Système gastrointestinal

Les souris chez qui la sonde de gavage part dans la trachée sont mises à mort sur-le-champ. 260 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles sont infectées par le parasite Giardia puis gavées chaque jour pendant douze jours au maximum, pour tester un traitement à base de probiotiques. Le RNT décrit l'infection comme asymptomatique et spontanément résolutive, l'essentiel des atteintes venant alors des gavages répétés eux-mêmes.

Objectifs

Giardia intestinalis est un parasite de l’intestin de nombreuses espèces de mammifères dont l’Homme. Il est à l’origine d’infections intestinales souvent chroniques se traduisant par des diarrhées et parfois des signes de malabsorption. Le nombre croissant de cas de giardiose liés à la contamination de l’eau potable, aux effets secondaires des traitements, ainsi qu’à l’émergence de souches résistantes aux médicaments, fait de la giardiose un sujet d’actualité de plus en plus préoccupant qui nécessite le développement de traitements alternatifs. Il est établi que la microflore intestinale et certains probiotiques, tels que les bactéries Lactobacillus johnsonii, jouent un rôle important dans la protection contre cette parasitose. Des résultats obtenus in vitro et in vivo montrent que ces bactéries agissent en produisant des composés toxiques pour le parasite, permettant de réduire les signes de la maladie. Une souche de L. johnsonii a également fait l’objet d’un essai clinique chez le chiot, au cours duquel ses propriétés anti-Giardia ont pu être confirmées. À partir de ces résultats encourageants, cinq nouvelles souches de probiotiques présentant des propriétés anti-Giardia augmentées comparativement à la souche d’origine in vitro ont été obtenues au laboratoire. Afin de déterminer quelle souche sera utilisée chez l’espèce hôte cible (le chien), et afin d’étudier in situ dans l’intestin les mécanismes à l’origine de ces effets, il est nécessaire de valider les résultats obtenus in vitro par des essais in vivo d’infection à Giardia sur des modèles rongeurs. L’objectif est de proposer une méthode de lutte novatrice de la giardiose chez le chien fondé sur la biothérapie.

Bénéfices attendus

La majorité des traitements humains ou vétérinaires actuels reposent sur l’emploi d’antibiotiques, qui provoquent d’importants effets secondaires et sont de moins en moins efficaces en raison de l’émergence de souches résistantes. Ce contexte préoccupant impose le développement de traitements alternatifs innovants, ainsi que des avancées majeures dans la compréhension des interactions hôte/Giardia/microbiote, qui constituent la base de nombreuses thérapies nouvelles. Giardia est un parasite présentant une prévalence importante pour l’élevage en Europe et dans le monde. La diminution de l’utilisation des antibiotiques dans les traitements des animaux constitue un enjeu majeur compte tenu de l’apparition de nombreuses souches résistantes. Le développement de traitements alternatifs est donc essentiel, en particulier dans ce secteur. La réduction des souches résistantes aux antibiotiques ainsi que la diminution des résidus d’antibiotiques dans l’alimentation humaine et animale sont au cœur des enjeux sociétaux et environnementaux actuels et futurs. Ce projet permettra, à court terme, le développement et la mise sur le marché vétérinaire de probiotiques anti-Giardia, puis à plus long terme une application potentielle chez l’Homme. Il contribuera à élargir l’éventail thérapeutique, à améliorer la prise en charge et le traitement de la maladie, et in fine à améliorer la qualité de vie des individus concernés. Il permettra également de faire progresser les connaissances fondamentales relatives à l’application de souches probiotiques produisant des BSH, notamment dans leur action synergique avec le microbiote. Le microbiote est au centre de découvertes majeures en médecine vétérinaire et humaine depuis plus de 20 ans. Ce projet vise à en comprendre les mécanismes clés, ouvrant ainsi la voie à l’identification de nouveaux axes de recherche fondamentaux et appliqués.

Procédures

Au cours des études et pour l’ensemble des animaux rentrant en procédures, les interventions seront : - Pesée et gavage oesogastrique quotidiens pendant 12 jours maximum (5 min maximum par animal) - Deux gavages oesogastriques quotidiens espacés d’une demi-journée : 1 fois - Mise à mort

Impact sur les animaux

L’infection à Giardia duodenalis est asymptomatique et auto-résolutive en une dizaine de jours chez la souris. Les potentiels effets indésirables seront les erreurs de gavage (fausse route avec passage de la sonde dans la trachée, détectable par présence de sang sur la sonde). Dans ce cas les animaux concernés seront mis à mort immédiatement.

Devenir

A l’issue de l’ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort afin de procéder au prélèvement des différents organes nécessaires à la quantification de la giardiose et aux traitements des données expérimentales.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est nécessaire pour confirmer les observations faites in vitro. En effet, le test in vitro ne permet d’apprécier que l’efficacité du surnageant de culture bactérienne sur Giardia. Il est donc nécessaire de vérifier l’efficacité de ces stratégies thérapeutiques dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas de modèle in vitro envisageable qui permet l’étude des interactions hôte/Giardia/microbiote. L’ensemble des souches de probiotiques qui seront administrées in vivo auront fait l’objet d’études préliminaires in vitro et seront le fruit d’une première sélection visant à ne garder que les souches ayant un réel intérêt anti-Giardia. Des tests en laboratoire auront d’abord été effectués afin d’évaluer l’efficacité des différentes souches et de ne retenir que les plus prometteuses avant les essais in vivo. Pour chaque formulation, des études de faisabilité, de stabilité de l’activité sont réalisées. Ainsi les formulations qui seront étudiées in vivo seront également issues d’un processus de sélection afin de limiter le nombre de groupes et donc le nombre d’animaux entrant dans cette étude.

