Système gastrointestinal

Soumis à une ulcération du côlon provoquée par l'introduction d'un agent chimique sous anesthésie, 64 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tandis que 16 rats témoins reçoivent une substance neutre dans les mêmes conditions. Les 80 rats sont mis à jeun douze heures avant l'induction, puis gavés quotidiennement pendant six ou vingt et un jours, et tous sont tués pour prélever leur côlon. Le porteur écrit qu'aucun traitement antidouleur ne pourra leur être administré, puisqu'il interférerait avec l'évaluation des deux substances anti-inflammatoires testées. Il annonce un test comportemental de cinq minutes en fin de protocole pour mesurer la douleur ressentie, sans préciser lequel ni quels paramètres y sont relevés.

Objectifs

La colite ulcéreuse ou rectocolite hémorragique (RCH) fait partie des deux principales maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) avec la maladie de Crohn, et affecte l'extrémité du tube digestif, côlon et rectum. La colite ulcéreuse se classe parmi les maladies inflammatoires parce qu'elle occasionne une inflammation, des plaies, des saignements et une déstructuration sur les parois internes du côlon. L’inflammation s’accompagne de la formation d’ulcères pouvant saigner et produire du mucus ou du pus. Les personnes atteintes de colite ulcéreuse doivent être attentives au risque d’anémie car lorsque la maladie est grave, les pertes de sang peuvent être abondantes, pertes que l’on peut compenser grâce à des suppléments en fer. Des facteurs génétiques et environnementaux influenceraient l’apparition de cette maladie. Le stress et les intolérances alimentaires peuvent déclencher les symptômes chez certaines personnes, mais ces facteurs ne seraient pas à l’origine de la maladie. Des complications liées à l’usage à long terme de certains médicaments peuvent survenir (ostéoporose, cataracte, hypertension, diabète...), médicaments qui peuvent aussi augmenter le risque d’infection. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de 2 substances pharmaceutiques ayant des propriétés anti-inflammatoires et antalgiques, administrées par voie orale à 2 doses en traitement préventif pour l’une, et en traitement curatif pour l’autre, chez des rats soumis à l’induction d’une ulcération colique. Les effets observés seront comparés à ceux obtenus chez des rats traités avec un placebo ou avec un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence. A l’issue de l’étude, les rats seront euthanasiés et le colon et la matière fécale qu’il contient seront prélevés pour la réalisation d’analyses biologiques.

Bénéfices attendus

La réalisation de cette étude va permettre d’évaluer les effets de 2 substances pharmaceutiques à 2 doses différentes, l’une en traitement préventif et l’autre en traitement curatif, chez le rat soumis à l’induction d’une ulcération colique expérimentale, et de comparer ces effets avec un placebo et un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence utilisé pour le traitement de la colite ulcéreuse. Les données des différents paramètres suivis au cours de l’expérimentation, poids corporel, prises alimentaire et hydrique, ainsi que les données comportementales relévées quotidiennement concernant l’activité, la posture, l’aspect de la fourrure et l’ouverture des yeux dans la cage d’habitation, l’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation pour mesurer l’activité exploratoire, et les analyses biologiques qui seront effectuées sur le colon et la matière fécale prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets bénéfiques ou non de traitements préventifs et curatifs avec ces 2 substances pharmaceutiques sur ses activités anti-inflammatoire intestinale et antidouleur chez le rat. Cela permettrait d’envisager la réalisation d’une étude clinique chez l’Homme avec l’une et ou l’autre de ces 2 substances pharmaceutiques, et à terme de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de la colite ulcéreuse.

Procédures

Les 80 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront placés à jeun pendant 12 heures avant l’induction de l’ulcération colique. L’ulcération colique sera induite par administration dans le colon d’une substance chimique permettant l’induction de cette pathologie. Elle sera effectuée sur 64 des 80 rats placés sous anesthésie générale et nécessitera environ 40 minutes pour être réalisée. Les 16 autres rats ne subiront pas l’induction de l’ulcération colique mais ils seront également placés sous anesthésie générale pendant 40 minutes environ et recevront une administration de substance neutre dans le colon. Avant ou après induction de l’ulcération colique, un traitement par voie orale avec les 2 substances pharmaceutiques à évaluer sera effectué quotidiennement pendant 21 ou 6 jours sur les animaux éveillés, geste effectué en moins d’1 minute par une personne expérimentée. Un test comportemental sera effectué à la fin de l’expérimentation pour évaluer la douleur ressentie par les animaux. Chaque rat sera placé pendant 5 minutes dans un dispositif expérimental permettant d’évaluer plusieurs paramètres comportementaux.

