Système gastrointestinal

4 768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des métabolites bactériens par gavage jusqu'à une fois par jour pendant six semaines, ou par injection sous-cutanée jusqu'à huit semaines, avec un risque d'irritation locale, de perte de poils et de fausse route. Suivent des tests de sociabilité, de comportements répétitifs et d'anxiété, dont le test du champ ouvert, et des évaluations de la physiologie intestinale allant jusqu'à six heures, pour reproduire chez la souris des traits associés à l'autisme. Le porteur écarte le rat au motif qu'il est plus grand, a besoin de plus d'espace et "ne convient pas à la taille de notre animalerie, surtout avec le nombre important d'animaux prévus".

Objectifs

Les troubles du neurodéveloppement, comme les troubles du spectre de l’autisme (TSA), concernent environ 1 % de la population mondiale. Ces troubles se manifestent par des difficultés d’interaction sociale, des comportements répétitifs, mais aussi par des troubles associés comme l’anxiété ou l’hyperactivité. Les patients atteint de la maladie présentent également des problèmes digestifs (constipation, diarrhée, douleurs abdominales), souvent associés à un déséquilibre de leur flore intestinale. Les causes exactes des TSA restent mal comprises, mais de plus en plus de travaux suggèrent un lien entre le cerveau, l’intestin et les milliards de microbes qui le peuplent : le microbiote intestinal. Le microbiote intestinal aide à réguler nos défenses immunitaires, notre digestion, et même à communiquer avec le cerveau, notamment grâce à certaines petites molécules produites par les bactéries intestinales- appelées métabolites. Chez les patients autistes, plusieurs études ont observé des anomalies dans certains métabolites présents dans leur corps. Par exemple, des métabolites issus de la dégradation par le microbiote intestinal d’un acide aminé appelé phénylalanine, sont retrouvés en quantité plus élevée dans les urines et le sang des patients. Le but de ce projet est d’identifier des métabolites capables de déclencher chez la souris des altérations du comportement (sociabilité, comportements répétitifs, anxiété) et/ou des troubles gastro-intestinaux (transit, perméabilité, inflammation), et d’explorer leur mode d’action, notamment par des approches pharmacologiques ciblant le système nerveux. Nous testerons également l’effet de traitements ciblant le microbiote, susceptibles de contrebalancer ces effets. Nous utiliserons un modèle murin, permettant la manipulation de nombreux outils génétiques, une bonne reproductibilité et une forte sensibilité aux variations du microbiote. Néanmoins, ce modèle ne reflète pas toute la complexité des TSA humains (cognition, langage) et les différences interespèces limitent l’extrapolation. Ce projet générera donc des données utiles pour guider de futures recherches cliniques.

Bénéfices attendus

Cette étude est conçue pour générer des connaissances fondamentales qui pourront être utiles pour la recherche chez l’humain. Elle permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans les TSA, en particulier le rôle du microbiote intestinal. Ce projet contribuera à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques ciblant le microbiote, et à tester leur efficacité dans des modèles animaux avant de les envisager pour une application chez l’humain, en vue d’améliorer la santé et la qualité de vie des personnes autistes. Ces résultats seront accessibles à court terme, à l’issue des différentes étapes expérimentales, c’est-à-dire dans les 2 à 3 ans suivant le début du projet. En revanche, leur application en santé humaine nécessitera des étapes supplémentaires, notamment des validations dans d’autres modèles expérimentaux, puis des essais cliniques. Ainsi, même si ce projet contribue à poser les bases de futures approches thérapeutiques, une application concrète chez l’humain ne pourra être envisagée qu’à moyen ou long terme.

Procédures

Identification par injection de puce : durée 10s ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Test de comportements évaluant le phénotype social : durée 4min30s, 10min, 12min, 25min et 72h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant les comportements répétitifs : durée 5 à 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant l’anxiété : durée 5min, 6min et 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Evaluation de la physiologie intestinale : durée 60min, 90min et 6h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Prélèvement sanguin après incision de l’extrémité de la queue : durée 10min ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Gavage : durée 5s ; fréquence allant d’une seule fois à une fois par jour pendant 6 semaines en fonction de la procédure. • Injections : durée 5s ; fréquence une seule fois à une fois par jour pendant 4 à 8 semaines en fonction de la procédure. • Anesthésie gazeuse : durée 10 min ; fréquence 1 fois sur la procédure.

