Système gastrointestinal

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines recevant jusqu'à 260 gavages ou 260 injections abdominales étalés sur douze mois. Le protocole commence tôt : biopsie de la queue à six jours pour l'identification génétique, injection unique d'un composé cancérogène à quinze jours, puis à partir de huit semaines l'administration répétée de benzo[a]pyrène, un polluant issu de la combustion, avec pour certains groupes des injections destinées à provoquer une fibrose du foie. Une inflammation hépatique, du tissu cicatriciel et des tumeurs du foie sont attendus et se développent progressivement. Les retombées annoncées, mieux évaluer le risque lié aux polluants et ouvrir des pistes de prévention, sont formulées au long terme, quand les atteintes du foie, elles, sont provoquées d'emblée.

Objectifs

Les polluants présents dans l’environnement peuvent avoir des conséquences importantes sur la santé humaine. Parmi eux, le benzo[a]pyrène (B[a]P) est une substance produite lors de la combustion incomplète de matières organiques, par exemple par le trafic routier, le chauffage, certaines activités industrielles ou le tabagisme. L’être humain y est exposé quotidiennement, notamment par l’alimentation et l’air ambiant. Plusieurs études suggèrent qu’une exposition prolongée à cette substance pourrait favoriser le développement de maladies du foie, notamment la fibrose (formation excessive de tissu cicatriciel) et le cancer du foie. Cependant, les mécanismes par lesquels ce polluant agit sur le foie restent encore mal connus. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment une exposition chronique au benzo[a]pyrène influence l’apparition et l’aggravation des maladies hépatiques. Le projet vise également à déterminer si le benzo[a]pyrène peut aggraver une maladie hépatique déjà présente et favoriser la progression du cancer du foie. Enfin, il permettra d’évaluer si un traitement expérimental capable de bloquer certains effets de ce polluant peut limiter le développement des lésions hépatiques et du cancer. Les résultats attendus contribueront à mieux comprendre les effets des polluants environnementaux sur le foie et pourraient aider à identifier de nouvelles stratégies de prévention ou de traitement des maladies du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment certains polluants présents dans l’environnement, et en particulier le benzo[a]pyrène, peuvent contribuer au développement de maladies du foie lorsqu’une exposition se prolonge sur une longue période. Les connaissances acquises aideront à identifier les mécanismes responsables de l’apparition de la fibrose hépatique et du cancer du foie liés à ces polluants. Elles permettront également de mieux comprendre comment certaines cellules du foie sont affectées par l’exposition chronique à ces substances. Le projet évaluera par ailleurs l’intérêt d’une approche thérapeutique expérimentale visant à limiter les effets nocifs du benzo[a]pyrène sur le foie. Ces travaux pourraient ainsi contribuer, à plus long terme, au développement de nouvelles stratégies de prévention ou de traitement des maladies hépatiques associées à l’exposition aux polluants environnementaux. Enfin, les résultats obtenus permettront d’améliorer l’évaluation des risques liés à l’exposition à ces polluants et pourront contribuer à l’élaboration de recommandations destinées à mieux protéger la santé humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions consistant principalement en l’administration répétée de substances par voie orale (gavage) ou par injection dans la cavité abdominale. Selon les groupes expérimentaux, les souris recevront : une biopsie de queue réalisée à l’âge de 6 jours pour l’identification génétique ; une injection unique à l’âge de 15 jours ; deux injections par semaine pendant 12 semaines (soit 24 injections au total) ; deux gavages par semaine pendant 12 semaines (soit 24 administrations) ; cinq gavages par semaine pendant 6, 9 ou 12 mois (soit respectivement 130, 195 ou 260 administrations) ; cinq injections par semaine pendant 12 semaines (soit 60 injections au total) ; cinq injections par semaine pendant 6, 9 ou 12 mois (soit respectivement 130, 195 ou 260 administrations). La durée de chaque intervention est courte : environ 5 à 30 secondes pour un gavage et environ 15 secondes pour une injection. À la fin de l’étude, un prélèvement sanguin sera réalisé au moment de la mise à mort des animaux afin de permettre les analyses nécessaires au projet.

