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Induction de la cholestase chez le modèle de rat de la myopathie myotubulaire, et son évolution dans le contexte des thérapies géniques visant à guérir la maladie
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- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
Trop faibles pour se relever ou pour ronger, les rats mâles porteurs d'une myopathie myotubulaire reçoivent leur nourriture posée à même le sol de la cage. 170 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour prélèvement de tissus. Un régime alimentaire modifie la composition de leur bile afin de provoquer une cholestase, cette accumulation de bile qui détruit le foie, et leur sang est prélevé une à quatre fois par la veine de la queue ou par voie intra-orbitale. L'objectif est de reproduire chez le rat les atteintes hépatiques qui ont tué quatre enfants inclus dans l'essai de thérapie génique ASPIRO, pour rendre les prochains essais moins dangereux.
Objectifs
La myopathie myotubulaire est une maladie génétique rare et très grave qui touche surtout les garçons. Elle provoque une forte faiblesse des muscles, y compris ceux qui servent à respirer, et entraîne souvent le décès avant l’âge d’un an. Elle est causée par une mutation du gène MTM1, indispensable au bon fonctionnement musculaire. Un essai clinique appelé ASPIRO teste une thérapie génique : un virus inoffensif est utilisé pour apporter une copie normale du gène dans les muscles. Quatre patients, qui présentaient déjà des signes de mauvais fonctionnement du foie, sont décédés d’une insuffisance cholestatique. Chez ces patients, la bile ne parvient plus à s’écouler vers l’intestin et s’accumule dans le foie, endommageant l’organe jusqu’à sa défaillance. Chez le rat, modèle de la maladie, la faiblesse musculaire et respiratoire est très proche de celle des patients. En revanche, les rats ne développent pas de cholestase, probablement grâce à la composition moins toxique de leur bile. Mais ils présentent déjà certains signes de mauvais fonctionnement du foie liés au manque de myotubularine. Notre projet consiste à modifier l’alimentation des rats pour changer la composition de leur bile et la rendre plus proche de celle des humains. Cela devrait provoquer une cholestase et donc mieux reproduire les atteintes observées chez les patients. Nous pourrons alors tester si, dans ces conditions, la thérapie génique aggrave les troubles du foie comme chez les enfants. Ce modèle permettrait d’anticiper les risques et de rendre les futurs essais cliniques plus sûrs.
Bénéfices attendus
Des troubles hépatiques avaient été détectés pour un percentage des patients sélectionnés pour participer à l’essai clinique visant à guérir la myopathie myotubulaire par thérapie génique. Ces conditions n’impliquaient pas une raison d’exclusion de l’essai clinique, et beaucoup des patients ont vu leur état amélioré après le traitement. Néanmoins, certains sont décédés à cause des complications hépatiques. Avec ce travail, nous cherchons à créer chez le modèle de myopathie myotubulaire une condition hépatique, appelé cholestase, qui nous permettra à approcher les caractéristiques du modèle à celles des patients. De cette façon, de nouvelles thérapies pourraient être testés dans des conditions similaires à la réalité des patients de myopathie myotubulaire avec complications hépatiques, ce qui nous aiderait à réduire les effets indésirables.
Procédures
Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés: environ 5 min par rat, entre 1 et 4 fois en fonction de la durée de l’étude. Injections intraveineuses du traitement : environ 1 min par rat, 1 fois. Injection d’anesthésiques : environ 1min, 1 fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances que les animaux utilisés dans cette étude peuvent rencontrer sont liées à trois circonstances : - Le phénotype délétère lié au manque d’expression de la protéine myotubularine. Les mâles Mtm1-KO développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leurs déplacements et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Cette condition amène les rats vers une condition sévère. - Les prélèvements du sang seront réalisés par la veine caudale ou par voie intra orbital (ce qui provoque une douleur légère), à une fréquence de 1 à 4 reprises, entre 3 semaines et l’euthanasie. - Les traitements seront appliqués par injection (ce qui provoque une douleur légère), et ils risquent d’exacerber les problèmes hépatiques (interruption du flux biliaire vers le système digestif) chez les rats qui seront nourris avec un régime visant à changer la composition de la bile provoquant ainsi des douleurs modérées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever les tissus qui nous permettront de déterminer les effets des régimes alimentaires seuls ou en combinaison avec la thérapie génique.
Remplacement
Le modèle de rat utilisé dans ce projet reproduit la myopathie myotubulaire avec fidélité, et grâce aux régimes alimentaires particuliers, nous visons à reproduire aussi les troubles hépatiques qu’on retrouve chez certains patients. Ces troubles, impliquant plusieurs organes du corps, ne peuvent pas être étudiés avec des cellules et nécessitent l’utilisation d’un animal. L’évaluation de l’état du foie dans le contexte de cette maladie et l’impact que la thérapie génique peut avoir sur lui n’est pas réalisable avec les modèles en laboratoire, car nous avons besoin d’étudier le métabolisme de la bile et le structure et l‘organisation des tissus hépatiques.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à partir de références bibliographiques permettant de déduire le nombre minimal d’animaux pour observer les effets des régimes alimentaires sur le foie des animaux sains et des animaux malades. La première étape de ce projet nous permettra d’évaluer l’impact de deux régimes différents sur l’état de santé du foie par rapport à un régime contrôle. Si cet effet est avéré, nous allons les tester dans le contexte des thérapies géniques, afin d’observer si nous observons les mêmes effets que chez les patients. Si un des deux régimes testés ne nous permets pas de nous rapprocher du phénotype du foie des patients, il ne sera pas testé dans le contexte de la thérapie génique.
Raffinement
Afin de garantir qu’ils puissent se nourrir correctement, la nourriture (pro-cholestase ou pas) sera placée au sol de la cage pour garantir son accessibilité, pour que les animaux malades (qui ont des problèmes musculaires qui les empêchent de se relever ou de bien ronger) puissent le manger facilement. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites et un l’arbre décisionnel ont été établis, décrivant les actions adaptées à réaliser en fonction de l’état des animaux. En cas d’appréciation de manque des interactions grégaires ou d’apathie, des conditions d'hébergement particulières seront appliquées garantissant ainsi leur survie et leur bien-être (inclusion de cylindres en carton). Les animaux seront traités avec de la crème soulageant et des pansements en cas de démangeaisons. Des soins particuliers seront administrés en cas de besoin des animaux : désinfection locale de la peau, des soins dentaires et des soins oculaires.
Choix des espèces
Le rat a été choisi comme animal modèle pour les raisons suivants: 1) Un modèle de rat de la myopathie myotubulaire a été caractérisé et il reproduit avec fidélité les signes cliniques caractéristiques de la maladie humaine. 2) Les rats Mtm1-KO montrent une atteinte au niveau du foie. 3) La gestation étant de 3 semaines, les animaux nécessaires peuvent être obtenus rapidement. Les animaux utilisés seront tous des mâles, pour se rapprocher de la clinique, car seulement les garçons sont touchés par la maladie. Les rats seront utilisés à partir de la 3ème semaine, au sevrage, ce qui correspond au moment où les premiers symptômes de la maladie apparaissent ; à 5 semaines en l’absence de traitement, et à 10 semaines après traitement de thérapie génique. Les rats seront utilisés à partir de la 3ème semaine, au sevrage, ce qui correspond au moment où les premiers symptômes de la maladie apparaissent ; à 5 semaines en l’absence de traitement, et à 10 semaines après traitement de thérapie génique.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse du cancer de foie pédiatrique grâce à la technique d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Une injection sous pression de plasmides dans la veine de la queue déclenche la formation de tumeurs du foie chez 890 souris, dont 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Les animaux reçoivent ensuite des anticancéreux à l'état vigile, jusqu'à une fois par jour pendant quinze à trente jours, avec une séance d'imagerie hebdomadaire sous anesthésie gazeuse. L'objet est d'identifier les gènes qui déclenchent le cancer du foie pédiatrique et de tester jusqu'à dix candidats-médicaments en cinq ans. Le porteur écrit qu'aucun signe de souffrance n'est détecté chez ces souris passé la demi-heure qui suit l'injection, alors que 600 d'entre elles sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) et notamment le cancer pédiatrique (hépatoblastome) sont des pathologies complexe, en raison de ses caractéristiques qui influencent son évolution et la résistance aux traitements. A ce jour le seul traitement pour l’hépatoblastome est la chimiothérapie avec une efficacité limitée et des effets secondaires et une toxicité non-négligeable. L'identification de gènes impliqués dans le déclenchement du processus de tumorigenèse est difficile en raison de la présence de plusieurs altérations qui n'ont pas d'impact fonctionnel. Nous avons généré un modèle murin qui récapitule le programme du développement du cancer du foie pédiatrique. L'utilisation de ce modèle à des stades précoces (avant l'apparition des tumeurs) permet de tester l'implication fonctionnelle de gènes qui coopèrent pour induire la formation de tumeurs. Nous avons conçu un programme de recherche interdisciplinaire pour identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans l'initiation des tumeurs hépatiques et leur évolution en cancer du foie, ainsi que leur mode de coopération. Ces objectifs seront réalisés en exprimant dans les cellules du foie les différents gènes d’intérêt. Ce projet nous permettra de tester l’implication fonctionnelle de nouveaux gènes (seuls ou en combinaison) agissant comme régulateur du processus de cancérisation dans le foie sain. Cette stratégie nous permettra de tester directement l’implication de gènes candidats dans la formation des tumeurs pédiatriques dans un foie sain et d’évaluer de nouveaux candidats médicaments qui permettraient une meilleure réponse au traitement des tumeurs.
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d'identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans la formation et l'évolution de tumeurs hépatiques pédiatriques ainsi que leur mode de coopération entre gènes. L'analyse par imagerie non-invasive permettra de suivre de manière longitudinale la formation, l'évolution et la régression des tumeurs. L’évaluation de nouveaux candidats-médicaments permet d’augmenter les taux de réponses et de cibler un maximum de la population pédiatrique atteinte du cancer du foie et ainsi de réduire la mortalité et morbidité de ce cancer. Nous prévoyons de faire un maximum de 2 études de nouveaux candidats par an, soit 10 nouveaux candidats médicaments sur 5 ans.
Procédures
Les souris subiront 1 seule injection de plasmides (qui véhiculent nos gènes d’intérêt) dans la veine de la queue pour une durée inférieure à 5 secondes. Certaines de ces souris seront traitées avec des drogues anti-cancéreuses, administrées en état vigile, selon les recommandations fournies pour chaque drogue. Après administration, la souris est placée en observation dans sa cage. La fréquence des injections dépend du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine) pour une durée approximative d’entre 15 et 30 jours. Les analyses par imagerie non-invasive seront effectuées 1 fois par semaine sous anesthésie gazeuse. Chaque séance d'imagerie durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Cette technique d’injection est couramment utilisée dans plusieurs laboratoires situés dans le monde entier. Les nuisances attendues sont : 1) Nuisance globale de l'expérience d'injection qui n'est que temporaire (inférieure à 30 minutes). Au-delà de cette période, les souris ne montrent plus aucun signe de souffrance. A ce stade initial du développement de la tumeur, aucun signe de souffrance n'est détecté chez les animaux ; 2) l’administration d’agents médicamenteux pourrait entraîner une douleur légère pendant quelques secondes au moment de l’injection. ; 3) Formation et évolution des tumeurs pourrait entrainer des malaises pour la souris, d’où l’importance d’un suivi quotidien avec une grille de score qui tient compte des différents signes de souffrance pour y remédier; 4) Injection du réactif pour imagerie, peut induire une doleur légère temporaire au cours de l’administration ; 5) Anesthésie volatile pour les techniques d'imagerie. Un petit groupe de souris sera concerné para les nuisances liées à la biopsie pour le génotypage : douleur temporelle de quelques secondes pendant le prélèvement sous anesthésie gazeuse.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées afin d'analyser les tumeurs d'un point de vue moléculaire et histologique.
