Système gastrointestinal
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Évaluation d’un nouveau traitement pour protéger le foie des atteintes provoquées par des médicaments
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
624 souris mâles vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à trois injections intrapéritonéales, dont 600 microlitres de paracétamol pour une souris de 30 grammes. 96 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger, 528 un niveau modéré, et toutes sont tuées pour le prélèvement du foie. Le porteur ne retient que des mâles, les femelles synthétisant le glutathion plus vite et supportant mieux le surdosage. Les bénéfices annoncés, de nouvelles pistes contre la première cause d'insuffisance hépatique d'origine médicamenteuse, sont renvoyés au long terme, alors que l'intoxication provoquée est immédiate et que le porteur qualifie le modèle animal d'"incontournable" après des essais in vitro qu'il dit déjà concluants sur hépatocytes.
Objectifs
Le paracétamol (appelé aussi acétaminophène, connu sous le nom de Doliprane) est l’un des médicaments les plus utilisés pour faire baisser la fièvre et soulager la douleur. Il est sûr lorsqu’il est pris aux doses recommandées, mais une prise trop importante peut provoquer de graves lésions du foie. Cette toxicité est liée à la formation, dans le foie, d’une substance nocive qui épuise les défenses naturelles de la cellule. Le seul traitement actuellement disponible est la N-acétylcystéine (NAC), efficace uniquement lorsqu’elle est administrée très rapidement après l’intoxication. Malgré ce traitement, le surdosage en paracétamol reste aujourd’hui la principale cause d’insuffisance hépatique aiguë. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont donc nécessaires, notamment pour agir à des stades plus avancés de la maladie. Des travaux récents ont montré que certains dérèglements des mitochondries (les «centrales énergétiques » des cellules) jouent un rôle clé dans les lésions du foie provoquées par le paracétamol. Notre équipe a développé une nouvelle molécule capable de bloquer ces dérèglements et de protéger les cellules du foie. Ce projet vise à évaluer, chez la souris, l’efficacité de ce composé comme traitement potentiel contre les atteintes hépatiques dues à un surdosage en paracétamol.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique d’un nouvel inhibiteur de cyclophilines (C105SR) dans l’intoxication au paracétamol, qui constitue la principale cause de défaillance hépatique d’origine médicamenteuse. Les résultats attendus permettront de : - déterminer l’efficacité du C105SR en termes de protection hépatique et mitochondriale, seul ou en association avec le traitement de référence (N-acétylcystéine) ; - mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la toxicité induite par le paracétamol et dans l’action protectrice du C105SR ; - identifier de nouvelles pistes thérapeutiques susceptibles d’améliorer la prise en charge de l’intoxication au paracétamol. À plus long terme, les connaissances générées pourraient également ouvrir la voie à l’exploration de stratégies innovantes de protection mitochondriale dans d’autres maladies hépatiques ou non hépatiques où le dysfonctionnement mitochondrial joue un rôle central.
Procédures
Les souris auront une administration par voie intrapéritonéale de paracétamol (ou son diluant), de C105SR (ou son diluant), et de NAC (ou son diluant), chacune d'une durée de 10 secondes par souris.
Impact sur les animaux
Les souris recevront : 1) une injection intrapéritonéale de paracétamol (APAP) ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (600 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection). Le modèle d’intoxication au paracétamol utilisé dans ce projet repose sur l’administration d’une dose unique de paracétamol à des souris mâles adultes qui provoque une atteinte hépatique aiguë, caractérisée par une élévation des enzymes hépatiques plasmatiques reproduisant de manière fiable les lésions observées chez l’humain après un surdosage. La majorité des souris ne présentent que des signes transitoires et modérés (diminution d’activité, diminution de la prise alimentaire), mais une petite proportion peut montrer des signes plus marqués, comme une posture anormale ou une perte de poids. Une surveillance quotidienne sera assurée après l’administration du paracétamol par les zootechniciens et les expérimentateurs (voir grille de score) ; 2) une injection intrapéritonéale de NAC ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (360 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection) ; 3) une injection intrapéritonéale de C105SR ou de son véhicule (NaCl 0,9%) (210 ul pour une souris de 30 g) (douleur légère de courte durée au moment de l’injection).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie.
Remplacement
Nos travaux préliminaires ont permis de valider in vitro la capacité de l'inhibiteur de cyclophilines à protéger les hépatocytes en culture de la toxicité du paracétamol. Nous arrivons ainsi à un stade du projet où le recours à un modèle animal est devenu incontournable pour confirmer ces observations dans un organisme entier et dans un environnement physiologique complexe. En effet, à ce jour, aucune méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière fiable la complexité des mécanismes impliqués dans l’intoxication par le paracétamol, lesquels résultent d’interactions entre plusieurs types cellulaires (notamment hépatocytes et cellules immunitaires). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été déterminé comme celui permettant de démontrer une différence statistiquement significative de 30 % du paramètre étudié (aire de nécrose). Les résultats seront analysés grâce à un test statistique non paramétrique.
Raffinement
Le bien-être animal sera garanti par des conditions d’élevage appropriées, incluant le contrôle de la température et de l’hygrométrie. Les souris seront hébergées dans des locaux adaptés, avec un enrichissement systématique (papier kraft, carrés de coton pour la construction de nids, dômes en cellulose). Elles seront maintenues en groupes de 5 individus par cage, favorisant leur comportement social. Toutes les manipulations, y compris la mise à mort, seront réalisées par du personnel formé, dans le strict respect des règles éthiques et réglementaires. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les zootechniciens. Ce suivi permettra de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de stress (prostration, négligence de la toilette, blessure). Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait sa mise à mort anticipée.
Choix des espèces
Le modèle murin d'hépatotoxicité du paracétamol reflète étroitement la physiopathologie humaine et est pertinent pour l'identification de cibles thérapeutiques potentielles. De plus, les sites actifs de CypA et CypD présentent une homologie de 100 % entre la souris et l'humain. Des souris mâles adultes (âgées de 8 à 12 semaines) seront utilisées, car les femelles sont moins sensibles au surdosage de paracétamol en raison d'un taux de synthèse du glutathion plus rapide, ce qui se traduit par une toxicité moindre de paracétamol par rapport aux mâles pour une dose donnée de paracétamol. Dans ce projet, l’objectif est d’évaluer les effets hépatoprotecteurs d’un nouvel inhibiteur de cyclophilines dans le contexte de l’intoxication par le paracétamol chez l’adulte. Pour cette raison, seules des souris adultes seront utilisées. L’âge choisi (8–12 semaines) correspond à une phase de maturité physiologique où le métabolisme hépatique est pleinement fonctionnel, ce qui permet de reproduire de manière pertinente la situation clinique observée chez l’adulte humain.
Rôle de la protéine X dans le développement tumoral pancréatique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
78 souris sur 5 079 subiront la chirurgie qui fait l'objet du projet, une incision de l'abdomen sous anesthésie pour injecter des cellules cancéreuses dans le pancréas. Les 5 001 autres sont élevées et biopsiées à l'oreille, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et toutes sont tuées, les reproductrices à neuf mois, les opérées trente-cinq jours après l'implantation. Après l'opération, les souris sont palpées deux fois par semaine pour sentir la tumeur pousser sous la peau et portent des agrafes pendant sept jours, avec une douleur modérée sur un à deux jours puis une douleur légère liée à la croissance tumorale. Les souris utilisées sont dépourvues de la protéine étudiée, hyperlaxes, en difficulté pour s'agripper, ce que le porteur qualifie de léger tout en prévoyant une surveillance renforcée toute leur vie.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer peu fréquent (12ème cancer le plus fréquent), mais pour lequel le pronostic vital est extrêmement sombre. En effet, l'espérance de vie des patients, 5 ans après le diagnostic, est inférieure à 10%. La protéine d'intérêt de ce projet est présente dans le pancréas sain, est surproduite autour des lésions précancéreuses puis disparait totalement dans les stades avancés de la maladie. Des premiers résultats suggèrent que cette protéine est produite par les cellules saines du pancréas dans les stades précoces du cancer pour empêcher la multiplication des cellules tumorales et par la suite, les cellules tumorales éduquent les cellules environnantes pour empêcher la production de cette protéine d'intérêt et ainsi favoriser le développement de la tumeur. Notre projet vise donc à vérifier cette hypothèse. Pour cela, nous disposons de souris génétiquement modifiées dans lesquelles la protéine X est absente. Ces souris ont une espérance de vie similaire aux souris sauvages, se reproduisent normalement, mais présentent des difficultés lors de tests d'agrippements aux supports, ce qui implique une surveillance accrue de celles-ci tout au long de leur vie. Nous injecterons dans le pancréas de ces souris des cellules tumorales pancréatiques. Si notre hypothèse est vérifiée, les souris dépourvues de la protéine X devraient développer une tumeur plus rapidement que les souris sauvages.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de confirmer que la protéine X empêche la prolifération des cellules tumorales dans les premiers stades de développement du cancer du pancréas et donc d'envisager cette molécule comme une cible thérapeutique dont la production devra être réactivée pour permettre de contrer ce cancer hautement mortel.
Procédures
Un prélèvement d'un bout d'oreille (
Impact sur les animaux
Les souris génétiquement modifiées pourraient développer des difficultés très légères au déplacement et à l'agrippement. Le prélèvement d'un bout d'oreille peut engendrer un stress léger lors de la contention et une douleur légère 1 à 2 minutes après cet acte réalisé sur animaux vigiles. Les souris d'intérêt subiront une chirurgie sous anesthésie pouvant engendrer une douleur modérée sur 1 à 2 jours. Cette opération pourrait conduire à une baisse de la température corporelle des souris sur quelques heures. La douleur post-chirurgie peut conduire à des difficultés de déplacement sur les premières heures post-chirurgie. Une sécheresse occulaire peut être induite au cours de la chirurgie. La présence d'agrafes sur la zone de chirurgie peut causer une gêne légère jusqu'à leur retrait (7 jours). La croissance tumorale peut conduire à une douleur légère. Les palpations et pesées sur animaux vigiles n'excéderont pas 1 minutes par souris au total 2 fois par semaine et pourront induire un stress léger.
Devenir
Tous les animaux d'élevage seront mis à mort à 9 mois. Une reproduction au-delà de ce point de cinétique pourrait impacter le bien-être des animaux et pourrait conduire à une baisse de la fertilité. Pour l'analyse du rôle anti-tumoral de la protéine X : les animaux seront mis à mort à 8 semaines + 35 jours post-implantation de cellules tumorales pancréatiques maximum. A la fin de cette étude, le pancréas doit être collecté pour analyses ainsi que les organes potentiels de métastase (foie + poumons).