Réduction

Pour le modèle de souris âgés de 3 semaines, une publication récente a démontré qu’un effectif de 10 souris par groupe étaient suffisants. Aussi, le choix d’un effectif de 10 souris par groupe repose sur des modèles précédemment publiés, dans lesquels des groupes de 10 animaux ont été utilisés pour évaluer la charge parasitaire et les réponses immunitaires en réponse à un traitement. Le nombre d’animaux inclus dans cette étude a été déterminé en amont à l’aide d’outils méthodologiques reconnus, afin de garantir un équilibre entre la robustesse scientifique des résultats et le respect du principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. Chaque expérience comprendra quatre groupes distincts, avec un effectif équilibré entre les groupes, pour un total de 40 individus. L’organisation des animaux (notamment leur répartition par cage) a été prise en compte afin de limiter les biais potentiels liés aux conditions d’hébergement. Cette précaution permet d’assurer une interprétation rigoureuse des résultats. Les données recueillies feront l’objet d’analyses statistiques adaptées à leur nature et à leur distribution, conformément aux standards méthodologiques en vigueur.

Raffinement

Un suivi quotidien du bien-être des animaux sera assuré à l’aide d’un cahier de suivi renseigné chaque jour par des animaliers et les expérimentateurs. Les points limites, fondés sur des critères objectifs et facilement mesurables, tels que la perte ou l’absence de gain de poids entre deux prises, les troubles de mobilité et la posture des animaux, permettront de détecter précocement toute altération de l’état général et d’éviter aux animaux l’apparition d’une souffrance inutile. Les gavages œsogastriques seront réalisés par des expérimentateurs formés et entraînés, conformément à une procédure dédiée, ce qui contribuera au raffinement de l’ensemble des manipulations prévues dans le projet. Un enrichissement du milieu d’hébergement sera également mis en place afin d’améliorer le confort des souris, notamment par l’ajout de maisons, de roues, de tubes transparents, de cellulose déchiquetée et de bâtons à ronger

Choix des espèces

Deux espèces de Rongeurs sont habituellement utilisées pour les études expérimentales de la giardiose : la souris et la gerbille de Mongolie qui est beaucoup plus difficile à manipuler et très sensible au stress et qui n’est utilisée que lorsque le modèle souris ne peut pas être utilisé notamment pour étudier la giardiose chronique. Deux espèces de Rongeurs sont utilisées pour les études expérimentales de la giardiose : la souris et la gerbille de Mongolie qui est beaucoup plus difficile à manipuler et très sensible au stress et qui n’est utilisée que lorsque le modèle souris ne peut pas être utilisé notamment pour étudier la giardiose chronique. Les modèles souris sont des modèles reproductibles. Ils correspondent aux modèles les plus utilisés pour tester des traitements contre la giardiose. L’infection par Giardia n’est possible que chez le souriceau avant sevrage et jusqu’à l’âge de 4 semaines. Après cet âge, l’infection est inconstante ou nécessite un traitement préalable des animaux (immunosuppression ou antibiothérapie pour détruire la flore digestive). La variabilité de l’infection est plus faible avant sevrage.

1 664 souris génétiquement modifiées, privées d'un à trois facteurs dans le foie, vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est nourrie quinze semaines avec un régime hypercalorique jusqu'à développer diabète et accumulation de graisse dans le foie, l'autre suivie un an avec des tests de glycémie répétés. Toutes sont tuées pour prélever sang et organes. Le projet étudie la coopération entre facteurs de transcription du métabolisme, présentés comme des cibles thérapeutiques contre les maladies liées à l'obésité.

Objectifs

L’obésité est en constante augmentation et représente un facteur de risque majeur pour le diabète de type 2 et d’autres maladies telles que la stéatose hépatique métabolique. Le foie est un organe majeur pour la régulation de l’homéostasie énergétique et contrôle de nombreuses fonctions métaboliques et des réponses inflammatoires. De nombreuses fonctions hépatiques sont assurées par des facteurs de transcription qui coopèrent pour réguler l’expression de gènes. La dérégulation de ces processus est l’un des mécanismes observés lors du diabète de type 2 et de la stéatose. Dans ce projet, nous souhaitons étudier les rôles respectifs et les coopérations potentielles entre plusieurs facteurs de transcription dans la régulation du métabolisme en condition physiologique et dans l’obésité induite par l’alimentation. Nous disposons au laboratoire de souris spécifiquement délétées pour un ou plusieurs facteurs de transcription dans les hépatocytes. Ces animaux, hébergés pour certains d'entre eux à thermoneutralité, seront soit nourris avec un régime standard et suivis au cours du temps, soit nourris avec un régime hypercalorique pendant 15 semaines. Les effets seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer les rôles spécifiques ainsi que les potentielles interactions ou redondances entre différents facteurs de transcription impliqués dans la régulation du métabolisme hépatique, en condition physiologique et physiopathologique.Les facteurs de transcription étudiés sont des cibles thérapeutiques de choix pour le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité et il existe actuellement un intérêt croissant pour le développement de molécules ciblant simultanément plusieurs de ces facteurs. Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.