Impact sur les animaux

Les animaux participeront à des études nécessitant l’administration répétée de substances par voie orale ou par injection. Ces manipulations pourront entraîner un stress ou une gêne légère et de courte durée liés à la contention et à l’administration des traitements. Certaines souris seront exposées à une substance polluante susceptible d’induire progressivement des atteintes du foie. Selon les groupes expérimentaux, ces atteintes pourront se traduire par une inflammation du foie, l’apparition de tissu cicatriciel (fibrose) ou le développement de tumeurs hépatiques. Ces effets apparaîtront de manière progressive au cours de l’étude. Les animaux seront surveillés régulièrement tout au long du projet afin de détecter précocement tout signe de souffrance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets du B[a]P.

Remplacement

Le recours à un modèle animal est indispensable pour répondre aux objectifs de ce projet. En effet, l’étude de l’impact d’une exposition chronique au benzo[a]pyrène (B[a]P) sur le développement de la fibrose et du cancer du foie nécessite l’analyse de processus physiopathologiques complexes impliquant de multiples types cellulaires (hépatocytes, cellules endothéliales, cellules immunitaires) ainsi que leurs interactions au sein d’un organisme intact. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de reproduire de manière intégrée les phénomènes de fibrogenèse, d’inflammation chronique et de carcinogenèse hépatique induits par une exposition prolongée à un polluant environnemental. Les modèles in vitro, bien que complémentaires, ne permettent pas de recapituler l’ensemble des interactions cellulaires, des réponses systémiques et de la cinétique d’évolution des lésions observées in vivo. L’utilisation de la souris constitue un modèle de choix en raison des similitudes physiopathologiques avec les maladies hépatiques humaines, en particulier dans les modèles de fibrose et de carcinome hépatocellulaire chimio-induits. Elle permet notamment d’étudier de manière intégrée les effets du B[a]P sur le foie dans un contexte physiologique pertinent, incluant le métabolisme des xénobiotiques et les réponses inflammatoires et vasculaires. Ainsi, en l’absence de méthodes substitutives adaptées, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Le nombre de souris a été limité à celui nécessaire pour obtenir une validation statistique des résultats expérimentaux. Il a été déterminé de manière à permettre la mise en évidence d’une différence statistiquement significative de 30 % d’un principal paramètre étudié, l’aire de fibrose hépatique. Les analyses statistiques seront réalisées à l’aide de tests non paramétriques adaptés aux effectifs. Ce choix permet de garantir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait sa mise à mort anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrés de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour étudier la fibrose et le développement du cancer du foie. Ce modèle présente également l’avantage de permettre l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Nous utilisons notamment des souris dans lesquelles le gène AhR, impliqué dans la réponse au stress cellulaire, est inactivé uniquement dans les cellules des vaisseaux sanguins du foie (cellules endothéliales). Cette inactivation est ciblée grâce à un système génétique permettant de supprimer ce gène uniquement dans ce type cellulaire, sans modifier les autres tissus de l’organisme. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement selon les objectifs des expériences. Dans les procédures visant à induire un cancer du foie, les souris recevront une injection unique d’un composé chimique (DEN) ou d’un produit contrôle à l’âge de 15 jours. Ce moment est choisi car le foie est encore en développement et les cellules se divisent activement, ce qui favorise l’apparition de modifications nécessaires à l’initiation de tumeurs. À l’âge adulte (8 semaines), certaines souris recevront des injections répétées de d’un autre composé chimique (CCl4) ou du produit contrôle afin d’induire une fibrose du foie, c’est-à-dire une accumulation excessive de tissu cicatriciel. Enfin, dans toutes les procédures, un polluant environnemental (B[a]P) ou son véhicule sera administré à partir de l’âge de 8 semaines, correspondant à l’âge adulte chez la souris.  

Percées à l'oreille pour identification, pesées seize fois en seize semaines, 360 souris mâles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, dont 270 rendues obèses par une alimentation riche en graisses et en sucres. Viennent jusqu'à 80 injections sous-cutanées ou 80 gavages par animal, deux passages de moins de deux minutes dans un tube d'analyse corporelle, six périodes de jeûne de six heures, des injections de glucose puis d'insuline, et six incisions au bout de la queue pour prélever le sang, aucun test comportemental n'étant prévu au-delà d'un contrôle de l'état général et du comportement trois fois par semaine. Les molécules évaluées viennent de l'industrie et trois d'entre elles sont déjà en phase avancée d'essai clinique chez des patients, le porteur justifiant le passage par la souris par l'impossibilité de pratiquer des biopsies hépatiques chez l'être humain. Toutes reçoivent en fin de protocole un analgésique puis un anesthésique, le temps d'un prélèvement de sang au niveau du foie, avant d'être mises à mort pour la collecte des tissus.