Remplacement
Concernant les objectifs de ce projet, nous testerons certains gènes dans des modèles in vitro (culture d'hépatocytes immortalisés établis au laboratoire, lignées cellulaires, organoïdes de cellules de foie). Ces systèmes in vitro nous permettront de limiter nos études in vivo, en se focalisant sur les gènes candidats les plus pertinents, notamment ceux rapportés comme étant altérés chez les patients. Cette étape de validation in vivo, chez la souris, est indispensable pour valider dans un contexte physiologique l'implication des gènes candidats dans les processus de tumorigenèse et notamment dans des cas cliniques où leur altération a été décrite. En outre, l'analyse dans ce contexte in vivo est une étape obligatoire pour comprendre comment ces gènes influencent également l'environnement tumoral, notamment les cellules immunitaires.
Réduction
Dans cette étude, quand possible nous utiliserons l’imagerie in vivo (échographe) similaires aux appareils utilisés chez les patients, mais adaptés à la taille de notre modèle rongeurs. Ces imageries nous permettent de suivre l’évolution des animaux, en particulier la croissance tumorale, sur plusieurs semaines et de réaliser plusieurs types de mesures, ce qui nous permet de minimiser le nombre d’animaux nécessaire pour avoir des résultats utilisables. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé au maximum tout assurant des résultats statistiquement exploitables, nous avons calculé qu'un effectif maximum de 10 animaux par groupe serait suffisant pour les expérimentations d’efficacité et 6 animaux par groupe pour les expériences de toxicité. Le nombre d’animaux utilisés est déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Cet outil d’analyse statistique nous permet d’estimer le nombre d’animaux nécessaires, selon la variabilité des réponses obtenues. De plus, nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal en réalisant des analyses post-mortem sur les tissus récupérés (foie, tumeurs, poumons, rate, sang, moelle osseuse). En outre, nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal en réalisant des analyses biologiques, biochimiques et histologiques sur le même animal. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats obtenus et de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Nous envisageons de mutualiser des groupes contrôles pour les différents tests, lorsque ce sera possible. Par exemple : 1) le groupe "plasmide contrôle" dans le cas où le même vecteur est injecté, 2) dans le cas d'injection
Raffinement
L'état de santé des souris sera quotidiennement surveillé ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour les prendre en charge. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de garantir le bien-être chez l’animal. La formation et l'évolution des tumeurs sera suivie au cours du temps par imagerie non invasive. En cas de souffrance de l’animal, des analgésiques seront administrés. Tout signe et/ou comportement anormal sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent l’animal sera sorti du protocole. Les conditions d’hébergement classiques seront enrichies en alternance par afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypie.
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes d'initiation et d'évolution du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches utilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent d'identifier de nouveaux gènes, leur implication dans le développement de tumeurs hépatiques, et de mettre en évidence des nouveaux mécanismes de coopération entre gènes, comme nous l'avons déjà démontré. Les souris seront utilisées au stade jeune (moins de 2 mois). Cet âge permet d'évaluer l'initiation et l'évolution tumorale dans des individus pédiatriques, pour récapituler le contexte de l’hépatoblastome.
Étude du rôle des cellules immunitaires innées dans la progression de la drépanocytose chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Jusqu'à quatre-vingt-dix gavages quotidiens, quinze injections, deux séjours de huit à vingt-quatre heures en cage métabolique et jusqu'à vingt-quatre heures dans une atmosphère appauvrie en oxygène : 1 825 souris vont subir ce protocole, toutes tuées à l'issue, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur reconnaît que les crises vaso-occlusives provoquées chez ces souris entraînent des douleurs intenses et prolongées, comparables aux épisodes que vivent les personnes drépanocytaires. L'objet du projet est d'identifier des cellules immunitaires comme cibles thérapeutiques dans les complications rénales et cardiaques de la maladie. Le choix de souris de quatre semaines à six mois est justifié par l'absence de fibrose liée à l'âge, qui assurerait "une variabilité minimale des résultats expérimentaux".
Objectifs
La drépanocytose est une maladie génétique récessive causée par une mutation d’un gène, qui provoque une déformation des globules rouges. Cette pathologie entraine des complications rénales et cardiaques. Malgré les traitements actuels, les complications multiorganiques persistent. Des recherches récentes soulignent le rôle clé de certaines cellules immunitaires dans l’amplification des réponses inflammatoires, aggravant les lésions tissulaires et les dysfonctionnements des organes. Ce projet vise à explorer l’implication de ces cellules dans les complications liées à la drépanocytose et à évaluer leur potentiel en tant que cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes inflammatoires impliqués dans les complications aiguës et chroniques rénales et cardiaques de la drépanocytose. En se concentrant sur la contribution des cellules immunitaires, l’objectif est d’identifier des marqueurs pronostiques validés ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques capables de dépasser les limites des traitements actuels, en s’attaquant directement aux causes sous-jacentes des atteintes organiques associées à la drépanocytose. À terme, cette recherche pourrait contribuer à améliorer de manière significative les résultats cliniques et le bien-être global des patients atteints de cette maladie.
Procédures
- Biopsie de la queue : une seule biopsie de moins de 2 mm (10 secondes) réalisée sur une souris. - Prélèvement sanguin : un prélèvement sur souris vigile (durée environ 30 secondes) et deux prélèvements sur souris anesthésiées (durée environ 1 minute). - Mesure de la pression artérielle : deux mesures non invasives de 20 minutes sur souris vigiles pendant deux jours consécutifs. - Injections : 15 injections (une par jour) sur souris vigiles (environ 20 secondes par jour). - Administration orale : entre 15 et 90 administrations orales (une par jour) sur souris (environ 20 secondes par jour). - Administration par mini-pompes osmotiques : implantation sous-cutanée de pompes pour la délivrance continue du traitement (durée de la chirurgie : environ 5 minutes). - Séjour individuel dans des dispositifs métaboliques d’une durée de 8 à 24 heures, réalisé une à deux fois selon le protocole. - Exposition à une atmosphère hypoxique contrôlée : une à deux expositions d’une durée de 3 à 24 heures dans un environnement à faible teneur en oxygène.
Impact sur les animaux
Les souris ressentiront des douleurs légères et de courte durée à la suite de la biopsie de la queue et de la mesure de la pression artérielle. - Elles subiront également le stress d’un confinement individuel dans des cages métaboliques pendant une durée de 8 à 24 heures. - L’administration par voie orale, le prélèvement sanguin et les injections leur causeront une douleur légère et de courte durée ou un inconfort minime au site d’injection. -Douleurs modérées et de courte durée après chirurgie pour la pose de la pompe osmotique. - Les crises vaso-occlusives, qui reproduisent les complications aiguës observées dans le contexte de la drépanocytose, provoquent des douleurs intenses et prolongées, comparables aux épisodes douloureux sévères ressentis chez les patients drépanocytaires. - L’administration par voie orale quotidien entraînera un certain inconfort chez les souris, mais cette technique sera réalisée à l’aide de sondes d’alimentation en plastique polypropylène, afin de minimiser les risques de lésions œsophagiennes.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et d’analyser les reins, le cœur et le foie.
Remplacement
Le modèle animal permet d’étudier la physiopathologie rénale, cardiaque et hépatique en tenant compte de l’ensemble des paramètres physiologiques présents chez un organisme vivant. Les approches in vitro ou in silico ne peuvent pas reproduire cette complexité, notamment les interactions entre les vaisseaux sanguins et le système immunitaire, ce qui les rend peu pertinentes pour comprendre ces mécanismes.
Réduction
Le nombre minimum d'animaux requis est calculé sur la base d'un plan expérimental permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire pour obtenir des conclusions biologiquement pertinentes. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour chaque animal, un maximum d’organes et d’échantillons biologiques sera prélevé afin d’éviter la répétition des expériences sur de nouveaux animaux. Ces tests statistiques sont adaptés à la taille de nos échantillons. Les accouplements sont optimisés pour obtenir les animaux d’intérêt avec le meilleur rendement possible.
Raffinement
Plusieurs mesures seront prises pour réduire le stress, l’anxiété et la souffrance des animaux : 1/ Des points limites clairs et stricts, spécifiques au projet, ainsi qu’un système de notation de la douleur ont été définis pour surveiller le bien-être des animaux et permettre une intervention si nécessaire. 2/ Pour limiter la douleurs, des prélèvements seront effectués sous anesthésie, des analgésies sont prévues pour traiter la douleur.
Choix des espèces
Le modèle souris est essentiel pour étudier les pathologies rénales, cardiaques et hépatiques, car il reflète la complexité de l’organisme vivant que les modèles in vitro ou in silico analyses ne peuvent pas reproduire. Les souris âgées de 4 semaines à 6 mois sont idéales, car elles ont dépassé le sevrage physiologique et ne sont pas encore à un âge où une fibrose des organes (rein, cœur, foie, etc.) pourrait se développer en raison de facteurs liés à l'âge pendant la drépanocytose, ce qui permet d’assurer une variabilité minimale des résultats expérimentaux.
Evaluation de l’effet anti-obésité de molécules biosourcées chez la souris sous régime obésogène.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Pour comparer des molécules biosourcées à un traitement de référence contre l'obésité, 200 souris mâles sont rendues obèses par un régime gras pendant dix à quinze semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes tuées à l'issue. Chacune subit treize prélèvements de sang obtenus en coupant un millimètre du bout de sa queue, neuf à quinze injections sous la peau, et des gavages de solution sucrée qui peuvent irriter la gorge. S'y ajoutent six privations d'eau de six heures, trente-six heures au total, et des isolements de quatre heures deux fois par semaine pour mesurer leurs préférences alimentaires. L'enjeu déclaré est de retenir l'une des deux molécules candidates pour la production pharmaceutique et le passage aux essais cliniques.
Objectifs
Des études montrent que l’obésité modifie le goût et augmente la préférence pour les graisses alimentaires. Pour y remédier, des composés d’origine naturelle ont été synthétisés pour diminuer la consommation des graisses alimentaires et augmenter la satiété. L’objectif de cette étude est de comparer l’effet des composés synthétisés à partir d’un ingrédient d’origine naturelle à un traitement de référence contre l’obésité sur la gestion de l’alimentation et du poids. Elle vise également à fournir des données comparatives entre différents molécules biosourcées. Les principaux buts de l’étude sont : 1. Évaluer l’impact des molécules biosourcées sur les préférences alimentaires chez des souris. 2. Comparer l’effet des molécules biosourcées à celui du traitement de référence et voir si leur combinaison aide à maintenir une perte de poids durable chez des souris obèses. 3. Vérifier si les molécules biosourcées peuvent prévenir la reprise de poids après l’arrêt d’un traitement contre l’obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comparer des molécules biosourcées par rapport à un traitement existant et de les évaluer en tant que traitement adjuvant ou d’entretien dans la gestion du poids. Nous évaluerons également des molécules biosourcées B et C et validerons l’un d’eux (B ou C) pour la production pharmaceutique et la réalisation des études cliniques.
Procédures
Les souris sous régime (obésogène ou standard), seront pesées hebdomadairement et subiront : - une mesure de glycémie toutes les deux semaines pendant 10-15 semaines (prélèvement d’une goutte de sang environ : technique de mesure peu invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute), - un isolement ainsi qu’une privation d’eau pendant 6 heures avant chaque test de préférence entre deux choix, à raison de 3 tests par semaine pendant 2 semaines (soit 6 périodes de restriction hydrique, totalisant 36 heures). Une privation d’eau de 6 heures sera également appliquée avant la réalisation du test pour mesurer leur réaction au sucre (test de tolérance au glucose). Pour la mesure du taux de sucre dans le sang, chaque souris subira 5 à 8 prélèvements. Les souris seront soumises à un test de tolérance au sucre impliquant une brève contention pour l’administration du sucre par gavage, suivie de cinq prélèvements sanguins de faible volume réalisés au niveau de la queue sous anesthésie locale. Un prélèvement sanguin d’un volume important sera réalisé sous anesthésie générale juste avant la mise à mort (elle aussi réalisée sous anesthésie générale). Après le décès de l’animal, certains de ses organes seront prélevés.