Procédures

Des groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard et suivis pendant 1 an (512 animaux). D’autres groupes, hébergés à thermoneutralité, seront nourris à volonté avec un régime standard ou hypercalorique pendant 15 semaines (1152 animaux). -pesées hebdomadaires - 6 mesures de la glycémie (tous les 2 mois sur 1 année) pour 512 animaux à partir d’une goutte de sang . La mesure ne nécessite pas de contention et prend moins de 5 secondes. - 2 mesures de la glycémie pour 1152 animaux - 3 tests de tolérance au glucose et 3 tests de tolérance à l’insuline sur une année pour 512 animaux, consistant en 6h de jeûne, suivi d'une mesure de la glycémie (temps 0) puis administration orale de glucose ou injection d'insuline prenant moins de 30 secondes, puis de mesures de la glycémie toutes les 15 min pendant 2 h (6 prélèvements de moins de 5 secondes). - 1 test de tolérance au glucose et 1 test de tolérance à l’insuline sur 1152 animaux - un dernier prélèvement sanguin avant la fin de l’étude pour tous les animaux

Impact sur les animaux

Les animaux nourris avec le régime hypercalorique vont progressivement prendre du poids associé à des perturbations métaboliques progressives telles que le développement d’un diabète (hyperglycémie, intolérance au glucose, résistance à l’insuline) et d’une stéatose (accumulation de lipides dans le foie). Ces altérations s’installent de manière progressive sur plusieurs semaines et correspondent à une nuisance d’intensité modérée, sans altération brutale de l’état général des animaux. La piqûre pour obtenir la goutte de sang peut entraîner une douleur ponctuelle de faible intensité (quelques secondes), sans effet persistant. Le dernier prélèvement de sang peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et une brève douleur d’intensité très modérée. L'administration de glucose ou d'insuline peut également entraîner un stress de quelques minutes lié essentiellement à la contention. Lorsqu'il est réalisé par du personnel expérimenté, ce geste n'entraîne pas de douleur significative ni de complication.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des méthodes alternatives utilisant des cellules de foie par exemple pourraientt être envisagées. Néanmoins, le métabolisme énergétique est un processus complexe qui met en jeu des interactions entre plusieurs organes (foie, tissu adipeux, intestin, muscle, cerveau) qui sont difficiles à reproduire avec des cellules en culture. L’utilisation d'un organisme vivant, dans lequel tous les organes fonctionnent ensemble, est donc nécessaire. De plus, l’utilisation de souris transgéniques rend possible la délétion d’une protéine d’intérêt dans un organe spécifique pour étudier son rôle et il est possible d’induire une obésité chez la souris grâce à un régime hypercalorique.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). L’hébergement à thermo-neutralité permet de limiter le stress dû au froid. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons les consommations alimentaire et hydrique. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Les modèles utilisés dans ce projet (délétés pour 1, 2 ou 3 protéines dans le foie) existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

Une colite est provoquée chez 832 souris par un agent chimique irritant administré dans l'eau de boisson ou par voie intra-rectale, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance modéré. Le RNT décrit pourtant une perte de poids supérieure à 10 pour cent, des diarrhées, une prostration et des signes de douleur au plus fort de l'inflammation. Toutes les souris seront tuées par dislocation cervicale pour prélèvements, certaines plus tôt si les points limites sont atteints. Le projet teste des molécules censées activer la résolution de l'inflammation, un essai chez l'humain restant une perspective lointaine.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité préclinique de molécules ciblant les voies de la résolution de l’inflammation, tout en limitant l’inflammation persistante et la fibrose, dans des pathologies caractérisées par un déficit de ces mécanismes. Depuis quelques années, il a été démontré que de nombreuses maladies inflammatoires chroniques, telles que les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), sont liées à un échec de la résolution de l’inflammation. Les traitements actuels (corticoïdes, immunomodulateurs) agissent principalement en bloquant l’initiation de l’inflammation, ce qui entraîne des effets secondaires importants. De plus, près de 60 % des patients présentent un échappement primaire ou secondaire à ces traitements, soulignant la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients résistants ou en échec. Chez les patients atteints de MICI l’absence de résolution de l’inflammation en dépit des traitements existant est la première cause d’échec thérapeutique, ce qui entraine une persistance de l’inflammation, un développement de fibrose et à des symptômes invalidants comme la douleur, les diarrhées chroniques ou un impact sur la qualité de vie et la santé mentale. Notre projet vise à tester, chez la souris, des molécules innovantes capables d’activer ces voies de résolution lorsque celles-ci sont défaillantes, tout en réduisant l’inflammation chronique et en limitant la fibrose, qui constitue une complication majeure des MICI et d’autres pathologies inflammatoires. Les molécules sélectionnées auront été validées in vitro au préalable. Nous comparerons ensuite nos traitements à des références établies dans chaque modèle, où l’efficacité sera mesurée par une accélération de la résolution de l’inflammation, une réduction des lésions tissulaires et une diminution des marqueurs de fibrose, par rapport à un groupe contrôle. 832 animaux pourront être utilisés, ce qui garantit une puissance statistique tout en limitant le nombre d’animaux conformément aux principes des 3R.