Remplacement
Au préalable de ce projet, différents travaux ont été réalisés sur des biopsies de patients atteints de cancer du pancréas et sur des cellules pancréatiques en culture. Cependant, le développement d'une cellule tumorale, la formation d'une tumeur et des métastases impliquent la participation de nombreux tissus environnants (vaisseaux sanguins, système immunitaire). Cette complexité tissulaire ne peut pas être reproduite dans des modèles cellulaires. Ainsi, le recours aux modèles murins génétiquement modifiés est nécessaire pour comprendre le rôle de la protéine X dans la carcinogenèse pancréatique.
Réduction
Pour l'élevage des souris génétiquement modifiées, le nombre de souris généré a été réduit au maximum pour pouvoir obtenir le nombre d'animaux suffisant à nos projets. La chirurgie (injection de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas de souris sauvages ou mutées) est très bien documentée dans la littérature. 12 souris par lot au maximum seront utilisées, ce qui correspond au nombre d'animaux minimal et suffisant pour conduire à l'obtention de résultats statistiquement interprétables. Ce projet a été établi de manière à réduire au minimum les gestes invasifs réalisés sur les animaux. En effet, les souris seront identifiées par simple marquage de la queue avec un stylo indélébile de couleur et le génotype des souris sera vérifié après la mise à mort en fin d'expérience.
Raffinement
Les souris déficientes en protéine X ne présentent pas de défauts de reproduction ou de vieillissement, ni de sensibilité à des pathogènes communs. Elles sont cependant hyperlaxes et présentent des difficultés légères mais significatives à l'agrippement, même si leur locomotion n'est pas altérée. Pour s'assurer du bien-être de ces souris, elles seront surveillées de leur naissance à leur mort 1 fois par semaine. Elles seront mises en reproduction de 6 semaines à 9 mois, âge max à leur mise à mort. Pour l'étude du rôle anti-tumoral de la protéine X au cours de la carcinogenèse pancréatique, la chirurgie sera réalisée sur des souris de 8 semaines, sous anesthésie générale supplémentée en analgésiques locaux et généraux. Les conditions de stérilité seront assurées par l'utilisation de matériel stérile (instruments, champs opératoire et gants stériles) et par l'utilisation de bétadine vétériniare pour éliminer les pathogènes sur la zone opérée. La chirurgie sera réalisée en plaçant la souris sur un tapis chauffant de manière à éviter la baisse de température corporelle. De même, les souris seront placées dans des cages placées dans des armoires chauffantes jusqu'au lendemain de la chirurgie. Du gel occulaire ophtalmique sera utilisé pour éviter le désèchement des yeux lors de la chirurgie. De la nourriture humide et de l'eau gélifiée seront déposées dans des coupelles au fond de la cage après la chirurgie pour favoriser la prise alimentaire et hydrique. Une surveillance étroite des souris sera réalisée post-chirurgie pour vérifier l'absence de douleur et une potentielle infection de la zone incisée. Cette surveillance s'attachera à observer le comportement de la souris, l'apparence de la plaie et le poids de la souris. Les agrafes seront enlevées à J7 sous anesthésie gazeuse et une pommade anlagésique sera appliquée sur la zone précédemment agrafée. Une surveillance des souris au cours de la croissance tumorale sera également réalisée 2 fois par semaine à partir de 15 jours post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort de l'animal (35 jours post-implantation max) pour détecter tout signe de mal-être potentiellement induits par la croissance de la tumeur. Hormis pendant les 24h après la chirurgie ou un tissu fin servira de litière, les animaux seront hébergés en groupe de 4-6 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, baton).
Choix des espèces
Notre objectif est de comprendre le rôle de la protéine X dans la carcinogenèse pancréatique. Le modèle murin est le modèle de choix pour les études en cancérologie. En effet, la proximité génétique et physiologique de la souris avec l’homme permet de reproduire de nombreux aspects de la biologie tumorale humaine, tant sur le plan moléculaire que cellulaire. Les souris seront utilisées (injectées) à 8 semaines de développmement. Nous voulons travailler sur des souris adultes, donc matures sexuellement pour standardiser notre modèle (éviter les variations dues à la puberté ou à l'âge) et cette maturité est atteinte chez le mâle et la femelle entre 5 et 7 semaines. Les souris génétiquement modifiées utilisées n'ont pas de problème de reproduction, ni de vieillissement, mais montrent des difficultés légères lors de tests d'agrippements et de suspension. Pour éviter leur mal-être induit par une période de reproduction avancée, elles ne seront mises en reproduction qu'à partir de 6 semaines jusqu'à 9 mois post-naissance.
Caractérisation de la virulence des virus influenza chez la caille et exploration de stratégies thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Anesthésiées brièvement au gaz, 300 cailles reçoivent un virus influenza dans la cavité oculo-nasale, geste répété chaque jour pour celles qui servent aux tests de nanoparticules antivirales. Suivent les prélèvements quotidiens sur animal éveillé, écouvillons dans le bec et à l'orifice cloacal, prélèvements de plumes, isolement en boîte jusqu'à la défécation, plus une prise de sang. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 100 d'entre elles, modéré pour 100 et sévère pour 100, avec abattement, anorexie, difficultés respiratoires, atteintes neurologiques si le virus gagne le cerveau, et une hypothermie qui précède souvent la mort. Toutes sont tuées pour le recueil des organes, aucune ne pouvant rejoindre un élevage après une infection expérimentale.
Objectifs
Ce projet vise à caractériser la virulence de différents virus influenza chez la caille, un hôte aviaire susceptible de jouer un rôle de réservoir ou d’amplificateur. Il a également pour objectif de mieux comprendre ce qui rend le virus plus actif et comprendre comment le système immunitaire de l’animal réagit à l’infection. Par ailleurs, l’étude permettra d’évaluer l’efficacité de différents candidats thérapeutiques ou prophylactiques, incluant des antiviraux, des immunomodulateurs ou des vaccins, dans ce modèle aviaire. Enfin, un volet spécifique portera sur l’influence du microbiote intestinal, explorée notamment grâce à l’utilisation de cailles axéniques (dépourvues de germes), afin de déterminer son rôle dans l’évolution de l’infection et la modulation des réponses de l’hôte. Notre objectif est de mieux comprendre les virus qui infectent différents organes et causent des formes sévères d’infection. Ce modèle expérimental nous aidera à identifier les régions du corps les plus ciblées par le virus, à comparer la gravité de l’infection selon les souches virales, et à mieux comprendre comment certaines souches deviennent capables d’envahir des organes habituellement protégés. À terme, ce travail permettra d’anticiper les risques posés par certains virus de la grippe chez les oiseaux, y compris ceux pouvant infecter d’autres espèces comme les volailles domestiques ou même l’homme. Il contribuera également à développer des stratégies plus efficaces pour prévenir ou limiter la propagation de ces virus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment certains virus de la grippe aviaire parviennent à se disséminer dans l’organisme des oiseaux, au-delà des voies respiratoires, en franchissant des barrières physiologiques comme celle du cerveau. Les résultats attendus contribueront à identifier les facteurs viraux associés à une virulence accrue, ce qui permettra d’évaluer plus finement les risques pour la santé animale et, potentiellement, pour la santé humaine en cas de transmission interespèce. Ils permettront également de définir si la flore commensale bactérienne jour un rôle protecteur dans ce type de situation infectieuse et également de vérifier l’efficacité de médicaments nanoparticulaires in vivo. À terme, ce projet apportera des connaissances utiles pour la surveillance, la prévention et le contrôle des virus influenza chez les oiseaux.
Procédures
Les cailles seront infectées par instillation dans la cavité oculo-nasale sous anesthésie légère gazeuse. Cette voie d’administration sera également utilisée lors des tests d’efficacité des nanoparticules antivirales. Dans le cas de ces tests de médicaments, l’instillation intra-nasale pourra être répétée quotidiennement. Les animaux seront aussi l’objet de prélèvements de fientes qui seront récupérées en introduisant les cailles dans des boites individuelles jusqu’à l’apparition de fientes (quelques minutes). Enfin, des prélèvements quotidiens seront réalisés sur des animaux vigiles : emploi d’un coton-tige stérile pour recueillir des sécrétions, dans la cavité buccale ou au niveau de l’orifice intestinal de la caille, prélèvements de plumes, ainsi qu’une prise de sang ponctuelle réalisée en cours d’expérimentation. Ces gestes, sont de courte durée (quelques secondes à quelques minutes) et induisent un stress modéré.
Impact sur les animaux
Les effets attendus chez les animaux sont principalement liés à l’infection expérimentale. Selon la souche virale utilisée, des signes cliniques modérés à sévères peuvent apparaître, tels qu’un abattement, une diminution de l’activité, un ébouriffement du plumage, une perte de poids, une anorexie ou une difficulté respiratoire. Dans les cas les plus graves, des atteintes neurologiques peuvent survenir si le virus dissémine jusqu’au système nerveux central. Dans certains cas, une morbidité plus importante voire une mortalité peuvent survenir, en particulier avec des souches virulentes, dans ce cas une fièvre se produit en général les 1ers jours de l’infection et une hypothermie précédant la mort est souvent observée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, pour permettre le recueil des organes et tissus indispensables aux analyses prévues dans le cadre du projet. Par ailleurs, aucun des animaux ne pourra être réutilisé ni réintégré dans une colonie d’élevage, compte tenu de l’infection expérimentale par un virus potentiellement pathogène. Cette mesure vise à garantir la biosécurité et à éviter tout risque de dissémination non contrôlée de l’agent infectieux.
Remplacement
Certains phénomènes liés à l’infection ne peuvent être reproduits ni sur des cellules en laboratoire ni par ordinateur. L’étude du virus nécessite d’observer les réactions complexes de l’organisme entier, comme la fièvre, l’inflammation, le rôle de la flore intestinale ou la réponse immunitaire. La caille est un bon modèle pour comprendre ces mécanismes chez les oiseaux. Le protocole utilise le nombre minimal d’animaux, dans le respect du bien-être animal et des règles éthiques en vigueur.
Réduction
Le nombre de cailles utilisées a été soigneusement fixé pour obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum le recours aux animaux. Pour chaque condition étudiée, nous comparons deux groupes similaires de 15 cailles. Ce nombre permet d’avoir des groupes assez grands pour tirer des conclusions solides, sans utiliser plus d’animaux que nécessaire.
Raffinement
Les cailles vivent en liberté dans des cages spécialement aménagées, avec eau et nourriture à volonté. Le sol est recouvert de copeaux pour protéger leurs pattes et leur permettre de gratter et fouiller, comme elles le feraient dans la nature. Elles disposent aussi de cachettes et de matériaux pour construire un nid ou se replier, ainsi que d’objets à manipuler pour stimuler leur activité et réduire le stress. La densité des animaux est adaptée pour éviter les bagarres ou comportements agressifs. Une surveillance rigoureuse et des critères d’arrêt précis seront mis en place pour détecter toute aggravation clinique et limiter la souffrance animale. Les animaux atteignant les points limites prédéfinis seront euthanasiés.