Impact sur les animaux

Certains des métabolites administrés pourraient impacter le métabolisme ou provoquer des troubles digestifs chez les souris, comme de la constipation, de la diarrhée, ou un inconfort intestinal (ballonnements, douleurs abdominales). Ces effets seront surveillés par l’observation du comportement des animaux, leur poids et leur consommation d’eau et de nourriture. Les substances seront parfois administrées par gavage, une méthode qui peut engendrer un stress temporaire et/ou une légère irritation de l’œsophage, mais la réalisation du geste par du personnel formé limite l’inconfort. Il est à noter que lorsque pratiqué quotidiennement, ce geste est susceptible entraîner un stress modéré lié à la contention répétée des animaux pour chaque gavage, bien que celui-ci tende à diminuer avec l’habituation. L’administration quotidienne de substances sous la peau, au niveau de la nuque, peut entraîner de la même manière, un stress modéré lié à la contention répétée des animaux. Une irritation locale, une perte de poil et une modification de la peau sont susceptible d’apparaitre au site d’injection. Certains des tests comportementaux prévus dans les procédures sont générateurs d’un inconfort faible à moyen mais de courte durée (comme le test du champ ouvert qui évalue les comportements anxieux) et n’induisent pas de douleur ni de signes caractéristiques de mal-être chez la souris (perte de poids, prostration, poil hirsute, absence de toilettage ...). Enfin, un petit prélèvement de sang sera effectué en coupant l’extrémité de la queue. Cette méthode entraîne un léger saignement, rapidement stoppé par une pression douce (hémostase), et ne laisse pas de séquelle à long terme.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés afin de permettre le prélèvement d’organes nécessaires à la réalisation d’analyses biologiques. Ces analyses sont indispensables pour approfondir la compréhension des mécanismes impliqués dans notre contexte d’étude.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, des alternatives non animales pourraient apporter des informations précieuses mais aucune ne permet actuellement de reproduire la complexité du microbiote ni ses interactions avec le système digestif et le système nerveux et l’impact sur la cognition. Par exemple, l’utilisation de cultures cellulaires intestinales permet d'étudier la perméabilité intestinale et l’inflammation mais s’affranchit de la complexité du microbiote et de ses interactions avec le système immunitaire ou nerveux. Les cultures de cellules neuronales ne permettent pas d'étudier les circuits neuronaux fonctionnels ni les comportements associés. L’utilisation de modèles informatiques (in silico) permettrait de simuler des voies de signalisation, des paramètres d'absorption intestinale, ou la distribution des métabolites dans l’organisme. Néanmoins, ces modèles dépendent fortement de données expérimentales préexistantes et sont incapables de prédire des effets émergents à l’échelle comportementale.

Réduction

Pour garantir l’obtention de résultats fiables et statistiquement exploitables, nous avons défini des tailles d’échantillons optimales à l’aide de calculs de puissance réalisés avec un logiciel dédié. Ces calculs ont permis de déterminer qu’un effectif de 12 animaux par groupe est suffisant pour détecter des effets de taille moyenne avec les tests statistiques les plus adaptés à nos données, tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés. Par ailleurs, nous intégrerons à la fois des mâles et des femelles dans notre étude, ce qui permet de couvrir les deux sexes dans une même expérimentation, réduisant ainsi le nombre global d’animaux nécessaires. L’ensemble des résultats sera analysé à l’aide de logiciels statistiques spécialisés. Au total, 4768 animaux sont requis pour l’ensemble du projet, ce chiffre ayant été réduit au strict nécessaire en respectant les principes de la règle des 3R.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes d’au moins quatre, dans des conditions contrôlées (température, humidité) et surveillés quotidiennement par les expérimentateurs. La plupart des procédures n’induiront qu’un inconfort léger et bref. Celles pouvant affecter le bien-être feront l’objet d’un suivi renforcé basé sur une grille de score permettant d’identifier toute souffrance et d’appliquer des points limites précoces. Pour limiter stress et douleur, les gavages répétés seront effectués avec des canules souples à bout rond de sorte à limiter au maximum une irritation de l'oesophage, et les animaux seront habitués avant au geste de contention et à l'introduction d'un cône dans la cavité bucale. En cas de fausse route,l'animal recevra un analgésique injectable toutes les 8–12 h. Si les signes de détresse (difficultés respiratoires, prostation) apparaissent ou persistent 24h après, l'animal sera euthanasié. Les injections seront réalisées en alternant les sites et avec des aiguilles fines. En cas d’inflammation locale, le site sera surveillé et traité si besoin. Les prélèvements sanguins seront effectués par incision de l’extrémité de la queue, méthode permettant de collecter rapidement du sang sans anesthésie et avec un stress minimal. En cas de saignement prolongé, une compresse stérile sera appliquée, et un stylet hémostatique utilisé si nécessaire. Les animaux seront systématiquement surveillés après le prélèvement. Les tests comportementaux seront précédés d’habituation aux dispositifs expérimentaux ; les sessions seront espacées pour favoriser la récupération et réalisées dans un environnement calme par les mêmes expérimentateurs autant que possible. Les procédures nécessitant une anesthésie seront conduites avec soin : le puçage se fera sous anésthésie gazeuse, assurant une intervention rapide et indolore ; avant les prélèvements d’organes, une analgésie préventive injectable sera administrée 30 min avant l’anesthésie générale injectable. Une surveillance clinique renforcée sera assurée tout au long de l’étude. Les points limites incluent : perte de poids > 20 %, altération de l’état général, troubles locomoteurs, blessures persistantes, refus de s’alimenter ou stress prolongé. Tout animal présentant ces signes sera examiné et, sans amélioration rapide, retiré de l’étude et euthanasié conformément aux recommandations.

