Système gastrointestinal

Une biopsie de la queue, des injections quotidiennes pendant quatre ou cinq jours pour bloquer un gène, un prélèvement de sang sous anesthésie : les actes décrits durent chacun quelques dizaines de secondes. 2 064 souris vont être utilisées, 1 104 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 960 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever l'intestin et les fèces. Les souris issues de l'élevage qui ne servent à aucune procédure sont tuées aussi. Le porteur veut comprendre comment une alimentation riche en lipides, le microbiote et le sexe influencent le cancer colorectal, et signale que le développement spontané des tumeurs provoque une douleur modérée. Il justifie l'effectif de 2 064 animaux en une phrase, les effectifs étant "déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés".

Objectifs

Les objectifs du projet sont de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement du cancer du côlon et du rectum. Des données de la littérature ont montré qu’une alimentation riche en lipides était un facteur de risque pour le cancer du côlon et du rectum. Une partie des effets délétères de ces régimes est médiée par des changement de la population microbienne de l’intestin. De plus, il existe une importante différence en fonction du sexe d’un individu en ce qui concerne la probabilité de développer un cancer du côlon et du rectum. Ce projet a pour but de comprendre comment les régimes alimentaire, le microbiote et le sexe influencent le développement de ce type de cancer.

Bénéfices attendus

Ces travaux devraient contribuer à une meilleure compréhension du rôle de la nutrition, du sexe de l’individu et du microbiote dans l’initiation et le développement du cancer du côlon et du rectum.

Procédures

1 biopsie de queue : 10 secondes. 1 Contention pour injection d’une molécule bloquant l’expression d’un gène : 20 secondes, (1X/jour pendant 5 ou 4 jours). 1 Contention pour injection d’une molécule marquant la prolifération cellulaire : 20 secondes. 1 Prélèvement sanguin : 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress lors de la contention et des injections. L’adaptation des souris aux nouveaux régimes ainsi que le développement des tumeurs peuvent induire une perte de poids. Une douleur légère lors de la biopsie. Le développement spontané de tumeur peut engendrer un stress chez la souris et une douleur modérée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de leurs intestins et de leurs fèces, nécessaires aux différentes analyses. Quant aux animaux issus de l’élevage qui ne seront pas inclus dans les procédures expérimentales, ils seront également mis à mort de manière éthique et appropriée.

Remplacement

L’utilisation de cultures de lignées cellulaires ne reflète pas la complexité de l’épithélium intestinal ni les dialogues intercellulaires et ne peuvent reproduire les effets systémiques de l’alimentation. Il n’existe pas de méthode de remplacement.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux vivent en groupes sociaux dans un milieu enrichi et ils seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Des points limites spécifiques sont établis. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Pour ce projet, l'espèce animale choisie est la souris. En effet cette espèce permet d'étudier le rôle de différentes mutations géniques affectant le développement du cancer colorectal. Des souris adultes âgées de 2 à 4 mois, ayant un tractus digestif mature et un microbiote établi sont utilisées.