Impact sur les animaux

La mise à jeun des animaux la veille au soir de l’induction de l’ulcération colique, pendant une durée de 12 heures, nécessaire pour que l’ensemble des animaux soient dans les mêmes conditions physiologiques et que leur colon soit vide de matière fécale, va induire une légère perte de poids des animaux. L’induction de l’ulcération colique va quant à elle induire un inconfort des animaux et une douleur ressentie notoires, se traduisant par une perte de poids modérée liée à une diminution de la prise alimentaire, voire également de la prise hydrique, et des modifications du comportement des animaux avec une activité moindre, une posture plus prostrée, une fourrure plus hérissée et des yeux moins ouverts, ainsi qu’avec une diminution de l’activité exploratoire. L’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation par la mise en place des animaux individuellement dans un dispositif expérimental pendant 5 minutes, va engendrer un stress modéré des animaux par l’isolement et la perte des interactions sociales entre congénères durant ce laps de temps.

Devenir

A l’issue de chacune des 2 procédures expérimentales, les 80 rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de du colon et de la matière fécale contenue dans celui-ci pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.

Remplacement

Des études préliminaires effectuées in vitro sur des cultures de cellules intestinales ont permis de sélectionner ces 2 substances pharmaceutiques ayant démontré les effets anti-inflammatoires les plus probants. Nous souhaitons donc maintenant confirmer ces effets anti-inflammatoires dans un modèle bien caractérisé de colite ulcérative. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer les effets de substances pharmaceutiques sur l’inflammation intestinale qui est un processus complexe impliquant le système digestif, le système immunitaire et le microbiote intestinal, et sur l’évaluation comportementale. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de colite ulcérative ayant montré des effets "forts" de traitements sur l’inflammation intestinale générée, l’évolution pondérale et les paramètres comportementaux évalués dans un test comportemental spécifique à la fin de la période de traitement. Nous utiliserons ainsi 8 animaux par groupe expérimental pour chacune des 2 études en traitement préventif et curatif. A l’issue des expérimentations, une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles avec un enrichissement adapté, et ils auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l’induction de la colite ulcérative, lors de la réalisation des traitements et la réalisation de l’évaluation comportementale. Les animaux seront observés plusieurs fois par jour tout au long de l’expérimentation par du personnel qualifié, week-end et jours fériés inclus. Un suivi régulier et/ou quotidien de leur poids et de leurs consommations alimentaire et hydrique sera effectué tout au long de l’expérimentation, de même qu’une observation spécifique de leur comportement dans leur cage pour évaluer le niveau de douleur ressentie au travers de l’observation de leur activité, de leur posture, de l’état de leur fourrure et de l’ouverture de leurs yeux. Cela permettra ainsi d’évaluer l’effet antidouleur de chaque substance pharmaceutique testée sur la pathologie induite et de la comparer à celui des autres groupes de traitement. L’évaluation de la douleur ressentie se fera également par la réalisation d’un test comportemental 24 heures après le dernier traitement oral et juste avant leur euthanasie, pour évaluer l’activité exploratoire des animaux au travers de différents paramètres. Le but de cette étude étant d’évaluer les effets anti-inflammatoires des 2 substances pharmaceutiques qui seront testées, il ne sera pas possible d’administrer de traitement antidouleur qui interférerait avec les résultats de l’étude et leur interprétation. Cependant, la surveillance de points limites définis permettra d’isoler voire d’exclure éventuellement des animaux avec une prise en charge en conformité avec les recommandations éthiques.

Choix des espèces

Le rat est un modèle très utilisé pour les études dans le domaine de l’inflammation et notamment le modèle d’ulcération colique induit par l'agent chimique utilisé qui est reconnu par la Communauté Scientifique Internationale. C'est donc l’espèce animale la plus appropriée pour ce type d’étude. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 6 à 9 semaines et d’un poids de 175-250 g à l’arrivée au laboratoire pour les 2 études à réaliser, correspondant à l’âge et au poids de rats que nous utilisons pour la réalisation d’expérimentations sur ce modèle de colite ulcérative. Lors de l’induction de l’ulcération colique pour les 2 études à réaliser, tous les animaux auront ainsi le même âge, 9-10 semaines, et environ le même poids, 250-275 g, conditions expérimentales que nous avons validées sur ce modèle de colite ulcérative avec des rats de cet âge et de ce poids.