Choix des espèces

L’autisme entraîne des troubles du comportement importants, et ces troubles peuvent être reproduits chez le rongeur grâce à des séries de tests comportementaux adaptés aussi bien aux jeunes souris qu’aux adultes. La souris est un modèle particulièrement pertinent car son système nerveux et son développement cérébral partagent de nombreuses similitudes avec ceux des humains, ce qui n’est pas aussi bien le cas chez d’autres espèces comme le poisson. En outre, la physiologie intestinale, notamment la perméabilité et la motilité de l’intestin et du côlon, ne peut être étudiée que chez un animal vivant, et la souris offre un bon compromis entre complexité biologique et faisabilité expérimentale. Notre institut a une animalerie avec des rats et des souris, mais les rats sont plus grands et ont besoin de plus d’espace, ce qui ne convient pas à la taille de notre animalerie, surtout avec le nombre important d’animaux prévus. Puisque notre projet porte sur les effets des métabolites produits par les microbes sur le développement du cerveau, nous avons choisi d’étudier les souris à des stades où leur système nerveux garde une certaine capacité d’adaptation, notamment à l’adolescence (vers 4 semaines), ainsi que pendant la gestation, afin de mieux comprendre comment l’exposition précoce influence le développement ultérieur. Ces choix permettent d’étudier les mécanismes liés aux troubles du neurodéveloppement dans un modèle fiable, pertinent et bien caractérisé, indispensable pour développer des traitements adaptés.

Hébergés seuls quarante-six heures en cage à métabolisme et nourris pendant vingt et un ou cent jours d'un régime dont seule la forme du fer change, 400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements du côlon. 240 d'entre eux reçoivent en plus une injection intrapéritonéale d'azoxyméthane, un cancérogène, pour déclencher les premiers stades d'un cancer colorectal. L'objet réel est d'évaluer si un substitut végétal de viande riche en fer, dont la mise sur le marché européen est envisagée à court terme, produit les mêmes effets sur le côlon que la charcuterie. Le porteur écrit que les régimes n'ont pas d'effet attendu sur le bien-être des rats et que la formation des phases précoces du cancer du côlon n'induit aucune douleur, tout en déclarant les 400 animaux au niveau de souffrance modéré.