Des rates sont mises en gestation pour fournir des ratons utilisés dès la naissance, puis renvoyées à l'animalerie pour y servir de nouveau : ce sont les 80 seuls animaux du projet à ne pas être tués. 1 580 animaux non-humains sont utilisés en tout, 1 280 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 300 un niveau léger. Les souris reçoivent un gavage deux fois par semaine pendant seize semaines, une bague posée dans l'oreille au sevrage, des prises de sang à la queue et des mesures de motricité intestinale sous anesthésie pouvant durer trois heures, à l'endoscope ou à la bille. Le porteur numérote quatre tests comportementaux sans en nommer aucun, et affirme qu'aucun effet indésirable des vésicules bactériennes n'est rapporté dans la littérature chez les rongeurs.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) touche plus de 40 millions de personnes dans le monde et a pour cause principale le vieillissement. Aucun traitement efficace n’existe pour prévenir, ralentir ou guérir la maladie. Elle est invalidante et entraîne une perte progressive des neurones au niveau du cerveau. Un des signes physiopathologiques majeurs de la MA est l’accumulation dans le cerveau d’un peptide appelé Abeta qui à la longue altère la connectivité des neurones. Plusieurs études montrent que les patients atteints de la MA ont également des altérations digestives pouvant se manifester de façon très précoce, avant qu’apparaissent les premiers signes cérébraux. De plus, les atteintes intestinales augmentent le risque de développer une forme sévère de la maladie. Enfin, il a été mis en évidence que les patients atteints de la MA souffrent de manière fréquente d’une altération du microbiote intestinal ainsi que de la quantité de métabolites produits par ce microbiote. L’inflammation est aussi une composante majeure de la pathologie et a été montrée comme stimulant la production de l’Abeta. Ce projet vise à apporter la preuve de concept qu’une approche thérapeutique utilisant des vésicules extracellulaires (VEs) bactériennes : 1) favorise le développement fonctionnel de l’intestin ; 2) prévient les altérations intestinales et/ou cérébrales chez un modèle murin de vieillissement accéléré évoluant vers une MA, ce qui pourrait ouvrir la voie à des traitements innovants ciblant le système nerveux entérique dans la MA. Les VEs seront produites à partir de bactéries à Gram+ ayant des propriétés anti-inflammatoires connues telles que Propionibacterium freudenreichii, une bactérie propionique laitière utilisée dans l’industrie agroalimentaire, et Faecalibacterium prausnitzii, une bactérie présente naturellement dans le microbiote intestinal. Du fait de leurs rôles ubiquitaires et leur biodisponibilité, les VEs sont perçues comme des acteurs et outils majeurs dans des approches thérapeutiques visant la santé humaine. De plus, des travaux récents montrent des effets bénéfiques de ces VEs dans des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Ce qui nous a permis d’émettre l’hypothèse que ces VES pourraient améliorer les fonctions et communications des neurones entériques et de la barrière épithéliale intestinale, baisser ou bloquer la neuro-inflammation intestinale et prévenir de ce fait les altérations des fonctions intestinales observées dans la MA.

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif et digestif lié à l’âge représente un véritable enjeu pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes âgées. De plus, améliorer les capacités cognitives est reconnu comme une stratégie visant à réduire le risque de développer des pathologies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (MA). Le vieillissement du cerveau est aussi associé à des altérations au niveau intestinal dont la cause pourrait être le vieillissement/ altération des neurones et/ou de la paroi intestinale. Dans ce contexte, améliorer les mécanismes de communication neuronale au niveau intestinal pourrait aussi positivement impacter ceux du cerveau. C’est ainsi qu’une étude récente montre qu’une approche de supplémentation en probiotique montre des effets bénéfiques sur l’intestin et le cerveau dans un modèle murin de MA. Il apparait donc pertinent de penser qu’une approche utilisant des probiotiques non vivants comme les VEs provenant de bactéries ayant des propriétés anti-inflammatoires, aurait des effets bénéfiques sur le développement fonctionnel de l’intestin, mais aussi pourrait contrecarrer les effets délétères de la protéine responsable de la MA. Ainsi, la capacité de VEs d’intérêt à prévenir les altérations au niveau intestinal et leur mode d’action dans le développement fonctionnel normal et pathologique de l’intestin reste inconnu à ce jour et fait l’objet de cette étude.

Procédures

1. Elevage des souris transgéniques - pose de la bague d’identification au moment du sevrage bague avec crème analgésique, sur l’oreille de l’animal (20 sec/pose de bague) 2. Étude du développement intestinal - pesée quotidienne (10 sec sur la balance pendant 21/22 jours) - - administration quotidienne de VEs à la pipette (20 sec pendant 21/22 jours)- mesure du temps de transit total (apparition crotte rouge, 4h maximum) - mesure du temps de transit colique (8 prélèvements maximum de selles toutes les 15 min, 2h au total) - mesure de la perméabilité intestinale in vivo : - contention + gavage 2 fois/semaine avec les VEs (30 sec, pendant 16 semaines) - mesure de motricité in vivo (3h max de l’anesthésie au réveil) 3. Étude de vieillissement pathologique évoluant vers des pertes de mémoire caractéristiques de la MA - pesée 2 fois/semaine (10 sec sur la balance, pendant 16 semaines) - contention + gavage 2 fois/semaine (30 sec, pendant 16 semaines) - mesure du temps de transit total (apparition crotte rouge, 2h maximum) - mesure du temps de transit colique (8 prélèvements maximum de selles toutes les 15 min, 2h au total) - mesure de la perméabilité intestinale in vivo : contention + gavage (30 sec) + prélèvement de sang à la queue sur animal vigile (1*30 sec) - test comportemental 1 (5 min à 2 mois et à 6 mois) - test comportemental 2 (10 min à 2 mois et à 6 mois) -- test comportemental 3 (30 min + 10 min + 10 min à 2 mois et à 6 mois) - - test comportemental 4 (10 min + 5 min à 2 mois et à 6 mois) - mesure de motricité in vivo avec un endoscope (3h max de l’anesthésie au réveil à 2 mois et à 6 mois) - mesure de motricité in vivo avec une bille (30min max de l’anesthésie au réveil à 2, 3, 4, 5 et 6 mois)