Impact sur les animaux
- Les souris recevront une alimentation pouvant les rendre obèse (grosse) et provoquer un certain inconfort. Mais cette période ne durera que le temps nécessaire pour voir si les substances testées fonctionnent, soit entre 10 et 15 semaines (incluant 2 semaines sans subir aucun protocole pour s’habituer à leur nouvel environnement et entre 8 et 13 semaines de test). Cela permet de limiter au maximum les effets désagréables pour les souris. - Les souris peuvent ressentir un peu de stress à cause de certaines manipulations. Par exemple, elles peuvent recevoir entre 9 et 15 petites piqûres sous la peau, ou plusieurs petites prises de sang au niveau de la queue : entre 5 et 8 pour mesurer le sucre dans le sang, et 5 autres pendant un test de tolérance au sucre (pour voir comment leur corps réagit au sucre) qui dure 2 heures. Elles peuvent aussi être mises seules dans une cage pendant 4 heures, deux fois par semaine, pendant 2 semaines, pour un test sur leurs préférences alimentaires. - Pour faire les tests, on doit prélever un peu de sang aux souris, environ la taille d’une petite goutte. Pour cela, on coupe un petit bout du bout de leur queue, à peine un millimètre, ce qui peut leur faire un peu mal et parfois provoquer une petite infection, mais c’est surveillé de près. Au total, chaque souris aura 13 prises de sang : 8 pour suivre l'apparition du diabète, faites toutes les deux semaines, et 5 autres pendant un test pour voir comment leur corps réagit au sucre. - Les administrations par la bouche de solution sucrée induisent un stress chez les animaux et sont susceptibles de provoquer une irritation au niveau de la gorge.
Devenir
À la fin de l’expérience, les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever des tissus et des organes nécessaires aux analyses scientifiques. Ces examens, notamment ceux qui regardent les cellules et les organes au microscope, ne peuvent pas se faire sur un animal vivant. La mise à mort est faite sous anesthésie générale pour que les animaux ne ressentent ni douleur ni stress.
Remplacement
L’obésité est une maladie qui touche plusieurs parties du corps en même temps et qui modifie la façon dont l’organisme utilise les graisses, les sucres et contrôle l’appétit. Pour comprendre tous ces changements, il faut les étudier dans un corps vivant, car ils dépendent de la communication entre les organes. Ainsi, les modèles cellulaires ne peuvent pas entièrement remplacer l’utilisation d’animaux vivants pour cette étude. En effet, bien que des résultats aient été obtenus sur des cellules en laboratoire, cela ne suffit pas pour comprendre les réactions complexes du corps, comme la manière dont il perçoit les saveurs et réagit à ce qu’il mange. C’est pourquoi on a besoin d’étudier ces effets chez des animaux vivants.
Réduction
En utilisant des cellules en laboratoire (in vitro), on a pu faire une partie des tests sans animaux. Cela nous permettra d’en utiliser moins pour comprendre comment les substances agissent dans le corps. 3. Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude a été réduit au minimum tout en permettant d’obtenir des résultats scientifiques fiables. Après estimation, 8 souris par groupe sont nécessaires. Pour tenir compte de possibles effets du transport sur leur comportement, 2 souris supplémentaires sont ajoutées, soit un total de 10 animaux par groupe.
Raffinement
• Prise en charge et environnement : • Les souris seront hébergées en groupes dans des conditions habituelles de l’animalerie. Le calme sera maintenu dans la pièce, et les animaux seront surveillés lors des pesées (2 fois par semaine) ; • Du matériel d’enrichissement (pour la construction de nids) sera fourni en continu, avec un accès permanent à la nourriture et à l’eau ; • Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la contention (par tunnel ou dans le creux des mains) quelques jours avant les expérimentations. • Gestion de la douleur : Pour limiter toute douleur ou souffrance, Les souris seront surveillées de près par l’équipe de recherche. Cela permettra d'intervenir rapidement en cas de problème et de garantir le bien-être des souris. Lors des tests pour mesurer le sucre dans le sang, une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue des souris quelques minutes avant la petite coupure nécessaire pour prélever le sang. La zone sera aussi nettoyée avant et après avec un produit désinfectant. Le matériel utilisé sera désinfecté à chaque fois. Pour réduire l’inconfort et le stress lors de l’administration des substances par la bouche, des sondes souples et adaptées à la taille des souris seront utilisées. L’animal sera maintenu seulement quelques secondes, et l’expérimentateur est formé pour faire cette manipulation de façon douce et rapide. Pour assurer une hygiène optimale lors des interventions : • Le personnel portera une blouse jetable propre et des gants désinfectés à l’alcool 70 % ; • Les surfaces de travail seront nettoyées, un champ stérile sera utilisé, et les instruments seront stérilisés ; • La zone d’incision sera tondue et la peau désinfectée avant toute intervention. Des points limites adaptés seront également mis en place .
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de l’obésité car c’est un modèle qui est assez documenté, conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 8 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. Des souris mâles adultes âgées de 22 semaines seront utilisées dans cette étude. Certaines auront été rendues obèses en recevant une alimentation très grasse pendant plusieurs semaines. Pour évaluer leur état corporel, on utilise une méthode appelée Body Condition Score (BCS), qui donne une note de 1 à 5 (maigre à obèse) selon la quantité de graisse et de muscle. Cette estimation est faite en touchant doucement leur dos et leurs côtes. On utilise aussi un appareil de mesure spécialisé (appelé EchoMRI) pour avoir une estimation précise de la masse graisseuse. À la fin de l’étude, les animaux auront environ 37 semaines, un âge permettant d’observer les effets d’un régime riche en graisses sur le fonctionnement du corps à un stade avancé de leur développement.
Creation de lignées de lapins porteurs d’une invalidation d’un gène codant pour un canal ionique intestinal EU2/2
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- Oncologie
- Système gastrointestinal
Nés de transferts d'embryons réalisés dans un premier établissement, des lapereaux sont transportés par camion vers une seconde animalerie, deux à trois par carton à air filtré. Ce second volet mobilise les mêmes 340 lapins et lapines, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 310 d'entre eux et modéré pour 30 autres. Les lapereaux d'un mois subissent des prélèvements de salive, de sang et de peau, avec une contention pouvant atteindre vingt-cinq minutes, puis sont génotypés et triés: ceux qui n'ont pas le gène recherché sont tués pour étudier ses fonctions. Trente femelles échappent à cette issue, gardées pour produire de nouveaux embryons.
Objectifs
Le microbiote, c'est-à-dire la flore bactérienne intestinale non pathogène, joue un rôle essentiel non seulement dans l'assimilation des résidus alimentaires non digestibles, mais aussi dans la protection de certaines infections en dialoguant avec le système immunitaire de l'hôte. Il est donc essentiel, au même titre que les cellules intestinales, à la santé humaine et vétérinaire. Ce projet a pour objectif de créer des lignées de lapins présentant une modification génétique ciblée, grâce à une nouvelle méthode qui utilise des cellules souches modifiées en laboratoire, injectées dans de jeunes embryons. Le gène que nous cherchons à désactiver, produit normalement une protéine présente dans les cellules de l’intestin, chez plusieurs espèces de mammifères. Cette protéine pourrait jouer un rôle important dans différentes fonctions intestinales et donc intervenir dans la régulation de l’environnement intérieur de l’intestin et influencer le microbiote qui est un acteur clé dans la physiologie digestive. Le gène étudié n’étant pas présent chez la souris, le lapin représente le seul modèle expérimental possible pour ces analyses, car les mini-organes intestinaux créés in vitro ne représentent pas encore la complexité des interactions entre microbiote et cellules de l’intestin. Ce projet sera réalisé dans deux établissement utilisateurs (EU1 et EU2) qui conjuguent leurs expertises.
Bénéfices attendus
Les retombées attendues de ce projet sont de trois ordres. Le premier est la validation de l'utilisation de cellules souches pour produire des lapins transgéniques, technique disponible actuellement uniquement chez les rongeurs. Le second est le développement de cette méthode pour produire des lapins modèles de maladie humaine ou de thérapie cellulaire. Enfin le troisième est la création d'un modèle animal permettant l'étude des fonctions physiologiques des cellules intestinales exprimant le gène d’intérêt dans la régulation du microbiote et de l'environnement intérieur de l'intestin.
Procédures
injections d’hormones durant 3 secondes chacune (2 minutes maximum avec la contention) sur 4 jours, 50 femelles (EU1); 2. Insémination artificielle des lapines vigiles: 1 fois par lapine, durée de la contention et de l'intervention 5 minutes maximum, 50 femelles (EU1); 3. Transferts embryonnaires sur lapines anesthésiées : 1 fois par lapine, durée de l'opération 1h15 jusqu'au réveil, 30 lapines prévues (EU1); 4. Echographie sur lapines vigiles: 1 fois par lapine opérée, durée de la contention et de l'échographie 10 minutes maximum (EU1); 5. Prélèvements de salive, de sang et éventuellement de peau sur lapereaux vigiles d'un mois avec anesthésie locale : 1 fois par animal, durée de l'expérimentation 5 minutes (25 minutes avec le temps d'action maximal de la pommade anesthésiante), 260 lapereaux (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Les lapines subiront de faibles douleurs liées aux injections d’hormones ou de produits anesthésiants avec une durée de contention de 2 minutes. Elles éprouveront un léger stress lors de la réalisation d’inséminations artificielles avec une durée de contention de 5 minutes maximum et des douleurs lors des chirurgies de transfert embryonnaire (durée 1h15 jusqu'au réveil). Les lapereaux sentiront aussi un léger stress et une faible douleur lors de la réalisation de biopsies au niveau des oreilles, avec une durée de contention un peu stressante de 25 minutes maximum (10 à 20 minutes pour l'effet de la pommade anesthésiante et 5 minutes d'intervention). Les responsables de ce projet resteront attentifs à l’apparition de problèmes digestifs ou de douleurs chez les lapins dépourvus du gène d’intérêt.
Devenir
Les lapines productrices d'embryons seront euthanasiées pour récupérer les embryons de 1,5 jours. Les femelles ayant subi un transfert embryonnaire avec un développement à terme pourront être réutilisées pour des productions d'embryons. Seules, les femelles issues des transferts d’embryons microinjectées avec des cellules souches modifiées seront utilisées pour produire les lignées de lapins dépourvus du gène d’intérêt, les mâles seront eux, à ce stade, euthanasiés. La création de ces lignées de lapins nécessitera ensuite deux générations de croisement de lapins porteurs ou non du gène d’intérêt, avec une sélection après génotypages des animaux à garder ou à euthanasier. Les lapereaux issus de ces croisements et dépourvus du gène d’intérêt seront alors euthanasiés pour les études des fonctions de ce gène.
Remplacement
Le projet nécessite l'utilisation d'animaux puisqu'il vise à créer des lignées de lapins dépourvues d’un gène d’intérêt. Cependant l'utilisation de cellules souches permettra de limiter le nombre d'animaux utilisés, car l’élimination du gène peut être vérifiée et validée in vitro avant la microinjection des cellules dans les embryons, contrairement aux techniques classiques basées sur des manipulations génétiques réalisées directement sur les embryons. De plus, les cellules de l’intestin exprimant le gène d’intérêt ne peuvent être étudiées qu'in vivo, car les modèles in vitro de type mini-organes ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité de tube digestif et de son interaction avec le microbiote. Il n’existe donc pas d’alternatives à l’expérimentation in vivo pour étudier le rôle du gène d’intérêt dans le dialogue entre les cellules de l’intestin et le microbiote.
Réduction
Le recours aux superovulations permettra de diminuer d’un tiers le nombre de lapines utilisées pour produire des embryons, avec 20 à 30 embryons obtenus en moyenne par femelle au lieu de 8 à 12. De plus, nous utiliserons des lapines ayant déjà eu des lapereaux pour transplanter des embryons, ce qui permettra d'éviter d'employer des lapines présentant des problèmes de nidation ou d’allaitement lors des transferts embryonnaires. Enfin, à chaque étape du projet, les expériences seront réalisées de façon séquentielle sur un petit nombre d’animaux, puis seront renouvelées uniquement si les résultats obtenus sont insuffisants pour poursuivre le projet.
