteurs impliqués. L’objectif final de cette recherche est de comprendre comment certaines petites molécules appelées microARNs peuvent influencer l’inflammation intestinale. Ces connaissances pourraient un jour permettre de développer de nouveaux traitements pour les personnes atteintes de MICI.
Réduction
Des expérimentations préliminaires, ont donc permis d’établir un nombre optimal d’animaux par groupe et réduit au maximum pour obtenir des résultats interprétables. De plus, l’utilisation d’un logiciel (Prism), a permis de définir le nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour avoir des résultats reproductibles et significatifs. Les données obtenues seront traitées en utilisant des tests statistiques.
Raffinement
Les souris seront observées tous les jours pendant toute la durée de l’étude, par du personnel formé. Si des signes de maladie apparaissent (comme une perte de poids, des selles anormales ou un changement de comportement), les soins apportés seront adaptés à leur état. Cela peut inclure la mise à disposition d’eau gélifiée pour éviter la déshydratation ou, si l’état de l’animal devient trop grave, l’arrêt de l’expérience et la mise à mort pour éviter toute souffrance inutile. L’apparition de la colite sera surveillée à l’aide d’un score standardisé prenant en compte le poids, l’aspect général, les signes cliniques visibles et le comportement. Ce score permet de détecter rapidement une aggravation et d’agir progressivement : Si le score dépasse un premier seuil, les observations seront faites plus souvent (deux fois par semaine, puis trois fois par semaine si le score continue d’augmenter). Si certains critères, comme la perte de poids ou la consistance des selles, atteignent un niveau critique, de l’eau gélifiée sera donnée aux animaux. Si l’état d’un animal dépasse le seuil défini comme « point limite », il sera mis à mort pour éviter toute souffrance. Enfin, les cages seront enrichies (coton, abris, alternance jour/nuit) pour permettre aux souris d’exprimer des comportements naturels et améliorer leur bien-être.
Choix des espèces
Des souris qui présentent des colites ou des lésions similaires aux MICI humaines de façon à imiter le développement, les symptômes et les complications de la maladie sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Notons que les miARNs sont les mêmes chez la souris et l'Homme et que des travaux antérieurs de la littérature scientifique ont validé l'utilisation de souris comme modèle animal pour l'étude de la colite, et l'inflammation. Enfin, de nombreux réactifs et outils de recherche, nécessaires à cette recherche, sont spécifiques et ont été validés dans cette espèce. Les souris utilisées pour les expériences (mâles et femelles) auront de 7 jours à 112 jours de vie. Ceci correspond à l’âge optimal pour obtenir la meilleure reproductibilité de la colite et a été décidé en fonction de travaux antérieurs utilisant des modèles de colite murine.
ROLE DU MICROBIOTE INTESTINAL SUR LA SENSIBILISATION CENTRALE A LA DOULEUR DANS LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
420 souris vont être utilisées, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent par voie orale le microbiote intestinal de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, une fois par semaine pendant quatre semaines, puis les expérimentateurs leur provoquent une arthrite par injection de molécules inflammatoires. Chaque semaine, ils mesurent leur seuil de douleur par piqûre de filaments de nylon et par réaction au froid, et évaluent leurs comportements anxieux et dépressifs. Aucun antalgique ne leur sera donné, l'hypersensibilité à la douleur étant l'objet même de l'étude, et le porteur conclut que le recours à la souris relève ici de considérations "scientifiques, techniques et éthiques".
Objectifs
Chez les personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde, 20 à 30 % continuent d’avoir des douleurs même si leur maladie est bien traitée. Leur corps réagit plus facilement à la douleur que celui de personnes non malades, et elles ont aussi souvent plus d’anxiété et de dépression. La flore intestinale, c'est-à-dire les bactéries présentes dans nos intestins, joue un rôle dans la maladie, et on sait qu'un lien important existe entre l’intestin et le cerveau. Nous pensons donc que les modifications de la flore intestinale des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde favorisent la douleur chronique et la dépression, notamment chez les patients qui ont des symptômes qui persistent après traitement. Pour mieux comprendre comment tout cela fonctionne, nous allons étudier l’impact de leur flore intestinale en la transférant à des souris. Ensuite, nous observerons ces souris avec différents tests permettant d’évaluer leur sensibilité au toucher ou au froid, mais aussi des tests qui permettent d’évaluer l’anxiété ou la dépression. Nous testerons l’effet des microbiotes dans deux situations : chez des souris saines pour évaluer les effets déclencheurs des microbiotes, et en conditions pathologiques, c’est à dire chez des souris avec de l’arthrite pour évaluer cette fois les effets aggravateurs des microbiotes. Une fois prouvé le rôle du microbiote, nous identifierons quels éléments issus du microbiote intestinal sont responsables pour pouvoir les cibler et tenter de bloquer les mécanismes qui déclenchent ou aggravent la maladie. L’objectif final est d’identifier des composés du microbiote pouvant réduire la douleur ou les troubles anxio-dépressifs, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients.
Bénéfices attendus
La douleur chronique et de la dépression restent difficiles à traiter chez certains patients, ce qui impacte fortement leur qualité de vie. Il est donc essentiel de comprendre l'origine de l’hypersensibilité à la douleur et de la dépression pour permettre le mieux les soigner. Une fois prouvé rôle de la flore intestinale, nous analyserons et comparerons les différents microbiotes pour identifier quelles sont les bactéries ou quelles sont les molécules produites pourraient expliquer l’hypersensibilité à la douleur et de la dépression. Ceci nous permettra ainsi de tester leur rôle protecteur chez les souris avant de les tester en clinique chez les patients. Ce projet permettra donc une véritable recherche translationnelle, du laboratoire au patient, avec pour objectif d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de douleurs chroniques ou de dépression.
Procédures
Nous réalisons des greffes de microbiote intestinal en donnant aux souris par voie orale des préparations de microbiote de patients une fois par semaine pendant 4 semaines. Suite à la greffe de microbiote, les souris seront suivies chaque semaine grâce à des tests comportementaux pour mesurer les seuils de sensibilité (réaction au toucher par filaments de Nylon ou réaction à la température) et caractériser les comportements anxieux ou dépressifs. Chaque test dure entre 5 et 20 min. Dans certains cas, nous examinons aussi si le microbiote modifie la perméabilité de l’intestin ou le passage de substances vers le cerveau, en administrant des traceurs fluorescents par voie orale ou par injection. Ces expériences sont menées chez des souris saines et dans un modèle de polyarthrite, induite par l’injection de molécules inflammatoires, sous anesthésie légère par inhalation. Enfin, lorsque des molécules produites par le microbiote auront été identifiées (comme des dérivés du tryptophane, de la sérotonine, des métabolites de fibres ou des acides biliaires), nous les ajouterons dans l’eau de boisson des souris pour tester leur effet bénéfique dans les modèles les plus pertinents.
Impact sur les animaux
La sensibilité tactile et thermale et les comportements anxio-dépressifs étant les paramètres étudiés dans nos procédures, aucune médication antalgique ou analgésique systématique ne peuvent être appliquées car ils fausseraient nos résultats. Les principaux désagréments pour les animaux seront liés au modèle inflammatoire utilisé pour induire l’arthrite. L’arthrite provoquera des douleurs articulaires, des gonflements et des rougeurs au niveau des pattes. Cependant l’arthrite induite sera dite aigüe, c’est-à-dire de courte durée (maximum 2 semaines), avec retour à un état normal. Les animaux subiront également des piqures d’aiguilles, un stress léger passager lié aux manipulations. Toutes les injections seront pratiquées sous anesthésie légère par inhalation, d’une durée d’environ 5 minutes, afin de réduire au maximum la douleur et l’inconfort.
Devenir
La douleur étant étudiée, et donc induite, chez certains animaux, le devenir de ceux-ci en fin de procédure expérimentale sera systématiquement l’euthanasie afin de ne pas générer de douleur inutile. De plus, L’euthanasie permet également de réaliser les analyses post mortem nécessaires, notamment sur le cerveau et l’intestin, afin de compléter les données comportementales et d’approfondir la compréhension des mécanismes reliant microbiote, douleur et comportements anxio-dépressifs.
Remplacement
Ce projet vise à comprendre comment le microbiote intestinal influence la douleur et les comportements associés dans la polyarthrite rhumatoïde. A ce jour, il n'existe pas de modèle de substitution permettant d'étudier les interactions complexes entre microbiote, système immunitaire, système nerveux et comportement. Par ailleurs, la perception de douleur, ainsi que les réponses anxieuses ou dépressives, sont des phénomènes appréhendés par l’organisme conscient, et lui seul. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.
Réduction
Tout sera mis en œuvre pour réduire la variabilité interindividuelle dans nos groupes et assurer qu’un nombre minimal de souris sera utilisé pour démontrer un effet (animaux du même âge, mâles et femelles, période d’habituation à l’environnement et à l’expérimentateur). Un grand soin est apporté aux animaux afin de limiter au maximum le stress qui pourrait entraîner des biais importants dans la détermination du seuil de sensibilité tactile. Le nombre de souris par lot a été déterminé sur la base d’expérimentations antérieures, ce qui nous a permis de déterminer qu’un nombre de 20 souris par groupe (10 males et 10 femelles) est nécessaire pour observer une différence statistique et biologiquement pertinente. Ainsi nous utiliserons le minimum d’animaux requis pour observer des différences statistiques entre les groupes, afin que les tests effectués soient pertinents mais sans sur-utilisation d’animaux.