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effets indésirables n’est reporté dans la littérature concernant l’administration de VEs bactériennes chez les murins. La technique du micropipette-guided drug administration devrait permettre de limiter le stress lié à l’administration de vésicules exracellulaires. Le gavage des souris est limité à 2 fois par semaine pour limiter le stress et la douleur liés à au gavage, bien que cet acte soit pratiqué par un personnel entraîné.

Devenir

Mise à mort de tous les ratons et toutes les souris à l’issue des procédures. Des prélèvements terminaux seront réalisés pour analyser les protéines, l’expression des gènes et les tissus. Les rates gestantes utilisées pour produire les ratons seront réutilisées à l’animalerie.

Remplacement

L’étude des effets bénéfiques de postbiotiques comme les vésicules extracellulaires sur l’intestin dans un contexte physiopathologique nécessite une étude in vivo non seulement des fonctions intestinales, mais aussi des capacités comportementales qui ne peuvent, à ce jour, se réaliser que sur un modèle animal. De plus, le vieillissement et le développement de la maladie d’Alzheimer mettent en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, flore microbienne intestinal, système immunitaire ...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée par une approche in vitro et justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer cette complexité d’interaction des acteurs impliqués et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.

Réduction

Les travaux réalisés in vitro sur des cultures de neurones de l’intestin nous ont permis d’identifier les vésicules extracellulaires d’intérêt parmi plusieurs types de vésicules extracellulaires bactériennes, réduisant de manière significative le nombre d’animaux nécessaire. Parallèlement, des expérimentations similaires menées chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et de réduire le nombre minimum d’animaux par groupe. Pour étudier l’effet des vésicules extracellulaires bactériennes sur le développement intestinal, nous avons réduit au nombre minimum le nombre d’animaux nécessaires pour nous permettre d’obtenir des résultats statistiquement interprétables.

Raffinement

Les rates gestantes seront seules dans leur cage avec de l’enrichissement (frisottis, tubes) leur permettant de déchiqueter, de jouer, se cacher et préparer leur nid. Les ratons seront gardés avec leur mère jusqu’à la fin de l’expérience. Les souris seront au maximum 5 par cages et de l’enrichissement (frisottis, tubes) sera placé dans les cages leur permettant de déchiqueter, de jouer et de se cacher. L’ensemble des animaux sera également surveillé quotidiennement à l’animalerie avant et pendant la procédure expérimentale, y compris le week-end. Les animaux seront habitués à la présence de l’utilisateur grâce à une manipulation régulière pour limiter le stress lors des expérimentations. Nous avons également défini des points limites à nos expérimentations pour évaluer le bien-être de nos animaux et prendre en charge la douleur si elle a lieu.