Bénéfices attendus

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin sont actuellement traitées principalement par trois types de médicaments : les corticoïdes, les traitements qui diminuent l’activité du système immunitaire et des thérapies ciblées plus récentes. Les corticoïdes permettent de réduire rapidement l’inflammation, mais leur utilisation prolongée peut entraîner des effets indésirables importants, tels qu’une prise de poids, une augmentation de la pression artérielle, des perturbations hormonales et des troubles du métabolisme du sucre. Les traitements immunosuppresseurs, qui réduisent de façon globale les défenses immunitaires, exposent quant à eux les patients à un risque accru d’infections. Les thérapies ciblées, utilisées lorsque les traitements précédents ne sont plus efficaces, agissent sur des mécanismes précis de l’inflammation intestinale et permettent de ralentir l’évolution de la maladie. Toutefois, environ six patients sur dix ne répondent pas durablement à ces approches, un phénomène également observé dans les modèles animaux. De plus, ces traitements peuvent eux aussi augmenter la sensibilité aux infections. Afin de répondre à ces limites, nous avons développé une nouvelle molécule innovante visant à stimuler les mécanismes naturels de résolution de l’inflammation plutôt qu’à inhiber globalement le système immunitaire. Dans des modèles expérimentaux de colite chez l’animal, nous espérons observer une récupération plus rapide du poids, une amélioration des symptômes digestifs, ainsi qu’une amélioration de l’aspect du côlon, indicateur d’une inflammation réduite. L’objectif est de restaurer une morphologie intestinale proche de la normale. Si ces résultats sont confirmés chez l’animal, nous envisageons à terme un essai clinique chez l’Homme, destiné aux patients pour lesquels les traitements actuels ne sont plus efficaces, afin de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique.

Procédures

Chirurgie : Pas de chirurgie ni sutures. Anesthésie : les animaux seront anesthésiés à J0 pour induire le modèle (protocole 3) par injection intra-rectale à raison d’un maximum de 280 souris. Un prélèvement de sang au niveau de la veine mandibulaire sur des animaux vigiles à hauteur d'une fois par semaine maximum pourra être envisagé (50µL par prélèvement). Cette procédure peut concerner l’ensemble des animaux à savoir un maximum de 832 souris. Les traitements

Impact sur les animaux

Modèle 1 : colite induite par un polysaccharide administré dans l’eau de boisson L’administration orale d’un agent chimique irritant entraîne une augmentation de la perméabilité de la paroi du tube digestif, provoquant une inflammation localisée du côlon, comparable à la rectocolite hémorragique observée chez l’Homme. Ce modèle se traduit par une perte de poids et l’apparition de diarrhée, évaluée à l’aide d’un score compris entre 0 et 4. Les animaux sont surveillés quotidiennement pendant la phase aiguë de l’inflammation, puis tous les deux jours par la suite. Lorsque le score de diarrhée atteint 3, celle‑ci s’accompagne généralement d’une prostration, d’une diminution de l’activité et de signes de douleur. Ces manifestations cliniques, associées à la perte de poids, apparaissent généralement entre le septième et le dixième jour après le début de l’induction, avant une récupération rapide, les animaux retrouvant leur poids initial vers le vingtième jour. Le score de diarrhée égal à 3 correspond à un épisode transitoire, observé sur une courte période, avec une amélioration progressive. Durant la phase la plus sévère, les animaux sont suivis quotidiennement et un traitement analgésique est administré afin de limiter la souffrance. Modèle 2 : colite induite par administration locale d’un agent inflammatoire L’administration locale d’un agent inflammatoire associé à un solvant provoque une augmentation de la perméabilité de la paroi colique et un recrutement important de cellules immunitaires. Ce modèle induit une perte de poids supérieure à 10 % ainsi qu’une diarrhée modérée. Les symptômes apparaissent dès le lendemain de l’administration et s’améliorent rapidement à partir du troisième jour. Les animaux sont surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’étude et un traitement analgésique est administré du jour de l’induction jusqu’au troisième jour afin de limiter la douleur.

Devenir

L’ensemble des 832 souris seront mis à mort par dislocation cervicale en fin d’expérimentation pour effectuer des prélèvements biologiques à des fin d’analyse cellulaire ou tissulaire. Au cours d’une des procédures décrites ci-dessus il se peut également que des animaux soient mis à mort précocement si des points limites sont atteints, que ce soit lié à la pathologie elle-même ou aux traitements si leur efficacité s’avère futile.

Remplacement

Le meilleur moyen pour étudier le rôle d'une molécule sur une réponse immune qui est complexe et qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires est in vivo et ce en utilisant des animaux. En effet, nos molécules d’intérêt pouvant être exprimées par de nombreux types cellulaires et jouant un rôle sur de nombreux acteurs de l'immunité, il n'est pas possible de reconstituer un modèle de dommage tissulaire et d'étudier l'homéostasie d'un tissu dans des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut ainsi que les études pilotes permettront de réduire l’utilisation de l’animal. Les études pilotes sur un nombre restreintes d’animaux et sans traitements thérapeutiques permette de valider la mise en place du modèle dans les conditions d’hébergement de l’animalerie. En amont nous avons étudié par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons tout d'abord déterminé la différence attendue entre le groupe contrôle et le groupe traité ainsi que l'écart-type des échantillons grâce à des expériences précédentes. Ceci nous a permis d'obtenir la variante d= 0.79. Pour un test statistique bilatéral n=22 animaux sont nécessaires pour obtenir une différence significative entre le groupe contrôle et le groupe traité dans nos expériences.