Raffinement
Notre objectif étant d’étudier l’hypersensibilité à la douleur, nous n’interviendrons pas tant que les niveaux de douleur observés restent dans les seuils attendus pour les modèles utilisés. En revanche, toutes les procédures sont conçues dans le respect de l’animal et avec pour objectif constant de réduire au maximum le stress et l’anxiété, afin de limiter l’inconfort à ce qui est strictement nécessaire au protocole et d’assurer le bien être des animaux. Cela passe par une étape d’habitation progressives des animaux (1 semaine à l’arrivée pour les locaux, puis 1 semaine pour les pièces d’expérimentation) et une manipulation douce par du personnel formé, avec là aussi une période d’habituation quotidienne des animaux aux expérimentateurs. L’enrichissement fourni comprend les matériaux réglementaires de nidification, auxquels est ajouté un igloo rouge, contribuant à améliorer leur confort et leur sentiment de sécurité. Tout au long du projet, l’objectif reste de limiter l’angoisse et la souffrance. Les animaux feront donc l’objet d’un suivi clinique régulier, plusieurs fois par semaine (et chaque jour en période inflammatoire), pour identifier rapidement toute douleur excessive, perte de poids, difficulté locomotrice ou comportement anormal. Une grille d’évaluation clinique, accompagnée des actions à mettre en œuvre, permettra une prise en charge immédiate et adaptée, afin d’éviter toute douleur inutile. De plus, la durée des expériences est volontairement limitée pour réduire l’exposition aux modèles inflammatoires et minimiser la souffrance.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de greffe de microbiote chez l’animal. Elle permet d’évaluer les effets d’un microbiote donné sur le comportement, la douleur, l’inflammation et les interactions neuro immunes de manière intégrée, ce qui n’est pas possible chez des espèces plus simples. Les souris utilisées seront adultes et auront entre 8 et 21 semaines afin que les animaux ne soient ni en croissance ni en phase de vieillissement.
Utilisation d’agents d’imagerie TEP (radiotraceurs) dans le diagnostic et le suivi de traitements-MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
Rats : 1100
1 100 souris et 1 100 rats reçoivent des injections de traceurs radioactifs sous anesthésie générale, puis passent des séances d'imagerie pouvant durer deux heures, jusqu'à six fois en six semaines. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et tous les animaux sont tués à l'issue, la mise à mort étant justifiée par une seule phrase sur des "analyses post-mortem". Le porteur qualifie la technique de "non invasive" et affirme qu'aucune toxicité n'a été mise en évidence sur la répétition des injections, tout en prévoyant d'examiner les images pour vérifier "des changements possibles". Le projet sert aussi à caractériser des modèles tumoraux, la souris pour les tumeurs spontanées, le rat pour les cancers de petits organes comme la prostate.
Objectifs
L'imagerie par Tomographie par Émission de Positons (TEP) en préclinique est une technique très précieuse pour la recherche biomédicale. Elle permet d'observer et de suivre en détail des radiotraceurs. Un radiotraceur est substance fixée à un atome radioactif. Cette substance est choisie parce qu’elle va se diriger vers un organe ou un tissu particulier. Une fois injectée dans le corps, elle émet de très faibles rayonnements qu’on peut détecter avec la TEP.. Ainsi, les chercheurs peuvent visualiser la distribution de substances radioactives dans le corps, ce qui est particulièrement utile pour étudier des maladies comme le cancer. Cette méthode offre une image précise en 3D, permettant d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements, de comprendre la progression des maladies, ou encore de tester de nouvelles molécules.La TEP est donc un outil essentiel pour faire avancer la recherche médicale de manière sûre et efficace, tout en réduisant la nécessité d'expériences invasives. La TEP est couplée à de l’imagerie de tomodensitométrie (TDM), permettant d’avoir une cartographie complète de la molécule dans l’organisme. L’utilisation de cette technique permet : • De révéler des mécanismes biologiques, comme le métabolisme glucidique ou lipidique ou encore la prolifération cellulaire • De révéler et de suivre la réponse aux traitements dans différentes pathologies • Etudier la biodistribution (c’est-à-dire la répartition de la molécule dans les différents organes) de médicaments Par aillleurs, cette technologie est aujourd’hui largement utilisée chez les patients atteints de cancer pour le diagnostic et le suivi de réponse au traitement. Cependant les radiotraceurs disponibles sont limités (le [18F]FDG est utilisé dans 90% des cas en clinique. Analogue du glucose, il permet de voir les cellules surconssomatrices de glucose mais son utilisation est limitée dans les organes où il y a une fixation physiologique, comme le cerveau . De plus le [18F]FDG peut marquer des cellules inflammatoires ou infectieuses donnant des faux positifs dans le cas de détection de cancer. Le développement de nouveaux radiotraceurs est donc nécessaire pour une meilleure prise en charge des patients atteints de cancers et d’autres pathologies.
Bénéfices attendus
L’imagerie TEP va permettre de valider des radiotraceurs pour leur utilisation à la fois dans les projets scientifiques précliniques et cliniques. Elle va participer à l’amélioration de l’exploration physiologique et fonctionnelle en recherche, à la détection de tumeur et à la visualisation des réponses tumorales suite aux traitements. Cela va permettre des avancées majeures dans la compréhension du vivant. Le développement de nouveaux radiotraceurs plus spécifiques que ceux déjà disponibles va permettre une meilleure prise en charge des patients. Il est essentiel pour améliorer le diagnostic et le traitement des cancers tout en augmentant la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans diverses pathologies. Les cibles innovantes pour le développement de radiotraceurs en TEP se diversifient et s’adaptent aux besoins de détection et de traitement des maladies complexes. Nos recherches se concentrent sur des biomarqueurs et des mécanismes biologiques spécifiques pour permettre une imagerie plus précise, une détection précoce des maladies, et une meilleure évaluation de l'efficacité des traitements.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, un radiotraceur est injecté en intra-veineux aux animaux anesthésiés (1 fois par animal). Après injection du radiotraceur, l’animal est positionné sous la TEP/TDM (TDM, tomodensitomètre : scanner). Des images dynamiques (plusieurs acquisitions pouvant aller de 1h à 2h, réalisés une seule fois par animal) sont réalisées permettant d’évaluer et quantifier la distribution de la molécule marquée dans les organes au cours du temps (2h max) Dans un deuxième lot d’animaux, un radiotraceur est injecté en intra-veineux aux animaux anesthésiés, puis l’animal est réveillé. Après un intervalle de temps adéquat (défini grâce au premier lot d’animaux), l’animal est de nouveau anesthésié puis positionné sous la caméra pour un scanner, suivi de l’acquisition TEP (max 20min). Cette manipulation pourra être répétée 3 à 4 fois sur une période de 6 semaines maximum (avec administration de traitements ou non en parallèle), afin de suivre l’évolution des pathologies chez les animaux.
Impact sur les animaux
L’injection du radiotraceur par voie intraveineuse n’est pas douloureuse pour l’animal. Une gêne de courte durée liée à la piqûre elle-même est attendue. L’animal est imagé sous anesthésie générale pour avoir une parfaite immobilité, Les nuisances attendues sont celles d’une très légère hypothermie (contrecarrée par les systèmes de maintien de chaleur dans l’appareil d’imagerie.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
En premier lieu, des expérimentations in vitro se déroulent sur des cellules ou des tissus isolés, pour tester la spécificité, la liaison et la stabilité du radiotraceur. Cela permet de vérifier que la substance fixée avec un atome radioactif cible bien toujours la molécule ou le récepteur d’intérêt, tout en gardant les mêmes propriétés. Les atomes radioactifs sont choisis afin de garantir une absence de toxicité de la molécule elle même. Des résultats satisfaisants in vitro conditionnent le passage à la phase in vivo, c’est-à-dire sur des modèles animaux. Cette étape permet d’observer comment le radiotraceur se comporte dans un organisme vivant : sa distribution dans les différents tissus, sa capacité à atteindre la cible, sa dégradation et son élimination par l’organisme. Cela donne une image plus réaliste de son efficacité et de sa sécurité, en tenant compte des processus physiologiques complexes. En résumé, le passage de l’in vitro à l’in vivo permet de valider la pertinence du radiotraceur dans un contexte biologique complet, étape essentielle avant toute application clinique. Des tests sur animaux sont nécessaires afin de caractériser la biodistribution de la molécule, son activité en lien avec le métabolisme de l’organisme et sa quantification dans les tissus cibles. Il n’y a pas d’approche à ce jour qui puisse se substituer à ce type d'imagerie.