Objectifs

Le diabète de type 2 et la stéatose hépatique d’origine métabolique (appelée aussi « foie gras ») sont des maladies très fréquentes qui représentent aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique. Ces deux maladies sont souvent associées : de nombreux patients atteints de diabète présentent également une accumulation excessive de graisse dans le foie. Même si plusieurs traitements existent déjà, ils ne permettent pas toujours de contrôler efficacement la maladie et peuvent parfois provoquer des effets indésirables. Il est donc important de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Le modèle de souris rendues obèses par une alimentation riche en graisses et en sucres reproduit les principales caractéristiques observées chez les patients atteints de diabète de type 2 et de stéatose hépatique. Dans ce projet, l’efficacité de plusieurs molécules prometteuses sera évaluée. Trois d’entre elles sont actuellement en phase avancée d’évaluation clinique en mode curatif chez l’Homme pour le diabète de type 2 et/ou le foie gras et seront comparées à un traitement déjà utilisé en pratique médicale. Deux autres molécules d’origine végétale, identifiées lors de nos travaux de recherche, seront également étudiées. L’objectif est de déterminer si ces traitements améliorent les troubles métaboliques associés à ces maladies et de mieux comprendre leurs mécanismes d’action au niveau hépatique (biopsie hépatique trop invasive chez l’homme). Les traitements seront administrés selon deux approches : soit dès le début de l’alimentation riche en graisses et en sucres afin d’évaluer leur capacité à prévenir l’apparition de la maladie, soit après l’installation de la maladie afin d’évaluer leur capacité à la traiter. Cette stratégie permettra d’étudier leur intérêt à la fois en prévention et en traitement, ce qui n’est pas le cas des études cliniques en cours qui sont réalisées chez des patients déjà malades.

Bénéfices attendus

À court terme, ces études permettront de mieux comprendre comment agissent de nouveaux traitements prometteurs contre le diabète de type 2 et la stéatose hépatique. Elles aideront notamment à déterminer si leurs effets bénéfiques sont associés à une amélioration de certaines molécules circulant dans l’organisme ainsi qu’à une restauration du bon fonctionnement des cellules du foie. À plus long terme, ces travaux contribueront à l’évaluation de ces candidats médicaments avant leur utilisation chez l’Homme. Les connaissances acquises pourront soutenir leur développement clinique et participer à l’identification de nouvelles options thérapeutiques pour les patients atteints de ces maladies.

Procédures

Les 360 animaux subiront un perçage de l’oreille pour leur identification (- de 30 sec avec contention) et seront pesés 1X/semaine pendant 16 semaines, soit 16 pesées/animal (- de 30 sec chacune). Parmi eux, 270 animaux recevront pendant 16 semaines une alimentation riche en graisses et en sucres induisant une prise de poids progressive. Concernant les traitements, 75 animaux recevront une injection sous la peau quotidienne (hors week-ends) pendant 16 semaines, soit 80 injections/animal, et 75 autres pendant 6 semaines, soit 30 injections/animal. Chaque injection durera moins de 30 secondes, contention comprise. Par ailleurs, 105 animaux recevront un gavage dans l’estomac quotidien (hors week-ends) pendant 16 semaines, soit 80 administrations/animal, et 105 autres pendant 6 semaines, soit 30 administrations/animal. Chaque gavage durera moins de 30 secondes, contention comprise. Les 360 animaux bénéficieront de deux mesures de composition corporelle, espacées de 13 semaines. Pour chaque mesure, ils seront placés moins de 2 minutes dans un tube cylindrique permettant leur introduction dans l’appareil d’analyse. Les 360 animaux subiront six périodes de jeûne (de 7 h à 13 h), espacées d’au moins une semaine. Ils recevront ensuite une injection dans le ventre de glucose pour évaluer la tolérance au glucose puis, une semaine plus tard, une injection dans le ventre d’insuline pour évaluer la sensibilité à l’insuline (- de 30 sec par injection, contention comprise). Les 360 animaux subiront six petites incisions à l’extrémité de la queue (- de 1 mm, - de 30 sec, sans contention), espacées d’au moins une semaine, afin de permettre les prélèvements sanguins. Ces prélèvements comprendront six gouttes de sang lors du test de tolérance au glucose, six gouttes lors du test de sensibilité à l’insuline et une goutte lors du suivi de la glycémie (- de 30 sec par prélèvement, sans contention). En fin de protocole, les 360 animaux recevront une injection d’analgésique puis, 30 minutes plus tard, une injection d’anesthésiques permettant le prélèvement sanguin au niveau du foie, suivi de la mise à mort (- de 30 sec par injection, contention comprise).