Choix des espèces

Pour l’étude des effets de vésicules extracellulaires sur le développement fonctionnel de l’intestin en condition physiologique, le raton nouveau-né constitue un bon modèle adapté du fait de la facilité d’administration de composés par la technique d’administration à la pipette à partir de la naissance et la possibilité d’effectuer des études fonctionnelles après le sevrage. Le modèle de souris choisi est un bon modèle de la maladie d’Alzheimer car c’est un modèle de vieillissement spontané puisqu’il ne présente aucune introduction de nouveaux gènes pour induire des signes de la maladie. De plus, il se prête bien à des expériences de traitement à but thérapeutique comme la supplémentation avec des vésicules extracellulaires envisagée dans ce projet. Les travaux menés au sein du laboratoire in vitro ont également montré que ce modèle est pertinent pour l’étude du rôle de l’intestin dans la maladie d’Alzheimer. Les souris seront utilisées dès l’âge de 3 semaines et supplémentées de façon chronique par gavage jusqu’à l’âge de 6 mois. Ces âges ont été retenus au vu de la littérature scientifique concernant la cinétique d’apparition des altérations au niveau de l’intestin ou du cerveau. Les rats seront utilisés dès la naissance pour pouvoir évaluer les effets bénéfiques sur le développement fonctionnel de l'intestin et sur la barrière épithéliale intestinale. En effet, la mise en place des mécanismes fonctionnelles de l’intestin telle que la motricité se fait très tôt et une intervention au-delà de cette fenêtre de temps risque de ne pas être efficace.

2 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs intestins et leurs fèces, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue, cinq jours d'injections quotidiennes d'une molécule bloquant un gène, une irradiation de cinq minutes et un prélèvement de sang sous anesthésie. Les souris nées dans l'élevage et non retenues pour les procédures sont tuées elles aussi. Le porteur attend de ce travail sur les cellules souches de l'intestin des traitements nutritionnels "à plus long terme" et justifie l'effectif de 2 064 animaux en une phrase, les effectifs étant "déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés".

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les effets de l’alimentation sur le maintien et l’autorenouvellement des cellules souches intestinales. Ces cellules permettent un renouvellement permanent de l’épithélium intestinal, essentiel pour maintenir l’équilibre du tissu intestinal et réparer les lésions causées par divers stress. Au cours du projet, l’irradiation provoque une accélération du renouvellement des cellules souches intestinales. Ainsi, il devient possible d’explorer comment les modifications du métabolisme des lipides entrainées par des changements alimentaires jouent sur cet équilibre. La flore intestinale joue également un rôle important dans le maintien de ce tissu. Un traitement antibiotique permet également d’évaluer la contribution de cette flore au phénotype observé.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra d'identifier les mécanismes impliqués dans les effets de l’alimentation sur l'intestin. Ces recherches devraient enrichir la compréhension de la biologie des cellules intestinales mais aussi ouvrir, à plus long terme, de nouvelles perspectives de traitements utilisant des approches nutritionnelles.

Procédures

1 biopsie de queue : 10 secondes. 1 contention pour injection de de molécule bloquant l’expression d’un gène: 20 secondes, (1X/jour pendant 5 jours). 1 irradiation : 5min. 1 contention pour injection d’anesthésique: 20 secondes. 1 prélèvement sanguin : 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une douleur légère et de courte durée lors de la biopsie et un stress lors de la contention et des injections. Potentiellement certains traitements peuvent conduire à une perte de poids temporaire. L’irradiation peut provoquer une perte de poids et un stress.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de leurs intestins et de leurs fèces, nécessaires aux différentes analyses. Quant aux animaux issus de l’élevage qui ne seront pas inclus l’expérimentation, ils seront également mis à mort de manière éthique et appropriée.

Remplacement

L’utilisation de cultures de lignées cellulaires ne reflète pas la complexité de l’épithélium intestinal ni les dialogues intercellulaires et ne peuvent reproduire les effets systémiques de l’alimentation. Il n’existe pas de méthode de remplacement.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux vivent en groupes sociaux dans un milieu enrichi et ils seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Des points limites spécifiques sont établies. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Pour ce projet, l'espèce animale choisie est la souris. En effet cette espèce permettent d'étudier le rôle de différentes mutations géniques affectant le maintien et le renouvellement de l'épithélium. Des souris adultes âgées de 2 à 4 mois, ayant un tractus digestif mature et un microbiote établi sont utilisées.

Neuf jours de régime cétogène ou vingt heures de jeûne, une pesée quotidienne, une piqûre de la veine caudale tous les deux jours pour mesurer la glycémie, un gavage libérant des graisses dans le sang, puis un prélèvement à la veine sous-mandibulaire juste avant la mise à mort. 1 258 souris transgéniques vont être utilisées ainsi, toutes tuées pour prélever le sang et les organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la moitié d'entre elles et modéré pour l'autre moitié. Le projet porte sur les interactions entre trois protéines du foie lors d'un afflux d'acides gras, dont le porteur attend "une contribution à la recherche biomédicale". Des points limites gradés portent sur le poids, l'apparence et le comportement, et il indique qu'un animal qui les atteint est retiré de la procédure et replacé en hébergement standard.