Raffinement
Les injections nécessaires aux différentes procédures seront faites de préférence par voie sous-cutanée, moins douloureuse que par voie intramusculaire. Dès que possible (pour 1 à 3 femelles puisque nous hébergeons 3 mâles), des accouplements naturels seront réalisés à la place des inséminations artificielles pour éviter du stress et de la douleur aux femelles. Les lapines opérées seront placées par deux dans une cage propre à leur réveil. Elles seront surveillées deux fois par jour par des animaliers qualifiés et bénéficieront d'un régime alimentaire amplifié avec des croquettes adaptées, à volonté à partir du second tiers de leur gestation. Après vérification des gestations par une échographie de contrôle, les lapines seront déplacées pour être seules par cage et une boite à nid adaptée aux cages sera ajoutée 5 jours avant la mise-bas, ainsi que du papier absorbant qui leur servira à amorcer la préparation de leur nid fait avec leurs poils. Après la mise-bas, une surveillance de l'allaitement et du bien-être des lapereaux sera faite chaque matin, avec le recours à une adoption ou à une supplémentation par biberon en cas de défaillance ou d'agression de la mère. Les lapereaux seront maintenus avec leur mère jusqu'à leur sevrage, soit entre 6 à 8 semaines, puis les mâles et les femelles seront séparées. Les lapereaux issus des transferts embryonnaires seront transportés dans la seconde animalerie, par camion agréé, sous température régulée, en plaçant deux à trois lapereaux par carton à air filtré contenant du foin et un bloc d’hydrogel. Toute manipulation sera effectuée de mamnière douce, après habituation progressive des lapins aux contacts humains (animaliers et expérimentateurs). Lors de l’application des procédures expérimentales et des mises à mort, des analgésiques et/ou anesthésiants seront utilisés, afin de réduire au maximum le stress et la douleur des animaux. De même, une surveillance adaptée avec une grille de score et des points limites ont été définis pour chaque procédure et seront appliqués par des animaliers qualifiés qui surveilleront les lapins quotidiennement.
Choix des espèces
Le but du projet est de créer des lignées de lapins dépourvus d’un gène d’intérêt impliqué dans la physiologie digestive. L’intérêt de l’espèce lapin est de deux ordres : d’une part la création d’un modèle expérimental, puisque la souris ne peut être utilisée, le gène d’intérêt étant absent chez les rongeurs ; et d’autre part la validation de la technique employant des cellules souches pour créer des animaux modèles, qui a été récemment développée chez le lapin. Dans ce cadre, le lapin présente de nombreux avantages comme sa taille moyenne, sa prolificité, son intervalle de génération court et sa forte production embryonnaire. Il est physiologiquement et génétiquement apparenté à l’Homme, et présente un développement embryonnaire et une organisation du placenta identiques à ceux des primates. De ce fait, l’utilisation de cellules souches de lapin faciliterait la création de modèles de maladies humaines et de réacteurs biologiques, des lapins capables de produire des molécules pharmaceutiques dans leur lait. Enfin, ce projet est réalisé en collaboration avec un laboratoire qui s'intéresse au gène étudié dans différentes espèces, dont le lapin qui exprime ce gène dans 5% des cellules de son tube digestif. Une partie des animaux sera utilisée en âge de reproduction, soit entre 5 et 30 mois pour les mâles et entre 5 et 36 mois pour les femelles. L'autre partie sera utilisée précocement, soit à 18 jours ou 5 à 6 semaines, pour le génotypage ou les études des fonctions du gène étudié.
Creation de lignées de lapins porteurs d’une invalidation d’un gène codant pour un canal ionique intestinal EU1/2
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
340 lapins et lapines vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 310 d'entre eux et modéré pour 30 autres, la plupart tués à l'issue et 30 femelles réutilisées pour de nouvelles productions d'embryons. Cinquante lapines reçoivent sept injections d'hormones en quatre jours puis une insémination artificielle, trente subissent un transfert embryonnaire sous anesthésie de 1 h 15, et 260 lapereaux d'un mois sont maintenus contenus jusqu'à vingt-cinq minutes pour des biopsies d'oreille et des prélèvements de sang. Les lapines productrices d'embryons sont tuées pour récupérer des embryons de 1,5 jour, et les mâles issus des transferts le sont aussi. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternatives" à l'expérimentation in vivo, les mini-organes intestinaux ne reproduisant selon lui pas la complexité du dialogue entre intestin et microbiote.
Objectifs
Le microbiote, c'est-à-dire la flore bactérienne intestinale non pathogène, joue un rôle essentiel non seulement dans l'assimilation des résidus alimentaires non digestibles, mais aussi dans la protection de certaines infections en dialoguant avec le système immunitaire de l'hôte. Il est donc essentiel, au même titre que les cellules intestinales, à la santé humaine et vétérinaire. Ce projet a pour objectif de créer des lignées de lapins présentant une modification génétique ciblée, grâce à une nouvelle méthode qui utilise des cellules souches modifiées en laboratoire, injectées dans de jeunes embryons. Le gène que nous cherchons à désactiver, produit normalement une protéine présente dans les cellules de l’intestin, chez plusieurs espèces de mammifères. Cette protéine pourrait jouer un rôle important dans différentes fonctions intestinales et donc intervenir dans la régulation de l’environnement intérieur de l’intestin et influencer le microbiote qui est un acteur clé dans la physiologie digestive. Le gène étudié n’étant pas présent chez la souris, le lapin représente le seul modèle expérimental possible pour ces analyses, car les mini-organes intestinaux créés in vitro ne représentent pas encore la complexité des interactions entre microbiote et cellules de l’intestin. Ce projet sera réalisé dans deux établissement utilisateurs (EU1 et EU2) qui conjuguent leurs expertises.
Bénéfices attendus
Les retombées attendues de ce projet sont de trois ordres. Le premier est la validation de l'utilisation de cellules souches pour produire des lapins transgéniques, technique disponible actuellement uniquement chez les rongeurs. Le second est le développement de cette méthode pour produire des lapins modèles de maladie humaine ou de thérapie cellulaire. Enfin le troisième est la création d'un modèle animal permettant l'étude des fonctions physiologiques des cellules intestinales exprimant le gène d’intérêt dans la régulation du microbiote et de l'environnement intérieur de l'intestin.
Procédures
Cinq types d’interventions sont prévues : 1. Traitement de superovulation sur lapines vigiles: 1 fois par lapine, 7 injections d’hormones durant 3 secondes chacune (2 minutes maximum avec la contention) sur 4 jours, 50 femelles (EU1); 2. Insémination artificielle des lapines vigiles: 1 fois par lapine, durée de la contention et de l'intervention 5 minutes maximum, 50 femelles (EU1); 3. Transferts embryonnaires sur lapines anesthésiées : 1 fois par lapine, durée de l'opération 1h15 jusqu'au réveil, 30 lapines prévues (EU1); 4. Echographie sur lapines vigiles: 1 fois par lapine opérée, durée de la contention et de l'échographie 10 minutes maximum (EU1); 5. Prélèvements de salive, de sang et éventuellement de peau sur lapereaux vigiles d'un mois avec anesthésie locale : 1 fois par animal, durée de l'expérimentation 5 minutes (25 minutes avec le temps d'action maximal de la pommade anesthésiante), 260 lapereaux (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Les lapines subiront de faibles douleurs liées aux injections d’hormones ou de produits anesthésiants avec une durée de contention de 2 minutes. Elles éprouveront un léger stress lors de la réalisation d’inséminations artificielles avec une durée de contention de 5 minutes maximum et des douleurs lors des chirurgies de transfert embryonnaire (durée 1h15 jusqu'au réveil). Les lapereaux sentiront aussi un léger stress et une faible douleur lors de la réalisation de biopsies au niveau des oreilles, avec une durée de contention un peu stressante de 25 minutes maximum (10 à 20 minutes pour l'effet de la pommade anesthésiante et 5 minutes d'intervention). Les responsables de ce projet resteront attentifs à l’apparition de problèmes digestifs ou de douleurs chez les lapins dépourvus du gène d’intérêt.
Devenir
Les lapines productrices d'embryons seront euthanasiées pour récupérer les embryons de 1,5 jours. Les femelles ayant subi un transfert embryonnaire avec un développement à terme pourront être réutilisées pour des productions d'embryons. Seules, les femelles issues des transferts d’embryons microinjectées avec des cellules souches modifiées seront utilisées pour produire les lignées de lapins dépourvus du gène d’intérêt, les mâles seront eux, à ce stade, euthanasiés. La création de ces lignées de lapins nécessitera ensuite deux générations de croisement de lapins porteurs ou non du gène d’intérêt, avec une sélection après génotypages des animaux à garder ou à euthanasier. Les lapereaux issus de ces croisements et dépourvus du gène d’intérêt seront alors euthanasiés pour les études des fonctions de ce gène.
Remplacement
Le projet nécessite l'utilisation d'animaux puisqu'il vise à créer des lignées de lapins dépourvues d’un gène d’intérêt. Cependant l'utilisation de cellules souches permettra de limiter le nombre d'animaux utilisés, car l’élimination du gène peut être vérifiée et validée in vitro avant la microinjection des cellules dans les embryons, contrairement aux techniques classiques basées sur des manipulations génétiques réalisées directement sur les embryons. De plus, les cellules de l’intestin exprimant le gène d’intérêt ne peuvent être étudiées qu'in vivo, car les modèles in vitro de type mini-organes ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité de tube digestif et de son interaction avec le microbiote. Il n’existe donc pas d’alternatives à l’expérimentation in vivo pour étudier le rôle du gène d’intérêt dans le dialogue entre les cellules de l’intestin et le microbiote.
Réduction
Le recours aux superovulations permettra de diminuer d’un tiers le nombre de lapines utilisées pour produire des embryons, avec 20 à 30 embryons obtenus en moyenne par femelle au lieu de 8 à 12. De plus, nous utiliserons des lapines ayant déjà eu des lapereaux pour transplanter des embryons, ce qui permettra d'éviter d'employer des lapines présentant des problèmes de nidation ou d’allaitement lors des transferts embryonnaires. Enfin, à chaque étape du projet, les expériences seront réalisées de façon séquentielle sur un petit nombre d’animaux, puis seront renouvelées uniquement si les résultats obtenus sont insuffisants pour poursuivre le projet.
Raffinement
Les injections nécessaires aux différentes procédures seront faites de préférence par voie sous-cutanée, moins douloureuse que par voie intramusculaire. Dès que possible (pour 1 à 3 femelles puisque nous hébergeons 3 mâles), des accouplements naturels seront réalisés à la place des inséminations artificielles pour éviter du stress et de la douleur aux femelles. Les lapines opérées seront placées par deux dans une cage propre à leur réveil. Elles seront surveillées deux fois par jour par des animaliers qualifiés et bénéficieront d'un régime alimentaire amplifié avec des croquettes adaptées, à volonté à partir du second tiers de leur gestation. Après vérification des gestations par une échographie de contrôle, les lapines seront déplacées pour être seules par cage et une boite à nid adaptée aux cages sera ajoutée 5 jours avant la mise-bas, ainsi que du papier absorbant qui leur servira à amorcer la préparation de leur nid fait avec leurs poils. Après la mise-bas, une surveillance de l'allaitement et du bien-être des lapereaux sera faite chaque matin, avec le recours à une adoption ou à une supplémentation par biberon en cas de défaillance ou d'agression de la mère. Les lapereaux seront maintenus avec leur mère jusqu'à leur sevrage, soit entre 6 à 8 semaines, puis les mâles et les femelles seront séparées. Les lapereaux issus des transferts embryonnaires seront transportés dans la seconde animalerie, par camion agréé, sous température régulée, en plaçant deux à trois lapereaux par carton à air filtré contenant du foin et un bloc d’hydrogel. Toute manipulation sera effectuée de mamnière douce, après habituation progressive des lapins aux contacts humains (animaliers et expérimentateurs). Lors de l’application des procédures expérimentales et des mises à mort, des analgésiques et/ou anesthésiants seront utilisés, afin de réduire au maximum le stress et la douleur des animaux. De même, une surveillance adaptée avec une grille de score et des points limites ont été définis pour chaque procédure et seront appliqués par des animaliers qualifiés qui surveilleront les lapins quotidiennement.