Objectifs

La consommation excessive de viande rouge et de charcuteries est associée chez l’Homme à une perturbation du fonctionnement de l’intestin, et à un risque augmenté de développer un cancer du côlon. Des études scientifiques ont permis de démontrer que ces impacts sont liés au fer présent dans les viandes. Ainsi, ce fer va pendant la digestion arriver au niveau du côlon et favoriser la formation de molécules toxiques. Les recommandations nutritionnelles actuelles sont donc de limiter la consommation de produits carnés riches en fer. Dans ce contexte, plusieurs produits alternatifs à la viande sont proposés aux consommateurs. Plus précisément, certaines de ces alternatives misent sur la ressemblance parfaite avec les produits carnés en utilisant une forme de fer végétale proche de celle apportée par les viandes afin de provoquer une couleur et un goût similaires aux viandes. La mise sur le marché d’une alternative à base de ce fer d’origine végétale est envisagée à court terme en Europe. Au regard de sa proximité avec le fer des viandes, se pose donc la question de savoir si ce produit destiné à végétaliser davantage nos régimes est susceptible d’engendrer des effets néfastes sur le côlon et le cancer du côlon. En termes de santé publique, l’objectif de cette étude est d’évaluer si un apport en fer d’origine végétale risque ou non d’induire les mêmes effets délétères sur le côlon qu’un apport en fer d’origine animale. Étant donné que chez l’Homme, aucune étude interventionnelle n’est envisageable, une évaluation pré-clinique chez le rat identique à ce qui a été mis en place par le passé pour alerter les politiques publiques sur la consommation des viandes rouges et le risque de carcinogénèse colorectale est proposée.

Bénéfices attendus

À l’issue du projet, nous serons en mesure de savoir si le fer d’origine végétale peut engendrer ou non la formation dans le côlon de produits toxiques en comparaison avec d’autres formes de fer d’origine animale. Ainsi, ces études permettront de (i) évaluer le risque de pathologies associées à la consommation humaine de ces substituts, et en conséquence, selon les résultats obtenus (ii) alerter les pouvoirs publics, pour qu’ils puissent à terme proposer des messages de recommandation nutritionnelle adaptés spécifiquement à ces substituts riches en fer végétal.

Procédures

400 rats recevront un régime expérimental dont seule la nature du fer sera modifiée selon le groupe expérimental pendant 21 jours pour 160 d’entre eux, et pendant 100 jours pour les 240 autres. Ces 400 rats seront hébergés individuellement une fois pendant 46 heures en cage à métabolisme après avoir été habitués 3 heures en amont. Parmi eux, les 240 rats exposés 100 jours aux régimes expérimentaux recevront en amont une injection intrapéritonéale d’azoxyméthane d'une durée de moins d'une minute, le temps de la préhension et l'injection, pour induire les premiers stades non douloureux du cancer du côlon.

Impact sur les animaux

Les régimes n’ont pas d’effet attendu sur le bien-être ou la croissance des rats. L’hébergement en cage individuelle d’une journée peut générer un stress transitoire mais il disparait dès le retour en hébergement conventionnel. Hormis les stress attendus lors de l’injection, seule une légère douleur passagère peut se produire au site d’injection en raison du produit injecté. La formation progressive des phases précoces du cancer du côlon pendant cette étude n’induit aucune douleur.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les rats seront mis à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures destinées à caractériser l’effet des régimes administrés sur la muqueuse colique, et engendrant éventuellement des perturbations de l’homéostasie des tissus environnants ou d’organes plus distants.

Remplacement

Bien que nous menions des études in vitro, aucun des modèles de cellule du côlon en culture ne permet d’évaluer l’ensemble des répercussions induites par un régime riche en produits carnés au niveau du côlon. En effet, outre la formation de composés toxiques, la consommation de fer des produits carnés va fortement modifier l’ensemble des composantes du côlon. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité du côlon et de l’impact de l’alimentation sur cet organe.

Réduction

Les études antérieures associées à ce projet ont permis d’améliorer les procédures sur le plan technique et du bien-être de l’animal, contribuant ainsi à minimiser le nombre d’animaux nécessaires pour mettre en évidence l’effet des régimes chez le rat. De plus, afin d’assurer la fiabilité des résultats, les études et analyses des échantillons issus de l’étude seront conduites en aveugle. La reproductibilité sera assurée par une répétition indépendante des études. Le traitement des données sera réalisé grâce à des tests statistiques appropriés permettant d'exploiter au maximum l'ensemble des données générées.

Raffinement

Le nombre et la durée d’hébergement individuel en cage individuelle seront limités au minimum nécessaire (46h) pour obtenir les quantités suffisantes d’urines et de fèces. Des phases d’habituation à ce type d’hébergement ont été mises en place afin de minimiser le stress. Quel que soit le type de cages, elles seront transparentes, alignées pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Lors de l’injection pour induire les premiers stades du cancer du côlon, l’acidité de la solution sera corrigée pour éviter une douleur au moment de l’injection, une habituation au geste de la piqure sera réalisée les jours précédents. Une observation des rats à l’occasion notamment de la distribution quotidienne des régimes permettra, grâce à l’utilisation de fiches individuelles de suivi, de détecter à temps toute anomalie éventuelle. Enfin, toutes les mesures susceptibles de réduire la douleur sans affecter l’objectif scientifique seront mises en application.