Impact sur les animaux

Les pesées entraînent un stress léger et temporaire. La consommation d’un régime riche en lipides entraîne une prise de poids sans altération de la mobilité ou du comportement. Lors des mesures de composition corporelle, les souris sont placées pendant moins de deux minutes dans un tube adapté à leur taille, ce qui génére un stress temporaire. Trois molécules sont administrées quotidiennement par injection. Ces injections répétées sur plusieurs semaines provoquent un stress lié à la manipulation et à la contention, ainsi qu’un inconfort local au point d’injection. Trois molécules seront administrées quotidiennement par gavage. Cela engendre un stress et un inconfort liés à la contention et à l’introduction de la sonde. Les tests métaboliques réalisés au cours de l’étude entraînent un inconfort ponctuel. Les périodes de jeûne de six heures sont source de stress. Les injections de glucose ou d’insuline utilisées lors de ces tests sont associées à une douleur légère et transitoire. Les prélèvements sanguins sont réalisés à partir d’une petite incision de moins d’un millimètre à l’extrémité de la queue, provoquant une légère douleur momentanée. À la fin de l’étude, les animaux recevront deux injections (antidouleur puis anesthésique) pour permettre le prélèvement de sang terminal. Ces injections provoquent une légère douleur et un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des expériences afin de collecter les tissus d’intérêt et de procéder aux analyses permettant de répondre à l’objectif du projet.

Remplacement

Des méthodes alternatives, réalisées sur cellules en laboratoire ou à l’aide d’outils informatiques, ont été utilisées dans un premier temps pour sélectionner et étudier les molécules. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire le fonctionnement complet d’un organisme vivant ni les interactions entre les différents organes, tels que le foie, les muscles, le tissu graisseux et l’intestin. Or, le diabète de type 2 et la maladie du foie gras résultent de mécanismes complexes impliquant l’ensemble de l’organisme. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour évaluer de manière fiable l’efficacité et les effets des traitements dans des conditions proches de celles observées chez les patients. Bien que certaines des molécules étudiées soient actuellement évaluées chez l'Homme dans des essais cliniques, ces essais ont pour objectif principal de démontrer leur efficacité et ne permettent pas d'explorer de façon approfondie leurs mécanismes d'action. Le modèle souris permet la réalisation d'analyses invasives impossibles chez l’Homme (nous ne pouvons pas faire de biopsies hépatiques) mais indispensables pour caractériser les mécanismes d'action hépatiques de ces traitements.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’une méthode statistique permettant d’utiliser le plus petit effectif possible tout en garantissant des résultats fiables et exploitables. Ce calcul s’est appuyé sur la capacité à détecter des différences de glycémie lors d’un test évaluant la tolérance au glucose. Cette approche a conduit à retenir un effectif de 15 souris par groupe, soit le nombre minimal nécessaire pour répondre aux objectifs de l’étude tout en limitant l’utilisation d’animaux. Les données recueillies seront ensuite analysées à l’aide de méthodes statistiques adaptées afin de déterminer si les différences observées entre les groupes sont réelles et non dues au hasard.

Raffinement

L’état général et le comportement des animaux seront contrôlés trois fois par semaine. Le poids corporel sera mesuré individuellement une fois par semaine et la consommation alimentaire sera suivie pour chaque cage. Une surveillance renforcée sera mise en place au début des traitements ainsi qu’au cours des tests métaboliques. Les différents tests seront espacés d’une semaine afin de laisser aux animaux un temps de récupération suffisant. Une attention particulière sera portée aux animaux pendant les tests et dans les heures qui suivent. Les prélèvements sanguins seront réalisés en limitant au maximum les manipulations et les quantités de sang prélevées. Une anesthésie de la queue sera réalisée avant les prélèvements de sang. Les administrations de traitements par gavage ou par injection seront réalisées avec du matériel adapté et les plus petits volumes possibles. Les animaux seront systématiquement surveillés après chaque administration afin de détecter rapidement tout signe d’inconfort. Avant les mesures de composition corporelle, les animaux seront progressivement habitués au dispositif utilisé afin de réduire leur stress. En fin de procédure, les animaux recevront un traitement antidouleur puis une anesthésie profonde avant le prélèvement terminal, garantissant l’absence de douleur lors de cette intervention. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel formé et expérimenté afin de limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux. Des points limites précis, prédictifs et précoces ont été définis afin d’éviter toute souffrance et angoisse chez les animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé pour étudier l’obésité, le diabète de type 2 et la stéatose hépatique (« foie gras »). Son organisme présente de nombreuses similitudes avec celui de l’Homme pour ces maladies, ce qui permet d’obtenir des résultats pertinents pour la recherche biomédicale. De plus, une alimentation riche en lipides et en sucres permet de reproduire de manière fiable les principales caractéristiques de ces pathologies. Ce modèle est largement utilisé par la communauté scientifique ce qui facilite la comparaison des résultats. Les souris seront âgées de 5 semaines au début de l’étude. À cet âge, elles sont particulièrement sensibles aux effets d’une alimentation riche en lipides et en sucres. Ce choix permet de reproduire de manière fiable les principales caractéristiques de l’obésité, du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique observées chez l’Homme. Il est également conforme aux pratiques couramment utilisées dans la recherche scientifique.

