Système gastrointestinal

Une partie des animaux témoins sera réintégrée en hébergement pour être réutilisée dans une autre phase du projet, dont le porteur demande la prolongation après une suspension imprévue des expériences. 1 293 souris et 95 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués pour collecter des organes ou vérifier la tolérance des produits. Les nanoparticules sont administrées par gavage, par voie rectale ou dans la veine de la queue, une même souris pouvant passer onze fois en une semaine sous anesthésie gazeuse pour l'imagerie, tandis qu'une colite est provoquée chez d'autres, avec perte de poids et troubles digestifs. Le porteur classe la nuisance des nanoparticules comme "inconnue a priori" et présente le choix du rat, dont on peut prélever davantage de sang, comme une mesure de raffinement.

Objectifs

L’objectif du projet est la mise au point d’un outil thérapeutique innovant, afin d’accroitre l’arsenal thérapeutique et d’améliorer l’efficacité de prise en charge des MICI. Pour répondre à cet objectif, trois nouveaux systèmes d'ingénierie constitué des nanoparticules capables de cibler la muqueuse intestinale enflammée ont été développés. Dans le cadre de notre projet d’expérimentation animale initial, nous souhaitons solliciter une extension de sa durée afin de poursuivre nos travaux dans des conditions optimales. Les résultats obtenus jusqu’à présent sont prometteurs et nécessitent une prolongation pour approfondir nos analyses et garantir la robustesse des données. Cette demande est motivée par un imprévu indépendant de notre volonté, ce qui a entraîné une suspension complète des expérimentations et un bouleversement du planning initial. Afin de garantir la cohérence et la qualité scientifique de l’étude, il est essentiel de prolonger la durée du projet pour achever les manipulations prévues et recueillir les données nécessaires. Cette extension ne modifiera pas le protocole expérimental et s’inscrit dans le respect strict des principes éthiques en vigueur, notamment ceux des 3R (Réduction, Raffinement, Remplacement), et n’engendrera pas d’augmentation du nombre d’animaux utilisés.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer un outil thérapeutique innovant pour améliorer la prise en charge des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), pathologies pour lesquelles les options thérapeutiques actuelles restent limitées et associées à des effets secondaires importants.Ce projet vise à développer un outil thérapeutique innovant pour améliorer la prise en charge des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), pathologies pour lesquelles les options thérapeutiques actuelles restent limitées et associées à des effets secondaires importants.

Procédures

Les animaux inclus dans ce projet seront soumis aux interventions suivantes, selon les phases expérimentales : Administrations des produits : les systèmes testés seront administrés par voie orale (gavage), rectale ou intraveineuse (injection dans la queue). Chaque administration dure entre 1 et 2 minutes. Ces interventions peuvent être répétées une ou plusieurs fois sur quelques jours. Imagerie in vivo (souris uniquement) : certaines souris recevront des produits marqués afin de permettre des acquisitions d’imagerie sous anesthésie gazeuse, d’une durée de 5 à 15 minutes. Un même animal pourra être suivi jusqu’à 11 fois sur une semaine, ou faire l’objet d’une acquisition unique juste avant euthanasie. Prélèvements sanguins (rats uniquement) : jusqu’à 2 à 3 prélèvements par animal seront réalisés, d’une durée de 1 à 2 minutes chacun. La durée globale de participation des animaux varie selon les phases, allant de quelques heures à environ dix jours, avant un retour en hébergement ou une euthanasie planifiée selon les objectifs de l’étude.

Impact sur les animaux

Certaines interventions prévues dans ce projet peuvent entraîner les nuisances suivantes : Gavage oral : nuisance légère, liée à une contention courte et un inconfort transitoire. Administration rectale : nuisance légère à modérée, en fonction de la sensibilité individuelle. Injection intraveineuse (queue) : nuisance modérée, due à la contention et au geste technique. Imagerie sous anesthésie répétée (jusqu’à 11 fois/semaine) : nuisance modérée, liée à l’exposition répétée à l’anesthésie gazeuse. Modèle inflammatoire intestinal : nuisance modérée à sévère, associée à une perte de poids, troubles digestifs et altération de l’état général. Prélèvements sanguins chez le rat (2 à 3 fois) : nuisance légère à modérée, selon le volume prélevé et la fréquence. Administration de produits faiblement radioactifs : nuisance légère, sans effet clinique attendu. Administration de nanoparticules expérimentales : nuisance inconnue a priori, potentiellement modérée en raison de leur formulation, nécessitant une surveillance adaptée.