Objectifs

Le foie est un organe majeur qui est capable de s’adapter aux différents changements nutritionnels auxquels nous sommes exposés (période de jeûne, régime enrichi ou carencé en certains nutriments, …). Par exemple, lors d’un jeûne, le foie est le lieu de production du sucre nécessaire au fonctionnement de l’organisme en période de carence en nutriments. Cette grande capacité du foie à s’adapter à différents statuts nutritionnels est principalement assurée par des protéines spécifiques. Parmi ces protéines importantes lors de périodes de jeûne figure la protéine PPARa, qui est également importante lors de la consommation d’un régime cétogène (très riche en graisses et pauvre en sucres). Dans ce projet, pour étudier les interactions entre PPARa et 2 autres protéines lors d'un afflux d'acides gras arrivant au foie, nous générerons des souris dont le gène PPARa et le gène d’autres protéines ne sont plus fonctionnels dans le foie. Les animaux seront soumis à une période de jeûne ou à un régime cétogène ou traités avec une molécule pharmacologique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les différentes protéines qui sont impliquées lors du jeûne et de la consommation d’un régime cétogène, qui sont 2 interventions nutritionnelles actuellement étudiées pour leurs effets bénéfiques dans plusieurs pathologies. Ainsi, les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.

Procédures

Des groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou un régime cétogène riche en graisses et pauvre en sucre pendant 2 semaines. MODIFICATION : durée du régime réduite à 9 jours. Les animaux seront pesés chaque semaine. MODIFICATION : pesée des animaux tous les jours. La glycémie sera mesurée chaque semaine (2 fois au total) par prélèvement d’une seule goutte de sang à la queue (petite piqûre de la veine caudale avec une lancette de 1 mm). La mesure ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. MODIFICATION : mesure de la glycémie tous les 2 jours. Juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire. D’autres groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou mis à jeun pendant 20h. Après les 20h de jeûne et juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire. D’autres groupes d’animaux seront traités par gavage avec une molécule pharmacologique permettant la libération d’une grande quantité de graisses dans la circulation sanguine. Le gavage prend moins de 30 secondes. Six heures après et juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire.

Impact sur les animaux

Le jeûne peut induire une baisse de la glycémie et de la température corporelle. Le régime cétogène peut induire une perte de poids et une baisse de la glycémie. MODIFICATION : le régime cétogène peut induire une diminution de la prise alimentaire conduisant à une réduction de la mobilité. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une légère douleur. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et une légère douleur. Le gavage peut entraîner un stress des animaux.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation de l’animal entier car les réponses de l’organisme engendrées par les interventions pharmacologiques nutritionnelles (jeûne et régime cétogène) étudiées sont complexes et ne peuvent pas être mimées avec fidélité en culture cellulaire. En effet, plusieurs organes de l'organisme communiquent entre eux. L’utilisation de souris transgéniques de laboratoire est appropriée car il est possible d'étudier le rôle de protéines spécifiques.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant la piqûre permettant de prélever une goutte de sang. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons les consommations alimentaire et hydrique. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

2200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 600 d'entre elles et modéré pour 1600, avec jusqu'à cinq prises de sang sous la mâchoire par souris, une par semaine. Pour rendre des souris allergiques à l'arachide puis déclencher une réaction allergique, du beurre d'arachide leur est administré par sonde gastrique, un geste qui peut léser l'œsophage et le foie, et certaines reçoivent des traitements par injections répétées. Le porteur décrit des douleurs inflammatoires, diarrhées et douleurs abdominales, pouvant entraîner hypothermie et perte de poids, et un "stress important" lié à la manipulation répétée. Il annonce au futur, sans conditionnel, une meilleure prise en charge des personnes allergiques et moins d'hospitalisations. Il écarte une prise volontaire du beurre d'arachide, qui éviterait la sonde, parce qu'elle "demande une étape d'entrainement importante" avant de garantir la quantité absorbée.