Réduction
L’objet de la demande vise à valider l’utilisation de radiotraceurs pour de l’imagerie TEP préclinique et à aider à caractériser des modèles tumoraux de façon non invasive. Ce type d’imagerie permet la réduction d’animaux puisqu’elle permet un suivi longitudinal du même animal au cours du temps Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental grâce à des approches statstiques robustes. A la fin de toutes les expériences, les tissus d’intérêt sont prélevés. Le maximum d’informations est récolté afin de répondre aux mieux aux questions scientifiques posées.
Raffinement
Les animaux seront suivis 3 fois par semaine afin d'assurer leur bien-être et mettre en place des soins si besoin. Les expérimentations seront arrêtées dès l’atteinte d’un point limite tel que décrit dans une grille de score. Lors de l’injection des radiotraceurs, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale. Un tapis et un lit chauffant permettent un maintien continu de leur température corporelle, leur évitant ainsi une hypothermie. De plus, les constantes vitales des animaux sont mesurées des, facilitant le monitoring durant les phases d’acquisition des images (scanner et TEP). Cette technique est dite « non invasive », l’injection du radiotraceur est uniquement sous forme de « trace ». Les doses de traceurs injectés n’induiront pas d’effets néfastes sur les animaux car la quantité de molécule est trop faible pour induire une modification conséquente des mécanismes biologiques. MODIFICATION : Pour ce qu’il est de la doses de radioactivité injectées, pour le suivi d’un animal il peut être injecté jusqu’à 6 fois sur une période de 6 semaines maximum. Nous respecterons le plus souvent, un délais de 7 jours minimum entre chaque injection de radiotraceur. Dans la littérature (préclinique et clinique) et par notre expérience aucune toxicité n’a encore été mise en évidence sur la répétition d’injection sur 6 semaines. Cependant les images TEP et TDM seront étudiées pour s’assurer des changements possibles. Si une étude demande plus d’injection et / ou imagerie sur un temps plus long, alors un suivi accru sera réalisé pour vérifier l’induction d’une quelconque toxicité (étude des images TEP et TDM histologie).
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont particulièrement utilisés en cancérologie : les souches sont génétiquement caractérisées et la parenté biologique avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Le choix du modèle murin ou rat sera dépendant de sa pertinence pour la question scientifique et son imagerie. Par exemple, les modèles de rat seront préferentiellement choisis lors de cancers ciblant des organes petits, comme la prostate ou dans l’étude de métastases. En revanche, dans le cas de tumeur spontanée développée sur un modèle murin mimant la pathologie humaine, alors la souris sera utilisée. Les études sont réalisées sur des animaux adultes afin de favoriser la reproductibilité des résultats (métabolisme différent à différents stades de développement, …)
Etude de la pénétration intestinale de nanoparticules chez la souris dans le cadre de la vaccination muqueuse
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Sur 1 232 souris, 714 subissent une ouverture de l'abdomen, une manipulation de leurs organes et une ligature de l'intestin sous une anesthésie pouvant durer une heure quarante-cinq, sans jamais se réveiller. Les 518 autres reçoivent un gavage unique après six heures de jeûne, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Toutes sont tuées pour prélever les organes et mesurer si des nanoparticules franchissent la muqueuse intestinale. Le vaccin à ARN messager pris par la bouche, qui justifie ces expériences, reste annoncé comme un bénéfice à long terme, aucun n'existant aujourd'hui.
Objectifs
Développer des vaccins plus efficaces contre les infections au niveau des muqueuses est un enjeu important, notamment celles qui commencent au niveau des muqueuses. Les muqueuses sont en effet la porte d’entrée de nombreux virus et bactéries. Parmi elles, la muqueuse intestinale est particulièrement intéressante, car elle contient de nombreux éléments du système immunitaire et peut déclencher une forte défense directement à l’endroit où l’infection débute. Cependant, administrer un vaccin par voie orale est difficile à cause de l’acidité de l’estomac, des enzymes digestives et de la couche de mucus qui protège l’intestin. La pandémie du Covid-19 a permis le développement de nouveaux vaccins utilisant l’ARN messager (ARNm), une molécule naturellement présente dans notre organisme qui donne aux cellules les instructions pour fabriquer des protéines. Cet ARNm est transporté par des nanoparticules composées de lipides. Néanmoins, il n’existe encore aucun vaccin à ARNm pouvant être pris par voie orale. Pour relever ce défi, des nanoparticules combinant des lipides et des polymères pourrait offrir une meilleure protection de l’ARNm et faciliter son passage jusqu’à la muqueuse intestinale. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer si ces nanoparticules peuvent atteindre et traverser la muqueuse intestinale, que ce soit après une administration directe dans l’intestin ou après une administration orale.
Bénéfices attendus
Ce modèle expérimental permet d’étudier comment les nanoparticules peuvent traverser la paroi de l’intestin. De plus, la résistance des nanoparticules à l’environnement digestif et leur répartition dans l’intestin seront évaluées après administration orale. Cette étude vise également à mieux comprendre la relation entre la composition des nanoparticules et leur comportement au contact de la muqueuse intestinale, afin de sélectionner les vaccins candidats les plus prometteurs. Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement d’un vaccin à ARNm administré par voie orale, pouvant être adapté à différents agents infectieux touchant le système digestif.
Procédures
Un groupe de 714 souris sera soumis à une chirurgie abdominale sans réveil et recevra donc une anesthésie générale d’une durée maximale de 1h45. Un autre groupe, composé de 518 souris, recevra une administration orale par gavage (1 fois/animal, durée de moins d’une minute).
Impact sur les animaux
Six heures avant l’anesthésie, les souris seront mises à jeun, mais avec un accès libre à l’eau, ce qui entraîne un stress. Les effets liés à l’intervention chirurgicale comprennent : • l’injection d’un traitement contre la douleur ; • l’anesthésie générale ; • les effets d’une anesthésie générale : les troubles cardio-respiratoires, la baisse de température corporelle, une déshydration ou une sécheresse des yeux ; • l’ouverture de l’abdomen, la manipulation des organes, la ligature de l’intestin ; • la fermeture de l’abdomen et de la peau ; • la durée de l’intervention. Les effets attendus liés à l’administration par voir orale : • le stress lié à la contention de l’animal, • l’administration orale par gavage chez des animaux conscients, provoquant un stress et une possible gêne après administration.
Devenir
A l’issu des trois procédures, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de prélever les organes d’intérêts.
Remplacement
Avant de tester les nanoparticules chez l’animal, des expériences ont été réalisées sur des cellules intestinales et immunitaires, ainsi que sur un modèle en trois dimensions reproduisant partiellement l’intestin humain. Cependant, ces modèles ne reflètent pas entièrement la réalité du corps vivant et ne possèdent pas certaines structures de la paroi intestinale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet tout en garantissant des résultats fiables. Au total, le projet prévoit l’utilisation de 1232 souris sur une période de 5 ans. Des tests préliminaires ont permis de sélectionner uniquement les formulations les plus prometteuses, ce qui réduit fortement le nombre d’animaux nécessaires. L’optimisation des conditions expérimentales permettra, si les résultats sont prometteurs, de diminuer encore ce nombre. Les formulations seront évaluées et comparées progressivement. Celles ne donnant pas de résultats satisfaisants seront écartées, afin de concentrer les études sur un nombre restreints de candidats. A terme, seules quatre formulations seront retenues pour les étapes finales. De plus, des temps d’étude optimisés seront sélectionnées afin de réduire davantage le nombre d’animaux utilisés. Cette approche progressive et sélective permettra de limiter au maximum le nombre d’animaux.
Raffinement
Pendant l’intervention, les souris seront placées sous anesthésie générale. Un médicament analgésique sera également administré avant la chirurgie. Une surveillance étroite des animaux sera assurée notamment pour vérifier la profondeur de l’anesthésie. Un tapis chauffant sera utilisé pour maintenir la température corporelle et un film protecteur recouvrira la zone afin de limiter la déshydratation. Un gel sera appliqué sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Des points limites sont définis afin de repérer rapidement tout signe de souffrance ou de problème chez les animaux. Si l’un de ces critères est atteint, des mesures seront prises immédiatement, et si nécessaire, l’animal sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé dans la recherche afin d’étudier comment des nanoparticules traversent la muqueuse intestinale. Dans ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisées afin d’analyser la pénétration et l’interaction des nanoparticules avec la muqueuse intestinale. Des souris de plus de 7 semaines seront utilisées afin d’assurer un système immunitaire mature.
Modèle nutritionnel de calculs biliaires chez la souris- MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Quarante heures d'isolement en cage individuelle sans enrichissement, vingt heures sur grille pour récolter urines et selles, un jeûne avant chacun des huit prélèvements de sang : 3 450 souris subissent ces procédures, classées en souffrance modérée, toutes tuées pour prélever tissus et sang. Un régime enrichi en cholestérol et en acides biliaires leur fait développer des calculs biliaires, avec inflammation du foie, sensibilité accrue à la douleur abdominale et jaunisse possibles, chez des souris génétiquement modifiées qui développent déjà spontanément la maladie. Le porteur qualifie ces complications hépatiques et intestinales de modérées tout en choisissant ce modèle pour étudier des stades plus avancés et plus sévères de la maladie. Il revendique le nombre minimal d'animaux, et cette version du projet en ajoute 1 650 à l'autorisation initiale.