Devenir

À l’issue de chaque phase expérimentale, les animaux seront traités comme suit : Animaux ayant reçu des administrations (orale, rectale, intraveineuse) : → Euthanasiés en fin d’étude pour collecte d’organes, sauf si réutilisation possible dans une phase compatible du projet. Souris incluses dans les phases d’imagerie : → Euthanasiées en fin de suivi pour analyses ex vivo ou histologie. Souris incluses dans le modèle inflammatoire : → Euthanasiées à la fin de la période de suivi, pour analyses tissulaires et/ou dosages. Rats ayant reçu des prélèvements sanguins : → Euthanasiés en fin de protocole, une fois les prélèvements terminés, pour analyses complémentaires ou vérification de tolérance. Animaux témoins non traités ou inclus dans des phases courtes sans effet attendu : → Réintégrés en hébergement si leur état est jugé compatible et s’ils peuvent être réutilisés dans une autre phase du projet, conformément à la réglementation.

Remplacement

Le développent des nouveaux médicaments à base des nanoparticules nécessite une évaluation in vivo chez le petit animal en complément des études in vitro, pour déterminer leurs affinités pour la cible et pour étudier leurs comportement/devenir in vivo (biodistribution), ses paramètres pharmacocinétiques, son éventuelle toxicité ainsi que leurs efficacités. En outre, l’acquisition de donnes précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. Le modèle de pathologie d'inflammation d'intestin sur souris est déjà bien établi, mime au mieux les pathologies ciblées et nous permettra d’acquérir les données nécessaires pour faire la preuve de l’efficacité thérapeutique et la non-toxicité de nos candidats médicaments

Réduction

Le projet a été conçu de manière à limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse et la pertinence des résultats scientifiques. La stratégie expérimentale repose sur une organisation séquentielle des procédures, permettant une prise de décision éclairée à chaque étape du projet. Ainsi, si une étape révèle une absence de ciblage, une toxicité inattendue ou une efficacité insuffisante, les phases suivantes ne seront pas engagées, ce qui permet d’éviter l’utilisation inutile d’animaux. La phase 1, qualitative, vise notamment à identifier les temps pertinents pour les phases ultérieures. En sélectionnant a posteriori un nombre réduit de points temporels (maximum 8) pour les phases 2 et 3, cela permet d’éviter un design trop exhaustif et d’éliminer les temps peu informatifs. Le recours à l’imagerie non-invasive (CCD et SPECT/CT) dans les phases 1 et 2 permet également de suivre la distribution des systèmes chez un même animal au fil du temps (phase 1), réduisant ainsi le nombre de sujets nécessaires à l’analyse cinétique. Dans les phases quantitatives (phases 2 et 3), le recours à l’espèce rat a été privilégié pour les études pharmacocinétiques. Cette espèce, mieux adaptée aux volumes de prélèvements sanguins, permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des courbes précises, en regroupant plusieurs temps sur un même individu, là où cela est autorisé par les recommandations éthiques. Par ailleurs, des outils statistiques ont été utilisés en amont pour calculer le nombre d’animaux nécessaires à la détection d’un effet significatif, sur la base des écarts-types obtenus lors d’études pilotes et des modèles cellulaires. Des effectifs minimums par groupe ont ainsi été définis, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour répondre aux objectifs du projet. Enfin, aucun doublon n’est prévu entre les études : chaque phase répond à des objectifs distincts (profil de distribution, cinétique, efficacité), ce qui évite les redondances expérimentales et limite l’usage excessif d’animaux.