Choix des espèces

Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études chez l’Homme mais aussi des approches qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus approprié à notre étude est le rat qui a l’avantage de présenter un développement de la maladie comparable à celui chez l’Homme. De plus, ce modèle chez le rat permet d’obtenir des résultats fiables dès les stades précoces du cancer, sans qu’il soit nécessaire de poursuivre l’étude aux stades avancées de la maladie (tumeur, métastases), qui sont des stades davantage susceptibles d’engendrer des dommages et des douleurs. Les études se feront sur des rats adultes de 5 à 6 semaines à leur arrivée. À cet âge, le système digestif est suffisamment mature et fonctionnel et la composition du microbiote bien stabilisée. Afin de se placer dans les conditions pour lesquelles le modèle est maîtrisé au laboratoire, il est important de rester au même stade de développement.

Sept prélèvements sanguins sur animal vigile, des injections dans l'orbite de l'œil et 72 heures d'isolement dans une cage métabolique de 500 cm2 : 2 184 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont soumises à des régimes hypercaloriques ou déficients en méthionine et en choline pour provoquer une maladie du foie, avec des jeûnes de 8 à 16 heures et des tests de tolérance au glucose. L'objectif déclaré est de comprendre comment les plaquettes sanguines régulent l'installation des maladies hépatiques métaboliques, les retombées thérapeutiques restant énoncées au futur. Le résumé annonce "plusieurs injections successives par souris" sans nommer les substances injectées ni en donner le nombre, et qualifie les perturbations du métabolisme hépatique de "non dommageable pour la souris".

Objectifs

Les maladies hépatiques métaboliques sont des conséquences hépatiques du syndrome métabolique. Elles peuvent rester asymptomatiques mais aussi évoluer vers une cirrhose et un cancer du foie avec un taux de survie de 10% sur 5 ans.Les maladies hépatiques métaboliques représentent un problème majeur de santé publique à l’échelon mondial. L'organisation mondiale de la santé les catégorise actuellement comme la cause numéro une des maladies hépatiques dans les pays occidentaux. Même si les maladies métaboliques hépatiques sont étroitement liées à l’obésité et au syndrome métabolique, les causes des maladies métaboliques hépatiques ne sont pas les mêmes chez tous les patients et demeurent actuellement en grande partie non élucidée, ce qui complique la prévention et la prise en charge de ces maladies. Comment les plaquettes sanguines et leur vésicules extra-cellulaires, acteurs clés du maintien de l’intégrité vasculaire, peuvent réguler l’installation des maladies métaboliques hépatiques est une question très intéressante et novatrice et aborde un problème médical important sous un angle à la fois moléculaire et de physiopathologie intégrée. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie hépatique et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour prévenir les maladies métaboliques du foie.

Procédures

La souris sera soumise à différents régimes alimentaires (hypercalorique et/ou déficients en méthionine ou/et choline) (réalisé dans l'Etablissement Utilisateur (EU) 1/2). La souris sera mise à jeun (8h ou 16h) pour les tests de tolérance (réalisé dans EU 1/2). La souris sera soumise à des procédures avec des injections sur souris vigiles ou anesthésiées (plusieurs injections successives par souris de quelques secondes) (réalisé dans EU 1/2). Sept prélèvements sanguins de 30 secondes sur souris vigile (réalisé dans EU1/2) et une prise de sang terminale sur la souris anesthésiée (d’une durée environ de 2 min) seront réalisées (réalisé dans EU1/2 ou 2/2 en fonction de l’expérimentation réalisée avec le sang et les organes prélevés). Pour l'évaluation du métabolisme in vivo, la souris sera isolée individuellement en cage métabolique d’une surface de 500cm2 sur une durée de 72h (réalisé dans EU 1/2). Pour l'évaluation de la structure et perméabilité des vaisseaux sanguin : une seule injection (injection d'une durée de quelques secondes) sera réalisée sur la souris anesthésiée suivie de la mise à mort de la souris 30 minutes après suite à une anesthésie générale et antalgie locale et une perfusion intra-cardiaque (EU 2/2).