Incision chirurgicale de la patte, injection d'une solution inflammatoire sous la voûte plantaire, implantation d'électrodes puis distension du côlon par un ballon gonflable, l'animal maintenu une heure dans un tube de contention : 4 032 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dont 1 824 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Il s'agit d'établir le rôle d'un récepteur dont la fonction reste inconnue dans la douleur et l'inflammation intestinales. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou saignent abondamment dans leurs selles sont retirées et tuées. Le porteur qualifie de "peu invasifs" les protocoles de mesure du transit, qui comprennent l'introduction dans le côlon d'une bille de la taille d'une fèces.

Objectifs

Nous avons récemment identifié le récepteur MrgprE comme un récepteur orphelin exprimé à la fois par les neurones sensoriels, les neurones du système nerveux entérique, certaines cellules immunitaire et épithéliales intestinales chez la souris. La fonction de ce récepteur dans l'intestin et l’hypersensibilité somatique et viscérale reste inconnue que ce soit dans un contexte physiologique ou pathologique. L'objectif général de ce projet est donc d'étudier le rôle de MrgprE dans la physiologie, l'inflammation et la douleur somatique et intestinale (du fait de son expression dans le tractus digestif et les neurones sensitifs).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de découvrir la biologie d'un nouveau récepteur : MrgprE, et de décrypter son implication dans le processus de la douleur et de l'inflammation intestinale. La prise en charge de la douleur repose actuellement sur des médicaments qui ont des effets secondaires, notamment les dérivés des opioïdes qui induisent une habituation et une dépendance. Par conséquent, MrgprE pourrait constituer une cible pharmacologique intéressante pour remplacer les traitements actuels dela douleur mais aussi de l'inflammation intestinale.

Procédures

Les animaux seront smousi à: 1) Chrirurgie d'incision plantaire (5minutes par chirurgie) puis test d'hypersenibilité à 24h, 48 et 96h après opération 2) Injection intra plantaire sous cutanée de solution induisant l'inflammation sous anesthésie gazeuse (10 secondes par injection) puis test d'évaluation de l'hypersensibilité tous le jours pendant 4 jours. 3) Chirurgie d'implantation des électrodes (sous anesthésie et analgésie, délivré par voie intrapéritonéale, durée 2 secondes), durée de la chrirurgie d'envrion 20 minutes par souris. Hébergement en cage individuelle pendant trois jours après la chirurgie. Pour le test de comportement, les souris seront mises en contention dans des tubes et l'expérimentation durera 1 heure. 4) les souris seront gavées avec les différentes solutions de suivi du transit (temps de gavage de 5 secondes par souris), et l'insertion de la bille dans le colon se fera sous anethésie gazeuse et l'opération prendra 5 secondes. 5) L'injection des agonistes/antgonistes se fera en par voie intrapéritonéale et durera 2 secondes par injection.

Impact sur les animaux

- Les souris mutantes utilisées ne présentent à notre connaissance pas de défauts de comportement, ni de déficiences immunitaires ni de létalité à l’état basal. -Les protocoles utilisés pour évaluer les temps de transit sont peu invasifs (gavage ou introduction d'une bille de la taille d’une fèces dans le colon) et seront conduits par des personnes expérimentées. La manipulation pouvant cependant générer un stress pour les souris, elles seront dès que possible anesthésiées à l'isoflurane pour minimiser leur stress pendant les procédures. -Les modèles d’inflammation somatique (incision plantaire et solution d’activation de l’inflammation) causeront un stress et une douleur de la patte chez l’animal et peuvent occasionner une boiterie. De ce fait, pour chacun des modèles, l’état général (mobilité, toilettage, sociabilité avec les autres animaux de la cage) et le poids seront suivit quotidiennement. Si jamais un animal perd plus de 20% de son poids initial, présente un état général non satisfaisant (immobilité, absence de toilettage, absence d'interactions), il sera écarté de l'expérience et euthanasié pour minimiser ses souffrances. -L'induction de l'inflammation colique par la solution d’activation de l’inflammation et la chirurgie causeront un stress chez l'animal. Celui-ci sera cependant suivit quotidiennement pour évaluer son état général (mobilité, toilettage, sociabilité avec les autres animaux de la cage), son poids, ainsi que la consistance de ses féces et la présence de sang dans les selles. Si jamais un animal perd plus de 20% de son poids initial, présente un état général non satisfaisant (immobilité, absence de toilettage, absence d'interactions), ou qu'il présente des saignements abondant dans les selles (nettement visible à l'œil nu), il sera écarté de l'expérience et euthanasié pour minimiser ses souffrances. - Lors de la chirurgie nécessaire à l'implantation des électrodes pour la mesure de la sensibilité viscérale, les animaux pourront décéder suite à l'anesthésie ou à la chirurgie. Suite à la chirurgie, les animaux pourront avoir une perte de poids et de la douleur. Lors de la distension colorectale, les animaux pourront être sujet à un stress dû à la contention de l'animal dans un tube, à la mise en place de la sonde et au gonflement du ballon. L'animal pourra aussi ressentir de la douleur viscérale lors de l'expérimentation.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasié à la fin de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements tissulaires post-mortem.