Objectifs
La formation de calculs biliaires peut entrainer des dysfonctions biliaires, hépatiques et intestinales importantes, notamment une inflammation sévère du foie qui peut elle-même entrainer un hépatocarcinome ou autrement appelé cancer du foie. Le but de ce projet est de modéliser ces dysfonctions en provoquant la formation de calculs biliaires et ainsi pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments. L'AJOUT D'UNE PROC2DURE NECESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISE AVEC AJOUT DE 1650 SOURIS.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de valider ou non des traitements limitants le développement de calculs biliaires et donc l’apparition des complications hépatiques et intestinales associées.
Procédures
Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles sur animal vigile ou anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile. 8 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 4h maximum avant le prélèvement. A maximum 4 étapes, nous mesurerons divers paramètres urinaires et fécaux (récolte pendant 20h par l’intermédiaire de cages à métabolisme). A maximum 2 étapes, nous mesurerons la composition corporelle (2 min sur animal vigile), la consommation énergétique (40h en cage individuelle sans enrichissement sur animal vigile), la force musculaire (5 minutes sur animal vigile).
Impact sur les animaux
1) La mise sous régime enrichi en cholestérol et en acide biliaire, va accentuer la formation de calculs biliaires. 2)Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3) Les mises à jeun (4h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress. 4)Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 20h. 5)Les mesures de consommation énergétiques impliquent un isolement pendant 40h, ce qui induit un stress à l'animal. 6)Les souris génétiquement modifiées développent spontanément une pathologie chronique. Ces évolutions de la maladie peuvent entrainer des modifications du comportement général, telles que : baisse d’activité, poil terne, diminution de la prise alimentaire ou perte de poids, augmentation possible de la sensibilité à la douleur abdominale ou à l’inconfort lié à l’inflammation chronique, une jaunice dans le sang.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno-marquages et expression de gènes, paramètres métaboliques...)
Remplacement
Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développés pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions associées à la formation de calculs biliaires notamment au niveau du foie et de l’intestin ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.
Réduction
Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. Une analyse statistique permettra d'utiliser le nombre minimal d'animaux tout en assurant la robustesse des résultats.
Raffinement
Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux. L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une rougeur ou plaies cutanées, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront.
Choix des espèces
La souris développe des calculs biliaires sous régime lithogénique entrainant des complications hépatiques et intestinales de façon modérée. La souris génétiquement modifiée est dépourvue de certains transporteurs, ce qui engendre une accumulation de lipides dans le foie et une accumulation d’acides biliaires dans la circulation sanguine et dans la bile. En utilisant ce modèle génétiquement modifié et prône à développer des calculs biliaires, cela nous permet d’exacerber l’effet du régime lithogénique et donc d’étudier des stades plus avancés et plus sévères de la maladie. Les animaux sont mis sous régime à l’âge de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge de maturité sexuelle.
Régulation des molécules antimicrobiennes par le microbiote intestinal chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Deux à trois secondes de biopsie au bout de la queue, une fois par animal : les gestes déclarés s'arrêtent là pour 1 080 souris, dont 160 relèvent d'une souffrance modérée, toutes tuées ensuite pour analyses. Les atteintes annoncées sont d'un autre ordre, avec une inflammation intestinale accompagnée de diarrhée et d'une possible perte de poids, et des lignées porteuses d'un phénotype dommageable qui apparaît après quatorze semaines. L'objet du projet est de modifier le microbiote intestinal de ces souris pour mesurer l'effet sur l'expression de molécules antimicrobiennes. Rien n'indique comment l'inflammation intestinale est provoquée, et le bénéfice tient en une phrase sur des approches thérapeutiques innovantes.
Objectifs
La flore intestinal (microbiote) joue un role crucial contre le développement de nombreuses maladies inflammatoires intestinales et extra-intestinales. Des études récentes montrent que le microbiote intestinal module l'expression de molécules antimicrobiennes dans différents organes qui peuvent jouer un role dans la protection contre ces maladies inflammatoires. Notre objectif est d'induire différents contextes intestinaux dans lesquels le microbiote est modifié et d'évaluer l'impact sur l'expression des molécules antimicrobiennes.
Bénéfices attendus
Notre étude révélera les mécanismes protecteurs du microbiote intestinal contre les maladies inflammatoires et ouvrira la voie à des approches thérapeutiques innovantes.
Procédures
- Biopsie de l'extrêmité de la queue sur souris vigile : 1 fois par animal, 2-3 secondes.
Impact sur les animaux
-Développement d'une inflammation intestinale associée à une diarrhée et une possible perte de poids. -les lignées à phénotype dommageable seront utilisées dans les procédures avant l'apparition de ce phénotype. -La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress léger chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses.
Remplacement
Pour étudier les interactions complexes entre le microbiote intestinal et les tissus, seuls les modèles in vivo sont relevants. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentations déjà menées.
Réduction
les groupes ont été dimensionnés par une étude statistique adaptée. Une analyse de puissance statistique a été utilisée pour déterminer le nombre minimum d'animaux nécessaires.
Raffinement
-nombre d’individus par cage adapté pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Selon le plan d’action défini, par les expérimentateurs : Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris car leur microbiote intestinal est proche de celui de l'homme et peut être modifié. Les biopsies pour génénotypage de l’extrême pointe de la queue sont effectuées à l’âge de 10 jours âge assez avancé pour être sexés correctement et suffisamment précoce pour le système nerveux qui n’est pas encore parfaitement achevé pour permettre de procéder à l’identification et à la biopsie avec une douleur minimale. Les souris adultes de 8 à 14 semaines seront utilisées avant l'apparition de symptômes pour les lignées à phénotype dommageable qui se fait après 14 semaines d'age.
Etude cinétique chez le porcelet d’un biocide après exposition orale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Dans les élevages porcins, les ammoniums quaternaires servent à désinfecter camions, locaux, abreuvoirs et nourrisseurs sans rinçage, ce qui expose les porcelets dès leur arrivée. 24 porcelets de 28 jours vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, exposés cette fois à des doses connues par leur alimentation. Onze prélèvements de matières fécales sont effectués sur 28 jours, par défécation spontanée ou par écouvillon, et le porteur n'attend qu'une éventuelle diarrhée légère. Aucun porcelet ne sera tué à l'issue, tous étant réutilisés dans une procédure ultérieure, ce que le porteur présente comme une contribution à la réduction du nombre d'animaux utilisés.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le programme Ecoantibio, qui vise à limiter la sélection et la dissémination de bactéries résistantes aux antibiotiques ou antimicrobiens. Or, pour les pratiques d’hygiène dans les élevages porcins, des désinfectants sont utilisés. Il est reconnu que ces désinfectants, et notamment les ammoniums quaternaires (QAC), peuvent participer indirectement à la sélection et à la dissémination de bactéries résistantes aux antibiotiques. Ces QAC sont utilisés dans le cadre des procédures de nettoyage et de désinfection des camions de transport, des locaux, des abreuvoirs et des nourrisseurs, avant l’arrivée des porcelets (et ne sont pas rincés), ce qui provoque une exposition involontaire des porcelets et de leurs bactéries intestinales (microbiote intestinal). Ainsi, ce projet vise à mieux comprendre comment les populations bactériennes du microbiote intestinal des porcelets se comportent lors d’une exposition maîtrisée (différentes doses connues) aux QAC, et de suivre l’évolution des bactéries résistantes aux antibiotiques, suite à cette exposition, depuis les matières fécales des porcelets jusqu’au moment de l’épandage de ces lisiers dans l’environnement. De plus, un dosage des QAC dans les matières fécales des porcelets, puis dans les lisiers, permettra d’avoir un aperçu des concentrations présentes dans ces matrices suite à cette exposition, et un aperçu de la rémanence de ces molécules.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'approfondir nos connaissances sur l'évolution des populations bactériennes en lien avec l'exposition aux désinfectants usuels dans les élevages porcins, et de mieux caractériser le rôle de ces désinfectants, et notamment les QAC, dans la perturbation du microbiote intestinal des porcs et la sélection de bactéries résistantes aux antibiotiques. Cela permettra in fine de proposer des pistes pour caractériser et optimiser les procédures d’hygiène en élevage porcin en prenant en compte la problématique de l’antibiorésistance, et d’émettre des recommandations éclairées concernant les pratiques.
Procédures
Durant l'experimentation, une récupération d'échantillons fécaux, soit par défécation spontanée, soit par stimulation avec un écouvillon sera effectuée régulièrement chez tous les animaux. Onze prélèvements de ce type auront lieu sur une période de 28 jours. La durée de cet acte ne dépassera pas 3 à 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’administration des QAC sera faite via l’alimentation à des doses ne provoquant pas d’effets indésirables cliniques. Eventuellement une légère diarrhée pourra être observée. Les prélèvements de féces n’engendreront qu’une légère contention qui pourra être source d’angoisse mais qui sera brève.
Devenir
Les animaux seront réutilisés dans une future procédure car la procédure effectuée sur ces animaux est légère. Cette réutilisation permettra de contribuer à la réduction (régle des 3R) du nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques, en évitant d'avoir recours à de nouveaux animaux.