Choix des espèces
Le but du projet est de créer des lignées de lapins dépourvus d’un gène d’intérêt impliqué dans la physiologie digestive. L’intérêt de l’espèce lapin est de deux ordres : d’une part la création d’un modèle expérimental, puisque la souris ne peut être utilisée, le gène d’intérêt étant absent chez les rongeurs ; et d’autre part la validation de la technique employant des cellules souches pour créer des animaux modèles, qui a été récemment développée chez le lapin. Dans ce cadre, le lapin présente de nombreux avantages comme sa taille moyenne, sa prolificité, son intervalle de génération court et sa forte production embryonnaire. Il est physiologiquement et génétiquement apparenté à l’Homme, et présente un développement embryonnaire et une organisation du placenta identiques à ceux des primates. De ce fait, l’utilisation de cellules souches de lapin faciliterait la création de modèles de maladies humaines et de réacteurs biologiques, des lapins capables de produire des molécules pharmaceutiques dans leur lait. Enfin, ce projet est réalisé en collaboration avec un laboratoire qui s'intéresse au gène étudié dans différentes espèces, dont le lapin qui exprime ce gène dans 5% des cellules de son tube digestif. Une partie des animaux sera utilisée en âge de reproduction, soit entre 5 et 30 mois pour les mâles et entre 5 et 36 mois pour les femelles. L'autre partie sera utilisée précocement, soit à 18 jours ou 5 à 6 semaines, pour le génotypage ou les études des fonctions du gène étudié.
Evaluation d’un transporteur de médicament pour lutter contre le cancer du foie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Des cellules de tumeur du foie sont implantées dans le ventre de souriceaux très jeunes et fortement immunodéprimés, pour reproduire l'hépatoblastome de l'enfant. 220 souris au total vont être utilisées, les petits greffés et leurs mères, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour vingt d'entre elles et sévère pour deux cents, toutes tuées pour prélever les foies et les tumeurs. La tumeur est mesurée deux fois par semaine par imagerie de bioluminescence. Le porteur écrit que la majorité des nuisances n'aura pas d'effet parce que les souris sont manipulées sous anesthésie, et résume l'objectif comme la démonstration que ce modèle animal sert à tester de futurs médicaments.
Objectifs
L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence utilise une chimiothérapie à l’aide d’un agent anticancéreux utilisé à l’hôpital mais qui est très toxique et ne permet pas de guérir tous les enfants. Ce cancer est caractérisé par des mutations bien connues mais les mécanismes biologiques responsables de son émergence après la naissance chez l’Homme restent très mal comprises. Notre modèle de cancer du foie chez la souris très jeune permet de mimer la maladie observée chez les enfants, d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de son apparition et de tester l’efficacité de candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Montrer que ces cellules d’hépatoblastomes répondent à une approche de thérapie génique et donc que ce modèle animal est utile pour tester de futurs médicaments. Disposer d’un modèle chez la souris très jeune qui permette d’étudier avec plus d’exactitude les mécanismes à l’origine de ce cancer pédiatrique.
Procédures
Implantation de cellules tumorales dans le foie après une incision de la peau au niveau ventral (1 seule incision et implantation, 10 minutes). Points de sutures au niveau ventral (3 points de sutures, 10 minutes). Administration unique de médicaments (20 secondes par injection). Mesure de la tumeur par imagerie à bioluminescence 2 fois par semaine (10 minutes par analyse). Pesée des souris deux fois par semaine (20 secondes par pesée).
Impact sur les animaux
Les nuisances sont la manipulation des cages et des souris, l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille, un stress lors de manipulations répétées, une légère douleur au point de piqure, une légère douleur liée aux particules virales injectées, une légère sensation de froid lors du nettoyage de la peau à l’alcool. Dans le cas où un point de suture se romprait, il sera recousu au plus vite. Comme les souris sont manipulées sous anesthésie, la majorité de ces nuisances n’aura pas d’effet sur les animaux.
Devenir
Les 220 animaux (souris greffées et leurs mères) seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des foies et des tumeurs et leur analyse par des approches moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude en boite de culture, car ces derniers ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, la communication et la diversité d’interactions entre les cellules normales et les cellules tumorales dans un animal entier.
Réduction
Nos effectifs sont déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour des raisons de réduction, nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie pour empêcher la douleur et le stress. Un analgésique sera utilisé 30 min avant toute opération. Les animaux sont hébergés en cages à raison de 3 mères et de 10 souriceaux par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. En cas de besoin et pour le bien-être des animaux, nous ajouterons de la nourriture humidifiée/ou du gel nutritif dans les cages ou feront des injections intrapéritonéales de sérum physiologique. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de paille végétale. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera traité par des analgésiques (buprénorphine à 30 µg/mL). S’il n’y a pas d’amélioration, il sera euthanasié sans attendre. Enfin, nous appliquerons les points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. Nous utiliserons des souris très jeunes pour mimer le plus justement possible le contexte de la maladie chez les enfants très jeunes.
Impact des PFAS et emulsifiants alimentaires sur la santé de l’axe microbiote-intestin-cerveau en condition de barrière intestinale intègre ou fragilisée par un stress chronique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va du léger au sévère, 540 d'entre elles en sévère. Elles reçoivent des polluants par la bouche dix fois en quatre-vingt-dix jours, passent une heure par jour perchées sur une plateforme au milieu d'un bac d'eau pendant onze jours, puis subissent l'implantation d'un dispositif sous la peau et le gonflement progressif d'un ballonnet dans le rectum, en cinq étapes douloureuses de dix secondes. Arrivées à l'animalerie à quatre semaines, elles servent à étudier l'effet d'une exposition précoce aux PFAS et aux émulsifiants alimentaires sur l'intestin et le cerveau. Le porteur écrit que les effets attendus "demeurent globalement transitoires".
Objectifs
Notre mode de vie moderne nous expose chaque jour à différentes substances chimiques présentes dans l’environnement et dans notre alimentation. Certaines d’entre elles, utilisées pour rendre les objets du quotidien antiadhésifs ou imperméables (comme certains ustensiles de cuisine, emballages ou textiles), attirent aujourd’hui l’attention car elles persistent longtemps dans l’environnement et peuvent s’accumuler dans l’organisme. Leurs effets sur la santé ne sont pas encore totalement connus, mais des données suggèrent qu’elles pourraient influencer le métabolisme, la fertilité, le système immunitaire ou certains processus biologiques à long terme, surtout en cas d’exposition prolongée ou à faibles doses. D’autres additifs alimentaires, utilisés pour améliorer la texture et la conservation des produits transformés, sont considérés comme sûrs dans les conditions actuelles. Cependant, des recherches récentes montrent qu’ils pourraient modifier l’équilibre du microbiote intestinal (les bactéries qui vivent dans nos intestins) et provoquer de légères réactions inflammatoires. Le système digestif joue un rôle clé car il est en contact direct avec ces substances. Un déséquilibre de cet équilibre fragile pourrait contribuer à l’apparition de troubles fonctionnels intestinaux, comme le syndrome de l’intestin irritable, caractérisé par une hypersensibilité abdominale. Ce projet a trois objectifs principaux : Étudier les effets d’une exposition prolongée à certaines substances polluantes environnementales et alimentaires, seules ou combinées, sur la barrière intestinale, le microbiote, les défenses immunitaires et la sensibilité digestive. Évaluer l’impact d’un stress chronique associé à ces expositions, afin de mieux comprendre leurs interactions sur la santé intestinale. Approfondir la compréhension de l’« exposome intestinal », c’est-à-dire l’ensemble des facteurs environnementaux qui peuvent influencer la santé digestive tout au long de la vie. En combinant ces approches, le projet vise à mieux comprendre comment certaines expositions environnementales peuvent contribuer à des déséquilibres digestifs persistants.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines substances présentes dans notre environnement et notre alimentation (comme certains polluants ou additifs alimentaires appelés émulsifiants) peuvent influencer la santé intestinale et la façon dont notre corps perçoit les signaux digestifs. À court terme, il apportera de nouvelles connaissances scientifiques en étudiant, pour la première fois, l’effet combiné de ces expositions sur le microbiote intestinal (les bactéries qui vivent dans nos intestins), sur la barrière intestinale (qui protège l’organisme) et sur la communication entre l’intestin et le cerveau. Ces résultats pourraient permettre d’identifier des signes précoces de déséquilibre intestinal, utiles pour la prévention et le diagnostic. À plus long terme, les données obtenues pourraient contribuer à améliorer les recommandations de santé publique concernant certains additifs ou polluants persistants, et encourager le développement d’alternatives plus respectueuses de la santé et de l’environnement. Enfin, en approfondissant la compréhension des liens entre environnement, microbiote et confort digestif, ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies destinées à améliorer la qualité de vie des personnes souffrant de troubles intestinaux fonctionnels.
Procédures
Types d’interventions prévues : - Administration orale : les animaux recevront une administration orale répétée 10 fois sur une période de 90 jours. Chaque manipulation, d’une durée d’environ 10 secondes, est réalisée par du personnel expérimenté et formé afin de limiter le stress. - Exposition à un stress chronique : Certains animaux seront placés sur une petite plateforme au centre d’un bac rempli d’eau, pendant 1 heure par jour, et ce durant les 11 derniers jours d'exposition (5 jours de stress, 2 jours de repos, 4 jours de stress). - Prélèvements sanguins : Du sang sera prélevé au niveau de la queue des animaux éveillés, à trois moments de l’étude (avant, au milieu et à la fin). Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes et respecte les volumes autorisés par la réglementation. - Mesure de la sensibilité intestinale : sous anesthésie générale, un petit dispositif sera implanté sous la peau pour mesurer la réaction de l’intestin. L’intervention, d’une durée maximale de 30 minutes, sera suivie d’une période d’hébergement individuel d’une durée de 4 jours, afin de permettre une récupération optimale et d’assurer une surveillance individualisée. La mesure de la réaction intestinale consiste à introduire un petit ballonnet dans le rectum, qui est gonflé progressivement en cinq étapes. Chaque étape dure 10 secondes, avec des pauses de 5 à 10 minutes entre elles. Cette procédure est réalisée une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
Les effets attendus au cours de ce protocole peuvent varier selon la nature des interventions, mais demeurent globalement transitoires. 1. Administration orale (polluants et traceur fluorescent) : Cet acte peut provoquer un léger stress ou une agitation passagère liée à la manipulation. Dans de rares cas, une irritation mineure de la gorge ou de l’œsophage peut apparaitre. La répétition de l’administration (tous les 10 jours sur une période de 90 jours) peut entraîner un stress limité, surveillé grâce à un suivi comportemental adapté. 2. Administration d’émulsifiants dans l’eau de boisson : Aucun inconfort particulier n’est attendu. De petites variations dans le comportement alimentaire ou le transit digestif peuvent apparaitre, selon la tolérance individuelle des animaux. 3. Exposition à un stress psychologique chronique : Cette étape peut entraîner une contrainte psychologique temporaire, se traduisant par une diminution de la mobilité, une vigilance accrue ou des signes de stress passagers. 4. Évaluation de la sensibilité intestinale : La courte intervention chirurgicale sous anesthésie générale peut s’accompagner d’une baisse transitoire de l’activité ou de l’appétit, ainsi que de signes d’inconfort abdominal modéré. Par la suite, la mesure de la sensibilité intestinale peut s’accompagner d’une douleur modérée pendant 10 secondes à chaque étape, suivie d’inconfort et d’un stress temporaire. 5. Hébergement individuel : Cette situation peut représenter une source de stress social, se manifestant par une anxiété passagère, une baisse d’activité ou des comportements répétitifs.
Devenir
Tous les animaux en fin de procédure, seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements de tissus post-mortem pour différentes analyses et dosages.
Remplacement
Des modèles cellulaires seront utilisés pour étudier les effets potentiels des polluants et des additifs alimentaires sur l’épithélium intestinal. Cependant, à ce stade du projet, les approches in vitro ou ex vivo ne permettent pas de reproduire la complexité de la physiologie digestive et des interactions entre microbiote, système immunitaire et système nerveux entérique. L’utilisation d’un modèle in vivo reste donc nécessaire pour comprendre de manière intégrée les conséquences d’une exposition prolongée à ces composés sur la santé intestinale, notamment sur les mécanismes de régulation de l’inflammation et de la sensibilité intestinale.
Réduction
Les études préliminaires menées dans le cadre de ce projet ont permis d’optimiser la procédure d’évaluation de la sensibilité intestinale, tant sur le plan technique que sur celui du bien-être animal. L’expérience acquise par l’équipe (rapidité d’exécution, maîtrise des gestes, conditions post-opératoires adaptées, maintien temporaire d’une température ambiante de 26 °C) a permis de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables, sur la base d’un calcul de puissance statistique. Ainsi, le nombre de souris par groupe est passé à 12 ou 15 suivant les protocoles, tout en maintenant la robustesse des analyses. Les résultats seront confirmés par deux expérimentations indépendantes afin d’assurer leur reproductibilité. Des analyses statistiques multivariées et corrélatives permettront d’exploiter pleinement les données générées, garantissant une utilisation optimale des animaux inclus. La taille des groupes expérimentaux est strictement limitée au minimum nécessaire pour atteindre la puissance scientifique attendue, conformément au principe des 3R.