Choix des espèces
La caille a été choisie car elle représente un hôte aviaire pertinent pour l’étude de souches influenza d’intérêt vétérinaire et zoonotique. Cette espèce est sensible à l’infection par ce virus ce qui en fait un modèle adapté pour étudier les tissus ou le pathogène se multiplie, la dissémination systémique et les barrières physiologiques spécifiques aux oiseaux. Les animaux utilisés seront des cailles juvéniles, âgées de 3 semaines car il est nécessaire que son système immunitaire soit mature. De plus, il permet une manipulation aisée des animaux et une observation optimale des signes cliniques et des réponses à l’infection.
Prélèvements « invasifs » en routine pour la caractérisation génétique d’une lignée de souris transgénique d’un récepteur impliqué dans la régulation du poids corporel
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Créer et entretenir une lignée de souris porteuses d'une mutation humaine liée à l'obésité et au diabète de type 2, telle est la seule finalité déclarée de cette première phase. 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans aucune expérience métabolique à ce stade. Chaque souriceau subit entre le septième et le dixième jour la section d'un millimètre de queue sous anesthésie locale, pour le seul génotypage, et se trouve séparé de sa mère quelques minutes. Le champ réglementaire ne déclare aucun animal gardé vivant, alors que le texte annonce des reproducteurs conservés pour la lignée et des descendants triés par sexe et génotype pour alimenter les expériences suivantes.
Objectifs
L’obésité affecte une personne sur 8 dans la population mondiale et constitue un facteur de risque majeur pour plusieurs comorbidités, en particulier le diabète de type 2. Au Mexique, les taux d’obésité sont particulièrement élevés, quel que soit l’âge. Une mutation spécifique d'un gène impliqué dans la régulation de l'appétit, retrouvée uniquement chez les personnes d’origine mexicaine et présente chez environ 1 % de cette population, a été identifiée comme un facteur génétique important favorisant l’obésité et le diabète de type 2. Cette première phase du projet vise à établir une lignée de souris mimant une mutation humaine impliquée dans la satiété, l'obésité et le diabète de type 2. L'objectif direct ici est donc de générer et caractériser génétiquement la lignée de souris afin de disposer d'animaux correctement identifiés. Cette phase conditionne la production d'animaux d'intérêt pour les futures analyses métaboliques et comportementales à venir. Elle constitue donc un prérequis essentiel à la réalisation des objectifs scientifiques du projet global.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette étape sont (1) la constitution d’une colonie reproductrice, comportant les trois génotypes d’intérêt et (2) la caractérisation génétique complète des animaux produits, permettant une gestion optimisée des élevages. Ces souris serviront à mieux comprendre le lien entre gènes, obésité et diabète, et à explorer les mécanismes biologiques qui influencent la régulation du poids et de la satiété. A terme, ces travaux contribueront à améliorer les connaissances scientifiques sur les causes génétiques de l'obésité et à mieux cibler les stratégies de prévention et traitement.
Procédures
Toutes les souris seront soumises à une procédure invasive consistant en un prélèvement tissulaire caudal réalisé entre J7 et J10 sous anesthésie locale dans le but exclusif du génotypage. Aucune autre intervention, traitement ou manipulation n’est prévue dans le cadre de cette procédure. Les reproducteurs seront ensuite uniquement utilisés pour la reproduction, tandis que les descendants génotypés seront orientés vers les futurs groupes expérimentaux.
Impact sur les animaux
- section d’1 mm de l’extrémité de la queue entre J7 et J10 - séparation transitoire (quelques minutes) de la portée et de la mère
Devenir
Les reproducteurs seront maintenus pour assurer la continuité et la gestion de la lignée, les descendants génotypés seront répartis selon leur sexe et leur génotype afin d’être utilisés dans des projets expérimentaux ultérieures.
Remplacement
L’étude des effets de cette mutation spécifique d'un gène impliqué dans la régulation de l'appétit nécessite un modèle vivant capable de reproduire l’ensemble des interactions entre le métabolisme, le comportement, l’inflammation et le système hormonal. À ce jour, aucune méthode sur cellules, organoïdes ou modèle informatique ne permet de recréer ces mécanismes complexes de façon réaliste. L’utilisation d’un modèle murin est donc essentielle pour comprendre ces processus dans leur globalité, et la gestion de cette lignée vise à disposer d’animaux fiablement caractérisés sur le plan génétique pour les futures études expérimentales.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires aux phases expérimentales futures a été estimé à l’aide d’un logiciel de calcul statistique adapté aux élevages de lignées transgéniques, en tenant compte des futurs groupes expérimentaux (3 génotypes, 2 sexes, 3 régimes alimentaires et 3 stades d’âge). Le calcul prédictif indique qu'un effectif de 11 animaux par groupe expérimental est suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres étudiés. Cette phase du projet concerne uniquement la mise en place et la gestion de la colonie de souris nécessaires aux futures études. L’inclusion systématique des deux sexes permet d’éviter de dupliquer les expérimentations, et la répartition des tests sur les mêmes individus maximise la quantité de données collectées par animal, tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
À leur arrivée, les souris parentes auront deux semaines pour s’habituer à leur nouvel environnement avant le début des accouplements. Elles seront hébergées dans des cages confortables et ventilées, dans une animalerie maintenant des conditions stables de température et d’humidité. Les accouplements se feront en duo (un mâle et une femelle par cage). Les femelles gestantes resteront hébergées dans les mêmes conditions, avec une attention particulière pendant la gestation et la lactation. Les manipulations seront limitées au strict nécessaire pour ne pas perturber les mères. Après le sevrage, les jeunes souris seront hébergées en petits groupes de quatre par cage, avec différents éléments d’enrichissement (matériel pour faire des nids, abris, tunnels, morceaux de bois à ronger) afin de favoriser leur bien-être et leurs comportements naturels. L’état et le comportement des animaux seront observés chaque jour grâce à une grille de suivi validée dans l’établissement, permettant de repérer rapidement tout signe de malaise ou de souffrance.
Choix des espèces
Ce projet nécessite la génération et la gestion d’un modèle murin génétiquement modifié porteur d'une susceptibilité à l'obésité. La souris constitue l’espèce modèle de référence pour ce type d’approche, en raison de sa facilité de reproduction, de la disponibilité d’outils génétiques adaptés et à la validation internationale des protocoles métaboliques et comportementaux. Les adultes reproducteurs seront utilisés à maturité sexuelle (6-7 semaine d’âge) pour réaliser les accouplements nécessaires à la production des portées expérimentales tout au long du projet. Les souris seront génotypées entre J7 -J10 à partir d’un prélèvement caudal, puis sevrées à J21.
Rôle de la protéine transmembranaire 1 dans la fibrose hépatique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Injectées dans l'abdomen avec du tétrachlorure de carbone deux fois par semaine pendant quatre semaines et demie, 48 souris dont le gène IRE1 a été désactivé dans le foie développent une fibrose hépatique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'injection dure dix secondes et se répète neuf fois, sous contention, sur animal éveillé. Le porteur qualifie la fibrose obtenue d'asymptomatique et sans douleur chez la souris, ce qui laisse le niveau modéré déclaré pour les 48 animaux reposer sur les seules piqûres. Toutes sont tuées à la fin du protocole, pour que leur foie soit prélevé et la surface de fibrose mesurée.
Objectifs
La fibrose hépatique correspond à une accumulation anormale de tissu cicatriciel dans le foie, qui apparaît lors de nombreuses maladies chroniques du foie. Aujourd’hui, il n’existe aucun traitement capable de stopper ou de faire régresser cette fibrose, ce qui explique la nécessité de mieux comprendre comment elle se développe. Dans ce projet, nous nous intéressons à une protéine appelée IRE1, présente dans les hépatocytes (les principales cellules du foie). Des études ont montré que cette protéine est fortement activée lorsque le foie est agressé et que son fonctionnement pourrait jouer un rôle important dans l’apparition de la fibrose. L’objectif de notre étude est de déterminer si l’absence d’IRE1 dans les hépatocytes peut protéger le foie contre la fibrose, en utilisant un modèle bien établi chez la souris, basé sur l'administration répétée d’une substance appelée CCl₄. En comprenant mieux le rôle d’IRE1 dans ce processus, nous espérons contribuer à l’identification de nouvelles pistes pour lutter contre la fibrose hépatique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à déterminer si IRE1 constitue une cible thérapeutique potentielle dans la fibrose hépatique, une pathologie pour laquelle aucun traitement spécifique n’est actuellement disponible. Il permettra également de préciser la contribution de la réponse UPR à la physiopathologie de la fibrose, et ainsi de mieux caractériser le rôle d’IRE1α en vue de son ciblage thérapeutique.
Procédures
Les souris auront une administration par voie intrapéritonéale de CCl4 d'une durée de 10 secondes par souris, 2 fois par semaine pendant 4,5 semaines.
Impact sur les animaux
Les souris recevront une injection de CCl₄ ou de son véhicule (huile d’olive) deux fois par semaine pendant 4 semaines (douleur légère de courte durée au moment de l’injection). Ce traitement induira le développement d’une fibrose hépatique, qui reste asymptomatique chez la souris (comme chez l’homme) (sans douleur).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie.
Remplacement
Des approches non animales existent dans le domaine de l'étude des mécanismes de fibrose hépatique, notamment les cultures d’hépatocytes ou de cellules stellaires, les cocultures, les modèles tridimensionnels (organoïdes) ou encore certaines simulations in silico. Ces méthodes sont utiles pour étudier des mécanismes moléculaires spécifiques, mais elles ne permettent pas de reproduire la complexité physiopathologique de la fibrose hépatique, qui implique l'interaction coordonnée entre hépatocytes, cellules stellaires, cellules immunitaires, inflammation, remodelage tissulaire et modifications du microenvironnement hépatique. Elles ne permettent donc pas de répondre aux objectifs du projet. Nous avons déjà utilisé des approches in vitro pour caractériser le rôle d’IRE1 dans les hépatocytes, mais la suite du projet nécessite impérativement un modèle intégrant un foie complet, perfusé, soumis à une agression chronique, ce qu’aucune alternative non animale ne permet aujourd’hui. Des alternatives animales partielles (tranches de foie, foies perfusés, modèles ex vivo) ont également été envisagées, mais elles ne reproduisent pas la fibrose qui résulte d’une maladie chronique, avec une dynamique d’activation des cellules stellaires sur plusieurs semaines. Elles ne permettent pas non plus d’évaluer l’effet d’une délétion génétique hépatocytaire spécifique dans un environnement physiologique complet. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable pour étudier le rôle d’IRE1 dans la fibrose hépatique et aucune alternative, animale ou non animale, ne permet d’atteindre les objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été déterminé comme celui permettant de démontrer une différence statistiquement significative de 30 % du paramètre étudié (aire de fibrose hépatique). Les résultats seront analysés grâce à un test statistique non paramétrique.