Impact sur les animaux

La mise en régime hyperlipidique de la souris induit : une prise de poids pour la souris et des perturbations du métabolisme hépatique non dommageable pour la souris. Les actions suivantes vont induire un stress modéré et un inconfort des animaux : injections intra-orbitaire et intra-péritonéale (durée : 30 sec), mise en isolation de 72h pour les mesures de calorimétrie indirecte, test de tolérance (induction d’hyerglécemie et d’hypoglycémie et prise de sang) (durée 2h).

Devenir

La souris sera euthanasiée suite à un prélèvement sanguin terminal à la veine cave ou suite à l’isolement dans les cages métaboliques de 72h qui ne permettra pas de réaliser en suivant d’autres mesures métaboliques.

Remplacement

Les effets pléiotropes dans un contexte d’hémostase et thrombose et de maladies métaboliques hépatiques font intervenir des fonctions et types cellulaires multiples dans l’organisme non modélisables à ce jour par des approches in vitro. Le recours à l’expérimentation animale est donc l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans un contexte intégré.

Réduction

Plusieurs résultats seront obtenus avec un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Nous utiliserons 6 à 8 animaux par groupe en fonction de la procédure (nombre minimum nécessaire déjà défini par des expériences déjà réalisées au laboratoire). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés. Les paramètres évalués seront analysés par une analyse de variance.

Raffinement

Le suivi des souris sera réalisé 2 fois par jour par les zootechniciens et l’expérimentateur et un calcul de score général sera réalisé. En fonction du score général, une surveillance accrue est nécessaire. De l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Des soins/désinfections seront prodigués à la souris. La souris peut être aussi momentanément séparée de ces congénères. Si l'animal atteint le point limite : mise à mort par l’expérimentateur ou par le service de zootechnie. Toutes les procédures invasives utilisent des analgésiques généraux ou locaux. Certains animaux seront transportés à pied selon un tracé bien défini de 5 minutes dans leur cage d’origine placée dans des sacs isotherme de transports à raison de 2 cages par sac de transport. Ceci permet de réduire le stress des animaux car dans l’obscurité et à une température contrôlée. Tout animal faible ou malade ne sera pas transporté et mis à mort avant transport par dislocation cervicale. Les animaux sont ensuite placés dans la salle d’expérimentaion pour une acclimation de 2 h avant l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous utilisons des modèles murins car nous disposons de modèles de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le compte plaquettaire chez la souris. Les modèles de drosophiles ou de poissons zèbres ne sont pas utilisables dans le contexte de ce projet de recherche car les plaquettes sanguines sont phénotypiquement et mecanistiquement très différentes de celles de l'Homme, ce qui n'est pas le cas chez les rongeurs. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).

2 184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant enchaîner sept prises de sang sur animal éveillé, des injections dans l'orbite de l'œil et soixante-douze heures seule dans une cage métabolique de 500 cm2. Elles reçoivent des régimes hypercaloriques ou privés de méthionine et de choline, et sont mises à jeun huit à seize heures avant les tests de tolérance. Le porteur qualifie les perturbations du métabolisme hépatique ainsi provoquées de "non dommageable pour la souris", alors que le projet vise justement à installer une maladie hépatique métabolique. Une partie des souris est tuée trente minutes après une injection, le sang étant chassé de leurs vaisseaux par une perfusion dans le cœur, pour mesurer la perméabilité de ces vaisseaux.

Objectifs

Les maladies hépatiques métaboliques sont des conséquences hépatiques du syndrome métabolique. Elles peuvent rester asymptomatiques mais aussi évoluer vers une cirrhose et un cancer du foie avec un taux de survie de 10% sur 5 ans.Les maladies hépatiques métaboliques représentent un problème majeur de santé publique à l’échelon mondial. L'organisation mondiale de la santé les catégorise actuellement comme la cause numéro une des maladies hépatiques dans les pays occidentaux. Même si les maladies métaboliques hépatiques sont étroitement liées à l’obésité et au syndrome métabolique, les causes des maladies métaboliques hépatiques ne sont pas les mêmes chez tous les patients et demeurent actuellement en grande partie non élucidée, ce qui complique la prévention et la prise en charge de ces maladies. Comment les plaquettes sanguines et leur vésicules extra-cellulaires, acteurs clés du maintien de l’intégrité vasculaire, peuvent réguler l’installation des maladies métaboliques hépatiques est une question très intéressante et novatrice et aborde un problème médical important sous un angle à la fois moléculaire et de physiopathologie intégrée. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie hépatique et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour prévenir les maladies métaboliques du foie.