Raffinement
Le bien-être des animaux est une priorité tout au long de l’étude. Les souris sont hébergées dans des conditions conformes aux recommandations européennes, avec un environnement enrichi qui favorise leurs comportements naturels. Les manipulations, comme les pesées hebdomadaires, sont réalisées de manière douce et progressive afin de réduire le stress et faciliter l’habituation. Lors des périodes où les animaux doivent être hébergés individuellement, les cages transparentes permettent de conserver des interactions visuelles, olfactives et auditives avec leurs congénères. Des matériaux de nidification (fibres de coton) et des objets d’enrichissement (bûchettes de bois) sont fournis pour stimuler leurs activités naturelles de construction et de rongement. Une observation quotidienne, notamment lors de la distribution des régimes alimentaires, permet de détecter rapidement tout changement de comportement ou d’état général. Des critères précis (points limites) garantissent une intervention rapide en cas de signe de souffrance ou de détérioration du bien-être. Les procédures peuvent être interrompues ou adaptées sur avis vétérinaire. Lors des interventions, toutes les précautions sont prises pour éviter la douleur et assurer une récupération optimale : anesthésie adaptée, maintien de la température corporelle, environnement chauffé après l’opération et réhydratation si nécessaire. L’ensemble du protocole a été conçu pour garantir un haut niveau de bien-être animal tout en préservant la qualité scientifique des résultats. Le projet respecte la réglementation en vigueur (Directive 2010/63/UE et Code rural) ainsi que les principes éthiques de l’expérimentation animale. Chaque étape applique les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement), avec pour priorités la limitation du nombre d’animaux, la minimisation des contraintes et le maintien du confort. Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, sous la supervision d’un vétérinaire, afin d’assurer à la fois la prise en charge optimale des animaux et la fiabilité scientifique des résultats.
Choix des espèces
Le modèle murin (Mus musculus) est un modèle de référence pour l’étude de la physiologie digestive et de la sensibilité intestinale. Il est largement utilisé en recherche biomédicale en raison de sa similarité avec l’humain sur les plans immunologique, métabolique et neurophysiologique, ainsi que de la disponibilité de nombreux outils génétiques et analytiques permettant d’explorer finement les mécanismes d’action des expositions environnementales. Ce modèle a été retenu car il est bien caractérisé, stable sur le plan génétique et couramment utilisé dans les études portant sur le microbiote, la réponse immunitaire et les effets du stress. Le modèle de stress (évitement passif de l’eau) a été spécifiquement validé avec cette lignée. Plusieurs travaux récents ont montré que ce modèle reproduit de manière fiable certaines modifications physiologiques observées lors de situations de stress prolongé, notamment une altération modérée de la motricité intestinale, une adaptation de la production de mucine et une modulation des réponses neuroendocrines et immunitaires. Ces caractéristiques font de ce modèle un outil pertinent pour explorer les interactions entre stress, microbiote, inflammation et fonction barrière intestinale. Les souris seront âgées de 4 semaines à leur arrivée à l’animalerie, suivies d’une période d’acclimatation d’une semaine avant le début des expositions. Le choix de jeunes souris permet d’étudier l’impact d’une exposition précoce à un mélange des polluants environnementaux et des additifs alimentaires, seuls ou combinés, et d’en suivre les effets à long terme sur la santé digestive et la communication intestin-cerveau. À la fin du protocole, les animaux auront environ 16 semaines, ce qui correspond à un stade jeune adulte, couramment utilisé pour les études de physiologie intégrée. Le choix de la souris, plutôt que d’une autre espèce, s’explique également par la disponibilité d’un large corpus de données de référence dans des conditions expérimentales similaires. Cela favorise la comparabilité des résultats, limite le nombre d’animaux nécessaires et évite la duplication d’expériences, conformément au principe de Réduction des 3R.
Développement d’hépatocytes humains fonctionnels via leur amplification initiale in vivo
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris dont l'état ne peut plus être rétabli pourront être tuées avant terme, sur la base d'une grille de mesure de l'inconfort. 430 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées au plus tard huit mois après la greffe. Une partie de leurs propres cellules de foie est détruite par injection, une fois ou une fois par semaine pendant neuf semaines, puis des hépatocytes humains leur sont greffés sous la membrane du rein ou dans la rate, avant des prélèvements sanguins répétés pendant huit mois. Le porteur écrit qu'aucune nuisance n'est décrite pour cette destruction partielle du foie, et présente le projet comme un moyen de diminuer à terme le nombre d'animaux utilisés dans les tests de toxicité.
Objectifs
Les atteintes du foie ou atteintes hépatiques sont une des raisons principales du retrait de médicaments du marché et de l’échec de nouvelles molécules en développement au cours des essais cliniques. Les études pré-cliniques de toxicité hépatique et de pharmacocinétique sont des éléments essentiels pour réduire ces retraits et échecs et les conséquences médicales graves parfois observées chez les patients ainsi que pour accélérer le développement de nouveaux médicaments. Le foie est principalement constitué de cellules appelées hépatocytes dont l’une des fonctions est la biotransformation et la détoxification des médicaments et toxines. Ainsi, la culture de cellules de foie humain constitue le modèle de référence pour prédire le métabolisme et la toxicité hépatique des médicaments en développement. Cependant, leur accès est limité et ils présentent l’inconvénient majeur d’une grande variabilité entre donneurs. Ainsi, les laboratoires se tournent vers des modèles animaux ou de lignées cellulaires modifiées éloignés de la physiologie humaine. L’objectif général du projet est de développer des lignées d’hépatocytes humains hautement fonctionnels à la manière de ce que nous avons précédemment réalisé avec des cellules du pancréas actuellement considérées comme un modèle in vitro de référence des cellules sécrétrices d'insuline humaines. Afin de parvenir à cet objectif, le projet nécessite tout d’abord de mettre au point un protocole de greffe d’hépatocytes humains dans la souris. En effet l’amplification et la sélection initiale des cellules dans l’animal a été un élément décisif de la génération des lignées de cellules béta humaines fonctionnelles. Puis dans un second temps le projet consistera à générer plusieurs lignées d’hépatocytes à partir de tissus issus de patients qui seront ensuite caractérisées in vitro afin de sélectionner les lignées d’hépatocytes fonctionnels adaptées aux études pré-cliniques.
Bénéfices attendus
Le développement d’hépatocytes, les cellules actives du foie, humains et fonctionnels, aurait des conséquences directes positives sur la santé humaine tout en diminuant l’utilisation de modèles animaux. Des hépatocytes humains, représentatifs des différences de métabolisme et de toxicité des médicaments entre individus, permettraient la caractérisation fiable et précoce des nouveaux médicaments en développement, réduisant les échecs et accélérant le développement de nouvelles thérapies. De plus cette caractérisation du métabolisme et de la toxicité des molécules en développement faite sur des cellules humaines, permettrait de rendre les médicaments plus sûrs en amont des essais cliniques, augmenterait la sécurité des médicaments mis sur le marché et diminuerait les risques de toxicité chez les patients. Enfin, l’accès à de tels hépatocytes humains prédictifs diminuerait l’utilisation d’animaux dans les études de métabolisme et de toxicité. En effet, alors même que les modèles animaux utilisés en recherche pharmaceutique sont seulement partiellement prédictifs, ils sont utilisés du fait de l’absence d’une alternative. La validation de la capacité de prédiction de la toxicité et du métabolisme des cellules que nous allons générer, qui est prévue comme un objectif principal du projet, aurait pour conséquence immédiate une diminution de l’utilisation d’animaux. Finalement, ces cellules humaines fonctionnelles accélèreraient la recherche sur la physiologie des cellules du foie et sur les mécanismes des maladies du foie. Elles faciliteraient ainsi grâce à leur reproductibilité et au fait que ce soit un modèle humain, l’identification de cibles thérapeutiques.
Procédures
Un groupe de 60 animaux maximum subira une élimination partielle de leurs hépatocytes nécessitant 1 injection (30 animaux) ou 1 injection par semaine pendant 9 semaines (30 animaux), réalisées à l’état vigile. Puis ces animaux subiront des prélèvements sanguins au rythme de 1 prélèvement par semaine pendant 2 semaines puis 2 prélèvements par mois pendant un maximum de 3 mois. Ces prélèvements seront réalisés à l'état vigile. La durée individuelle de ces actes d’injection et de prélèvement est de 30 secondes. Un second groupe de 370 animaux maximum subira l'élimination partielle de leurs hépatocytes nécessitant, selon les résultats des groupes pilotes, 1 injection ou 1 injection par semaine pendant 9 semaines, réalisées à l’état vigile. Les animaux subiront ensuite la greffe d’hépatocytes humains. Cette procédure de chirurgie sera effectuée sous anesthésie et dure environ 15 minutes. Puis les animaux subiront 3 injections d’analgésique post-chirurgie (30 secondes par acte). Ces injections seront réalisées à l'état vigile. Enfin, les animaux subiront des prélèvements sanguins. Le nombre de prélèvements sera de 1 prélèvement par semaine pendant 4 semaines puis 2 prélèvements par mois pendant un maximum de 8 mois. Ces prélèvements seront réalisés à l'état vigile. La durée individuelle de ces actes d’injection et de prélèvement est de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, les souris seront soumises à une élimination partielle de leurs hépatocytes, induite chimiquement, puis à une chirurgie pour greffe d’hépatocytes humains sous la membrane qui entoure un de leur rein ou par injection dans la rate et enfin à des prélèvements sanguins et échographies afin de mesurer la multiplication des hépatocytes humains. Plusieurs nuisances liées à la procédure de greffe des hépatocytes pourraient être subies par les animaux. Il s’agit de douleur et de stress liés à la chirurgie et de gêne et/ou douleur occasionnée par la plaie. Il pourrait s’agir également d’une hypothermie liée à l’anesthésie ou d’une infection suite à la chirurgie. Par ailleurs les animaux pourraient subir une gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des injections. Enfin les animaux pourraient subir une gêne et du stress lors des prélèvements de sang pour le suivi des cellules implantées. Enfin, il n’y a pas de nuisances décrites induites par l'élimination partielle des hépatocytes. Il n’y a pas non plus de nuisances attendues en conséquence de la multiplication des hépatocytes humains greffés étant donné que la taille du greffon restera très modeste d’après notre expérience sur les précédents types cellulaires générés.
Devenir
Les animaux utilisés pour les études pilotes de déplétion des hépatocytes endogènes seront euthanasiés au maximum 3 mois après la procédure afin de confirmer la déplétion des hépatocytes. Ils ne pourront pas être ré-utilisés pour les expériences de greffe d’hépatocytes humains car ces greffes doivent être effectuées quelques jours après l’induction de la déplétion. Les animaux utilisés pour la greffe d’hépatocytes humains seront euthanasiés au plus tard 8 mois après la greffe, ce qui est le temps nécessaire pour permettre la croissance d’une lignée d’hépatocytes.
Remplacement
Les travaux prévus dans ce projet ne peuvent pas être transposées dans des modèles in vitro par exemple en culture cellulaire. En effet, notre expérience de génération de précédentes cellules humaines fonctionnelles montre qu’une étape essentielle est la greffe des cellules humaines dans l’animal pour une multiplication sélective de cellules qui conservent leur fonction. Ainsi, lors du développement du modèle de cellules sécrétrices d'insuline, aucune stratégie in vitro n’a permis la sélection de cellules qui maintenaient leur fonction. De plus plusieurs travaux décrivant l’immortalisation in vitro de cellules du foie humain ont été publiés par d’autres équipes, mais aucune de ces lignées de cellules n’a abouti à des cellules avec des caractéristiques fonctionnelles proches des cellules du foie, principalement en ce qui concerne leur capacité à détoxifier les toxines, ce qui empêche leur utilisation dans les études de toxicologie et de pharmacologie. Pour ces raisons, la greffe initiale des hépatocytes humains à des souris apparait indispensable pour pouvoir assurer l’obtention de cellules similaires aux cellules présentes dans le foie.