Remplacement
En ce qui concerne l’étude de l’émergence ou sélection de bactéries/supports de la résistance aux antimicrobiens, il n’existe pas de modèle in vitro suffisamment développé et performant permettant de reproduire l’environnement complexe du tube digestif et du microbiote intestinal afin d’étudier les conséquences d’une exposition aux ammonium quaternaire et de prédire les niveaux de concentrations retrouvées. De plus, le remplacement partiel n’est pas possible car il s’agit de l’espèce cible de cette exposition (involontaire) aux biocides en élevage.
Réduction
Nous avons réduit au minimum le nombre de porcelets par groupe (6 animaux), à savoir 24 porcelets répartis dans 4 groupes ce qui permetra d’estimer correctement la variabilité inter-individuelle pour les concentrations fécales de QAC grâce à un modèle mathématique. Cela sera nécessire également pour obtenir la puissance statistique suffisante pour comparer la composition du microbiote entre les groupes.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux auront une période d’acclimatation d’une semaine. Les animaux seront hébergés par groupe de 3 animaux dans des box sur caillebotis. Les cloisons en plexiglas transparentes entre chaque case permettent un contact visuel et olfactif entre les autres groupes voisins. Des jouets seront mis à disposition : balle, ainsi que jouets à mâcher suspendus. Une surveillance quotidienne du comportement et de l’état général des animaux sera effectuée, au regard de leur consommation d’eau, de leur alimentation, et en effectuant des mesures du poids.
Choix des espèces
Nous avons fait le choix d'utiliser des animaux similaires à ceux utilisés en élevage agricole afin de se rapprocher le plus possible des pratiques du terrain et avoir des résultats plus concrets. Les porcelets utilisés auront 28 jours. Ce stade correspond au passage au post-sevrage du porcelet, ce qui correspond à une exposition forte des animaux dans les élevages conventionnels aux biocides utilisés pendant les phases de désinfection des bâtiments, qui ont lieu quelques jours/heures avant le passage des animaux à la phase d’engraissement.
Bioaccessibilité orale de contaminants (tels que les métaux lourds) présents dans les sols, en utilisant un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour valider un test in vitro normalisé, 1 410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 290 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent dix jours en cage à diurèse, sur grille, sans litière ni coton de nidification, ce que le porteur décrit comme un "inconfort constant". Leurs croquettes sont élaborées avec des échantillons de sols contaminés au chrome et au nickel, ce qui réduit la prise alimentaire et empêche l'usure normale des dents, et leurs reins sont prélevés après la mise à mort. Le test ainsi validé est une norme ISO d'évaluation des risques liés aux sols pollués, le porteur présentant le passage du porcelet à la souris comme un gain d'information.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de valider le test in vitro "Unified Barge Method" (Norme International Organization for Standardization 17924:2019) pour l’évaluation de la bioaccessibilité des métaux lourds, tels que le chrome et le nickel, en s’appuyant sur le modèle souris, en établissant des corrélations in vitro-in vivo fiables au regard des critères de validation entre bioaccessibilité et biodisponibilité relative, afin d’améliorer l’évaluation des risques sanitaires liés à l’exposition aux sols contaminés.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de confirmer les résultats obtenus sur le modèle porcelet, mais également d’apporter de nouveaux résultats, tels que la mesure des métaux dans les urines sur le modèle murin. L’établissement de relations dose-réponse linéaires pour les matrices de référence de métaux lourds (Nickel, Chrome II et Chrome VI) constitue une étape fondamentale pour évaluer la biodisponibilité relative des sols contaminés. Cette linéarité, qui suppose une proportionnalité entre la dose administrée et l’accumulation dans les matrices biologiques cibles, est essentielle pour comparer de manière fiable les sols aux références. Il s’agira plus spécifiquement de surmonter les limites rencontrées avec le modèle porcelet, notamment la difficulté de collecter les urines, en utilisant la souris pour faciliter la collecte des matrices biologiques, en particulier des urines et des reins (organes principaux d’accumulation pour Chrome et Nickel). Les bénéfices attendus de la troisième procédure sont également une confirmation des résultats déjà obtenus in vitro.
Procédures
Mesure de l'acceptation de la nourriture supplémentée avec de la terre. Les animaux seront placées en cages à diurèse pendant 10 jours consécutifs
Impact sur les animaux
L'utilisation des cages à diurèse sur une durée prolongée (10 jours) entraîne un inconfort constant (grille, absence de litière, de coton de nidification). L'alimentation AIN-93G peut induire une diminution de la prise alimentaire et limite l'usure de dents réalisée avec les croquettes classiques.
Devenir
À la fin de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés. Cette étape est nécessaire afin de prélever différents organes, notamment les reins, afin de mesurer la biodisponibilité des métaux lourds et d’effectuer les analyses biologiques prévues dans le protocole expérimental.
Remplacement
L'objectif est de valider le test in vitro "Unified Barge Method" (Norme International Organization for Standardization 17924:2019) pour l’évaluation de la biodisponibilité relative des métaux lourds, tels que le chrome et le nickel, des sols contaminés. Le remplacement du modèle porcelet par la souris permettra d'obtenir des informations supplémentaires, notamment grâce à la collecte des urines en cages à diurèse. L'utilisation d'un modèle animal pour déterminer la bioaccumulation dans les tissus reste, à ce jour, indispensable.
Réduction
La réalisation des tests sur un seul des deux sexes, en fonction des résultats obtenus, permet de diviser le nombre d’animaux par deux. Dans la littérature, les expérimentations étant généralement réalisées sur des souris femelles, cependant, elle sera réalisée afin de considérer les deux sexes pour justement les comparer (car pas ou peu fait dans la littérature) et voir quel sexe serait le plus pertinent pour n’en sélectionner qu’un (et donc réduire le nombre d’animaux). La mesure de l'acceptation de l'alimentation ne sera réalisée qu'une seule fois si les matrices testées sont identiques, ce qui limite les répétitions inutiles. De plus, le nombre de souris sera réduit si une même matrice est testée lors d’une deuxième session. Enfin, si des animaux issus de procédures non invasives sont disponibles, le choix se portera sur l'utilisation de ces animaux afin d’éviter la commande de nouveaux animaux. Le principe de réduction a été appliqué dans la définition des effectifs, avec un minimum de 6 animaux par groupe , ce qui représente le seuil nécessaire pour garantir la robustesse des analyses statistiques, tout en tenant compte des éventuelles variations individuelles de croissance. Enfin, après euthanasie, les prélèvements collectés seront divisés en aliquotes pour réaliser plusieurs analyses sur un même individu. Cette approche maximise l’exploitation des données et contribue à une réduction significative du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Dès leur réception, les animaux seront placés par 6 dans les cages durant les phases (acclimatation, la mesure de l'acceptation de l'alimentation et avant la mise dans les cages à diurèse). Les souris ne seront pas isolées, elles seront hébergées par deux dans les cages à diurèse pour ne pas induire de stress lié à l’isolement. Toutes les cages seront équipées d’éléments d’enrichissement environnemental : tunnels ou maisons rouges, litière, coton de nidification et rondins de bois. Les urines, fèces et reins des 2 animaux seront donc respectivement poolées par cage et il est prévu d’avoir pour chaque condition 3 cages, ce qui permettra d’évaluer la répétabilité. Afin de diminuer le stress induit par les différentes procédures, un entraînement préalable sera mis en place pour habituer les animaux à la contention et aux cages à diurèse. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne lors des phases d’acclimatation et de l’étude préliminaire et seront observés attentivement. Pour les souris hébergées en cages à diurèse, une évaluation systématique de l’état de santé sera réalisée deux fois par jour à l’aide d'une grille de score. Un arbre décisionnel sera également appliqué pour garantir une prise de décision rapide et appropriée en cas de signes de détresse. Pour améliorer le confort des souris, les grilles des cages à diurèse, seront remplacées par des plaques avec des trous, et des maisons rouges ou tunnels y seront installés afin d’offrir aux animaux un espace où se cacher. Un rondin de bois suspendu sur le côté des cages (afin d’éviter que les souris urinent dessus) sera également ajouté. Il permettra de compenser le fait que les croquettes (élaborées avec les différents échantillons de sol) seront proposées sous forme de pâtée, en offrant aux souris la possibilité d’exprimer leur comportement de rongeur. La conception des plaques perforées a été pensée dans un objectif d’amélioration du bien-être animal. Toutefois, afin d’éviter ou de limiter la stagnation des selles et des urines, les plaques seront légèrement inclinées vers le centre. Les plaques seront fabriquées à façon (fabricarium, Polytech) et des essais seront réalisés pour vérifier l’absence de stagnation avant que la totalité des plaques ne soit fabriquée. Une alternative serait, en cas d’observation d’une stagnation, un remplacement quotidien des plaques perforées, permettant ainsi leur nettoyage et leur séchage.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour compléter les résultats obtenus lors d'une première étude réalisée sur le porcelet. En effet, la collecte des urines n'avait pas été possible chez le porcelet, alors que les métaux lourds, tels que le nickel et le chrome se retrouvent en partie dans les urines. Le choix de la souris se justifie également par la disponibilité des cages à diurèse adaptées à cette espèce, permettant la collecte optimale des urines nécessaires à l’analyse de la biodisponibilité des métaux. Les animaux utilisés seront adultes (âgés de plus de 9 semaines). À ce stade, leur poids est stabilisé et le facteur croissance n’impactera pas la prise alimentaire.