Raffinement

Les animaux auront une phase d’acclimatation de 5 jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. Les protocoles sont planifiés afin d’éviter le stress à l’animal et les points limites définis sont bien intégrés afin d’anticiper toute souffrance inutile. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront de la buprénorphine dans l’eau de biberon (0.003mg/mL). Lorsque les points limites seront atteint, les animaux seront mis à mort par dislocation des cervicales après anesthésie par un mélange d’air/isoflurane 4%. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrit pour chaque modèle, limitant leur souffrance. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissements de type : dôme ou tunnel, frisottis, coton. Pour finir, si des animaux montrent des difficultés pour s'alimenter, des croquettes mouillées seront mise au fond de la cage.

Choix des espèces

Afin d’étudier différents mécanismes de l’inflammation chez l’animal vivant, nous utiliserons des souris appartenant à plusieurs lignées connues pour leur sensibilité aux modèles de colite induite chimiquement. Ces lignées présentent des niveaux d’inflammation plus ou moins marqués, ce qui permet d’adapter la sévérité du modèle aux objectifs de l’étude. Le choix de la lignée dépend également du traitement testé, certains agissant uniquement chez des animaux exprimant la cible biologique concernée. Les souris utilisées auront entre 6 et 10 semaines car l’inflammation générée par les molécules chimiques utilisées dans les différents modèles est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.

52 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Dès le sevrage, elles reçoivent un régime pauvre en protéines pendant cinq semaines pour modéliser la malnutrition infantile, avec contentions quotidiennes, frottis vaginaux et un test au glucose comprenant six heures de jeûne, une incision de la queue et plusieurs prélèvements de sang. Le projet cherche à savoir si l'énergie dépensée pour maintenir la température du corps module la réponse au manque de protéines. Les retombées annoncées pour les 150 millions d'enfants malnutris restent lointaines, la mise à mort servant à prélever muscle et graisses.

Objectifs

La malnutrition chez l’enfant est un problème majeur de santé publique dans le monde. Elle peut avoir des conséquences durables sur la croissance, le métabolisme (la manière dont le corps utilise l’énergie) et la puberté. Des études suggèrent que les garçons pourraient être plus touchés que les filles. Dans nos travaux précédents chez la souris, nous avons observé qu’un régime pauvre en protéines affecte davantage la croissance et le métabolisme des jeunes mâles, tandis qu’il retarde surtout la puberté chez les femelles. Ces résultats indiquent que, lorsqu’il manque de nutriments, l’organisme doit répartir son énergie entre plusieurs fonctions essentielles : grandir, maintenir son métabolisme et assurer la reproduction. Cette répartition semble différer selon le sexe. Nous avons montré que, chez les jeunes mâles, l’énergie consacrée à la reproduction joue un rôle limité dans ces effets. En revanche, une part importante de l’énergie pourrait être utilisée pour maintenir la température corporelle. L’objectif de ce projet est de comprendre si l’énergie associée au maintien de la température corporelle influence la façon dont l’organisme gère un manque de protéines, en particulier pendant la période juvénile, lorsque la croissance et la puberté demandent aussi beaucoup d’énergie. Nous mesurerons les effets d’un régime pauvre en protéines sur la croissance et sur certains paramètres du métabolisme, dans des conditions adaptées aux besoins physiologiques des souris. Ce projet permettra de mieux comprendre comment la nutrition au début de la vie peut influencer le risque ultérieur de troubles métaboliques et reproductifs, en tenant compte des différences entre sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’organisme répartit son énergie en cas de manque de protéines pendant l’enfance, notamment l’énergie utilisée pour maintenir la température du corps, et comment ces mécanismes peuvent différer entre les sexes. La malnutrition infantile touche malheureusement encore 150 millions d’enfants de moins de 5 ans à travers le monde. Ces connaissances aideront à mieux comprendre le fonctionnement du corps des jeunes en situation de malnutrition et pourraient, à plus long terme, contribuer à identifier de nouvelles pistes de prévention ou d’amélioration de la prise en charge en santé humaine.