Raffinement

L’ensemble des procédures expérimentales prévues dans ce projet a été élaboré en tenant compte des principes de raffinement, afin de minimiser la douleur, le stress et la détresse des animaux tout au long de l’étude. Chaque technique d’administration a été choisie et adaptée pour limiter les nuisances : la voie orale est peu invasive, la voie rectale est réalisée avec des volumes modérés, et la voie IV est pratiquée uniquement par des opérateurs formés pour garantir rapidité et efficacité, évitant les manipulations prolongées. Les anesthésies nécessaires aux acquisitions d’imagerie (CCD et SPECT/CT) seront réalisées à l’isoflurane, un agent à induction et récupération rapide. Un plateau chauffant à 37°C sera utilisé pendant toute la durée de l’imagerie pour éviter l’hypothermie, et les yeux des animaux seront protégés par un gel ophtalmique. Après chaque anesthésie, les animaux seront placés en cage chauffée et surveillés jusqu’au réveil complet. Les modèles pathologiques sont bien maîtrisés et les signes cliniques (perte de poids, selles, comportement) seront suivis quotidiennement. Une grille d’évaluation clinique et des critères d’arrêt stricts permettront d’euthanasier rapidement tout animal présentant des signes de souffrance excessive. Les conditions d’hébergement, l’enrichissement en cage, et l’habituation des animaux aux manipulations avant les procédures permettront également de réduire le stress. Les prélèvements sanguins réalisés chez le rat tiendront compte des volumes maximaux autorisés et seront espacés pour garantir le confort et la récupération des animaux. Le choix de cette espèce, plus tolérante aux volumes de sang nécessaires à l’analyse, participe directement à une approche plus éthique. Enfin, les protocoles seront ajustés de façon dynamique à chaque phase, en fonction des résultats obtenus, permettant d’éliminer les conditions ou temps expérimentaux non pertinents. Cette approche itérative permettra de réduire la souffrance animale en optimisant en permanence les procédures.

Choix des espèces

La souris représente un modèle expérimental privilégié pour les investigations de la physiopathologie des maladies inflammatoires de l’intestin survenant chez l’homme et permet d’objectiver l’apparition d’une colite en moins de 10 jours chez un animal non transgénique et non immunodéprimé. Pour la détermination de la pharmacocinétique (PK), les rats sont l’espèce animale de prédilection et sur laquelle un maximum de données historiques est disponible. Les rats ont été choisis pour des raisons de raffinement. Nous avons choisi les rats parce que les méthodes d'étude de nos produits nécessitent des volumes importants de sang que nous ne pouvons atteindre en utilisant des souris. En effet, les volumes prélevés peuvent être plus important que chez la souris nous permettant ainsi de réaliser des analyses plus précises et de réduire le nombre d’animaux utilisés. Il est important de noter que les rats utilisés lors de cette procédure seront des rats sains. Le modèle a été développé et validé sur des souris âgées de 8 à 10 semaines. Ainsi, les souris seront toutes âgées de 8 à 10 semaines lors de leur inclusion dans les procédures. Pour les études de pharmacocinétique sur les rats, ces derniers seront tous âgés de plus de 8 à 10 semaines.

4 032 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection destinée à déclencher un cancer du foie, d'un volume équivalant à environ 9 % de leur poids corporel, qui dilate le foie et augmente le volume sanguin, puis jusqu'à quinze échographies hépatiques sous anesthésie et huit injections de traitements immunomodulateurs sur trois à six mois. Le porteur reconnaît que la croissance de la tumeur peut dégrader l'état général des animaux, fatigue et perte de poids comprises. Les retombées annoncées se limitent à de futurs outils de diagnostic et de pronostic, le porteur affirmant que la souris est le "seul modèle préclinique" permettant d'éteindre ou d'activer des gènes tissu par tissu.

Objectifs

Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC, Carcinome Hépato-Cellulaire) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent à caractériser fonctionnellement les populations immunitaires notamment celles impliquées dans la réponse anti-tumorale. Ce projet sera axé sur les cellules lymphocytes. La compréhension de la fonctionnalité des cellules immunitaires servira de bases fondamentales pour le développement d’immunothérapie pour combattre le cancer du foie. Ce projet sera mené pour une durée de 5 ans.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront de définir le rôle d’acteurs clés de la réponse immunitaire, lors du développement du cancer du foie. Ces travaux pourraient ainsi permettre le développement de nouveaux outils diagnostic/pronostic pour ce cancer grave sans traitement effectif.