Jusqu'à neuf gavages sur animal éveillé et huit prélèvements de fèces, chacun précédé de cinq minutes seule dans un pot transparent : 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour la collecte d'organes et de tissus. Le projet doit vérifier si des mélanges de bactéries intestinales mis au point par un partenaire industriel s'implantent dans l'intestin de la souris et y produisent les métabolites attendus. Le porteur décrit la souris comme un "modèle établi" pour la recherche sur le microbiote intestinal, d'une "pertinence démontrée pour la situation humaine", et retient des adultes de 8 à 12 semaines. Il ne retient comme atteintes que le stress des gavages et des prélèvements de fèces, plus une légère douleur à l'injection de l'anesthésique, pour un projet qu'il classe en souffrance modérée.

Objectifs

Ce projet vise le développement de technologies permettant d’accéder à l’ensemble de la diversité des bactéries intestinales en vue de concevoir un ensemble de souches bactériennes fonctionnelles pour des patients atteints de maladie métabolique et inflammatoire. Il cherche à traiter les déséquilibres des relations entre le microbiote et l’organisme de ces patients. L’objectif du projet est de vérifier l’implantation des bactéries dans le système intestinal de la souris et d’en évaluer la production métabolique

Bénéfices attendus

Les avancées scientifiques ont souligné le rôle des bactéries intestinales dans diverses maladies humaines. L'introduction de grandes quantités de bactéries intestinales non caractérisées chez des individus malades comporte des risques significatifs, soulignant l'urgence de développer des produits davantage définis, contrôlés et fonctionnels. Des mélanges de bactéries, soigneusement étudiés en laboratoire pour ressembler à une flore intestinale saine, pourraient aider à rééquilibrer un intestin perturbé et ouvrir la voie à des traitements efficaces et accessibles contre plusieurs maladies du système digestif. Pour comprendre comment y parvenir, des expériences sont nécessaires pour transposer nos résultats de laboratoire dans un modèle animal plus complexe. Les résultats de ce projet permettront de vérifier si les mélanges bactériens mis au point par le partenaire industriel remplissent leur fonction. A long terme, les résultats de ce projet permettront d’améliorer les performances des thérapies de restauration du microbiote chez les patients atteints de maladie métabolique ou inflammatoire de l’intestin.

Procédures

Les souris subiront les interventions suivantes : - Gavage (1 à 2 minutes) sur animal vigile, 9 fois au maximum au cours de l’expérimentation - Prélèvement de fèces (5 minutes) sur animal vigile, 8 fois au maximum au cours de l’expérimentation - Pesée des animaux (5 minutes), 4 fois au cours de l’expérimentation - Injection (1 minute) sur animal vigile, 1 seule injection pour anesthésier les animaux - Injection (1 minute) sur animal anesthésié, 1 seule injection pour l’analgésique local - Deux prélèvements sanguins (1 à 2 minutes) sur animal anesthésié, 1 seule fois

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress lors des gavages et lors des prélèvements de fèces (5 minutes de séjour dans le pot transparent). De plus, les animaux subiront un léger stress et une légère douleur lors de l’injection des anesthésiques.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte d’organes et de tissus pour des analyses métaboliques.

Remplacement

Actuellement, aucun autre modèle que l’animal n’existe pour caractériser l’implantation de microbiote complexe dans le système intestinal et en évaluer les effets sur les différents organes. Par contre, les données cliniques recueillies dans ce projet serviront à créer des modèles informatiques du système digestif et des microbes qui y vivent (modélisation in silico). Les microbes étudiés sont d’abord analysés en détail en laboratoire, ce qui permet de mieux comprendre comment ils interagissent entre eux et ce qui se passe lorsqu’on les associe différemment. Grâce à ces informations, les expériences sur les animaux peuvent être mieux préparées et le nombre de souris utilisées est ainsi réduit.