Raffinement
Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait sa mise à mort anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrées de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose. L'injection de CCl4 sera réalisée par une personne expérimentée qui maîtrise donc parfaitement le geste ce qui réduit le temps nécessaire pour le réaliser et donc le temps de contention de la souris.
Choix des espèces
Le modèle "souris" présente l’avantage de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées afin d'identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables du développement de la fibrose hépatique. Dans ce projet, nous utiliserons les souris KO IRE1 dans les hépatocytes pour lesquelles la protéine IRE1 est spécifiquement invalidée dans les hépatocytes. La fibrose hépatique sont des processus qui surviennent chez l’adulte, nous utiliserons donc des animaux âgés de plus de 8 semaines dans notre étude.
Immunothérapie à base d’ARN pour cibler les cellules infectées par les bradyzoites de Toxoplasma gondii
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Inoculées dans le bas-ventre avec une souche de toxoplasme puis vaccinées par deux injections intramusculaires dans les pattes arrière, 60 souris femelles sont toutes tuées à l'issue, l'infection par un agent pathogène interdisant tout autre devenir. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré pour la totalité des animaux. Le projet teste une immunothérapie à ARN visant les cellules qui hébergent les kystes du parasite, transposée des vaccins contre le Covid-19 et des traitements anticancéreux. Le porteur écrit pourtant que la souche choisie ne provoque ni symptôme clinique ni souffrance notable et que les seules nuisances attendues tiennent aux deux piqûres, ce qui laisse la souffrance modérée déclarée pour les 60 souris sans description.
Objectifs
Validation in vivo d'une immunothérapie à ARN contre les parasites persistants à l'intérieur des cellules. Ce projet propose une approche innovante pour traiter le parasite appelé toxoplasme en ciblant non pas directement le parasite dormant, mais les cellules qui l’hébergent sous forme de kyste. En s’inspirant des stratégies d’immunothérapie développées contre les rechutes du cancer et la vaccination contre le Covid-19, notre objectif est de stimuler une réponse capable de détruire de façon ciblé les cellules infectées par les kystes, via une thérapie à ARN. Nous testons une immunothérapie à ARN dans un modèle murin infecté par le toxoplasme. En ciblant des protéines capables d’activer les cellules immunitaires cytotoxiques, nous espérons éliminer les cellules infectées par les kystes. Ce modèle permettra d’évaluer l’efficacité, la sécurité et la réponse immunitaire de cette approche innovante.
Bénéfices attendus
L’approche que nous proposons, est une première étape de validation d’une nouvelle stratégie thérapeutique adapté à l’infection de la souris par le toxoplasme extrapolable à l'ensemble de ses hôtes mammifères . Cette méthodologie pourrait ensuite être étendue à d’autres infections parasitaire à formes dormantes.
Procédures
Les interventions qui peuvent causer des nuisances sont (1) l'inoculation dans le bas ventre de 100 µL d'une souche avirulente pour la souris (la durée de cette intervention est estimée à 15 secondes) et (2) l'inoculation de l’immunothérapie de 50 µL en intramusculaire dans chacune des 2 pattes postérieures soit 100 µL au total (la durée de cette intervention est estimée au maximum à 30 secondes par injections soit 2 x 30 s), qui peuvent entrainer une gêne sur un laps de temps très court. Ces interventions seront réalisées une seule fois pour chaque souris.
Impact sur les animaux
La souche de toxoplasme inoculée est sélectionnée pour sa non virulence pour la souris. Elles ne provoquent pas de symptômes cliniques ni de souffrance notable chez les animaux, ce qui garantit une charge parasitaire suffisante pour l’étude tout en préservant leur bien-être. Le protocole inclura un suivi rigoureux des animaux qui seront surveillés quotidiennement afin de détecter tout signe de détresse ou d'effet indésirable en lien avec le traitement. Les seules nuisances ou effets indésirables potentiellement attendus sont liés à l'injection vaccinale : 2 injections intramusculaires de 50 µL chacune, même si les traitements à ARNm (vaccins COVID-19 ou immunothérapies anticancéreuses) ont démontré une innocuité préclinique solide chez la souris.
Devenir
Les animaux ayant été infectés par un agent pathogène, les souris seront systématiquement mises à mort après avoir été au préalable endormis en fin de procédure.
Remplacement
Le remplacement n’est pas possible à ce stade du projet. L’objectif est de valider in vivo un traitement à base d’ARN visant à éliminer les formes dormantes de parasites intracellulaires. Les mécanismes immunitaires complexes ne peuvent être reproduits de manière fiable in vitro. Le modèle murin infecté par le toxoplasme est actuellement le seul disponible pour reproduire une infection chronique à formes dormantes.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été strictement limité. L’expérience sera conduite en duplicat sur trois groupes de 10 souris seulement, soit un total de 60 animaux, ce qui représente un compromis entre puissance statistique et minimisation du nombre de sujets. Ce design expérimental a été optimisé pour maximiser l’information obtenue par animal.
Raffinement
Un soin particulier sera apporté au bien-être des animaux tout au long de l’étude. Du fait du faible nombre de souris inclues dans l’étude les souris inoculées seront hébergées dans des cages pouvant contenir plus de souris d’après les normes en vigueur. Les souris font l’objet d’un enrichissement dès leur mise en cage et jusqu’à la fin de l’expérimentation. Les souris recevront un traitement antalgique en cas de symptôme afin d'éliminer toute douleur potentielle liée à la procédure. L’infection sera induite par une souche adaptée à l’établissement d’une infection chronique sans signes cliniques pour la souris, ce qui permet d’éviter toute souffrance chez ces dernières. Les animaux seront anesthésiés et sous antalgique pour minimiser tous risque de stress et souffrance au cours de l'injection du traitement en intramusculaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour détecter précocement tout signe de détresse ou de dégradation de l’état général et la fréquence d’observation est accentuée (deux à trois fois par jour au lieu d’une seule) en cas de symtômes. Des critères d’arrêt (score clinique) seront mis en place pour garantir leur prise en charge immédiate si nécessaire.
Choix des espèces
Les souris (Mus musculus) sont l’animal de choix pour l'entretien du parasite. Mis à part le chat domestique, la souris représente l'espèce animale de laboratoire la plus adaptée pour l'isolement et l'entretien de souches de toxoplasmes (le modèle rat par exemple ne permet pas le maintien des souches). Elle est utilisée par l'ensemble des équipes de recherche internationale qui travaille sur la culture in vivo du toxoplasme. Des souris femelles (âgées de 4 à 8 semaines) seront utilisées pour la mise en place d'une infection chronique par le toxoplasme et tester la réponse au traitement ARN. L’âge des animaux utilisés dans nos procédures correspond à une taille et un poids de l’animal minimum pour lequel l’injection des volumes d’inoculum et de traitement envisagés sont bien tolérés.
Une nouvelle voie pour réduire la lipotoxicité hépatique liant les maladies métaboliques du foie et l’athérosclérose dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
Soumises à un régime riche en graisses et en sucre pendant huit à vingt-quatre semaines, injectées avec des particules pour modifier l'expression d'un gène, puis placées jusqu'à onze jours en cage individuelle ou en enceinte à 30 degrés, 784 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. En fin de parcours s'ajoutent des injections de lipoprotéines tous les deux jours pendant deux semaines, avant que toutes soient tuées pour prélever le sang et les organes. Le projet vise à décrire le dialogue entre le foie, le cœur et les vaisseaux dans la stéatose hépatique et l'athérosclérose, et le porteur affirme que ce dialogue ne s'étudie qu'à l'échelle de l'"organisme entier". La composition et la durée exacte du régime restent indéterminées, renvoyées aux résultats d'une étude pilote encore en cours.
Objectifs
Les maladies métaboliques telles que la stéatose hépatique associée à un dysfonctionnement métabolique sont caractérisées par des désordres touchant le métabolisme énergétique, et notamment des lipides. Elles sont fréquemment associées à des complications cardiaques et vasculaires. L’accumulation de lipides dans la paroi des artères est une conséquence fréquente qui peut conduire à des accidents vasculaires comme la crise cardiaque. Elle est associée à d’autres troubles comme l’obésité, le diabète et les dyslipidémies. Ces maladies touchent plusieurs organes et doivent être étudiées de façon globale afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués. Toutefois les mécanismes impliqués dans la communication foie - cœur et contribuant au développement de l’athérosclérose sont peu connus. L’objectif principal de ce projet est de valider la contribution majeure de la voie d’un transporteur et des lipoprotéines dans cette communication et de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement des maladies cardiovasculaires chez les patients atteints de stéatose hépatique associée à un dysfonctionnement métabolique.
Bénéfices attendus
La prévalence mondiale des maladies du foie telle que la stéatose hépatique associée à un dysfonctionnement métabolique (Metabolic dysfunction–Associated Liver Disease, MASLD) associée à l’athérosclérose ne cesse de croitre (38 pourcents) et celle-ci est associée à une augmentation de la mortalité. Ainsi, 65 pourcents des patients diabétiques de type 2 sont atteints de MASLD. Ce projet permettra de mettre en évidence les mécanismes associés au développement de MASLD et de l’athérosclérose et aux troubles métaboliques qui en découlent tels que l’insulino-résistance, et plus particulièrement d’identifier un lipide clé des hépatocytes dans ce processus. Cette étude nous permettra de comprendre l’importance de la dérégulation de l’homéostasie lipidique des hépatocytes dans le développement des maladies cardiométaboliques et d’explorer les dialogues inter-cellulaire et inter-organes. L’ensemble de ces données permettra d’envisager notre transporteur d’intérêt comme une potentielle cible thérapeutique dans le traitement des patients ayant une MASLD et un risque cardiovasculaire élevé.