ROLE DU MICROBIOTE INTESTINAL SUR LA SENSIBILISATION CENTRALE A LA DOULEUR DANS LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Aucun antalgique ni analgésique systématique n'est administré, parce qu'il fausserait la mesure de la douleur étudiée. 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, par groupes de vingt. Elles reçoivent le microbiote intestinal de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, subissent une arthrite induite avec gonflements et rougeurs des pattes, puis des tests de sensibilité au toucher et au froid et des tests d'anxiété et de dépression, avant que leur cerveau et leur intestin soient prélevés. Le porteur écrit vouloir "éviter toute douleur inutile" et annonce qu'il n'interviendra pas tant que les niveaux de douleur observés resteront dans les seuils attendus.
Objectifs
Chez les personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde, 20 à 30 % continuent d’avoir des douleurs même si leur maladie est bien traitée. Leur corps réagit plus facilement à la douleur que celui de personnes non malades, et elles ont aussi souvent plus d’anxiété et de dépression. La flore intestinale, c'est-à-dire les bactéries présentes dans nos intestins, joue un rôle dans la maladie, et on sait qu'un lien important existe entre l’intestin et le cerveau. Nous pensons donc que les modifications de la flore intestinale des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde favorisent la douleur chronique et la dépression, notamment chez les patients qui ont des symptômes qui persistent après traitement. Pour mieux comprendre comment tout cela fonctionne, nous allons étudier l’impact de leur flore intestinale en la transférant à des souris. Ensuite, nous observerons ces souris avec différents tests permettant d’évaluer leur sensibilité au toucher ou au froid, mais aussi des tests qui permettent d’évaluer l’anxiété ou la dépression. Nous testerons l’effet des microbiotes dans deux situations : chez des souris saines pour évaluer les effets déclencheurs des microbiotes, et en conditions pathologiques, c’est à dire chez des souris avec de l’arthrite pour évaluer cette fois les effets aggravateurs des microbiotes. Une fois prouvé le rôle du microbiote, nous identifierons quels éléments issus du microbiote intestinal sont responsables pour pouvoir les cibler et tenter de bloquer les mécanismes qui déclenchent ou aggravent la maladie. L’objectif final est d’identifier des composés du microbiote pouvant réduire la douleur ou les troubles anxio dépressifs, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients.
Bénéfices attendus
La douleur chronique et de la dépression restent difficiles à traiter chez certains patients, ce qui impacte fortement leur qualité de vie. Il est donc essentiel de comprendre l'origine de l’hypersensibilité à la douleur et de la dépression pour permettre le mieux les soigner. Une fois prouvé rôle de la flore intestinale, nous analyserons et comparerons les différents microbiotes pour identifier quelles sont les bactéries ou quelles sont les molécules produites pourraient expliquer l’hypersensibilité à la douleur et de la dépression. Ceci nous permettra ainsi de tester leur rôle protecteur chez les souris avant de les tester en clinique chez les patients. Ce projet permettra donc une véritable recherche translationnelle, du laboratoire au patient, avec pour objectif d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de douleurs chroniques ou de dépression.
Procédures
Nous réalisons des greffes de microbiote intestinal en donnant aux souris par voie orale des préparations de microbiote de patients une fois par semaine pendant 4 semaines. Suite à la greffe de microbiote, les souris seront suivies chaque semaine grâce à des tests comportementaux pour mesurer les seuils de sensibilité (réaction au toucher par filaments de Nylon ou réaction à la température) et caractériser les comportements anxieux ou dépressifs. Chaque test dure entre 5 et 20 min. Dans certains cas, nous examinons aussi si le microbiote modifie la perméabilité de l’intestin ou le passage de substances vers le cerveau, en administrant des traceurs fluorescents par voie orale ou par injection. Ces expériences sont menées chez des souris saines mais aussi dans différents modèles d’inflammation (polyarthrite aiguë ou chronique, inflammation locale de la patte). Les inflammations sont induites par l’injection de molécules inflammatoires, toujours sous anesthésie légère par inhalation. Enfin, lorsque des molécules produites par le microbiote auront été identifiées (comme des dérivés du tryptophane, de la sérotonine, des métabolites de fibres ou des acides biliaires), nous les ajouterons dans l’eau de boisson des souris pour tester leur effet bénéfique dans les modèles les plus pertinents.
Impact sur les animaux
La sensibilité tactile et thermale et les comportements anxio-dépressifs étant les paramètres étudiés dans nos procédures, aucune médication antalgique ou analgésique systématique ne peuvent être appliquées car ils fausseraient nos résultats. Les principaux désagréments pour les animaux seront liés aux modèles inflammatoires utilisés pour induire l’arthrite ou l’inflammation locale. Ces inflammations provoqueront des douleurs articulaires, des gonflements et des rougeurs au niveau des pattes. L’arthrite aiguë sera de courte durée (maximum 2 semaines), avec retour à un état normal. L’arthrite chronique durera plus longtemps, mais la durée de suivi sera limitée à 5 semaines après l’apparition des premiers symptômes d’arthrite pour éviter des souffrances prolongées. Les animaux subiront également des piqures d’aiguilles, un stress léger passager lié aux manipulations. Toutes les injections seront pratiquées sous anesthésie légère par inhalation, d’une durée d’environ 5 minutes, afin de réduire au maximum la douleur et l’inconfort.
Devenir
La douleur étant étudiée, et donc induite, chez certains animaux, le devenir de ceux-ci en fin de procédure expérimentale sera systématiquement l’euthanasie afin de ne pas générer de douleur inutile. De plus, L’euthanasie permet également de réaliser les analyses post mortem nécessaires, notamment sur le cerveau et l’intestin, afin de compléter les données comportementales et d’approfondir la compréhension des mécanismes reliant microbiote, douleur et comportements anxio dépressifs.
Remplacement
Ce projet vise à comprendre comment le microbiote intestinal influence la douleur et les comportements associés dans la polyarthrite rhumatoïde. A ce jour, il n'existe pas de modèle de substitution permettant d'étudier les interactions complexes entre microbiote, système immunitaire, système nerveux et comportement. Par ailleurs, la perception de douleur, ainsi que les réponses anxieuses ou dépressives, sont des phénomènes appréhendés par l’organisme conscient, et lui seul. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.
Réduction
Tout sera mis en œuvre pour réduire la variabilité interindividuelle dans nos groupes et assurer qu’un nombre minimal de souris sera utilisé pour démontrer un effet (animaux du même âge, mâles et femelles, période d’habituation à l’environnement et à l’expérimentateur). Un grand soin est apporté aux animaux afin de limiter au maximum le stress qui pourrait entraîner des biais importants dans la détermination du seuil de sensibilité tactile. Le nombre de de souris par lot a été déterminé sur la base d’expérimentations précédentes réalisées, ce qui nous a permis de déterminer qu’un nombre de 20 souris par groupe (10 males et 10 femelles) est nécéssaire pour observer une différence statistique et biologique. Ainsi nous utiliserons le minimum d’animaux requis pour observer des différences statistiques entre les groupes, afin que les tests effectués soient pertinents mais sans sur-utilisation d’animaux.
Raffinement
Notre objectif étant d’étudier l’hypersensibilité à la douleur, nous n’interviendrons pas tant que les niveaux de douleur observés restent dans les seuils attendus pour les modèles utilisés. En revanche, toutes les procédures sont conçues dans le respect de l’animal et avec pour objectif constant de réduire au maximum le stress et l’anxiété, afin de limiter l’inconfort à ce qui est strictement nécessaire au protocole et d’assurer le bien être des animaux. Cela passe par une étape d’habitation progressives des animaux (1 semaine à l’arrivée pour les locaux, puis 1 semaine pour les pièces d’expérimentation) et une manipulation douce par du personnel formé, avec là aussi une période d’habituation quotidienne des animaux aux expérimentateurs. L’enrichissement fourni comprend les matériaux réglementaires de nidification, auxquels est ajouté un igloo rouge, contribuant à améliorer leur confort et leur sentiment de sécurité. Tout au long du projet, l’objectif reste de limiter l’angoisse et la souffrance. Les animaux feront donc l’objet d’un suivi clinique régulier, plusieurs fois par semaine (et chaque jour en période inflammatoire), pour identifier rapidement toute douleur excessive, perte de poids, difficulté locomotrice ou comportement anormal. Une grille d’évaluation clinique, accompagnée des actions à mettre en œuvre, permettra une prise en charge immédiate et adaptée, afin d’éviter toute douleur inutile. De plus, la durée des expériences est volontairement limitée pour réduire l’exposition aux modèles inflammatoires et minimiser la souffrance.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de greffe de microbiote chez l’animal. Elle permet d’évaluer les effets d’un microbiote donné sur le comportement, la douleur, l’inflammation et les interactions neuro immunes de manière intégrée, ce qui n’est pas possible chez des espèces plus simples. Les souris utilisées seront adultes et auront entre 8 et 21 semaines afin que les animaux ne soient ni en croissance ni en phase de vieillissement.