Objectifs

Les allergies alimentaires et les réactions graves qu’elles peuvent provoquer, comme l’anaphylaxie (une réaction très rapide pouvant mettre la vie en danger), constituent aujourd’hui un important problème de santé publique. Leur fréquence augmente et elles peuvent être très sévères. En Europe, on estime que 3 à 6 % des adultes et 6 à 13 % des enfants sont concernés. L’allergie à l’arachide est l’une des plus redoutées. Lorsqu’une personne allergique en consomme, elle peut développer des symptômes digestifs (vomissements, diarrhée, douleurs au ventre), cutanés (gonflements), respiratoires (difficultés à respirer) et cardiovasculaires (baisse de la tension), pouvant aller jusqu’à la perte de connaissance et, dans de rares cas, au décès. Pour mieux comprendre ces allergies et développer de nouveaux traitements, les chercheurs utilisent des modèles animaux, notamment des modèles chez la souris. Cela permet d’étudier de près les mécanismes biologiques qui déclenchent l’allergie et l’anaphylaxie. L’objectif de ce projet est de créer et d’analyser un modèle de souris allergiques à l’arachide (par exemple au beurre d’arachide). Ce modèle aidera à mieux comprendre comment l’allergie se développe, comment la réaction allergique survient et quels sont les mécanismes immunologiques impliqués. À terme, il servira aussi à tester de nouveaux médicaments ou stratégies thérapeutiques contre l’allergie à l’arachide. Le projet se déroule en trois procédure autour des objectifs spécifiques suivants : 1. Développer le modèle d’allergie alimentaire o Mettre au point un protocole reproductible pour rendre les souris allergiques à l’arachide et déclencher une réaction allergique. o Déterminer les doses, la fréquence et les conditions qui provoquent une réaction allergique fiable et spécifique. 2.Tester des composés à visée thérapeutique o Évaluer l’efficacité de candidats médicaments pour réduire ou prévenir la réaction allergique. 3. Etudier les mécanismes biologiques impliqués o Analyser les voies de signalisation et les réponses immunitaires activées dans ce modèle.

Bénéfices attendus

L’allergie à l’arachide est l’une des allergies alimentaires les plus graves. Elle peut durer toute la vie et provoquer des réactions très violentes, comme le choc anaphylactique, qui peut être mortel. Aujourd’hui, il n’existe aucun traitement pour guérir cette allergie : la seule solution est d’éviter complètement l’arachide et de savoir réagir en cas d’urgence. Ce projet vise plusieurs objectifs importants : • Mieux comprendre comment et pourquoi le corps devient allergique à l’arachide, en étudiant les mécanismes du système immunitaire impliqués dans ces réactions. • Créer un modèle animal fiable pour pouvoir tester de nouveaux médicaments, des méthodes pour rendre les patients moins sensibles à l’arachide, ou de nouvelles formes d’immunothérapie. • Identifier des marqueurs biologiques capables de prédire la gravité de l’allergie ou la manière dont un patient répondra à un futur traitement. Ces avancées permettront d’améliorer la prise en charge des personnes allergiques, de réduire le nombre d’hospitalisations dues aux réactions graves, et de favoriser le développement de traitements plus ciblés et mieux tolérés à l’avenir.

Procédures

L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements et le prélèvement submandibullaire (5x maximum, et 1x/semaine) peuvent induire une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et un stress. L'administration intragastrique peut entraîner chez les animaux des lésions au niveau de l’œsophage et du foie, ainsi qu’un stress important lié à la manipulation répétée. Les souris en expérimentation sont observées tous les jours pour identifier d’éventuels effets indésirables et d’éventuels signes de souffrance.

Impact sur les animaux

Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie par exemple diarrhée, douleurs abdominales comme chez l’homme. La douleur pourra générer une hypothermie et/ou une perte de poids. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. L'administration intragastrique peut entraîner chez les animaux des lésions au niveau de l’œsophage et du foie, ainsi qu’un stress important lié à la manipulation répétée. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements et le prélèvement submandibullaire peuvent induire une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et un stress. Les souris en expérimentation sont observées tous les jours pour identifier d’éventuels effets indésirables et d’éventuels signes de souffrance. Nous proposons donc une procédure de suivi utilisant une grille de score. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet pourront présenter un phénotype dommageable du fait de leur sensibilité plus élevée aux infections, car elles présentent une absence de défenses immunitaires efficaces. Si elles sont contaminées par des bactéries et/ou virus, cela entrainerait leur décès. Si nous sommes amenés à en utiliser, elles seront donc hébergées en portoir ventilé où il y a une très haute protection contre ces agents pathogènes empêchant ainsi l’expression de ce phénotype. Ce statut est également garanti durant les différentes manipulations pendant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris s'il y a lieu).