Procédures

Des animaux recevront une injection unique visant à mimer le cancer du foie (1 fois, 10 secondes/animal vigile). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs hebdomadaire dès l’apparition de tumeurs (entre 5 et 8 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront suivis par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 2 à 4 semaines ou toutes les semaines selon les conditions expérimentales (entre 2 échos minimum et 15 échos maximum) jusqu’à euthanasie à la fin de la procédure expérimentale (3-6 mois) par une méthode réglementaire. Des animaux recevront une injection unique visant à mimer l’initiation tumorale (1 fois, 5 minutes/animal anesthésié). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs (4 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale par une méthode réglementaire. Des animaux recevront une injection unique visant à mimer la progression du cancer du foie (1 fois, 5 minutes/animal anesthésié). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs hebdomadaire dès l’apparition de tumeurs (entre 5 et 8 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront suivis par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 2 à 4 semaines ou toutes les semaines selon les conditions expérimentales (entre 2 échos minimum et 10 échos maximum) jusqu’à l’euthanasie à la fin de la procédure expérimentale par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, nous réaliserons une injection qui peut provoquer un léger inconfort de courte durée, lié au passage de l’aiguille à travers la peau. De plus, le fait de maintenir l’animal pendant l’injection peut entraîner un stress temporaire. L’injection intra-veineuse comporte des risques de saignement local et/ou d’hématome. L’injection correspond à un volume de liquide équivalant à environ 9 pourcents du poids de l’animal. Elle peut provoquer une douleur passagère et entraîne une dilatation importante mais temporaire du foie (moins de 30 minutes), ainsi qu’une augmentation du volume total de sang. Lors de l’anesthésie par gaz utilisée pour l’échographie du foie, une baisse de la pression sanguine et de la température corporelle peut survenir. Enfin, la croissance prévue de la tumeur au niveau du foie pourrait entraîner une dégradation de l’état général des animaux (fatigue, perte de poids, etc.).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire de l’ensemble des animaux).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant le carcinome hépatocellulaire.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 4032 animaux seront étudiés. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les souris utilisées dans ces procédures seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour ce projet de recherche, nous avons choisi la souris du fait de la disponibilité de modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 à 8 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans le développement tumoral. Une souris trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.

Tuées en fin de procédure pour que leurs tissus et organes passent en analyse post-mortem, 1 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie du foie de deux heures sous anesthésie et analgésie, une autre un jeûne de douze heures en hébergement individuel, une autre vingt-quatre heures en cage métabolique sur grille, avec un risque de lésions aux pattes reconnu par le porteur. Des traitements antibiotiques ou des polyamines sont administrés dans l'eau de boisson pendant sept ou vingt-huit jours. L'hépatite ischémique visée touche entre 0,5 et 1,3 % des admissions hospitalières, et les molécules testées, censées reproduire les effets du jeûne, n'ont pour l'instant été sélectionnées qu'in vitro.

Objectifs

L’autophagie est un processus naturel essentiel, présent chez tous les êtres vivants, qui permet aux cellules de se nettoyer et de fonctionner correctement. Elle aide aussi les cellules à s’adapter en situation de stress. Lorsque l’autophagie ne fonctionne pas bien, cela peut contribuer au développement de maladies comme le diabète, certaines maladies neurologiques ou certains cancers. Le jeûne (ou restriction calorique) est un moyen naturel d’activer l’autophagie. Dans nos recherches, nous avons identifié des composés capables de reproduire les effets bénéfiques du jeûne, en particulier sur l’activation de ce mécanisme. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de ces composés, appelés polyamines, sur le foie, et de voir s’ils pourraient aider à prévenir une atteinte grave du foie appelée hépatite ischémique, en utilisant des modèles expérimentaux chez la souris.