Réduction
Le principe de réduction du nombre d’animaux est appliqué dans ce projet en premier lieu via l’estimation précise du nombre d’animaux permettant de garantir l’interprétabilité des résultats. Le nombre d'animaux nécessaires a été déterminé par une approche statistique. Une analyse précise des protocoles publiés a également été réalisée afin de sélectionner les conditions expérimentales favorables et ainsi réduire le nombre de conditions expérimentales à comparer ainsi que le risque d’échecs et par conséquence le nombre d’animaux qui seront utilisés. Par ailleurs, le projet est construit en incluant des étapes pilotes afin d’éliminer toute utilisation inutile d’animaux. Nous procéderons ainsi lors de l’étape 1 à la comparaison de 2 modèles d'élimination partielle des hépatocytes du foie de l'animal. Seul le modèle permettant l'élimination partielle la plus reproductible sera conservé pour les étapes suivantes. Lors de la seconde étape, deux protocoles de greffe des hépatocytes seront comparés. Seul le modèle permettant la greffe reproductible sera conservé pour la troisième étape de génération des cellules à partir de foie humain. De plus, nous veillons très attentivement à ce que toutes les personnes impliquées dans le projet, que ce soit la partie animale mais aussi les parties cellulaire et biochimique de préparation des cellules et d’analyse, soient parfaitement formées aux procédures employées, ceci de façon à réduire au maximum le risque d’échecs, mais aussi de nuisance pour les animaux en ce qui concerne le travail in vivo, et ainsi le nombre d’animaux qui seront utilisés. Enfin, nous procéderons dans toutes nos étapes à une surveillance des animaux pour les nuisances possibles, de façon à les minimiser et ainsi garantir une plus reproductibilité optimale de nos résultats et conséquemment une diminution du nombre de répétitions des expériences et ainsi du nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
La démarche de raffinement de ce projet implique notamment un personnel précisément formé aux procédures afin de limiter les nuisances ou la survenue de complications, ainsi que la surveillance des nuisances possibles à toutes les étapes afin de minimiser les effets néfastes et la souffrance. Un système de mesure objective du niveau d'inconfort, de stress ou de souffrance des animaux est mis en place pour évaluer le bien-être et prendre des actions au plus tôt. Par ailleurs, différentes actions de raffinement seront également menées. Afin de réduire le stress, les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation avant de les manipuler. Pendant l’hébergement ils auront accès à nourriture et boisson ainsi qu’à différents objets pour enrichir leur environnement. Lors de la chirurgie, avant la procédure, les animaux recevront un traitement analgésique, puis une anesthésie générale. Pour prévenir l’hypothermie, un tapis chauffant sera utilisé et l’animal couvert. Dans la phase de réveil, celui-ci sera placé dans une cage séparée dans un environnement également chauffé par un tapis. Sa température corporelle, son hydratation et l'absence de douleur seront suivies. Et de la nourriture et de l’eau seront fournies. Enfin, un traitement analgésique sera administré en préventif pendant 3 jours. La plaie de l’animal sera surveillée et les agrafes retirées autour de 10 jours après la chirurgie. Après récupération, l’animal sera à nouveau hébergé dans les conditions classiques et surveillé tous les jours. L’apparition d'éventuels signes d’hypothermie, de douleur, stress, perte d’activité, déshydratation ou absence de prise de nourriture, perte de poids, infection ou ulcération de la plaie sera surveillée. Si une limite prévue par le système de mesure objective est atteinte, des actions de traitement seront prises en accord avec la structure chargée du bien-être des animaux et avec le vétérinaire de la zootechnie afin d’éviter la dégradation de l’état de l’animal. Dans les cas où il n’est pas possible de rétablir ou de soulager l’état de l’animal, l’euthanasie sera appliquée.
Choix des espèces
Le choix d'utiliser des souris est lié à l’existence de protocoles de greffe d’hépatocytes humains chez cet animal, à la disponibilité de lignées de souris immuno-déprimées qui favorisent l’implantation des cellules humaines ainsi qu’à notre expérience passée de génération de lignées de cellules humaines hautement fonctionnelles via la greffe de cellules primaires immortalisées dans des souris. Les lignées cellulaires que nous avons précédemment générées (principalement cellules béta pancréatiques) ont depuis été adoptées par plusieurs centaines de laboratoires travaillant sur le diabète ou sur la physiologie du pancréas dans le monde. La même stratégie sera appliquée ici à l’amplification et à la maturation d’hépatocytes humains pour lesquels il n’existe pas de modèle cellulaire humain complet. La procédure expérimentale de dérivation de cellules fonctionnelles n’a été testée que sur la souris rendant nécessaire le choix de la souris pour mener le projet concernant les hépatocytes. Enfin, les souris qui seront utilisées auront entre 7 et 12 semaines au moment de l’implantation des cellules ou tissus humains transduits, ceci afin que l’animal ne soit pas trop petit et pour ainsi faciliter et garantir la réussite de la procédure de chirurgie.
rétablissement de l’expression du gene CAR (Nr1i3) chez la souris par thérapie génique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Quatre injections et un prélèvement sanguin en trois semaines, dont une injection dans la queue sous anesthésie locale : 144 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leur foie. L'objectif est instrumental, réintroduire par thérapie génique la protéine CAR chez des souris transgéniques qui ne l'expriment pas, en y ajoutant un marqueur reconnaissable par un anticorps du commerce. Le laboratoire s'y résout après avoir échoué à obtenir un anticorps spécifique de cette protéine. Le porteur écrit que le modèle n'est disponible que chez la souris, et écarte les animaux âgés chez qui des troubles métaboliques apparaissent spontanément.
Objectifs
La protéine CAR (Constitutive Androstane Receptor) est produite très majoritairement dans le foie. Elle joue un rôle essentiel dans la dégradation de nombreux xénobiotiques (contaminants externes) au niveau hépatique, participant ainsi grandement à la fonction de détoxification de l’organisme. CAR module également le métabolisme glucidique et lipidique du foie. Son expression et son activité sont plus élevées chez les femmes que chez les hommes. L'utilisation d'anticorps pour purifier une protéine d'un fluide biologique est une stratégie bien connue et qui a fait ses preuves. Cependant, pour la protéine CAR, il s'est avéré impossible d'obtenir un anticorps spécifique. Il est donc ici envisagé d'utiliser des souris transgéniques n'exprimant pas cette protéine, et de la réintroduire par thérapie génique, très légèrement modifiée par l’ajout d’un motif antigénique (tag). Les souris obtenues exprimeront alors la protéine qui, grâce au tag, sera reconnue par un anticorps du commerce. Ceci permettra d’isoler la protéine et de caractériser les autres molécules avec lesquelles elle entre en interaction. Il sera également possible d’identifier les séquences d’ADN auxquelles se fixe la protéine CAR activée, et d’en identifier de nouveaux gènes cibles.
Bénéfices attendus
La purification spécifique de la protéine CAR permettra son étude approfondie (liaison à l’ADN, interaction protéine-protéine, identification de ligands). Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront une contribution aux domaines de la biologie fondamentale, de la médecine (humaine et vétérinaire), de la pharmacologie et de la nutrition.
Procédures
Les animaux recevront une injection de la protéine génétiquement modifiée sous anesthésie locale (2 minutes de contention dans un dispositif prévu à cet effet de manière à la rendre rapide et limiter le stress). Deux semaines plus tard, les animaux restés vigiles recevront 3 injections d'un activateur pharmacologique (10 secondes de contention par injection) sur 3 jours. Le dernier jour de l’expérimentation, il sera pratiqué un prélèvement sanguin (30 secondes de contention) sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les contentions nécessaires pour pratiquer les 4 injections et le prélèvement sanguin occasionnent un stress transitoire. L'injection pour la thérapie génique de la protéine génétiquement modifiée au niveau de la queue peut engendrer éventuellement une inflammation temporaire.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure et leur foie sera prélevé pour des analyses permettant de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Tous les tests préliminaires sur les différents transgènes utilisés (gène rapporteur, reconnaissance par anticorps spécifique) ont été effectués in vitro par culture cellulaire sur une lignée cellulaire du commerce puis sur des cellules isolées d’un animal, et sont concluants. La suite de l’expérimentation doit être menée sur le foie murin in vivo car le foie, constitué d’une grande diversité de cellules, est un organe complexe impacté par des signaux hormonaux et nutritionnels provenant de tout l’organisme. Cet environnement ne peut pas être mimé avec fidélité en culture cellulaire.
Réduction
L’utilisation de lignées de grande proximité génétique permet de limiter le nombre d'animaux nécessaires. De plus, en fonction de l'amplitude de réponse à la transgénèse, les tests de puissance statistique pourront être refaits avec de nouvelles données, et le nombre d'individus par lot révisé à la baisse au cours du projet.
Raffinement
Pour limiter le stress, les animaux seront manipulés régulièrement et habitués à la contention. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris : en plus de l’observation quotidienne, il y aura une observation 2h après chaque injection. Concernant la gestion de la douleur, nous appliquerons un analgésique local sur la queue avant l'injection de la protéine génétiquement modifiée. Une méthode d'évaluation du stress et de la douleur est prévue sur la base d'une grille de scoring. Elle inclut des critères spécifiques tels que l’observation du point d’injection, ainsi que le suivi comportemental et de l’état physique des animaux. Des points limites adaptés ont été définis et permettent de décider des modalités de prise en charge de l'animal ainsi que des critères d'arrêt.
Choix des espèces
Le modèle que nous utiliserons n’est disponible que chez la souris. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes, dont le foie est arrivé à maturité. Les animaux trop vieux sont à éviter car des troubles métaboliques apparaissent spontanément avec l'âge.
Évaluation d’un nouveau traitement pour protéger le foie des atteintes provoquées par des médicaments
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
624 souris mâles vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à trois injections intrapéritonéales, dont 600 microlitres de paracétamol pour une souris de 30 grammes. 96 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger, 528 un niveau modéré, et toutes sont tuées pour le prélèvement du foie. Le porteur ne retient que des mâles, les femelles synthétisant le glutathion plus vite et supportant mieux le surdosage. Les bénéfices annoncés, de nouvelles pistes contre la première cause d'insuffisance hépatique d'origine médicamenteuse, sont renvoyés au long terme, alors que l'intoxication provoquée est immédiate et que le porteur qualifie le modèle animal d'"incontournable" après des essais in vitro qu'il dit déjà concluants sur hépatocytes.
Objectifs
Le paracétamol (appelé aussi acétaminophène, connu sous le nom de Doliprane) est l’un des médicaments les plus utilisés pour faire baisser la fièvre et soulager la douleur. Il est sûr lorsqu’il est pris aux doses recommandées, mais une prise trop importante peut provoquer de graves lésions du foie. Cette toxicité est liée à la formation, dans le foie, d’une substance nocive qui épuise les défenses naturelles de la cellule. Le seul traitement actuellement disponible est la N-acétylcystéine (NAC), efficace uniquement lorsqu’elle est administrée très rapidement après l’intoxication. Malgré ce traitement, le surdosage en paracétamol reste aujourd’hui la principale cause d’insuffisance hépatique aiguë. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont donc nécessaires, notamment pour agir à des stades plus avancés de la maladie. Des travaux récents ont montré que certains dérèglements des mitochondries (les «centrales énergétiques » des cellules) jouent un rôle clé dans les lésions du foie provoquées par le paracétamol. Notre équipe a développé une nouvelle molécule capable de bloquer ces dérèglements et de protéger les cellules du foie. Ce projet vise à évaluer, chez la souris, l’efficacité de ce composé comme traitement potentiel contre les atteintes hépatiques dues à un surdosage en paracétamol.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique d’un nouvel inhibiteur de cyclophilines (C105SR) dans l’intoxication au paracétamol, qui constitue la principale cause de défaillance hépatique d’origine médicamenteuse. Les résultats attendus permettront de : - déterminer l’efficacité du C105SR en termes de protection hépatique et mitochondriale, seul ou en association avec le traitement de référence (N-acétylcystéine) ; - mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la toxicité induite par le paracétamol et dans l’action protectrice du C105SR ; - identifier de nouvelles pistes thérapeutiques susceptibles d’améliorer la prise en charge de l’intoxication au paracétamol. À plus long terme, les connaissances générées pourraient également ouvrir la voie à l’exploration de stratégies innovantes de protection mitochondriale dans d’autres maladies hépatiques ou non hépatiques où le dysfonctionnement mitochondrial joue un rôle central.