Etude du rôle de l’intestin grêle dans les altérations métaboliques chez le porc.
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Un cathéter est posé chirurgicalement dans la veine jugulaire de chaque animal, qui subit ensuite cinq prélèvements de l'intestin grêle sous endoscopie et un régime riche en graisses et en sucres, avec ou sans émulsifiants. 70 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, l'hébergement en loges individuelles étant reconnu comme une source de stress. L'objectif déclaré est de suivre l'intestin grêle du mini-porc Yucatan pendant l'installation de l'obésité, puis pendant une perte de poids obtenue par un régime de type méditerranéen. Le porteur annonce une prise de poids, une dyslipidémie, un contrôle glycémique perturbé et une hypertension chez les animaux nourris au régime obésogène, en précisant que ces atteintes "font partie des objectifs du projet".
Objectifs
La prévalence actuelle de l’obésité et du surpoids, qui touchent plus de 40% de la population mondiale, et des pathologies associées comme le diabète de type 2, nécessite d’accentuer les efforts de recherche pour comprendre les liens entre alimentation et santé. La composition de l’aliment, notamment riche en lipides et en sucres mais aussi la présence d’émulsifiants dans l’alimentation sont des facteurs clés du développement de l’obésité. De nombreux travaux ont montré le rôle joué par le microbiote intestinal et l’intestin distal dans le développement du surpoids et de l’obésité. Alors que la plupart des travaux se sont focalisés sur le microbiote fécal chez l’Homme, des travaux récents suggèrent que le microbiote du petit intestin pourrait aussi jouer un rôle. Cependant, les données actuelles chez l’Homme ne permettent pas de bien comprendre ce rôle lors de l’installation de l’obésité ou au contraire lors d’une prise en charge diététique pour perdre du poids. Or, ces connaissances sont nécessaires pour pouvoir proposer des stratégies pertinentes pour prévenir ou atténuer les conséquences du surpoids et de l’obésité L’objectif de ce projet est de suivre l’évolution de différents paramètres au niveau du petit intestin chez le mini-porc Yucatan rendu obèse via la consommation d’un régime hyperénergétique riche en lipides et en sucres et contenant ou non des émulsifiants puis lors d’une perte de poids induite par la réduction des apports énergétiques et un régime de type Méditerranéen. Ce régime est en effet connu chez l’Homme pour ses effets protecteurs sur la santé.
Bénéfices attendus
Ce projet ayant recours à l’expérimentation animale est complémentaire d’une étude clinique menée chez l’Homme. Ce projet mené chez le mini-porc apportera des connaissances plus fines sur la cinétique des interactions entre le microbiote du petit intestin et les modifications du métabolisme et du comportement alimentaire dans la mise en place de l’obésité et la perte de poids. Nos analyses permettront d’identifier des espèces bactériennes et/ou des métabolites bactériens d’intérêt et leurs liens avec la composition de l’aliment. Ces données pourront être comparées aux données obtenues chez l’Homme. Ces connaissances seront utiles pour, à terme, proposer des régimes alimentaires préservant la santé chez l’homme via leur action sur la composition ou le métabolisme bactériens et pour développer des probiotiques à partir des souches bactériennes identifiées.
Procédures
Endoscopie sous anesthésie générale pour prélèvement de biopsies mucosales : 1 endoscopie sur 20 porcs conventionnels et 5 endoscopies sur une période de 16 semaines sur 50 mini-porcs Pose chirurgicale d’un cathéter jugulaire sous anesthésie générale : 50 mini-porcs, 1 seule fois, possibilité de répéter si problème de fonctionnement du cathéter Tests de comportement alimentaire : validation du dispositif sur 20 porcs conventionnels, tests de préférence et motivation, 50 mini-porcs, répété 5 fois en 16 semaines Tests de tolérance au glucose nécessitant le prélèvement de 40 mL de sang en 2h, 50 mini-porcs, répété 5 fois en 16 semaines Hébergement en cages individuelles : 50 mini-porcs pendant 18 semaines et 20 porcs conventionnels pendant 2 semaines Mise à jeun nocturne de 18h à 8h : 50 mini-porcs pendant 18 semaines et 20 porcs conventionnels pendant 2 semaines
Impact sur les animaux
Un développement de perturbations du métabolisme avec des signes cliniques tels qu’une augmentation du poids, un profil lipidique plasmatique perturbé (triglycéridémie, cholestérolémie, LDL-cholestérol augmentés), une perturbation du contrôle glycémique lors d’une hyperglycémie provoquée et une hypertension, est attendu chez les animaux recevant le régime riche en lipides et en sucres additionné ou non d’émulsifiant mais font partie des objectifs du projet. Une perte de poids pour les groupes recevant un régime moins riche en énergie que le régime obésogène est attendue mais fait partie des objectifs du projet. La chirurgie pour la pose de cathéter peut engendrer de l’inconfort transitoire au réveil et des douleurs post-opératoires. La répétition des prélèvements sous endoscopie (5 prélèvements par animal) peut entrainer de l’inconfort transitoire au réveil. L’hébergement en loges individuelles peut engendrer du stress.
Devenir
Les animaux utilisés en procédure 1 seront mis à mort. Il s’agit d’animaux dit de réforme qui ne seraient pas rentrés dans la chaine alimentaire. Cette mise à mort sera suivie de divers prélèvements afin de constituer une banque de tissus. Les animaux de la procédure 2 seront mis à mort afin de pouvoir prélever divers organes et tissus et analyser les effets des différents traitements sur des paramètres physiologiques et métaboliques.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de mettre en relation des données issues de la composition de l’aliment, du microbiote intestinal et de l’intestin en regard de perturbations du métabolisme et du comportement alimentaire. Ces derniers font intervenir de nombreux organes (tissu adipeux, foie, cerveau, muscle). Le manque de connaissances actuel et la complexité de ces interactions rend difficile leur modélisation in vitro ou in silico, justifiant le recours à l’animal pour les étudier..
Réduction
Le projet prévoit l’utilisation de 20 porcs conventionnels et 50 mini-porcs. Le nombre de porcs conventionnels utilisés permettra d’observer l’ensemble des comportements alimentaires individuels (4 profils type sont décrits chez le porc) et de travailler sur des animaux de poids différents. Un nombre de minimal de 8 mini-porcs par groupe a été calculé sur la base de nos expériences précédentes sur le développement de l'obésité chez ce modèle animal. Afin de s’affranchir de difficultés liées notamment au fonctionnement du cathéter jugulaire, un nombre de 10 mini-porcs par groupe a été décidé. Le choix de procéder à des prélèvements duodéno-jéjunaux sous endoscopie permet d’éviter de mettre à mort des animaux à chaque point de la cinétique choisie et donc de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et expérimenté. La surface des loges et les interactions visuelles, tactiles et auditives entre animaux permettront aux mini-porcs d’avoir des interactions avec les congénères. Des jouets (chaine, ballon) permettront d’enrichir le milieu et aux animaux d’avoir de l’activité physique. Ils seront régulièrement remplacés pour limiter l’ennui. La pose d’un cathéter jugulaire à demeure permettra d’éviter les prises de sang répétées lors de certains tests. La procédure chirurgicale de pose de ce cathéter sera faite sous anesthésie générale avec mise en place d’une analgésie per-opératoire. La procédure de prélèvements sous endoscopie sera réalisée sous anesthésie et analgésie pour éviter stress et inconfort. Une pesée hebdomadaire des animaux et une surveillance quotidienne de leur état clinique et de leur comportement ainsi que la mesure de leur consommation alimentaire quotidienne sera mise en place afin de détecter tout signe de mal-être ou inconfort. Des points limites ont été définis et seront scrupuleusement suivis pendant les expérimentations.
Choix des espèces
Le mini-porc est un modèle pertinent pour l’étude de la mise en place de l’obésité car il reproduit les signes cliniques du syndrome métabolique (augmentation de poids et d’adiposité, notamment viscérale, perturbations du bilan lipidique plasmatique, augmentation de la pression artérielle, perte de la sensibilité à l’insuline) lorsqu’il consomme de façon chronique un régime riche en lipides et en sucres. Des altérations du microbiote intestinal et de la fonction de barrière intestinale sont aussi décrites comme chez l’Homme. L’utilisation de porcs conventionnels pour une partie du projet est liée à des raisons de disponibilité au sein de l’établissement utilisateur. L’anatomie oro-gastrique des deux races est identique. Nous utiliserons des porcs conventionnels de poids corporels variés (entre 45 et 90 kg). Les porcs conventionnels utilisés seront des animaux de réforme de 3 à 6 mois d’âge afin que la gamme de poids soit proche de celle des mini-porcs utilisés dans le reste du projet. Les mini-porcs utilisés seront de jeunes adultes (12 à 14 mois d’âge) afin de travailler sur des animaux avec un microbiote stable au début de l’expérience et s’affranchir d’une variabilité liée au vieillissement.