Réduction

Le nombre d'animaux requis a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation des résultats. Étant donné que ces expériences testent des effets encore peu documentés, elles comportent un niveau d'incertitude. Pour contrer cela, les calculs s'appuient sur des données publiées, permettant d'estimer les effets attendus. Pour les groupes témoins, le nombre de souris testées lors de ces expériences a été diminué et les données seront regroupées afin d’avoir des données statistiques fiables.

Raffinement

L’expérience commencera après une semaine d’acclimatation aux nouveaux groupes sociaux et aux nouvelles conditions environnementales. Il y aura une observation quotidienne des animaux depuis l’extérieur de leur cage, une observation individuelle et une pesée hebdomadaire à l’occasion des prélèvements fécaux, ainsi qu’une observation accrue dans les heures qui suivront les inoculations orales. Les animaux seront dans des cages standards à couvercle filtrant par groupe de 3 souris du même sexe. Du papier absorbant ou des nids de papier kraft à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des abris en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. Des points limites ont été déterminés dans ce projet et seront mis en place si besoin. De plus, avant les prélèvements sanguins en phase terminale, les souris seront placées sous anesthésie profonde. Des points limites adaptés sont définis et seront appliqués en cas de nécessité.

Choix des espèces

La souris est un modèle établi pour la recherche sur le microbiote intestinal, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des souris adultes âgés de 8 à 12 semaines. En effet, l’utilisation de souris à l’âge adulte garantit qu’elles ont dépassé les phases critiques du développement et que leurs systèmes immunitaire et hormonal sont relativement stables et matures, ce qui constitue une condition préalable à l’étude des différences liées au traitement.

Pour identifier le rôle d'un gène dans l'apparition de lésions précancéreuses du pancréas, 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Au stade souriceau, elles sont tatouées à la base des phalanges et amputées de moins de deux millimètres de queue pour le génotypage. À partir de cinq semaines, elles reçoivent quarante injections dans l'abdomen réparties sur neuf semaines, jusqu'à six par jour, destinées à déclencher les lésions et à en accélérer la progression. Les retombées annoncées, de nouvelles cibles thérapeutiques contre le cancer du pancréas, sont formulées au conditionnel, quand les lésions sont provoquées puis laissées se développer jusqu'à l'âge de quatre mois, soit environ un quart de la vie d'une souris.

Objectifs

La partie exocrine du pancr?as joue un r?le essentiel dans la digestion des aliments. Elle repr?sente la grande majorit? du pancr?as et est constitu?e principalement de cellules sp?cialis?es, appel?es cellules acineuses, qui produisent des enzymes digestives. Ces enzymes sont ensuite transport?es par les canaux pancr?atiques jusqu?? l?intestin afin de participer ? la digestion. La grande majorit? des cancers du pancr?as prennent naissance dans ces cellules exocrines, qui peuvent subir des modifications progressives les transformant en cellules canc?reuses. L?activation anormale d?un g?ne appel? KRAS est notamment l?un des premiers ?v?nements fr?quemment observ?s dans le d?veloppement de ce cancer. La pancr?atite chronique est une maladie du pancr?as caract?ris?e par une inflammation persistante et progressive de cet organe. Au cours de la maladie, cette inflammation entra?ne une perte des cellules acineuses ainsi que la formation de tissu cicatriciel (fibrose), ce qui perturbe progressivement le fonctionnement normal du pancr?as. Plusieurs facteurs peuvent ?tre responsables d?une pancr?atite chronique, notamment les calculs biliaires, la consommation d?alcool, le tabagisme ou certaines pr?dispositions g?n?tiques. Toutefois, un certain nombre de cas, aucune cause pr?cise n?est identifi?e. Les modifications du tissu pancr?atique observ?es lors d?une pancr?atite chronique peuvent favoriser l?apparition d?un cancer du pancr?as. Ce cancer, dont le nombre de cas augmente r?guli?rement, est l?un des plus agressifs. Son taux de survie ? 5 ans reste tr?s faible, principalement parce qu?il est souvent diagnostiqu? tardivement, lorsque les possibilit?s de traitement sont limit?es. Il est donc essentiel de mieux comprendre les m?canismes responsables de la pancr?atite chronique ainsi que les premi?res ?tapes qui conduisent au d?veloppement du cancer du pancr?as. L?objectif de ce projet de recherche est d??tudier le r?le d?un g?ne impliqu? dans le d?veloppement du cancer du pancr?as. Pour cela, nous utilisons des mod?les de souris permettant de d?sactiver ce g?ne de mani?re contr?l?e afin d??valuer son influence sur l?apparition des premi?res l?sions pouvant ?voluer vers un cancer. Ces travaux pourraient contribuer ? une meilleure compr?hension des ?tapes pr?coces de la maladie et permettre d?identifier de nouvelles cibles th?rapeutiques pour d?velopper de futurs traitements.