Bénéfices attendus

L’hépatite ischémique est une maladie grave du foie causée par un manque d’oxygène ou de sang. Il s’agit d’une affection relativement rare (incidence entre 0.5 et 1.3 pourcent des admissions hospitalières), mais qui entraîne la mort des cellules du foie et peut avoir des conséquences très graves : plus d’un patient sur deux décède dans les six mois. Il s’agit donc d’un véritable enjeu de santé publique. Ce projet vise à étudier si certaines molécules naturelles, appelées polyamines, peuvent protéger le foie contre ce type de lésion. L’objectif est aussi d’identifier de nouvelles pistes pour mieux prévenir ou traiter cette maladie à l’avenir.

Procédures

Une partie des animaux sera soumise à un jeun non strict de 12 heures et hébergés seule mais sans isolement sensoriel (une seule fois). Une partie des animaux sera soumise à des traitements antibiotiques ou avec des polyamines via eau de boisson pendant 7 ou 28 jours. Une partie des animaux recevra une seule administration d’un traitement (moins de 1 minute par animal vigile). Une partie des animaux sera mise pour 24 heures (une seule fois) dans des cages métaboliques (sur grilles) afin de recueillir les urines produites. Une partie des animaux sera soumise (une seule fois) à une procédure de chirurgie au niveau du foie (animal sous anesthésie et analgésie, acte de 2 heures /animal).

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un certain stress. De plus, lors des injections une légère douleur (équivalente à une piqure) peut survenir, éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection. Les sites d’injections peuvent s’infecter. Les conditions d’hébergement des animaux seront modifiées ponctuellement lors des mises à jeun (pour 12 heures) nécessaires pour le déroulement des expériences. Le jeûne peut induire une sensation de faim, une perte de poids, l’affaiblissement de l’animal et parfois de l’hypothermie. La stabulation sur grille pourrait induire des lésions aux pattes. L’hébergement individuel peut induire du stress. La chirurgie peut induire des douleurs post-opératoire. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie. Les animaux seront euthanasiés, à la fin des procédures, par une méthode réglementaire en vue des prélèvements d’organes.

Devenir

Tous les animaux à la fin des procédures seront euthanasiés. A la fin des expériences, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Nos recherches ont permis d’identifier et de sélectionner in vitro des molécules (des polyamines naturelles), capables de mimer les effets biochimiques du jeûne et d’activer l’autophagie, un mécanisme physiologique essentiel, qui joue un rôle clé dans le maintien de l’équilibre cellulaire. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du métabolisme des polyamines sur le foie et la réponse à la modulation du microbiote intestinal. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la chirurgie hépatique ainsi que la modulation du microbiote intestinal vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1600 souris. Pour sa réalisation, des groupes homogènes d’animaux seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. L’étude sera interrompue si les expériences initiales ne confirment pas l’hypothèse de travail. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux commerciaux seront soumis à 7 jours d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, tunnels en carton, maisonnettes). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long des expériences. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de tapis chauffants). Lors de la chirurgie, l’asepsie et la stérilité du matériel seront respectés. Si les souris apparaissent affaiblies pendant les procédures, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. La souris a une génétique bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront utilisés au stade adulte (à partir de 6 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire actif.

Une partie des souris est injectée à quinze jours de vie, âge auquel le porteur indique que le foie prolifère encore et permet d'induire l'atteinte hépatique. 840 souris mâles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec des atteintes du foie légères à modérées déjà observées lors de travaux antérieurs. Le génome du virus de l'hépatite B leur est transféré par injection sous anesthésie, un autre groupe recevant un réactif qui déclenche un cancer du foie, avec un à deux prélèvements sanguins sur des expériences durant de sept semaines à six mois. Toutes sont tuées pour prélever des organes et conduire histologie, virologie et immunologie post-mortem.