Procédures
Les animaux impliqués dans ce projet seront injectés avec des particules (moins de 5 minutes) pour exprimer le gène cible. Un maximum de 6 actes est prévu par animal. Seuls 6 actes au total sont réalisés sur animaux anesthésiés (injection des particules, prélèvements sanguins, échographie cardiaque, électrocardiogramme, activité d’enzyme et injection de lipoprotéines), les autres actes étant réalisés sur des animaux vigiles. Après 2 semaines, les souris seront mises en présence d’un régime riche en graisses et en sucre pour une durée de 8-24 semaines. Avant et après régime, sur les souris vigiles nous évaluerons la masse grasse ce qui nécessite une courte contention (moins de 5 min), et elles seront testées par un faible prélèvement de sang sous anesthésie (moins de 5 minutes). A la suite du régime riche en sucres ou en lipides, les souris seront mises à jeun (entre 2 et 15h) et rapidement évaluées sur le plan métabolique. Les conséquences de l’ingestion de sucres ou de lipides seront alors évaluées grâce à de très faibles prélèvements (5 et 6 prélèvements) de sang sur de courtes périodes (respectivement 5 et 6 prélèvements à 2h et 6h par intervention). De même, la sensibilité des souris à l’insuline, afin d’estimer un potentiel diabète, sera réalisé selon la même procédure (2h) et une procédure complémentaire (5 minutes). Afin que les évaluations soient fiables, les animaux seront vigiles et libres de leurs mouvements. De même, les évaluations seront réparties dans le temps afin d’éviter toute fatigue. Le comportement des animaux sera mesuré sur quatre jours grâce à des cages munies de divers capteurs. L’impact de la température sur la prise de poids sera mesuré dans des cages de thermoneutralité à 30 degrés Celsius. Une partie des animaux sera évaluée sur le fonctionnement du cœur par une échographie (15 minutes) et un électrocardiogramme (15 minutes). Ceci sera réalisé sous anesthésie afin de garantir l’immobilité des souris et la qualité des images sans stresser l’animal. Enfin, des lipoprotéines seront injectées tous les 2 jours pendant les 2 dernières semaines (moins de 5 minutes) pour tester leur effet thérapeutique. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet. Les organes seront prélevés post-mortem.
Impact sur les animaux
Les souris seront exposées à des régimes riches en lipides et en sucre pendant plusieurs semaines (24 maximum) pour induire une MASLD et de l’athérosclérose afin de provoquer les désordres métaboliques qui lui sont associée : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, troubles du rythme, troubles du rythme cardiaque…. Ces régimes pourraient induire un inconfort et une difficulté de déplacement dus à la prise de poids développée. L’injection de particule pourrait induire une douleur de courte durée et un risque d’hématome ou d’hémorragie. De plus, les souris seront soumises à un phénotypage métabolique qui inclus un jeûne non-strict de quelques heures ce qui peut engendrer une sensation de faim chez l’animal. Les injections pour le test de sensibilité à l’insuline et l'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose et un le suivi de glycémie (ou lipides) associé avec des prélèvements sanguins de faible volume pourront induire un stress et une douleur légère de courte durée. L'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose ou de lipide pour le test de tolérance aux lipides pourrait induire des microlésions et des irritations. De plus, les sites d’injections et prélèvements peuvent également s’infecter. L’analyse corporelle ainsi que l’hébergement dans les cages métaboliques ou en thermoneutralité peuvent engendrer un stress de courte durée. Le placement de certaines souris en cage individuelle pendant une période de 11 jours pourra causer un stress social. Les anesthésies gazeuses peuvent provoquer un risque léger de dépression respiratoire et de température corporelle. Enfin, la manipulation des animaux peut induire un stress
Devenir
Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins pour répondre à la question (ou aux objectifs) scientifique de ce projet.
Remplacement
Le dialogue inter-organes (coeur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (hépatocytes et macrophages) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires. Ainsi l’impact induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, l’altération du métabolisme lipidique dans un organe peut avoir un écho profond dans des organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués.
Réduction
Le projet impliquera 784 animaux au total. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre d’évaluations à réaliser, et donc le nombre d’animaux requis. La composition et la durée du régime riche en lipides et en sucres utilisé ici sera déterminée par les résultats d’une étude pilote en cours. Cette méthode nous permet ainsi d’assurer avec un faible nombre d’animaux le succès de ce projet et une utilisation rationnée et réduite au strict nécessaire.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel ou à 30 degrés Celsius (thermoneutralité) est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les greffes et les explorations cardiaques seront réalisées sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux. Les animaux seront vérifiés quotidiennement et un suivi régulier du poids sera effectué afin de s'assurer du bien-être des animaux. Pour faciliter l'alimentation, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage en cas de nécessité. Conformément à la réglementation, les actes techniques seront réalisés par du personnel formé et compétent pour respecter le bien-être animal et diminuer leur stress. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
La souris constitue le modèle privilégié pour l’étude des mécanismes impliqués dans la pathophysiologie des maladies métaboliques : la souris est le mammifère le moins évolué qui développe rapidement des maladies métaboliques similaires à l’Homme. L’analyse de l’athérosclérose requiert une modification du métabolisme lipidique et une altération de la communication inter-organes. Nous utiliserons une lignée de souris qui présente un métabolisme lipidique plus proche de ce que l’on peut observer chez l’Homme. Des souris âgées de 8 à 10 semaines, un âge auquel elles sont suffisamment matures pour être injectées avec les particules, seront utilisées. Les régimes riches en lipides et en sucres seront mis en place à l'âge de 10 à 12 semaines, afin que l’expression du transporteur dans les hépatocytes suite à l’injection des particules soit optimale.
Exacerbation de la colite expérimentale par la co-exposition à l’alcool et aux mycotoxines
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Gavées une fois par jour, trente-cinq fois au total, sous contention manuelle, 768 souris reçoivent de l'alcool et des mycotoxines puis un agent inflammatoire pendant cinq jours pour déclencher une colite. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et tuées à l'issue pour prélever les organes. Le porteur décrit des diarrhées importantes, des déshydratations, une inflammation généralisée et une perte de poids qui durent jusqu'à la mise à mort, l'objet du projet étant de démontrer que l'alcool et les mycotoxines aggravent la sévérité des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Il classe pourtant le gavage en nuisance modérée, tout en décrivant le risque de fausse route avec détresse respiratoire et hypersalivation.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin touchent un nombre croissant de patients en Europe. L’analyse des données du registre qui répertorie les cas de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin dans le nord de la France montre que le nombre de cas est en forte augmentation, en particulier chez les jeunes et adolescents (10 à 16 ans). Les prédictions pour 2030 sont alarmantes puisque la prévalence des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin pourrait atteindre 0,5% à 1% de la population générale. Ces maladies, marquées par des poussées inflammatoires récurrentes, sont influencées par des facteurs environnementaux, notamment l’alcool et les mycotoxines (toxines naturelles produites par les champignons). L’alcool, en altérant la barrière intestinale, et les mycotoxines, principaux contaminants naturels de notre alimentation, exacerbent l’inflammation intestinale et pourraient aggraver la progression et la sévérité des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Des études ont montré que les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin conservaient une consommation d’alcool équivalente à celle de la population générale et que, malgré les contre-indications, l’abstinence ne fait pas partie des recommandations actuelles. D’autre part, le réchauffement climatique favorise la prolifération des mycotoxines qui contaminent de plus en plus notre alimentation. L’objectif de cette étude vise à démontrer les effets combinés de l’alcool et des mycotoxines sur la sévérité des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin dans un modèle expérimental de colite (inflammation du colon).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mettre en évidence l’aggravation de la sévérité des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin chez les patients consommateurs d’alcool co-exposés aux mycotoxines. Tandis que l’impact de la consommation d’alcool sur l’incidence de la maladie inflammatoire chronique de l’intestin est débattu, aucune étude n’a, à ce jour, examiné son impact sur la sévérité de ces pathologies. Or une étude démontre une augmentation de la sévérité de la colite dans un modèle expérimental suite à une exposition à l’alcool. Dans ce contexte, aucune donnée à ce jour n’a évalué l’interaction entre la consommation d’alcool et l’exposition aux mycotoxines. Mettre en évidence l’effet de l’interaction alcool/mycotoxines dans ce modèle de colite permettrait d’améliorer les connaissances scientifiques sur cette co-exposition et encourager la prise en compte de ces deux facteurs dans le suivi et la prise en charge des patients. Nos résultats pourraient contribuer à faire évoluer les recommandations actuelles. L’abstinence à l’alcool pourrait devenir une recommandation pour les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Par ailleurs, l’identification des aliments fréquemment contaminés par les mycotoxines permettrait de mieux définir les aliments à risque et d’affiner les conseils nutritionnels destinés à ces patients.
Procédures
Les animaux seront tous exposés aux interventions suivantes : Gavage tous les jours (= 35 gavages) sur animal vigile tout au long du protocole expérimental. Pour cette intervention, les animaux seront maintenus en contention manuelle pour une durée inférieure à 1 minute par administration. Les animaux recevront un agent inflammatoire pendant 5 jours. Anesthésie (2 fois ; moins de 3 minutes). Prélèvement sanguin à la fin du protocole. Le prélèvement sanguin se fera sur animal anesthésié. Le prélèvement sanguin dure moins d’une minute. Ces interventions seront réalisées sur l’ensemble des 768 animaux.
Impact sur les animaux
Lors de cette procédure, plusieurs nuisances pouvant affecter le bien-être des animaux sont identifiés : - Les gavages peuvent générer des nuisances modérées liées au stress de la contention et à la procédure. En cas de fausse route, accident pouvant survenir lors de la procédure de gavage, l’animal peut présenter des signes de souffrance tels que détresse respiratoire et une hypersalivation. - D’après notre expertise, la consommation orale d’alcool peut induire des nuisances importantes. L’administration d’une forte dose d’alcool par gavage peut réduire l’activité motrice et limiter la prise alimentaire pendant quelques heures. Sur le long terme, jusqu’à la mise à mort de l’animal, des signes de déshydratation, de diarrhée et de perte de poids liées à l’exposition répétée à l’alcool peuvent être observés. - Les mycotoxines utilisées devraient induire des nuisances légères. La concentration de mycotoxines choisie pourrait induire une diminution de l’alimentation des souris associées à une légère perte de poids. Quelques modifications des selles pourraient survenir occasionellement jusqu’à la fin de la procédure. - L’induction de la colite est associée à des nuisances sévères jusqu’à la mise à mort de l’animal. L’exposition à l’agent inflammatoire peut entraîner d’importantes diarrhées et donc des déshydratations. De plus, une inflammation généralisée et d’importantes atteintes intestinales sont attendues pouvant entraîner des douleurs. - Le prélèvement de sang entraîne des nuisances légères principalement liées au stress induit par l’anesthésie gazeuse.