Procédures

52 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 5 semaines. Toutes les souris seront mesurées avec une règle chaque semaine sous anesthésie générale (3 minutes) puis pesées (< 1 min) entre 21 et 56 jours. Certaines souris subiront des contentions manuelles, tous les jours à partir de 21 jours (< 1 min par contention) pour détecter la puberté. Chez certaines femelles, un frottis vaginal sera réalisé quotidiennement à partir de cette détection et jusqu’à 56 jours (15 sec de contention). A 56 jours, les souris seront anesthésiées (3 minutes), et subiront un prélèvement sanguin (20 sec). Toutes les souris subiront un test permettant d’évaluer la réponse de chaque individu à un sucre (glucose), et seront donc soumises à : 6 heures de jeûne, introduction orale de glucose (10 sec), incision à la queue (1 sec), 7 prélèvements d’une petite goutte de sang et 3 prélèvements supplémentaires de quelques gouttes (durée totale de prélèvement < 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les pesées, mesures et frottis vaginaux hebdomadaires induisent un stress modéré lié à la contention, ainsi qu’un inconfort transitoire. Ces manipulations sont associées à un stress transitoire lié à la contention. Les prélèvements de petites gouttes de sang à la queue impliquent une incision d’environ 1 mm et un recueil répété des gouttes, provoquant une douleur légère à chaque point temporel. Le jeûne de 6 heures induit un stress modéré. L’introduction orale est source d’inconfort et peut entraîner un risque de fausse route ou d’irritation œsophagienne.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette recherche vise à comprendre comment l’organisme dans son ensemble réagit à différents régimes alimentaires, en particulier en cas de manque de protéines. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative (comme des cultures de cellules en laboratoire) capable de reproduire la complexité d’un organisme entier, où plusieurs organes interagissent en permanence pour réguler l’état nutritionnel. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire pour répondre à ces questions. La souris a été choisie car elle constitue un modèle bien établi en recherche en nutrition et permet d’étudier de façon fiable les effets d’une carence en protéines dans des conditions proches de la physiologie. L’objectif étant d’analyser des mécanismes à l’échelle de plusieurs organes, ainsi qu’au niveau moléculaire, ce type d’étude ne peut pas être réalisé chez l’être humain.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire tout en garantissant des résultats fiables. Le nombre d’animaux par groupe (14 mâles et 12 femelles) a été déterminé grâce à un calcul statistique précis, afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant la validité scientifique des conclusions. Ce calcul s’appuie sur les paramètres les plus variables entre les individus. Les analyses permettront de comparer les effets de l’alimentation, du sexe et d’autres paramètres biologiques. Enfin, pour éviter d’avoir recours à de nouveaux animaux dans de futurs projets, différents organes pouvant être utiles à d’autres recherches (comme le muscle ou les graisses) seront prélevés à la fin de l’étude et conservés pour d’éventuelles analyses ultérieures.

Raffinement

L’étude ne débutera que chez des animaux suffisamment développés, pesant plus de 7 g au moment du sevrage. Leur croissance (taille et poids) sera suivie chaque semaine de manière individuelle. Pour faciliter l’alimentation des plus jeunes, la nourriture sera placée directement dans la litière afin qu’elle soit facilement accessible. La quantité de nourriture consommée sera également surveillée pour s’assurer de leur bon état général. Des seuils d’alerte seront définis à l’avance : si un animal les atteint, il sera retiré immédiatement de l’étude pour éviter toute souffrance. Le régime pauvre en protéines et les méthodes utilisées sont déjà bien maîtrisés au laboratoire et ne provoquent pas de signes de souffrance. Les mesures finales, ainsi que le prélèvement nécessaire, seront effectuées sous anesthésie pour garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris, un animal omnivore comme l’humain, est couramment utilisée pour les recherches en nutrition. Son microbiote est bien connu et de nombreux outils scientifiques existent déjà, ce qui en fait un modèle préclinique idéal pour comprendre le fonctionnement de l’organisme lors de changements alimentaires. Les animaux seront suivis pendant 5 semaines après le sevrage, c’est-à-dire de 3 à 8 semaines d’âge. Le but du projet est de comprendre comment la production de chaleur par l’organisme oriente la réponse à un manque de protéines dans l’alimentation. Il est important de commencer l’étude dès le sevrage, car c’est le stade où la croissance et la reproduction se mettent en place chez la souris.

Pour évaluer des alternatives aux nitrites de la charcuterie, 272 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des régimes expérimentaux pendant 21 à 100 jours, sont placés jusqu'à 46 heures en cage individuelle à métabolisme, et 144 d'entre eux reçoivent une injection déclenchant les premiers stades du cancer du côlon. Le porteur affirme que ces stades précoces "n'induisent aucune douleur". L'espèce est choisie pour arrêter l'étude avant les stades avancés, jugés plus douloureux, le côlon étant prélevé après mise à mort.

Objectifs

Sur la base d’études épidémiologiques réalisées chez l’homme et d’études mécanistiques réalisées chez l’animal, la consommation de charcuteries a été classée par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) et le Centre International de Recherche sur le Cancer (CIRC) comme étant cancérigène pour l’homme, particulièrement à cause de résultats obtenus sur la cancérogenèse colique. Les additifs nitrés (sels de nitrites et de nitrates) sont largement utilisés dans les charcuteries et sont suspectés d’être à l’origine de leur effet cancérigène sur le côlon. Ces additifs sont utilisés comme conservateurs afin de limiter le développement de bactéries pathogènes et le rancissement oxydatif des charcuteries, mais aussi pour les qualités organoleptiques particulières qu’ils confèrent à la viande (goût, couleur, texture). Les charcuteries contiennent également du fer héminique, constituant important des muscles ou viande. Pendant la digestion, les nitrites et les nitrates des charcuteries favorisent la formation de composés nitrosés toxiques pour le côlon tandis que le fer héminique est un agent pro-oxydant qui provoque l'oxydation des lipides du régime aboutissant à la formation de composés également toxiques pour le côlon. L’objectif de ce projet est d’évaluer chez l’animal modèle l’effet de plusieurs alternatives à ces sels nitrités dans deux charcuteries largement consommées, le jambon et la saucisse de type hot-dog, sur différents paramètres liés à la cancérogenèse colique et à la peroxydation lipidique. Ces alternatives sont soit des composés qui permettent la réduction de la formation des composés nitrosés issus des nitrites tout en gardant la maîtrise des processus oxydatifs, soit des composés qui viennent en remplacement de ces sels nitrités, en ayant les mêmes propriétés de conservateurs, sans les effets délétères. Ces différents composés, déjà utilisés en alimentation humaine (extraits végétaux, fibres, vitamines) seront d’abord testés dans les deux types de charcuteries lors de phase de digestion in vitro, à différentes doses d’incorporation. Seuls les composés les plus prometteurs seront choisis pour les phases animales.