Bénéfices attendus

Ces mod?les de souris sont n?cessaires pour comprendre les causes de pr?disposition et de progression des l?sions pr?-canc?reuses pancr?atiques, ce qui a un int?r?t pour le d?veloppement de strat?gie de d?pistage et de strat?gie th?rapeutique du cancer du pancr?as.

Procédures

Les souriceaux sont marqu?s par tatouage ? la base des phalanges et un pr?l?vement d?un petit bout de queue (moins de 2 mm) est effectu? pour le g?notypage, c'est ? dire l'identification des modifications g?n?tiques induites chez chaque animal. La manipulation est tr?s rapide et n?induit pas de modification du comportement du souriceau, et la queue cicatrise tr?s rapidement ? ce stade. Les souris sont trait?es par injections au niveau de l?abdomen (1 fois par jour pendant 4 jours cons?cutifs ? l??ge de 5 semaines, puis 4 semaines apr?s elles sont inject?es 6 fois par jour pendant 2 jours cons?cutifs, puis 6 fois par jour 1 jour par semaine pendant les 4 semaines suivantes. La n?cessit? de ce nombre d'injection a ?t? ?tablie par des travaux de mise au point valid?s dans diff?rents laboratoires dans le monde). Ces injections servent ? induire les modifications g?n?tiques et ? favoriser le d?veloppement des l?sions pr?-canc?reuses pour ?tudier les causes de leur initiation et de leur progression.

Impact sur les animaux

Les souris sont trait?es par un certain nombre d?injections dans la cavit? p?riton?ale, au niveau de l?abdomen. Cela peut entrainer une l?g?re perte de poids le jour suivant l?injection. Les souris vont d?velopper des l?sions microscopiques pr?-canc?reuses au niveau du pancr?as. Les souris sont euthanasi?es pr?cocement pour l?analyse de ces l?sions avant le stade de cancer.

Devenir

Les animaux de la proc?dure sont euthanasi?s pour des analyses effectu?es sur le pancr?as (visualisation et ?tudes de mol?cules) afin d??tudier les l?sions pr?canc?reuses.

Remplacement

Les connaissances issues de cette ?tude sur l?animal ne peuvent pas ?tre actuellement obtenues par d?autres m?thodes compte-tenu de la complexit? physiologique du d?veloppement des l?sions pr?canc?reuses, nous obligeant ? travailler ? l'?chelle d'un organisme. Des ?tudes in vitro sur des cellules et des "mini-organes" en culture ou issus de pr?l?vements de l?sions humaines sont ?galement possibles en compl?ment mais ne peuvent pas remplacer cette ?tude avec ce mod?le physiologique. Les retomb?es de ce travail sont utiles du point de vue des implications th?rapeutiques ? terme chez l'homme.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal de souris, determin? par des r?sultats obtenus pr?c?demment et dans les publications scientifiques pour ce type d?analyse, et qui permet d'obtenir des r?sultats statistiques permettant la validation de l'?tude.

Raffinement

Les m?thodes et les mesures choisies visent ? diminuer au maximum les contraintes impos?es aux animaux. Les souris sont plac?es dans des conditions optimales d'?levage, en portoirs ventil?s. Les souris sont 5 individus par cage au maximum pour avoir assez de place dans la cage sans pour autant ?tre isol?s car ce sont des animaux gr?gaires. La temp?rature, l'hygrom?trie, la nourriture et l'eau sont contr?l?es tous les jours. En plus de la liti?re, les cages sont enrichies avec des cotons et des petits abris. Une surveillance quotidienne du personnel de l'animalerie et un suivi r?gulier de l'exp?rimentateur (au moins 1 fois par semaine) avec la prise en compte de diff?rents ?l?ments bien d?finis tels que l'aspect du pelage et des yeux, le poids et le comportement des souris permet d'?viter toute souffrance des animaux. Nos analyses sont pr?coces et concernent les phases de l?sions pr?-canc?reuses. Les souris sont euthanasi?es pour analyse avant de d?velopper un cancer.