Devenir
Afin d’étudier les atteintes induites par le protocole, un prélèvement d’organes est nécessaire, ce qui implique la mise à mort de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Le modèle souris de colite est la méthode de référence dans l’étude des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Dans ce modèle souris de colite expérimentale, nous souhaitons étudier l’interaction entre l’alcool et les mycotoxines qui ont la capacité d’influencer aussi bien le microbiote intestinal que le système immunitaire ce qu’il n’est pas possible d’analyser par les méthodes alternatives. De plus, des effets différents peuvent être observés en fonction du sexe. Pour cela, l’étude chez la souris nous permettra la comparaison entre mâles et femelles, que l’on ne peut pas réaliser in vitro ou in silico. Le développement de la colite va générer des modifications physiologiques, telles qu’une perte de poids, une déshydratation et également des changements de la température corporelle qui peuvent affecter les conditions physiologiques de l’animal. Enfin, l’animal nous permet de mimer le mode de contamination observée chez l’Homme avec une administration par voie orale. Il rend donc possible de prendre en compte la diffusion des contaminants, leur capacité à affecter et traverser la barrière intestinale ainsi que leur métabolisation. Ces variables physiologiques ne peuvent être observées sur des modèles d’explants biologiques ou sur les animaux non vertébrés ou vertébrés moins sentients. Dans ce contexte, les méthodes alternatives actuelles ne sont pas suffisantes pour tenir compte de la complexité des mécanismes de cette pathologie multifactorielle et l’utilisation de modèles animaux expérimentaux demeure essentielle.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, des tests préliminaires in vitro sur cultures cellulaires seront réalisés pour sélectionner 4 mycotoxines d’intérêt à étudier dans le modèle souris de colite. Dans le cadre de cette étude et pour déterminer l’impact de la co-exposition alcool/mycotoxine sur la sévérité de la colite induite chimiquement, des analyses statistiques seront effectuées. Après calcul, le nombre d’animaux nécessaire est de 24 dans chaque groupe pour atteindre la puissance statistique souhaitée. Notre étude comprend 4 groupes différents : colite, alcool/colite, mycotoxine/colite, alcool/mycotoxine/colite 4 mycotoxines x 2 sexes x 4 groupes x 24 animaux par groupe = 768 souris. Ainsi 768 animaux sont nécessaires pour réaliser l’ensemble du protocole. Afin de prendre en compte le principe de réduction, chaque groupe de 24 animaux sera divisé en trois sous-groupes de 8 animaux. A la fin de chaque expérience, une évaluation statistique intermédiaire sera réalisée. Si les résultats sont satisfaisants, nous ne réaliserons pas les expériences sur les sous-groupes suivants afin de limiter et réduire le nombre total d’animaux utilisé.
Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie et jusqu’à leur mort, nos animaux seront surveillés individuellement et quotidiennement, pesés 2 fois par semaine à l’exception de la 5ème semaine pour laquelle la surveillance sera renforcée et la pesée sera quotidienne. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 afin de garantir un enrichissement social suffisant. Les animaux auront accès à volonté à l’eau et à la nourriture en présence d’enrichissement (litière foisonnante, roue d’activité, dôme, copeaux de bois compactés) tout au long du projet. Afin de réduire le nombre de manipulations désagréables pour les animaux, l’administration des molécules par voie orale se fera de façon conjointe. Les opérateurs sont régulièrement entraînés à l’administration orale sur des mannequins de souris afin de perfectionner le geste. L’alcool pouvant altérer le bien-être animal, les cages sont placées, immédiatement après le gavage et pendant quelques minutes, sur tapis chauffant. Des point limites ont été établis pour évaluer la souffrance des animaux. Ils sont relatifs à l’apparence physique, la variation de poids, la déshydratation, et au comportement social. Ces indicateurs sont présentés dans une grille d’évaluation affichée dans les locaux d’hébergement et complétée chaque jour après l’inspection de chaque animal. Toute atteinte de point limite conduira à mener une action corrective. Tout animal présentant des signes de douleur ou de souffrance jugés excessifs, sera immédiatement euthanasié.
Choix des espèces
Nous avons choisi de réaliser l’étude sur des souris pour les raisons suivantes : - Modèle de référence pour analyser l’impact d’une alcoolisation importante sur la perméabilité intestinale et la colite expérimentale - Expertise sur les concentrations d’alcool et de mycotoxine utilisables ce qui limite l’utilisation d’animaux pour des protocoles préliminaires. Le protocole sera réalisé sur des jeunes souris adultes de 9 semaines en adéquation avec le mode de consommation d’alcool et l’apparition des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin chez l’Homme.
Protection des lésions d’ischémie-reperfusion hépatiques par modulation du métabolisme lipidique chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Nourries pendant quatre mois d'un régime riche en sucres et en graisses jusqu'à devenir obèses, une partie des 664 souris de ce projet passe ensuite sur la table d'opération pour un arrêt puis une reprise de la circulation sanguine dans le foie, sous anesthésie, pendant quatre-vingt-dix minutes. Toutes subissent trois à quatre prélèvements sanguins, certaines reçoivent deux administrations de molécules agissant sur les lipides, et les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. L'enjeu déclaré est de rendre greffables des foies stéatosiques aujourd'hui écartés, et le projet sert aussi à la formation professionnelle. Toutes les souris sont tuées, le porteur précisant que les prélèvements d'organes prévus sont "incompatibles avec le maintien en vie des animaux".
Objectifs
La transplantation est aujourd’hui une solution reconnue pour soigner des patients lorsqu'un organe ne fonctionne plus. Mais il y a un manque d'organes de qualité à greffer. Les médecins doivent donc parfois utiliser des organes dits "marginaux", provenant de personnes âgées ou ayant eu certains problèmes de santé comme l’obésité ou le diabète. Ces organes sont plus fragiles et réagissent mal à un phénomène appelé ischémie-reperfusion, inévitable en transplantation. Il correspond à l’arrêt temporaire de la circulation du sang dans l’organe, puis à son retour. Cela provoque des lésions qui abîment fortement l’organe et peuvent compromettre la réussite de la greffe. Les organes dits marginaux, comme les foies avec stéatose, sont encore plus sensibles à ces lésions d’ischémie reperfusion, d’où la nécessité d’évaluer des molécules pour les protéger et pouvoir les utiliser en transplantation. Des recherches récentes ont montré une altération précoce du métabolisme des lipides après une ischémie dans le foie avec apparition de lipides toxiques. Le but de notre projet est de déterminer si l'ischémie du foie sain ou avec stéatose conduit aussi à l'apparition de lipides dits toxiques et s'il est possible de limiter les lésions du foie après ischémie reperfusion en utilisant des molécules qui agissent sur les lipides toxiques.
Bénéfices attendus
A court terme, cette étude permettra de mieux comprendre les modulations précoces du métabolisme lipidique après ischémie sur foies sains et stéatosiques et leurs implications dans la genèse des lésions hépatiques. A long terme, ce projet vise à réhabiliter des greffons stéatosiques aujourd’hui récusés pour la transplantation en mettant au point des stratégies thérapeutiques limitant la production d’espèces lipotoxiques, dont le nombre va croitre massivement dans les années à venir en raison de la pandémie d’obésité, et ainsi répondre à la pénurie de greffons que subit aujourd’hui la France.
Procédures
Certains animaux suivront un régime riche en sucres et graisses pendant 4 mois pour provoquer une stéatose hépatique. Tous les animaux subiront 3 à 4 prélèvements de sang (durée de moins de 5 minutes) faits sous anesthésie pour mesurer différents paramètres biologiques et une chirurgie pour réaliser l'ischémie-reperfusion du foie (durée de 90 minutes) sous anesthésie également. Les prélèvements de sang seront espacés d'un minimum de 20 heures. Parmi la totalité des souris, une partie n’aura aucune administration de molécules et d’autres souris auront 2 administrations de molécules agissant sur le métabolisme lipidique (durée de moins de 5 minutes). Les 2 administrations seront espacées au moins de 90 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux suivront un régime riche en sucres et graisses pendant 4 mois. Ce régime conduira à la prise de poids progressive des animaux tout au long du régime jusqu’à atteindre une obésité. Les prélèvements sanguin (acte
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements d’organes, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.
Remplacement
A ce jour, il existe des modèles de foie in silico ou in vitro, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire la complexité cellulaire du foie, le métabolisme des lipides et les lésions d’ischémie reperfusion. De plus, les modèles de perfusion de foies ex vivo ne nous permettent pas non plus d’étudier le remodelage du lipidome hépatique et plasmatique.
Réduction
Le nombre d'animaux requis par condition expérimentale pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant a été calculé à l'aide d'un outil statistique. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures, ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Les organes prélevés seront placés dans une banque d'organes pour être mutualisés avec d'autres projets.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). La répartition sera de 3 à 5 souris par cage. Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape de la procédure en pré-, per- et post- opératoire. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie, sous anesthésie générale, avec un maintien de la température corporelle.
Choix des espèces
Le choix porté sur la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2) Le modèle de régime obésogène chez la souris, qui mime une obésité environnementale chez l’homme, est validé et adapté pour répondre aux objectifs du projet. 3) La disponibilité chez cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques déjà présents au laboratoire. 4) La souche de souris sélectionnée offre moins de variabilité dans la réponse au régime occidental que d'autres souches de souris et développe moins de shunt porto-systémique comme mis en évidence dans notre précédente saisine
Détermination de biomarqueurs IRM de désordres hépatiques dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 480
480 rats et 288 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois injections par semaine pendant sept semaines leur administrent une molécule qui abîme le foie, avec une absence de prise de poids, une déshydratation et, dans les formes avancées, une dégradation de l'état général que le porteur ne peut pas exclure. Chaque animal passe ensuite une à deux séances d'IRM par semaine sous anesthésie générale, avec injection d'un agent de contraste, pour caler des marqueurs d'imagerie de la fibrose hépatique transposables au diagnostic humain. Le porteur présente l'imagerie du petit animal vivant comme un "maillon indispensable" et affirme que ces marqueurs permettraient de remplacer les "nombreux sacrifices d'animaux" des études à venir.
Objectifs
Le syndrome métabolique est un ensemble de désordres incluant le diabète, l'obésité ou la stéatose hépatique, qui constituent un problème de santé majeur dans les pays occidentaux. Sa prévalence est estimée entre 25% et 30% de la population et pour les patient atteints du diabète du type 2, elle monte à 70%. Ce syndrome est un facteur de risque pour les maladies cardio-vasculaires, la cirrhose et le cancer. Ce syndrome se caractérise par un foie gras, inflammé avec présence de fibrose. La présence de fibrose est un marqueur de la gravité de la maladie et sert à la stratification des patients. La présence de surcharge en fer est un facteur aggravant de la maladie. Afin de limiter la progression de ces désordres métaboliques, l’industrie pharmaceutique tente de développer des molécules pour restaurer la fonction des tissus endommagés (pancréas, foie, tissus adipeux...). Des études histologiques ont déjà été réalisées pour valider les modèles ani-maux. Cependant, plusieurs problèmes persistent, notamment le nombre très important d’animaux utilisés (pour évaluer l’évolution de la pathologie à différents temps, pour évaluer la sévérité de la pathologie, évaluer l’efficacité d’un traitement, etc..). L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique incontournable pour le diagnostic médical, grâce à sa bonne résolution spatiale, son caractère non-traumatique et sa grande variété de contrastes. L’IRM devrait permettre de définir des bio-marqueurs IRM pour détecter la pathologie et la sévérité de la fibrose pour ensuite évaluer l’impact de médicaments sur la pathologie, sans avoir recours à une biopsie. Ces marqueurs ont pour objectifs d’être, à terme, utilisés en routine clinique chez l’homme. Ce projet est donc basé sur le développement de séquences IRM sur le petit animal pour obtenir des informations précises et fiables, en 3D et en des temps d’acquisition rapides.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de développer des méthodes IRM produisant des marqueurs fiables de désordres hépatiques. Ainsi, il n’y aura plus besoin d’utiliser un grand nombre d’animaux pour les futures études, développant des traitements contre les désordres métaboliques. De plus, ces méthodes IRM seront transférables à l’homme, et limiteront ainsi le recours à des biopsies régulières sur les patients.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à trois injections intrapéritonéales par semaine de sérum physiologique ou d’une molécule induisant un désordre hépatique, pendant 7 semaines. Ensuite, les animaux seront imagés par IRM sous anesthésie générale une à deux fois par semaine. Une fois par semaine (lors d’une session IRM), un agent de contraste sera injecté par voie intraveineuse. Suite à la session d’imagerie, les animaux recevront une injection intra-péritonéale d’un mélange d’antalgique et d’analgésique avant d’être euthanasiés.