Modèle d’étude du colon et de ses perturbations
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
La muqueuse du côlon est abrasée à plusieurs reprises chez un même animal, ce qui provoque une inflammation et peut faire saigner, et des tumeurs se développent jusqu'à un centimètre et demi de l'anus. 1 965 souris vont être utilisées, dont 1 440 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec une endoscopie hebdomadaire sous anesthésie générale de dix minutes. Le porteur qualifie pourtant l'inflammation de transitoire, dit n'avoir jamais noté d'hémorragie ni de déshydratation et juge le risque de perforation "pratiquement nul", tout en surveillant chaque semaine l'envahissement du côlon pour éviter un fécalome et une occlusion. Toutes seront tuées pour des analyses post-mortem.
Objectifs
Le côlon, aussi appelé gros intestin, joue un rôle essentiel dans la digestion. C’est lui qui prend en charge ce que notre intestin grêle n’a pas pu absorber. Grâce à la présence de milliards de bactéries (qu'on appelle aussi le microbiote intestinal), il transforme ces résidus en matières fécales, prêtes à être évacuées. Mais ce rôle n’est pas le seul : le côlon est aussi impliqué dans de nombreuses maladies. Parmi les plus fréquentes, on trouve le syndrome du côlon irritable, qui provoque douleurs abdominales, ballonnements et troubles du transit. Il y a aussi des maladies beaucoup plus graves, comme le cancer colorectal. Ce type de cancer est aujourd’hui le deuxième cancer le plus fréquent, et son nombre de cas augmente chaque année. Cette hausse est en grande partie liée à notre mode de vie, en particulier à la consommation élevée de produits ultra-transformés, pauvres en fibres et riches en additifs. Le cancer du côlon est dangereux car il peut former des métastases (des cellules cancéreuses qui se déplacent vers d’autres parties du corps), souvent difficiles à traiter. Ce sont d’ailleurs ces métastases qui sont responsables de la majorité des décès liés à ce cancer. Un point commun à beaucoup de maladies du côlon est l’inflammation chronique des cellules qui tapissent sa paroi interne. C’est cette inflammation qui peut, avec le temps, favoriser l’apparition de troubles digestifs ou de cancers. Ce projet de recherche a pour but de mieux comprendre ce qui déclenche cette inflammation, comment elle évolue, et comment elle peut conduire à la prolifération anormale des cellules ou à leur capacité à "envahir" d'autres tissus (comme dans le cas du cancer). En étudiant en détail ces mécanismes, les chercheurs espèrent trouver de nouvelles pistes pour prévenir, mieux diagnostiquer, ou mieux traiter les maladies du côlon, notamment les formes graves comme le cancer colorectal.
Bénéfices attendus
Les études menées sur l’inflammation du colon permettront une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les maladies chroniques inflammatoires. Les études menées sur les modèles les greffes issues de l’implantation de tumeurs dans le colon des souris permettront une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la tumorigénèse et l’apparition de métastases.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, des micro-blessures de la paroi du colon seront effectuées afin d’étudier les mécanismes d’inflammation. La durée de cette procédure est inférieure à 10 minutes et se fait sous anesthésie générale. Ces animaux seront injectés en amont par un traitement permettant d’inactiver une protéine afin d’en étudier son rôle. Le traitement sera adminsitré 1 fois par jour pendant 5 jours , La durée de chaque injection ne dépassant pas 10 secondes. Dans un second lot d’animaux, la même procédure que ci-dessus sera effectuée avec en plus l’apport de cellules permettant le développement de cancer. Le temps pour cette procédure ne dépasse pas 10 minutes. Ces souris pourront avoir été injectées en amont ou aval par le traitement inactivateur de protéine. Tous les animaux du second lot seront surveillés par coloscopie sous anesthésie générale à raison d’une fois par semaine (durée de l’anesthésie : 5 min) . Certains animaux pourront être imagés in vivo à la fin de l’expérience, La durée de l’imagerie sera au maximum de 10h sous anesthésie générale, Certains animaux pourront recevoir une injection de marqueurs fluorescents afin de suivre le développement de tumeur, 2h avant la mise à mort, d’autres pourront recevoir une injection de marqueurs luminescent afin de suivre la croissance des tumeurs et/ou des métastases,
Impact sur les animaux
Les abrasions provoquent une inflammation de la muqueuse colique qui est transitoire, Elles peuvent également provoquer des saignements lors de la procédure. Lors de nos précédentes expériences d’abrasion, il n’a jamais été noté d’hémorragie, de diarrhées ni de déshydratation. Le risque de perforation est également pratiquement nul. La cicatrisation de la muqueuse colique sera évaluée sous endoscopie. De part nos précédentes expériences, les tumeurs se développent dans le colon au maximum à 1,5cm de l’anus, La croissance des tumeurs sera monitorée une fois par semaine sous endoscopie tout au long de l’expérience., Les endoscopies seront effectuées sur des souris sous anesthésie générale (10 min) pouvant entraîner une baisse de la température corporelle ainsi qu’une irritation transitoire. La croissance des tumeurs pourra entrainer une difficulté de passage des selles , Le pourcentage d’envahissement de la lumière colique sera monitorée sous endoscopie de façon hebdomadaire afin d’éviter la formation de fécalome pouvant provoquer des douleurs abdominales ou des occlusions,
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Des études effectuées in vitro sur des lignées cellulaires et/ou sur des organoïdes (cultures cellulaires en 3D) sont en cours. Ces organoïdes, dérivés de tumeurs représentent des modèles physiologiques avancés permettant une étude précise des mécanismes cellulaires. Cependant, il reste nécessaire de valider l’effet observé dans un système intégré, tenant compte de la complexité d’un organisme vivant, des multiples interactions biologiques. En effet, l’inflammation, développement de cancer et de métastases sont le résultat d’un ensemble d’interactions entre différents types cellulaires qu’il est impossible de reconstituer in vitro.
Réduction
1. Le nombre de souris prévu dans ce projet est donné comme un nombre maximum mais peut être réduit en fonction des résultats et des analyses obtenus. Il a été établi grâce à une étude pilote qui a permis de déterminer le nombre de souris nécessaires pour obtenir un pourcentage de tumeurs significatif. Également, des techniques d'imagerie in vivo seront utilisées tout au long de ce projet afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Grâce à la technique d’abrasion, il est possible de prélever les cellules qui tapissent l’intérieur du côlon (la paroi colique) de manière longitudinale, c’est-à-dire en suivant l’évolution de ces cellules au fil du temps, chez un même animal. Cette méthode permet donc de réaliser plusieurs prélèvements tout au long de la vie de l’animal. Les cellules ainsi récupérées peuvent ensuite être étudiées en laboratoire (in vitro), dans des conditions contrôlées. Elle contribue donc à réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Un protocole rigoureux est mis en œuvre afin de minimiser les contraintes et la douleur infligées aux animaux. Le personnel est spécifiquement formé aux gestes techniques requis. L'utilisation d'anesthésiques et d’analgésiques est systématique lors de chaque procédure et des mesures sont prises pour réduire l'hypothermie pendant la chirurgie. L'utilisation de tapis et de lampe chauffante est systématique du début de l'anesthésie jusqu'au réveil des animaux. Pour toutes les procédures,L'analgésie est prolongée systématiquement 48h. Des gels nutritifs sont proposés aux souris après l'opération, et une hydratation supplémentaire est fournie en cas de perte de poids ou de difficulté à se déplacer. Une surveillance étroite des animaux est mise en place le jour de l’intervention et pendant 48h. Par la suite, un suivi clinique rapproché au minimum est assuré par du personnel qualifié afin de garantir le bien-être des animaux tout au long de l’expérience, et rapproché si baisse de l’état général de l’animal. Une grille de score est utilisée pour évaluer objectivement l'état des animaux et déterminer les points-limite. En cas de signes de douleur, des analgésiants sont administrés. L'expérience est interrompue lorsque la tumeur atteint la limite éthique, ou si d'autres points limites décrits dans cette grille sont atteints.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce souris a été fait pour plusieurs raisons : - En tant que mammifère, la souris possède une physiologie proche de celle de l’Homme, ce qui en fait un modèle pertinent pour étudier les mécanismes d’inflammations et de développement de cancer. - La disponibilité de souches immunodéficientes chez la souris offre la possibilité de greffer des cellules humaines, sans provoquer de rejet de ces tumeurs. Cette approche est souvent plus complexe avec d’autres espèces (le poisson zèbre, par exemple, se révèle moins immunodéprimé) Les expériences seront réalisés sur des jeunes adultes ou adultes, à partir de 5 semaines, période au cours de laquelle les souris ont terminé leur croissance. Dans certains cas elles pourront être réalisées sur des souris âgées (>12 mois) dans le cas de l’étude de l’inflammation pour étudier les mécanismes d’inflammation liés à l’âge. Pour ce qui est de la greffe de cellules tumorales sur des souris immunodéficientes, le choix d’utiliser des animaux jeunes adultes/adultes est stratégique, car il permet d’augmenter les chances de prise de la tumeur greffée, l’immunodéficience des souris ayant tendance à diminuer avec l’âge. De plus à cet âge, les souris supportent également mieux les interventions telles que l’anesthésie, la chirurgie.