Procédures
Les souris auront une administration par voie intrapéritonéale de paracétamol (ou son diluant), de C105SR (ou son diluant), et de NAC (ou son diluant), chacune d'une durée de 10 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Les souris recevront : 1) une injection intrapéritonéale de paracétamol (APAP) ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (600 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection). Le modèle d’intoxication au paracétamol utilisé dans ce projet repose sur l’administration d’une dose unique de paracétamol à des souris mâles adultes qui provoque une atteinte hépatique aiguë, caractérisée par une élévation des enzymes hépatiques plasmatiques reproduisant de manière fiable les lésions observées chez l’humain après un surdosage. La majorité des souris ne présentent que des signes transitoires et modérés (diminution d’activité, diminution de la prise alimentaire), mais une petite proportion peut montrer des signes plus marqués, comme une posture anormale ou une perte de poids. Une surveillance quotidienne sera assurée après l’administration du paracétamol par les zootechniciens et les expérimentateurs (voir grille de score) ; 2) une injection intrapéritonéale de NAC ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (360 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection) ; 3) une injection intrapéritonéale de C105SR ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (210 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie.
Remplacement
Nos travaux préliminaires ont permis de valider in vitro la capacité de l'inhibiteur de cyclophilines à protéger les hépatocytes en culture de la toxicité du paracétamol. Nous arrivons ainsi à un stade du projet où le recours à un modèle animal est devenu incontournable pour confirmer ces observations dans un organisme entier et dans un environnement physiologique complexe. En effet, à ce jour, aucune méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière fiable la complexité des mécanismes impliqués dans l’intoxication par le paracétamol, lesquels résultent d’interactions entre plusieurs types cellulaires (notamment hépatocytes et cellules immunitaires). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été déterminé comme celui permettant de démontrer une différence statistiquement significative de 30 % du paramètre étudié (aire de nécrose). Les résultats seront analysés grâce à un test statistique non paramétrique.
Raffinement
Le bien-être animal sera garanti par des conditions d’élevage appropriées, incluant le contrôle de la température et de l’hygrométrie. Les souris seront hébergées dans des locaux adaptés, avec un enrichissement systématique (papier kraft, carrés de coton pour la construction de nids, dômes en cellulose). Elles seront maintenues en groupes de 5 individus par cage, favorisant leur comportement social. Toutes les manipulations, y compris la mise à mort, seront réalisées par du personnel formé, dans le strict respect des règles éthiques et réglementaires. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les zootechniciens. Ce suivi permettra de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de stress (prostration, négligence de la toilette, blessure). Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait sa mise à mort anticipée.
Choix des espèces
Le modèle murin d'hépatotoxicité du paracétamol reflète étroitement la physiopathologie humaine et est pertinent pour l'identification de cibles thérapeutiques potentielles. De plus, les sites actifs de CypA et CypD présentent une homologie de 100 % entre la souris et l'humain. Des souris mâles adultes (âgées de 8 à 12 semaines) seront utilisées, car les femelles sont moins sensibles au surdosage de paracétamol en raison d'un taux de synthèse du glutathion plus rapide, ce qui se traduit par une toxicité moindre de paracétamol par rapport aux mâles pour une dose donnée de paracétamol. Dans ce projet, l’objectif est d’évaluer les effets hépatoprotecteurs d’un nouvel inhibiteur de cyclophilines dans le contexte de l’intoxication par le paracétamol chez l’adulte. Pour cette raison, seules des souris adultes seront utilisées. L’âge choisi (8–12 semaines) correspond à une phase de maturité physiologique où le métabolisme hépatique est pleinement fonctionnel, ce qui permet de reproduire de manière pertinente la situation clinique observée chez l’adulte humain.
Rôle de la protéine X dans le développement tumoral pancréatique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
78 souris sur 5 079 subiront la chirurgie qui fait l'objet du projet, une incision de l'abdomen sous anesthésie pour injecter des cellules cancéreuses dans le pancréas. Les 5 001 autres sont élevées et biopsiées à l'oreille, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et toutes sont tuées, les reproductrices à neuf mois, les opérées trente-cinq jours après l'implantation. Après l'opération, les souris sont palpées deux fois par semaine pour sentir la tumeur pousser sous la peau et portent des agrafes pendant sept jours, avec une douleur modérée sur un à deux jours puis une douleur légère liée à la croissance tumorale. Les souris utilisées sont dépourvues de la protéine étudiée, hyperlaxes, en difficulté pour s'agripper, ce que le porteur qualifie de léger tout en prévoyant une surveillance renforcée toute leur vie.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer peu fréquent (12ème cancer le plus fréquent), mais pour lequel le pronostic vital est extrêmement sombre. En effet, l'espérance de vie des patients, 5 ans après le diagnostic, est inférieure à 10%. La protéine d'intérêt de ce projet est présente dans le pancréas sain, est surproduite autour des lésions précancéreuses puis disparait totalement dans les stades avancés de la maladie. Des premiers résultats suggèrent que cette protéine est produite par les cellules saines du pancréas dans les stades précoces du cancer pour empêcher la multiplication des cellules tumorales et par la suite, les cellules tumorales éduquent les cellules environnantes pour empêcher la production de cette protéine d'intérêt et ainsi favoriser le développement de la tumeur. Notre projet vise donc à vérifier cette hypothèse. Pour cela, nous disposons de souris génétiquement modifiées dans lesquelles la protéine X est absente. Ces souris ont une espérance de vie similaire aux souris sauvages, se reproduisent normalement, mais présentent des difficultés lors de tests d'agrippements aux supports, ce qui implique une surveillance accrue de celles-ci tout au long de leur vie. Nous injecterons dans le pancréas de ces souris des cellules tumorales pancréatiques. Si notre hypothèse est vérifiée, les souris dépourvues de la protéine X devraient développer une tumeur plus rapidement que les souris sauvages.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de confirmer que la protéine X empêche la prolifération des cellules tumorales dans les premiers stades de développement du cancer du pancréas et donc d'envisager cette molécule comme une cible thérapeutique dont la production devra être réactivée pour permettre de contrer ce cancer hautement mortel.
Procédures
Un prélèvement d'un bout d'oreille (
Impact sur les animaux
Les souris génétiquement modifiées pourraient développer des difficultés très légères au déplacement et à l'agrippement. Le prélèvement d'un bout d'oreille peut engendrer un stress léger lors de la contention et une douleur légère 1 à 2 minutes après cet acte réalisé sur animaux vigiles. Les souris d'intérêt subiront une chirurgie sous anesthésie pouvant engendrer une douleur modérée sur 1 à 2 jours. Cette opération pourrait conduire à une baisse de la température corporelle des souris sur quelques heures. La douleur post-chirurgie peut conduire à des difficultés de déplacement sur les premières heures post-chirurgie. Une sécheresse occulaire peut être induite au cours de la chirurgie. La présence d'agrafes sur la zone de chirurgie peut causer une gêne légère jusqu'à leur retrait (7 jours). La croissance tumorale peut conduire à une douleur légère. Les palpations et pesées sur animaux vigiles n'excéderont pas 1 minutes par souris au total 2 fois par semaine et pourront induire un stress léger.
Devenir
Tous les animaux d'élevage seront mis à mort à 9 mois. Une reproduction au-delà de ce point de cinétique pourrait impacter le bien-être des animaux et pourrait conduire à une baisse de la fertilité. Pour l'analyse du rôle anti-tumoral de la protéine X : les animaux seront mis à mort à 8 semaines + 35 jours post-implantation de cellules tumorales pancréatiques maximum. A la fin de cette étude, le pancréas doit être collecté pour analyses ainsi que les organes potentiels de métastase (foie + poumons).
Remplacement
Au préalable de ce projet, différents travaux ont été réalisés sur des biopsies de patients atteints de cancer du pancréas et sur des cellules pancréatiques en culture. Cependant, le développement d'une cellule tumorale, la formation d'une tumeur et des métastases impliquent la participation de nombreux tissus environnants (vaisseaux sanguins, système immunitaire). Cette complexité tissulaire ne peut pas être reproduite dans des modèles cellulaires. Ainsi, le recours aux modèles murins génétiquement modifiés est nécessaire pour comprendre le rôle de la protéine X dans la carcinogenèse pancréatique.
Réduction
Pour l'élevage des souris génétiquement modifiées, le nombre de souris généré a été réduit au maximum pour pouvoir obtenir le nombre d'animaux suffisant à nos projets. La chirurgie (injection de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas de souris sauvages ou mutées) est très bien documentée dans la littérature. 12 souris par lot au maximum seront utilisées, ce qui correspond au nombre d'animaux minimal et suffisant pour conduire à l'obtention de résultats statistiquement interprétables. Ce projet a été établi de manière à réduire au minimum les gestes invasifs réalisés sur les animaux. En effet, les souris seront identifiées par simple marquage de la queue avec un stylo indélébile de couleur et le génotype des souris sera vérifié après la mise à mort en fin d'expérience.
Raffinement
Les souris déficientes en protéine X ne présentent pas de défauts de reproduction ou de vieillissement, ni de sensibilité à des pathogènes communs. Elles sont cependant hyperlaxes et présentent des difficultés légères mais significatives à l'agrippement, même si leur locomotion n'est pas altérée. Pour s'assurer du bien-être de ces souris, elles seront surveillées de leur naissance à leur mort 1 fois par semaine. Elles seront mises en reproduction de 6 semaines à 9 mois, âge max à leur mise à mort. Pour l'étude du rôle anti-tumoral de la protéine X au cours de la carcinogenèse pancréatique, la chirurgie sera réalisée sur des souris de 8 semaines, sous anesthésie générale supplémentée en analgésiques locaux et généraux. Les conditions de stérilité seront assurées par l'utilisation de matériel stérile (instruments, champs opératoire et gants stériles) et par l'utilisation de bétadine vétériniare pour éliminer les pathogènes sur la zone opérée. La chirurgie sera réalisée en plaçant la souris sur un tapis chauffant de manière à éviter la baisse de température corporelle. De même, les souris seront placées dans des cages placées dans des armoires chauffantes jusqu'au lendemain de la chirurgie. Du gel occulaire ophtalmique sera utilisé pour éviter le désèchement des yeux lors de la chirurgie. De la nourriture humide et de l'eau gélifiée seront déposées dans des coupelles au fond de la cage après la chirurgie pour favoriser la prise alimentaire et hydrique. Une surveillance étroite des souris sera réalisée post-chirurgie pour vérifier l'absence de douleur et une potentielle infection de la zone incisée. Cette surveillance s'attachera à observer le comportement de la souris, l'apparence de la plaie et le poids de la souris. Les agrafes seront enlevées à J7 sous anesthésie gazeuse et une pommade anlagésique sera appliquée sur la zone précédemment agrafée. Une surveillance des souris au cours de la croissance tumorale sera également réalisée 2 fois par semaine à partir de 15 jours post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort de l'animal (35 jours post-implantation max) pour détecter tout signe de mal-être potentiellement induits par la croissance de la tumeur. Hormis pendant les 24h après la chirurgie ou un tissu fin servira de litière, les animaux seront hébergés en groupe de 4-6 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, baton).
Choix des espèces
Notre objectif est de comprendre le rôle de la protéine X dans la carcinogenèse pancréatique. Le modèle murin est le modèle de choix pour les études en cancérologie. En effet, la proximité génétique et physiologique de la souris avec l’homme permet de reproduire de nombreux aspects de la biologie tumorale humaine, tant sur le plan moléculaire que cellulaire. Les souris seront utilisées (injectées) à 8 semaines de développmement. Nous voulons travailler sur des souris adultes, donc matures sexuellement pour standardiser notre modèle (éviter les variations dues à la puberté ou à l'âge) et cette maturité est atteinte chez le mâle et la femelle entre 5 et 7 semaines. Les souris génétiquement modifiées utilisées n'ont pas de problème de reproduction, ni de vieillissement, mais montrent des difficultés légères lors de tests d'agrippements et de suspension. Pour éviter leur mal-être induit par une période de reproduction avancée, elles ne seront mises en reproduction qu'à partir de 6 semaines jusqu'à 9 mois post-naissance.