Remplacement

Ce projet vise à étudier l'effet du récepteur MrgprE sur l’inflammation et la douleur somatique et intestinale chez la souris. Il n'existe pas à ce jour de modèle cellulaire satisfaisant qui puisse rendre compte de la diversité des interactions étudiées dans le contexte de ce projet. Devant la complexité de ces phénomènes, due notamment à l’implication de différents organes et types cellulaires, le recours aux modèles animaux est indispensable. De ce fait, les modèles de souris sont des éléments clés et incontournables pour étudier le rôle du récepteur MrgprE sur les phénomènes étudiés.

Réduction

Une veille bibliographique est/sera effectuée pour éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d'autres équipes. Les croisements des souris, notamment les croisements incluant des souris Cre, seront réalisés de telle façon que toute la descendance soit utilisée lors des manipulations (contrôle et animaux d’intérêt issu de la même portée). Le nombre d'animaux (12 souris par groupe) a été consciencieusement établit avec le minimum nécessaire pour l'obtention de résultats statistiquement significatifs (en prenant en compte la variabilité interindividuelle). Nous avons déterminé le nombre d'animaux par lot en utilisant une analyse de puissance statistique.. Cela nous a permis de déterminer qu'un minimum de 12 animaux par lot est nécessaire pour détecter des différences significatives entre les groupes expérimentaux, en raison de la variabilité inter-individuelle présente dans les différents modèles utilisés.

Raffinement

Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, le souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. Les souris seront hébergées à maximum 5 par cages en portoir ventilé dans un environnement contrôlé . L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour. Pour chaque procédure des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Lors de la procédure chirurgicale nécessaire pour mesurer la sensibilité viscérale des souris, un mélange de produits analgésiants et anesthésiants sera utilisé comme anesthésie et le souris seront mise sur tapis chauffant pendant la procédure chirurgicale. Un anti-inflammatoire sera utilisée comme analgésique en phase post-opératoire. Tout au long de la vie des animaux, si nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine, ou bien un comportement apathique, des plaies trop importantes (due aux altercations courantes chez les mâles) ou la présence de dents longues ou de prolapsus, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les méthodes alternatives, permettant une évaluation de l’inflammation et de la douleur ne sont pas développées à l’heure actuelle, du fait que la douleur et l'inflammation sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à ce jour à reproduire in vitro dans leur intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques dans l’inflammation et la douleur qui représentent des problèmes de santé publique. Enfin, tous les animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont disponibles chez la souris et sont déjà dans le laboratoire. Les animaux seront utilisés entre 8 et 16 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.

Irradiées trois fois au niveau du côlon sous anesthésie, à deux ou trois jours d'intervalle, puis traitées par jusqu'à vingt-cinq injections, 1 248 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 1 094 d'entre elles et sévère pour 154. Toutes sont tuées à l'issue pour le prélèvement des tissus coliques. Le projet porte sur les séquelles intestinales tardives des radiothérapies pelviennes et sur ce qu'y ajoute l'immunothérapie, en irradiant des tissus sains. Le porteur écrit qu'à cette dose les animaux ne perdent pas de poids, et indique quelques lignes plus loin qu'environ 20 % d'entre eux meurent avant la date prévue de mise à mort dans le protocole à douze semaines.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au niveau du côlon qui sont responsables des séquelles tardives des irradiations de la zone pelvienne occasionnés par la radiothérapie et la combinaison de traitements d’immunothérapie et radiothérapie.