Choix des espèces

Les souris modifi?es g?n?tiquement sont largement utilis?es dans l'?tude des m?canismes physiopathologiques de pathologie humaine. L?objectif du projet est d??tudier le d?veloppement et l??volutivit? de l?sions pr?-canc?reuses pancr?atiques gr?ce au mod?le de souris et d?identifier de nouvelles cibles th?rapeutiques. Les souris seront utilis?es ? l??ge de 5 semaines car au tout d?but de l??ge adulte. On laisse les l?sions pr?- canc?reuses se d?velopper dans ce mod?le de souris jusqu?? l??ge de 4 mois (ce qui correspond ? environ 1/4 de la dur?e de vie de la souris). Cela permet d??tudier l?impact de notre g?ne d?int?r?t dans l?initiation et la progression de ces l?sions pr?canc?reuses.

Inspectées et pesées deux à trois minutes par semaine pendant huit semaines à partir de quatre mois, soumises à contention lors de prélèvements de matières fécales, 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'inactivation de certains gènes doit leur donner des polypes intestinaux, avec anémie, saignements intestinaux et risque de perte de poids, pour obtenir des lignées qui développent d'elles-mêmes des micro-tumeurs de l'intestin. Le devenir compte 680 souris tuées, quand le porteur écrit que les animaux ayant servi à la reproduction ou dépourvus des combinaisons de gènes recherchées seront "en priorité mis à disposition à des fins pédagogiques", ou tués. Les procédures décrites s'arrêtent à l'inspection, à la pesée et aux prélèvements fécaux, sans que le porteur précise ce que subissent les souris dont les polypes progressent, ni ce que couvre l'usage pédagogique annoncé.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à comprendre le rôle de différents gènes dans les toutes premières étapes de la formation de tumeurs intestinales. A ce titre, nous développerons des lignées de souris génétiquement modifiées développant de manière spontanée des micro tumeurs intestinales, mimant la maladie humaine. Ce projet de création de lignées sera accompagné d’un protocole d’élevage et de suivi adapté.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de disposer de nouveaux modèles d’études valorisables dans le cadre de la lutte contre le cancer colorectal, touchant de nombreuses personnes dans les pays occidentaux. L’exploitation de ces modèles permettront de découvrir de nouveaux éléments clefs dans la prise en charge de l’inflammation et son impact dans la formation des tumeurs.

Procédures

Les animaux, à partir de 4 mois d’âge, seront régulièrement inspectés et pesés (2-3 minutes par semaine, durant 8 semaines). Les animaux seront soumis à contention lors de prélèvements fécaux, et manipulés lors des phases de mises en accouplement et de leur suivi.

Impact sur les animaux

L'inactivation de certains gènes conférera une susceptibilité accrue des animaux à la formation de polypes intestinaux, avec apparition de signe d’anémie, et risque de perte de poid et de saignements intestinaux.

Devenir

Les animaux, après utilisation pour reproduction, ou ne possédant pas les combinaisons de gènes souhaités seront en priorité mis à disposition à des fins pédagogiques ou euthanasiées.

Remplacement

La question centrale de notre projet implique de comprendre les interactions entre les microbes, les cellules intestinales et le système immunitaire dans le cadre de la formation du tumeurs digestives. A ce jour, les alternatives utilisant des cultures de cellules ne permettent pas de reproduire un tel niveau de complexité. Dans ce contexte, le modèle animal représente notre seule alternative

Réduction

Nous avons, sur la base de données précédemment acquises, et grâce à une approche statistique robuste, pu déterminer le nombre minimum d’animaux requis pour permettre d’obtenir des données interprétables.

Raffinement

Nous avons mis en place un mode de suivi adapté à nos procédures, consistant en une surveillance accrue des individus lors des phases de vieillissement, accompagné d’une grille de suivi reprenant les paramètres physiologiques les plus pertinents à mesurer. L’utilisation de points limites adaptés nous permettra de rapidement stopper l’expérience en cas d’atteintes de critères d’arrêts, et réduire toutes nuisances aux animaux.

Choix des espèces

La souris possède de nombreuses similitudes avec l’homme en termes de biologie digestive, et cette espèce permet d’inactiver certains gènes d’intérêts. Les animaux seront utilisés à partir de 5 à 6 semaine, lorsque le système digestif arrive à maturité.