Procédures

La souris sera soumise à différents régimes alimentaires (hypercalorique et/ou déficients en méthionine ou/et choline) (réalisé dans l'Etablissement Utilisateur (EU) 1/2). La souris sera mise à jeun (8h ou 16h) pour les tests de tolérance (réalisé dans EU 1/2). La souris sera soumise à des procédures avec des injections sur souris vigiles ou anesthésiées (plusieurs injections successives par souris de quelques secondes) (réalisé dans EU 1/2). Sept prélèvements sanguins de 30 secondes sur souris vigile (réalisé dans EU1/2) et une prise de sang terminale sur la souris anesthésiée (d’une durée environ de 2 min) seront réalisées (réalisé dans EU1/2 ou 2/2 en fonction de l’expérimentation réalisée avec le sang et les organes prélevés). Pour l'évaluation du métabolisme in vivo, la souris sera isolée individuellement en cage métabolique d’une surface de 500cm2 sur une durée de 72h (réalisé dans EU 1/2). Pour l'évaluation de la structure et perméabilité des vaisseaux sanguin : une seule injection (injection d'une durée de quelques secondes) sera réalisée sur la souris anesthésiée suivie de la mise à mort de la souris 30 minutes après suite à une anesthésie générale et antalgie locale et une perfusion intra-cardiaque (EU 2/2).

Impact sur les animaux

La mise en régime hyperlipidique de la souris induit : une prise de poids pour la souris et des perturbations du métabolisme hépatique non dommageable pour la souris. Les actions suivantes vont induire un stress modéré et un inconfort des animaux : injections intra-orbitaire et intra-péritonéale (durée : 30 sec), mise en isolation de 72h pour les mesures de calorimétrie indirecte, test de tolérance (induction d’hyerglécemie et d’hypoglycémie et prise de sang) (durée 2h).

Devenir

La souris sera euthanasiée suite à un prélèvement sanguin terminal à la veine cave ou suite à l’isolement dans les cages métaboliques de 72h qui ne permettra pas de réaliser en suivant d’autres mesures métaboliques.

Remplacement

Les effets pléiotropes dans un contexte d’hémostase et thrombose et de maladies métaboliques hépatiques font intervenir des fonctions et types cellulaires multiples dans l’organisme non modélisables à ce jour par des approches in vitro. Le recours à l’expérimentation animale est donc l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans un contexte intégré.

Réduction

Plusieurs résultats seront obtenus avec un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Nous utiliserons 6 à 8 animaux par groupe en fonction de la procédure (nombre minimum nécessaire déjà défini par des expériences déjà réalisées au laboratoire). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés. Les paramètres évalués seront analysés par une analyse de variance.

Raffinement

Le suivi des souris sera réalisé 2 fois par jour par les zootechniciens et l’expérimentateur et un calcul de score général sera réalisé. En fonction du score général, une surveillance accrue est nécessaire. De l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Des soins/désinfections seront prodigués à la souris. La souris peut être aussi momentanément séparée de ces congénères. Si l'animal atteint le point limite : mise à mort par l’expérimentateur ou par le service de zootechnie. Toutes les procédures invasives utilisent des analgésiques généraux ou locaux. Certains animaux seront transportés à pied selon un tracé bien défini de 5 minutes dans leur cage d’origine placée dans des sacs isotherme de transports à raison de 2 cages par sac de transport. Ceci permet de réduire le stress des animaux car dans l’obscurité et à une température contrôlée. Tout animal faible ou malade ne sera pas transporté et mis à mort avant transport par dislocation cervicale. Les animaux sont ensuite placés dans la salle d’expérimentaion pour une acclimation de 2 h avant l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous utilisons des modèles murins car nous disposons de modèles de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le compte plaquettaire chez la souris. Les modèles de drosophiles ou de poissons zèbres ne sont pas utilisables dans le contexte de ce projet de recherche car les plaquettes sanguines sont phénotypiquement et mecanistiquement très différentes de celles de l'Homme, ce qui n'est pas le cas chez les rongeurs. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).