Objectifs

Le virus de l’hépatite B (VHB) est le facteur de risque majeur du carcinome hépatocellulaire (CHC). Le CHC est la seconde cause de mortalité par cancer dans le monde. Des travaux de recherche ont montré une corrélation entre certaines formes virales du VHB et la sévérité de l’atteinte hépatique jusqu’au cancer du foie. Ce projet a pour objectif de déterminer le rôle de l'interaction protéine-protéine d'une des protéines de VHB produites par ces formes virales avec une protéine cellulaire dans le mécanisme d'action de la pathogenèse hépatique générée par l'infection par le VHB.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'avoir une meilleure compréhension des mécanismes associés à la modulation de la pathogenèse hépatique liée à l’infection par le virus de l'hépatite B (VHB), qui pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques améliorant la prise en charge du carcinome hépatocellulaire de patients. Le virus de l’hépatite B (VHB) est un facteur de risque majeur du carcinome hépatocellulaire (CHC), augmentant d’un facteur x100 ce risque (800 000 décès par an par cirrhose ou CHC associés au VHB). De plus, le CHC est la seconde cause de mortalité par cancer dans le monde. Notre principale hypothèse est que l'interaction d'une des protéines du VHB avec une protéine cellulaire module l'atteinte hépatique. Grâce aux modèles murins, il est possible d'invalider l'expression de cette protéine cellulaire dans le foie, et ainsi réduire l'atteinte hépatique induite par l'infection par le VHB. À terme, ces travaux de recherche pourraient permettre d'interférer sur ces interactions protéiques et, en conséquence, de bloquer la progression de la maladie vers le CHC.

Procédures

Le transfert du génome du virus de l'hépatite B (VHB) sera réalisé sous anesthésie et analgésie sur l'ensemble des souris incluses de 7 à 10 semaines de vie (souris adulte) par injection. Un second groupe de souris vigiles subira une injection unique d'un réactif générant un cancer du foie. Deux groupes supplémentaires de souris recevront une petite injection de substances destinées à activer temporairement leurs défenses naturelles. Ces injections seront effectuées avec précaution, sous anesthésie ou sur animaux vigiles selon les cas, et avec des médicaments contre la douleur si nécessaire, quelques heures avant la fin de l’expérience. La durée de chaque injection est estimée à environ 3 secondes chez les animaux vigiles, et à 5 secondes chez les animaux anesthésiés, incluant la manipulation. Au cours de cette étude, nous serons amenés à prélever du sang. Le nombre de prélèvements varie de 1 à 2 selon la durée de l’expérimentation (de 7 semaines à 6 mois), et la durée totale de chaque acte de prélèvement est comprise entre 30 et 60 secondes. Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale, laquelle apporte également une analgésie efficace, garantissant l’absence de douleur pendant l’acte. À la fin de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Des études antérieures utilisant les mêmes protocoles ont montré des atteintes hépatiques légères à modérées chez les animaux traités. Les manipulations, en particulier les injections et les prélèvements sanguins, peuvent entraîner un stress modéré. Les injections peuvent provoquer une douleur légère, un petit saignement ou un hématome localisé, généralement transitoires. Les prélèvements sanguins peuvent également induire une douleur légère ainsi qu’un stress transitoire. L’anesthésie peut induire un stress thermique lié à la perte de chaleur corporelle. L’administration de certaines substances peut entraîner une inflammation hépatique, voire, dans certains cas, une tumorigenèse. Des troubles digestifs transitoires peuvent également survenir, sans conséquences durables.

Devenir

L'euthanasie est effectuée, apres anesthesie, afin de prélever differents organes. Ces animaux vont permettre de réaliser de nombreuses analyses post-mortem (histologie, quantification de paramètres cliniques, virologiques et immunologiques...) pour répondre à la question scientifique. Cet acte nécessaire sera réalisé par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques d'euthanasie des animaux.