Impact sur les animaux
Une absence de prise de poids et une deshydratation sont attendues dans ces modèles. De plus, dans les formes les plus avancées de la pathologie, une dégradation de l’état général n'est pas à exclure.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de corréler les biomarqueurs IRM aux analyses histologiques.
Remplacement
Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant le diagnostic et l’évaluation de la sévérité de désordres hépatiques chez l’homme. L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus. En effet, nous souhaitons détecter l’apparition d’une maladie (diagnostic précoce) et ensuite suivre son évolution (pronostic). Ceci permettrait de remplacer les nombreux sacrifices d’animaux en fournissant des biomarqueurs fiables et robustes grâce à l’obtention d’images avec des résolutions spatiales élevées, et des informations quantitatives. Tout cela, dans le but de suivre plus tard l’application de traitements contre les désordres métaboliques.
Réduction
Du fait de la non-invasivité de l’IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum d’une semaine entre chaque examen. Ainsi chaque animal sera son propre contrôle. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire. De plus, sur la base de publications scientifiques, il était estimé un écart-type standard d’environ 25% sur la plupart des expérimentations réalisées. Nous utiliserons les tests statistiques pour comparer les biomarqueurs entre des animaux pathologiques et des animaux sains, ainsi qu’entre animaux à différents stades de la pathologie.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages collectives, avec de l’enrichissement (bâtonnets de bois à ronger, matériaux de construction de nid, maisonnette pour le souris, tubes en carton pour les rats, litière) et de la nourriture et de l’eau à volonté. L'utilisation d'anesthésies gazeuses générales lors des procédures, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Il est à rappeler que l’expérience d’IRM en elle-même ne génère aucun signe de souffrance visible. Une surveillance régulière de la santé et du bien-être des animaux sera réalisée, comprenant des signes au niveau du comportement, de la mobilité, de la perte de poids, et de l’apparition de symptômes cliniques. Si des signes de mal-être apparaissent, les animaux seront pris en charge par un analgésique. Des points limites ont aussi été instaurés, induisant une euthanasie immédiate. L’état de santé des animaux sera suivie quotidiennement.
Choix des espèces
Les animaux sélectionnés sont largement utilisés et caractérisés par la communauté scientifique afin d'étudier la progression du diabète, de l’obésité et des désordres hépatiques. Ils ont une progression pathologique similaire à celles observés chez l'Homme. En particulier, les rats sont très bien caractérisés au niveau métabolique. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Ceci permet d'une part de reproduire ces modèles couramment utilisés par la communauté scientifique et d'autre part d'éviter de considérer les effets due à l'immaturité du tube digestif des animaux non-adultes qui pourront altérer nos conclusions.
Modèle murin innovant pour tester des stratégies thérapeutiques ciblant l’axe intestin-peau
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système gastrointestinal
1300 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour le prélèvement des organes et des fluides. Les reproducteurs reçoivent des micro-organismes par voie orale, une fois pour les mâles et deux fois pour les femelles, et chaque animal issu de ces reproductions subit jusqu'à quatre injections avant une prise de sang terminale. Le porteur décrit une colonisation intestinale par des bactéries potentiellement pathogènes, avec diarrhées, perte de poids, baisse d'activité et risque d'infection disséminée par Klebsiella pneumoniae ou Enterococcus faecium, l'atteinte cutanée recherchée reproduisant une dermatite atopique ou un psoriasis. Il passe en revue cultures cellulaires, explants, organoïdes et simulation informatique, pour conclure que rien ne reproduit "la complexité d'un organisme entier".
Objectifs
Chez la souris, l’étude de l'axe intestin-peau est particulièrement pertinente car elle permet de modéliser comment le microbiote intestinal influence la physiologie cutanée. Ce modèle va permettre d'explorer le rôle du microbiote dans le maintien de l’intégrité de la barrière cutanée, dans la régulation de la réponse inflammatoire locale, et dans la susceptibilité à des pathologies cutanées chroniques. Ce modèle préclinique de dermatite atopique ou de psoriasis offre la possibilité d’identifier des signatures microbiennes ou métaboliques associées à ces affections, et d’évaluer l’effet de manipulations ciblant le microbiote (probiotiques, prébiotiques, transplantation fécale, antibiotiques). Ces approches ouvrent la voie à une meilleure compréhension des interactions systémiques entre l’intestin et la peau, et à l’émergence de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à restaurer l’homéostasie de l’axe intestin-peau.
Bénéfices attendus
La modulation du microbiote intestinal constitue une approche innovante pour explorer les interactions systémiques entre l’intestin et la peau. Les traitements envisagés (probiotiques, postbiotiques, postbiotiques, antibiotiques, petites molécules chimiques, peptides, protéines, anticorps, vaccins, phages ou encore immunomodulateurs) ciblent directement la composition et la fonction du microbiote, avec des répercussions attendues sur l’immunité systémique et sur la barrière cutanée dont l’intégrité et la fonction protectrice dépendent en partie des signaux métaboliques et immunitaires émanant de l’intestin. Le modèle murin mis en place permettra de reproduire un état de dysbiose intestinale menant à des atteintes cutanées caractéristiques de pathologies chroniques telles que la dermatite atopique ou le psoriasis. L’intérêt scientifique de ce modèle repose sur plusieurs axes majeurs. Le décryptage mécanistique va permettre d’élucider les voies immunologiques et métaboliques reliant le déséquilibre intestinal à la dysfonction cutanée, contribuant ainsi à une meilleure compréhension de l’axe intestin-peau. La validation thérapeutique en testant et comparant les différents modulateurs du microbiote ou de la réponse immunitaire va permettre d’identifier des stratégies efficaces de régulation de l’inflammation et de restauration de l’homéostasie cutanée. L’identification de biomarqueurs va mettre en évidence des signatures microbiennes, immunitaires ou métaboliques associées aux atteintes cutanées, susceptibles de servir de cibles ou de marqueurs prédictifs pour de futurs essais cliniques chez l’humain. La pertinence translationnelle va permettre de générer des données précliniques robustes et transposables, renforçant la valeur du modèle comme outil de prédiction et de sélection de nouvelles approches thérapeutiques. En somme, ce projet vise à établir un cadre expérimental permettant à la fois de mieux comprendre les bases biologiques de l’axe intestin-peau et de favoriser l’émergence de nouvelles stratégies thérapeutiques intégrées pour les maladies inflammatoires cutanées.
Procédures
Le projet implique une administration de microorganismes par voie orale (1 fois pour les males reproducteurs et 2 fois pour les femelles reproductrices). Cette procédure n'excède pas 15 secondes pour chaque animal. Chaque animal (issu des reproductions) subira 1 à 4 injections (10 sec) au maximum. Un prélèvement de sang unique terminal sera réalisé (sous anesthésie gazeuse et avec un traitement préalable à la buprénorphine en sous cutané) (20sec)
Impact sur les animaux
Le modèle murin de transmission verticale contrôlée du microbiote intestinal peut induire certains effets indésirables chez les animaux, principalement liés à la colonisation intestinale par des bactéries potentiellement pathogènes: des perturbations digestives avec apparition possible de diarrhées, modification de la consistance des selles ou ralentissement du transit intestinal, une inflammation locale de la muqueuse digestive, une altération de l’état général avec une perte de poids transitoire, une diminution de l’appétit ou une baisse de l’activité spontanée, notamment en cas de forte charge bactérienne, un risque infectieux systémique (bien que limité, un passage translocatif de certaines bactéries (ex. Klebsiella pneumoniae, E. faecium) à travers la barrière intestinale peut entraîner une infection disséminée.
Devenir
A la fin de chaque procédure tous les animaux sont mis à mort, afin d’en prélever les organes et fluides biologiques afin de quantifier des biomarqueurs divers.
Remplacement
Préalablement à toute utilisation d'animaux, nous intègrons dans nos projets des modèles in vitro, tissulaires et des organoïdes, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d’optimiser les essais précliniques. Il existe plusieurs alternatives non animales, mais elles ne peuvent pas remplacer totalement les tests sur les animaux utilisés dans ce projet. 1. Modèles in vitro : Les cultures cellulaires humaines ou animales permettent d’étudier des interactions cellulaires et les réponses inflammatoires. Cependant, elles ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier, notamment les interactions multicellulaires complexes et la réponse immunitaire systémique. 2. Modèles ex vivo : Les tissus humains ou animaux (biopsies, explants) permettent d’étudier des processus biologiques en conditions plus réalistes, mais il manque des interactions entre plusieurs systèmes organiques. 3. Modèles organoïdes: Ces systèmes imitent des organes pour étudier les réponses biologiques. Cependant, ils ne peuvent pas reproduire la réponse systémique d'un organisme complet. 4. Modélisation informatique : Les simulations informatiques peuvent modéliser certaines interactions pathogènes et immunitaires, mais elles ne peuvent pas simuler toutes les réactions biologiques complexes d'un organisme vivant. Ces alternatives ne peuvent pas complètement remplacer les animaux, car les modèles non animaux ne peuvent pas reproduire la complexité d’un organisme vivant complet, limitant leur capacité à simuler des réponses biologiques globales et interconnectées.
Réduction
Les modèles in vitro et tissulaires permettent de tester les composés en développement sur des cultures cellulaires et tissulaires, évaluant leur efficacité, leur innocuité et leurs mécanismes d’action avant tout essai in vivo. Les organoïdes reproduisent des structures d’organes spécifiques, permettant d’étudier la réponse des tissus aux traitements dans un environnement plus réaliste. En combinant ces approches, nous contribuons à la réduction des expérimentations animales, tout en garantissant la précision des résultats. Cette approche permet d'identifier les composés les plus prometteurs et de maximiser l'efficacité des traitements. De façon systématique des analyses statistiques sont effectuées afin de déterminer le nombre d’animaux optimal afin de produire des résultats robustes pour chaque point de mesure.