Bénéfices attendus

A l’issue du projet, nous serons en mesure de savoir si les alternatives aux sels nitrités que nous avons étudiées peuvent constituer de bonnes candidates pour pouvoir proposer des charcuteries qui soient respectueuses la santé du consommateur, c’est-à-dire des denrées ne provoquant plus formation de composés nitrosés toxiques durant la digestion tout en gardant la maîtrise des processus oxydatifs, mais aussi possédant des qualités organoleptiques acceptables pour le consommateur.

Procédures

272 rats recevront un régime expérimental pendant 21 jours pour 128 d’entre eux, et pendant 100 jours pour les 144 autres. Ces 272 rats seront hébergés individuellement une fois pendant 46 heures maximum en cage à métabolisme après avoir été habitués 3 heures en amont. Parmi eux, les 144 rats exposés 100 jours aux régimes expérimentaux recevront en amont une injection intrapéritonéale d’une durée de moins d'une minute (préhension, injection) pour induire les premiers stades non douloureux du cancer du côlon.

Impact sur les animaux

L’hébergement en cage individuelle peut générer un stress transitoire mais il disparait dès le retour en hébergement conventionnel. Hormis les stress attendus lors de l’injection, seule une légère douleur passagère peut se produire au site d’injection en raison du produit injecté. La formation progressive des phases précoces du cancer du côlon pendant cette étude n’induit aucune douleur.

Devenir

Le prélèvement du côlon est nécessaire à la réalisation des analyses prévues dans le projet. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin de la période d'expérimentation.

Remplacement

Bien que nous menions des études in vitro, aucun des modèles de cellule du côlon en culture ne permet d’évaluer l’ensemble des répercussions induites par un régime riche en produits carnés au niveau du côlon. En effet, outre la formation de composés toxiques, la consommation des produits carnés va fortement modifier l’ensemble des composantes du côlon. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité du côlon et de l’impact de l’alimentation sur cet organe.

Réduction

Les études antérieures associées à ce projet ont permis d’améliorer les procédures sur le plan technique et du bien-être de l’animal, contribuant ainsi à minimiser le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence l’effet des régimes chez le rat. De plus, afin d’assurer la fiabilité des résultats, les études et analyses des échantillons issus de l’étude seront conduites en aveugle. Le traitement des données sera réalisé grâce à des tests statistiques appropriés permettant d'exploiter au maximum l'ensemble des données générées.

Raffinement

Le nombre et la durée d’hébergement individuel en cage individuelle seront limités au minimum nécessaire (maximum 46h) pour obtenir les quantités suffisantes d’urine et de fèces. Des phases d’habituation à ce type d’hébergement ont été mises en place afin de minimiser le stress. Quel que soit le type de cages, elles seront transparentes, alignées pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Lors de l’injection pour induire les premiers stades du cancer du côlon, l’acidité de la solution sera corrigée pour éviter une douleur au moment de l’injection, une habituation au geste de la piqure sera réalisée les jours précédents. Une observation des rats à l’occasion notamment de la distribution quotidienne des régimes permettra, grâce à l’utilisation de fiches individuelles de suivi, de détecter à temps toute anomalie éventuelle. Enfin, toutes les mesures susceptibles de réduire la douleur sans affecter l’objectif scientifique seront mises en application.

Choix des espèces

Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi des approches expérimentales in vivo qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus approprié à notre étude est le rat qui a l’avantage de présenter un développement de la maladie comparable à la situation humaine. De plus, ce modèle rat permet d’obtenir des résultats fiables dès les stades précoces du cancer, sans qu’il soit nécessaire de poursuivre l’étude aux stades avancées de la maladie (tumeurs, métastases), qui sont des stades davantage susceptibles d’engendrer des dommages et des douleurs. Les 2 études se feront sur des rats de 5 semaines à leur arrivée. A cet âge, le système digestif est suffisamment mature et fonctionnel et la composition du microbiote bien stabilisée. Afin de se placer dans les conditions pour lesquelles le modèle est maitrisé au laboratoire, il est important de rester au même stade de développement.

40 souris juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le sevrage, elles reçoivent un régime pauvre en protéines pendant cinq semaines, avec des jeûnes de six heures, des introductions orales de colorant et de glucose et des prélèvements sanguins, pour mesurer le transit intestinal. L'étude cherche à décrire l'effet de la malnutrition infantile sur l'intestin, en comparant mâles et femelles. Le porteur affirme que ce travail est "indispensable" et ne peut être mené chez l'humain.