Remplacement

Nous avons précedemment effectué des cultures cellulaires à l'aide de modèles bidimensionnels (2D) et tridimensionnels (3D) pour diverses lignées cellulaires invalidées ou non pour un gène cellulaire afin d'examiner si l'effet de l'expression d'une des protéines du VHB in vitro est modulée. Cette protéine du VHB a des effets intra- et extracellulaires. C'est pourquoi un modèle de co-culture en compartiments séparés a été créé pour examiner les rapports entre les cellules hépatiques, qui expriment cette protéine du VHB, et differentes sous-populations immunitaires présentes dans le foie. Toutefois, il n'existe pas encore de modèle in vitro qui condenserait toutes les cellules présentes autour des hépatocytes dans le foie. Le modèle in vivo est donc indispensable pour déterminer le mécanisme d'action des effets intra- et extracellulaires d'une des protéines du VHB sur la pathogenèse hépatique.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été évalué par approche statistique afin que les résultats obtenus puissent être signigicatifs. Certains groupes contrôles seront utilisés pour plusieurs procédures, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. À la fin des procédures, les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire, et un grand nombre de tissus seront prélevés afin qu'un grand nombre d'analyses puissent être effectuées. Le nombre total de souris mâles à utiliser sera de 840.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans une animalerie dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées (vérifiée quotidiennement par les techniciens animaliers), avec un cycle de lumière du jour de 12 heures. L'eau et la nourriture sont fournies à tout moment. En outre, les cages seront enrichies de bandes de nidification en kraft et d'un bâton à ronger en bois. Les animaux ne sont manipulés que par du personnel qualifié et sensible au bien-être des animaux. Les procédures nécessitant le sommeil des animaux sont affinées par un protocole d'anesthésie et d'analgésie approprié, la gestion du risque d'hypothermie par l'utilisation d'une lampe chauffante ou d'un tapis chauffant, et l'ajout d'un gel protecteur pour les yeux afin d'éviter la sécheresse oculaire. Des limites sont fixées et respectées pour éviter la souffrance des animaux. Si les signes de douleur persistent ou si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé dans cette étude est couramment employé en recherche car il permet d’obtenir des résultats fiables. Son système de défense naturelle fonctionne de manière similaire à celui de l’être humain, ce qui facilite l’étude de certaines maladies du foie. Les animaux seront utilisés à deux stades de développement, soit à 15 jours de vie (stade de développement murin pendant lequel le foie est encore en prolifération et permet l'induction de la pathogenèse hépatique), soit de 7 semaines (souris sevrées et adultes) car il est nécessaire que le foie soit mature.

656 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent deux gavages d'une minute espacés de vingt jours, une biopsie d'oreille au sevrage, et pour une partie d'entre elles une chirurgie du cou ou de l'abdomen pour recevoir une injection de virus dans le ganglion plexiforme ou dans l'estomac. Le porteur cherche à savoir comment un régime gras et sucré reçu autour de la naissance modifie durablement le nerf vague, qui relie l'intestin aux circuits cérébraux du plaisir. La mise à mort permet de récupérer le cerveau, l'intestin et les ganglions pour suivre le trajet du virus dans les fibres nerveuses.

Objectifs

Notre projet de recherche consiste à comprendre comment une alimentation occidentale (grasse et sucrée), reçue dès la période périnatale, peut modifier de façon durable la communication entre l’intestin et le cerveau. Pourquoi est-ce important ? Parce que le surpoids et l’obésité augmentent rapidement et posent un gros problème de santé publique. Ils nécessitent des actions précoces et variées pour limiter leurs effets nocifs, de l’enfance jusqu’à l’âge adulte. De plus, il est maintenant établi qu’un environnement nutritionnel riche en gras et en sucres dès le plus jeune âge augmente le risque d’obésité. Des recherches chez l’Homme et l’animal ont montré une relation entre l’obésité, une forte attirance pour des aliments très savoureux et des changements dans le « circuit de la récompense » du cerveau, régulant le plaisir et la motivation. Des études récentes soulignent aussi l’importance du nerf vague, qui relie l’intestin à ces zones cérébrales du plaisir. Les neurones du nerf vague participent aux mécanismes du plaisir et de la motivation. Il est donc crucial de mieux comprendre cette communication intestin-cerveau via le nerf vague, en particulier pendant la période périnatale, un moment décisif pour le développement. Dans un premier temps, nous allons donc analyser comment un régime occidental donné en période périnatale peut perturber l’axe intestin-nerf vague-cerveau à l’âge adulte. Pour y parvenir, nous utiliserons des souris transgéniques, nous permettant de manipuler et tracer, par génie génétique, les fibres du nerf vague connectant l’intestin au cerveau. Ce modèle nous permettra d’identifier exactement les neurones de l’axe intestin cerveau activés par le gras et le sucre chez les souris, et cela à différents âges (enfance jusqu’à l’adulte). Ensuite, nous vérifierons si ces modifications du nerf vague, induites par cette exposition précoce à un régime occidental, entraînent une altération fonctionnelle au niveau du tronc cérébral (zone de projection et d’intégration des informations transmises par le nerf vague). Pour cela, nous utiliserons ce même modèle transgénique, couplé à des techniques de pointe en neurosciences (expression virale de récepteurs, enregistrement des activités électriques des neurones cérébraux…). L’ensemble de ces expériences nous permettra de comprendre comment et par quels mécanismes le nerf vague contribue à moduler les circuits cérébraux contrôlant la prise alimentaire et ainsi participer à l’épidémie d'obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera de nouvelles connaissances essentielles à une meilleure compréhension de l’axe intestin-nerfs vague-cerveau en étudiant l’altération des neurones vagaux sensitifs et la connexion entre les neurones vagaux et le NTS (Noyau du tractus solitaire),zone de projection et d’intégration des informations transmises par le nerf vague au niveau du tronc cérébral. De plus, ce projet pourrait avoir une contribution significative à la santé publique en offrant des pistes pour de nouvelles stratégies préventives aux maladies métaboliques, pendant la période délicate de la nutrition périnatale.