Raffinement
La fréquence de surveillance des animaux est essentielle pour garantir leur bien-être. Les signes de détérioration de l’état de santé, tels que la perte de poids, fièvre, modifications de la mobilité, ou respiration laborieuse, sont particulièrement surveillés par l'observation de points limites en raison des effets des infections et inflammations. Après l'infection ou l'administration de traitements, une surveillance plus rapprochée (toutes les 2 à 4 heures) est mise en place dans les premières 12 heures, pour détecter rapidement des signes de détresse. Si des signes de stress apparaissent, nous ajusterons l'environnement pour améliorer le bien-être des souris et notamment stimuler leurs sens et leurs comportements naturels. Nous augmenterons l’enrichissement physique par l’apport de cachettes (boîtes, tunnels) et de matériaux pour la construction de nids (papier déchiqueté, fibres) ainsi que l’enrichissement sensoriel par la modification régulière de la disposition de leur cage et des éléments à l’intérieur de la cage pour offrir de la nouveauté. L'introduction de nouveaux enrichissements se fera progressivement pour éviter un stress supplémentaire Des critères d'arrêt stricts sont définis pour éviter la souffrance excessive des animaux. L’objectif est de garantir que l’état de l’animal est constamment suivi et que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux.
Choix des espèces
Les modèles souris sont largement utilisés en raison de : -la disponibilité d'un grand nombre de modèles génétiques, ce qui permet d'étudier des maladies spécifiques ou des processus biologiques particuliers. -cette espèce se prête aux analyses immunologiques en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes du développement de la physiopathologie Des animaux ayant atteint une maturité sexuelle (7 à 10 semaines) seront utilisés à des fins de reproduction. Le but de la procédure étant d'étudier l'évolution de l'intégrité cutanée après l'acquisition d'un microbiote intestinal particulier au moment de la naissance, des nouveau -nés seront également analysés. Les animaux issus de la reproduction dans le cadre de ce projet seront analysés à différents âges (J8, J15, J30, J60 et J90)
Immunothérapie adjuvante des allergies chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une réaction allergique leur est provoquée, avec une inflammation locale ou généralisée, un inconfort respiratoire transitoire et une baisse de la température corporelle mesurée trente minutes après chaque administration d'antigène, puis elles reçoivent des substances une à deux fois par semaine pendant cinq à huit semaines et subissent deux à trois prélèvements sanguins. La mise à mort sert à prélever poumons, intestin, peau et ganglions, le porteur indiquant que ces analyses ne peuvent pas être faites sur des animaux vivants. L'objet reste l'optimisation d'une molécule immunomodulatrice, dont il compare plusieurs versions pour la rendre "plus facile à produire", tout en affirmant qu'aucune alternative au modèle murin n'est disponible et que la souris demeure "incontournable".
Objectifs
Ce projet a pour but de mieux comprendre et d’optimiser une approche innovante pour traiter les allergies. Il repose sur trois grands axes : 1.Observer comment une molécule testée agit sur certaines cellules du système immunitaire, en particulier celles qui fabriquent les anticorps. 2.Vérifier si cette approche pourrait prévenir ou soulager les différents allergies, en l’essayant dans différents modèles d’allergie chez la souris. 3.Améliorer cette stratégie en comparant plusieurs versions de la molécule, pour la rendre plus efficace, mieux tolérée, plus stable dans le temps et plus facile à produire.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’explorer une approche immunomodulatrice innovante dans un contexte allergique, et de caractériser de manière approfondie les mécanismes immunitaires sous-jacents, afin de mieux comprendre leur implication dans l’efficacité thérapeutique. Ces pathologies, en forte augmentation dans les pays industrialisés, touchent aujourd’hui jusqu’à 30 à 40 pourcents de la population mondiale et représentent un fardeau important en termes de santé publique et de coût socio-économique (arrêts de travail, baisse de qualité de vie, consommation de soins). En étudiant les effets immunologiques de cette approche, notamment sur la production d’anticorps et la régulation de la réponse immunitaire, ce projet a pour objectif d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques, plus efficaces, mieux tolérées et adaptées aux besoins des patients allergiques. Les retombées attendues concernent principalement la santé humaine, avec un potentiel impact à long terme sur la prévention et la prise en charge des maladies allergiques. Ce projet contribue également à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation immunitaire, ce qui pourrait bénéficier à d’autres pathologies inflammatoires ou auto-immunes.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions non chirurgicales, réparties sur plusieurs semaines selon le modèle expérimental. Celles-ci incluent des administrations de substances (1 à 2 fois par semaine, quelques minutes, sur une période totale de 5 à 8 semaines, sur animaux vigiles ou sous anesthésie courte), la mesure des paramètres respiratoires (1 fois pendant le projet, environ 20 minutes, sur animaux vigiles avec contention douce) et des prélèvements sanguins (2 à 3 fois par animal sur l’ensemble du protocole, environ 5 minutes, sur animaux vigiles).
Impact sur les animaux
L’induction d’une réaction allergique chez les souris peut provoquer une réponse inflammatoire locale ou généralisée, pouvant entraîner une gêne physique passagère, ainsi qu’un état temporaire de mal-être. Selon le modèle allergique utilisé, cette réaction peut également s’accompagner d’un inconfort respiratoire transitoire. Par ailleurs, cette phase d’induction est susceptible de provoquer une baisse modérée de la température corporelle (stress thermique), nécessitant une surveillance spécifique. Les nuisances attendues incluent le stress lié à la contention temporaire nécessaire pour les injections et administrations, ainsi qu’à la réalisation de mesures de paramètres respiratoires. Ces manipulations peuvent entraîner un inconfort transitoire, sans conséquences durables pour les animaux. Les prélèvements sanguins répétés, indispensables pour le suivi de la réponse immunitaire, peuvent occasionner une douleur brève ainsi qu’un risque localisé d’irritation ou d’hématome. La contention temporaire nécessaire à ces procédures est également susceptible de générer un stress ponctuel, en raison de la restriction de mouvement qu’elle implique.
Devenir
À l’issue des différentes procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés afin de permettre la récupération des tissus nécessaires aux analyses scientifiques. Cette étape est indispensable pour atteindre les objectifs du projet, qui nécessitent l’étude fine des organes impliqués dans les réponses allergiques (poumons, intestin, peau, ganglions, etc.). Les prélèvements post-mortem permettent de réaliser des analyses de type histologique, immunologique, transcriptomique ou moléculaire, qui ne peuvent pas être effectuées sur des animaux vivants sans entraîner une souffrance importante ou des biais expérimentaux. L’euthanasie est donc justifiée scientifiquement et a été retenue comme la seule solution éthique permettant d’obtenir des résultats fiables tout en respectant le bien-être animal.
Remplacement
La souris est un modèle valide en immunologie et particulièrement dans les études visant à mieux décrire les mécanismes modulant la réponse immunitaire. Aucune alternative à l'utilisation d'un modèle murin n'est disponible pour cette recherche. Avant d’avoir recours à l’expérimentation animale, des approches alternatives ont été utilisées en amont du projet, notamment des cultures cellulaires et des tests de stimulation in vitro pour étudier certaines voies de signalisation. Ces modèles ont permis de mieux cibler les conditions expérimentales, de réduire le nombre d’animaux nécessaires et d’optimiser les doses utilisées. Toutefois, ces approches ne permettent pas d’évaluer l’efficacité globale d’une immunothérapie ou l’impact d’une modulation immunitaire dans le cadre d’une pathologie systémique comme l’allergie. La souris a donc été retenue comme modèle, en raison de sa pertinence en immunologie et de la disponibilité de lignées transgéniques bien caractérisées, qui permettent une exploration fine des mécanismes impliqués. Ainsi, malgré les efforts de remplacement mis en œuvre, l’utilisation d’un modèle murin reste à ce jour incontournable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.
Réduction
Dans le cadre de ce projet, un total de 2064 souris est prévu sur une durée de 5 ans. Ce nombre représente le minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, tout en respectant le principe de réduction inscrit dans la règle des 3R. Le nombre d’animaux par groupe expérimentale a été défini à partir de calculs de puissance statistique, en se basant sur les données issues de nos travaux antérieurs, afin de garantir une puissance suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives. Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, plusieurs mesures de réduction ont été mises en œuvre : Optimisation des protocoles expérimentaux à partir de données issues de cultures cellulaires et d’études préliminaires in vitro. Planification raisonnée des groupes expérimentaux, en tenant compte à la fois de l’objectif scientifique et des contraintes de stabulation. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux impliqués, sans compromettre la validité scientifique des résultats attendus.
Raffinement
Des mesures spécifiques sont appliquées à chaque étape du protocole pour réduire douleur, stress et souffrance. Une surveillance clinique quotidienne est effectuée, incluant l’observation du comportement dans l’environnement habituel afin de détecter précocement tout signe de mal-être. Lors de la phase d’induction allergique, une chute de température corporelle pouvant survenir (stress thermique), une mesure systématique est réalisée 30 minutes après l’administration de l’antigène. Un suivi clinique quotidien est effectué. Des critères d’arrêt stricts sont définis. Les prélèvements sanguins répétés sont réalisés à l’aide de techniques peu invasives, et la contention est brève et maîtrisée afin de minimiser la gêne. Les animaux sont hébergés en groupe dans des portoirs ventilés, à température et hygrométrie contrôlées, avec accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, et un cycle lumineux de 12 heures par jour. L'environnement est enrichi. L’ensemble de ces mesures vise à réduire au strict minimum les contraintes imposées aux animaux, en garantissant leur bien-être tout en assurant la fiabilité et la qualité des données expérimentales. Les procédures peuvent générer un inconfort passager lié à la contention ou aux manipulations, sans effets durables. Toutes les interventions seront réalisées par du personnel expérimenté, dans des conditions visant à limiter le stress et à préserver le bien-être des animaux.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris dans ce projet se justifie par son statut de modèle validé en immunologie, particulièrement adapté aux études portant sur les mécanismes de régulation du système immunitaire et le développement de nouvelles stratégies d’immunothérapie. La souris offre une excellente reproductibilité des résultats, grâce à sa standardisation génétique, à la disponibilité d’outils immunologiques spécifiques, et à l’existence de nombreux modèles expérimentaux bien caractérisés. Les animaux seront utilisés à un stade adulte jeune, entre 6 et 8 semaines d’âge. Ce choix correspond à un stade de développement où le système immunitaire est pleinement mature, ce qui est essentiel pour étudier les réponses immunitaires induites dans le cadre du projet.