Bénéfices attendus

La radiothérapie externe est l’un des traitements incontournables dans la prise en charge des cancers (60% des patients en bénéficient). L’objectif est la recherche d’un compromis entre le contrôle du volume de la tumeur et les dommages aux tissus sains, situés autour de la tumeur. En effet, l’irradiation des tissus sains de la zone pelvienne entraîne de nombreux effets toxiques au niveau de certains organes tels que le côlon, le rectum ou l’intestin grêle dits « organes radiosensibles » du fait d’une forte capacité d’auto-renouvèlement des cellules et aussi d’une forte sensibilité aux rayonnements ionisants. La toxicité radio-induite du tissu intestinal peut entrainer chez certains patients des séquelles à long terme, altérer fortement la qualité de vie du patient voire même dans les cas les plus sévères engager son pronostic vital. L’ensemble et la complexité des séquelles induites suite à une radiothérapie pelvienne ont amené à la définition d’une nouvelle maladie, la « Pelvic Radiation Disease » ou PRD. Aujourd’hui, les traitements combinés, radiothérapie et immunothérapie, par l’utilisation d’inhibiteur de checkpoint, ont montré des bénéfices majeurs dans certains cas de cancers. Ce projet étudiera les conséquences de ces traitements sur le développement des lésions à court et long terme.

Procédures

Les animaux seront irradiés localement sous anesthésie : 3 irradiations de 7-8 min à deux ou trois jours d’intervalle (soit 10 min d’anesthésie au maximum). Pour chaque irradiation, les animaux sont transférés sur la plateforme (5 min aller, 5 min retour). Les souris recevront un traitement par injection (produit aqueux) 3 fois par semaine pour le protocole aigu (soit 6 injections maximum) et 2 fois par semaine pour le protocole tardif (soit 25 injections maximum).

Impact sur les animaux

Suite à l’irradiation locale du côlon en dose fractionnée, certaines souris vont présenter une dépilation au niveau de la zone d’irradiation et d’autres uniquement une décoloration des poils. A cette dose, les animaux ne perdent pas de poids. Pour le temps d’étude tardif (12 semaines) certains animaux peuvent décéder juste avant la date d’euthanasie. Les expériences précédentes montrent un taux de décès d’environ 20% selon les lots d’animaux. Les injections nécessitent une piqure pouvant entrainer une douleur légère et de courte durée. Ces actes seront réalisés dans le respect des bonnes pratiques. Il n’est pas attendu d’effet secondaire des produits administrés.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires indispensables aux analyses ultérieures.

Remplacement

Le développement des séquelles coliques nécessite l’interaction entre différents compartiments tissulaires (vasculaire, stromal, inflammatoire et épithélial), conditions retrouvées chez le modèle animal intégré. A ce jour, il n’existe pas d’alternative au modèle animal pour étudier les processus physiopathologiques des séquelles des radiothérapies pelviennes. Ce projet in vivo chez l’animal sera complété par des analyses chez l’homme dans le cadre d’une étude clinique cognitive de ce projet financé et par des analyses in vitro sur des organoïdes issus de colon de souris.

Réduction

Les modèles d’expérimentation pour l’étude tardive des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques, cellulaires et moléculaires des groupes de 10 à 20 animaux sont nécessaires en fonction du modèle et des mesures réalisées. Des tests statistiques seront réalisés afin de comparer tous les groupes entre eux.

Raffinement

Différentes mesures spécifiques sont prises pour réduire au maximum l’impact sur le bien-être des animaux - Hébergement en petit groupe (3 animaux par cage) avec enrichissement (coton et igloo en carton) - Observation quotidienne des animaux suivi du comportement et de leur aspect physique (aspect du poil, mobilité, prostration, pesée) - Pesée hebdomadaire (voire plus fréquente aux temps tardifs) - Mise à disposition des animaux, si besoin, de poches d’eau gélifiée (avec ou sans vitamines) et/ou croquettes humides selon l’état général de l’animal - Mise en place d’une ceinture pour limiter les risques d’irradiation de zone radiosensible.

Choix des espèces

Les modèles d’irradiation chez la souris permettent de reproduire des lésions colorectales et similaires à celles que l’on peut observer chez des patients ayant des séquelles graves des radiothérapies pelviennes. De nombreux outils pour les études moléculaires sont disponibles chez la souris. Pour reproduire la pathologie humaine, des animaux au stade jeune adulte sont utilisés (12 semaines).