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques nécessaires à la validation du modèle et l’analyse de l’effet des différentes molécules et thérapies testées.

Remplacement

La mise en place d’un modèle murin d’allergie alimentaire à l’arachide implique nécessairement l’utilisation d’un organisme entier. En effet, les mécanismes allergiques requièrent une complexité physiologique et immunologique qui ne peut être reproduite in vitro à ce jour. Néanmoins, une stratégie active de remplacement partiel a été intégrée dans la conception du projet : • Avant de démarrer les phases in vivo, une caractérisation biochimique poussée des extraits /ou beurre d’arachide est effectuée in vitro, afin de valider les lots expérimentaux et limiter les tests sur animaux. • Des cultures cellulaires primaires ou lignées humaines sont utilisées pour tester in vitro la réactivité aux extraits. Ces approches permettent d’optimiser la qualité des extraits et de prédire leur capacité à induire une réponse immunitaire. Cependant, le déclenchement et l’étude fine de la réaction allergique, de l’inflammation intestinale in situ et des paramètres cliniques systémiques nécessitent une approche in vivo. Aucun substitut ne permet actuellement d’évaluer de manière fiable les conséquences physiopathologiques complètes d’une exposition répétée à un allergène alimentaire chez l’humain.

Réduction

Une attention particulière est portée à la réduction du nombre d’animaux utilisés tout au long du projet. Cette réduction repose sur une planification expérimentale rigoureuse, sur l’analyse statistique en amont, et sur l’exploitation optimale des données récoltées. Plusieurs mesures concrètes de réduction sont mises en œuvre : 1. Tests pilotes préalables : Un petit nombre d’animaux (n < 10) sera utilisé dans une phase préliminaire pour identifier les doses optimales d’allergène, les modalités de sensibilisation et les fenêtres de provocation les plus pertinentes. Cela évitera les essais multiples à grande échelle. 2. Calcul de puissance statistique : Les effectifs animaux par groupe sont justifiés par une analyse de puissance (power analysis) permettant d’atteindre une significativité statistique avec un minimum d’animaux (généralement 6 à 10 par groupe selon les variables mesurées). 3. Utilisation de groupes partagés : Certains groupes témoins (souris naïves ou sensibilisées mais non provoquées) peuvent être communs à plusieurs sous-expériences si les conditions restent identiques. Cela limite le nombre total de groupes expérimentaux.

Raffinement

Le projet intègre de nombreuses mesures de raffinement visant à minimiser la douleur, le stress, et les souffrances potentielles des animaux, tout en améliorant la qualité des données scientifiques obtenues. Les mesures principales ci-dessous listées seront mises en œuvre : Sélection des méthodes les moins invasives possibles : o La voie intragastrique est privilégiée à la voie intrapéritonéale lorsque possible. o L’utilisation d’aiguilles fines, la réduction du nombre d’injections, et le recours à des formulations douces sont privilégiés. Nous n'envisageons pas de faire un apprentissage d'administration du beurre d'arachide de manière volontaire sans passer par l'administration intragastrique car cela demande une étape d'entrainement importante avant de pourvoir réaliser ce geste et de garantir la quantité prise par administration.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce la plus pertinente pour ce projet en raison de sa réponse immunitaire bien caractérisée et de sa forte sensibilité aux allergènes alimentaires. Les souris de différentes lignées classiques sont particulièrement adaptées pour modéliser la sensibilisation à l’arachide et les réactions allergiques. La souris permet une reproductibilité expérimentale élevée, un suivi longitudinal individuel, et offre un accès à de nombreux outils immunologiques et génétiques (anticorps, lignées transgéniques). Les animaux sont utilisés au stade adulte, de 7 à 16 semaines à l'arrivée afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).