Objectifs

La malnutrition chez l’enfant est un problème majeur dans le monde. Elle peut provoquer des troubles durables de la croissance, de la gestion de l’énergie et du développement. Des études récentes montrent que les garçons semblent plus touchés que les filles. L’intestin, qui absorbe les nutriments et joue un rôle central dans de nombreux processus du corps, est au cœur de cette problématique. Pourtant, on connaît encore mal la façon dont il réagit à une alimentation pauvre en protéines. Nos premiers résultats suggèrent que ce type de régime pourrait ralentir le passage des aliments dans l’intestin. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment un régime pauvre en protéines influence le fonctionnement de l’intestin, essentiel à la digestion et à la communication entre les organes. Nous utiliserons une seule procédure expérimentale pour mesurer la vitesse de transit intestinal, qui est un indicateur important de la santé du système digestif. Ce projet aidera à mieux comprendre l’effet de l’alimentation sur l’intestin, en tenant compte des différences entre sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment le fonctionnement intestinal est affecté par la malnutrition protéique juvénile, en tenant compte du sexe. Cette description extensive de la motilité intestinale permettra à terme d’éclairer de nouvelles pistes de prévention ou d’intervention en santé humaine, où les enfants en malnutrition sont généralement sujets à des symptômes intestinaux associé à un mauvais fonctionnement intestinal (comme le transit).

Procédures

40 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 5 semaines. Toutes les souris seront mesurées avec une règle chaque semaine sous anesthésie générale (3 minutes) puis pesées (< 1 min) entre 21 et 56 jours. A 56 jours, les souris seront anesthésiées (3 minutes), et subiront un prélèvement sanguin (20 sec). Pour étudier différents paramètres du transit intestinal : toutes les souris subiront à 48 jours une mise à jeun de 6h, suivie d’une introduction orale de colorant rouge (10 sec), à 52 jours une mise à jeun de 6h suivie d’une introduction orale de glucose (10 sec), puis 15 min plus tard d’une introduction orale de colorant rouge (10 sec), et à 56 jours une mise à jeun de 6h suivie d’une introduction orale de colorant rouge (10 sec).

Impact sur les animaux

Les pesées et mesures hebdomadaires induisent un stress modéré, ainsi qu’un inconfort transitoire. Le prélèvement sanguin est invasif et peut induire une légère douleur. Ces manipulations sont associées à un stress transitoire lié à la contention. Les trois introductions orales nécessitent un jeûne de 6 heures induisant un stress modéré. L’introduction orale est source d’inconfort et peut entraîner un risque de fausse route ou d’irritation œsophagienne. La récolte des féces est réalisée en cage individuelle, les animaux sont donc isolés pendant maximum 6h après l’introduction orale, induisant un stress modéré.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue de la mesure terminale des paramètres de transit, et du prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

Pour comprendre comment le corps réagit à différents types d’alimentation, en particulier en cas de manque de protéines, il est nécessaire d’étudier l’organisme dans son ensemble. Aucun modèle en laboratoire (sans animal) ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité du corps humain, où plusieurs organes communiquent entre eux et influencent ensemble l’état nutritionnel. C’est pour cette raison que l’utilisation d’animaux est indispensable dans ce projet. La souris a été choisie car elle représente un bon modèle pour étudier les effets d’une alimentation pauvre en protéines dans des conditions proches de la physiologie humaine. L’objectif est de mieux comprendre ce qui se passe dans l’intestin, à la fois à l’échelle de l’organe et au niveau moléculaire. Ce type d’étude ne peut pas être réalisé chez l’humain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été limité autant que possible tout en permettant d’obtenir des résultats fiables. Nous avons choisi d’inclure 10 animaux par groupe, sur la base d’un calcul statistique garantissant la solidité des conclusions. Ce calcul s’appuie sur la mesure la plus variable que nous connaissons déjà : la longueur de l’intestin, qui réagit de manière comparable chez les mâles et les femelles lorsqu’ils reçoivent un régime pauvre en protéines. Les analyses prévues permettront de comparer les effets du régime alimentaire et du sexe. Pour éviter d’utiliser davantage d’animaux dans de futurs projets, tous les organes qui pourraient être utiles à d’autres recherches (comme certains tissus liés au métabolisme ou au système nerveux) seront prélevés à la fin de l’étude et conservés pour d’éventuelles analyses ultérieures.

Raffinement

L’étude commencera uniquement avec des animaux suffisamment développés, pesant plus de 7 g au moment du sevrage. Leur croissance (taille et poids) sera suivie chaque semaine, et la nourriture sera mise à portée des plus jeunes pour qu’ils puissent y accéder facilement. Nous surveillerons aussi leur prise alimentaire afin de vérifier qu’ils s’alimentent correctement. Des seuils d’alerte seront définis à l’avance : si un animal les atteint, il sera retiré immédiatement de l’étude pour éviter toute souffrance. Le régime pauvre en protéines et les méthodes utilisées sont déjà bien maîtrisés au laboratoire et ne provoquent pas de signes de souffrance. Les mesures finales, ainsi que le prélèvement nécessaire, seront effectués sous anesthésie pour garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris, un animal omnivore comme l’humain, est couramment utilisée pour les recherches en nutrition. Son microbiote est bien connu et de nombreux outils scientifiques existent déjà, ce qui en fait un modèle préclinique idéal pour étudier le fonctionnement de l’intestin lors de changements alimentaires. Les animaux seront suivis pendant 5 semaines après le sevrage, c’est-à-dire de 3 à 8 semaines d’âge. Le but du projet est de comprendre comment un manque de protéines dans l’alimentation influence l’intestin durant la période juvénile. Il est important de commencer l’étude dès le sevrage, car l’intestin joue un rôle essentiel dans l’absorption des nutriments dès les premiers stades de la vie et peut ainsi influencer de nombreux aspects du développement, comme la croissance.