Procédures

Les souris recevront un gavage oral sur animal vigile, d’une durée d’une minute, réalisé deux fois, espacé de 20 jours. Une injection de virus AAV, virus infectant localement les cellules, sera réalisée sur le ganglion plexiforme (au niveau du cou) ou dans l’estomac, sur une partie des animaux, sous anesthésie générale et sous anti-douleurs (analgésiques et AINS ou Anti-inflammatoire non-stéroïdien). Pour l’entretien des lignées, les petits auront une biopsie d’oreille à 3 semaines (sevrage) pour le génotypage.

Impact sur les animaux

Pour le gavage, les animaux pourraient ressentir un stress et un inconfort de courte durée. Pour l’entretiens des lignées, la biopsie d’oreille pour le génotypage pourrait entrainer un stress et une légère douleur de courte durée. Les animaux subiront différentes opérations chirurgicales au niveau du cou ou de l’abdomen. Suite à ces interventions, d’éventuels signes d’inflammation et/ou de gonflement au niveau des zones de chirurgie (cou et abdomen) pourraient apparaitre. Ils pourraient présenter une modification dans leur comportement témoignant d’un inconfort, de stress, d’hypo- ou hyperthermie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin d’étudier le remodelage de l’axe intestin-nerf vague-cerveau suite à une alimentation périnatale riche en lipides et en sucres. Cela requiert une quantification de paramètres biologiques au sein de différents organes tels que l’intestin, les ganglions plexiformes et le cerveau. L’administration d’un virus infectant localement les neurones nécessite que l’on récupère le cerveau afin de mettre en lumière la communication entre les fibres afférentes vagales et certaines régions du cerveau. Cette procédure nécessite alors la mise à mort des animaux.

Remplacement

Il s’agit d’une étude in-vivo étudiant les interactions complexes de l’axe intestin-cerveau ce qui nécessite des modèles vivants, notamment pour observer les réponses physiopathologiques liant l’intestin au cerveau via le nerf vague, justifiant l’utilisation de souris. Il n’existe pas encore d’alternatives permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiopathologiques soutenant l’interaction de l’intestin avec le cerveau via le nerf vague. L’étude animale ne peut donc pas être remplacée par un modèle in-vitro, ex-vivo ou in-silico dans cette étude.

Réduction

Un effort particulier est fait pour optimiser le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse des résultats. Des outils statistiques avancés ainsi que l’expérience du laboratoire sont employés pour calculer la taille minimale d’échantillon nécessaire, prenant en compte la variabilité intragroupe et intergroupe inhérente à l’expérimentation in-vivo. En effet, il sera utilisé un effectif de 8 à 10 souris mâles et 8 à 10 souris femelles pour chaque groupe. De plus, les protocoles expérimentaux sont conçus pour permettre plusieurs niveaux d’analyses sur le même animal (ex : combiner des évaluations physiologiques et moléculaires sur différents organes comme le cerveau et l’intestin), réduisant ainsi le besoin d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Toutes les procédures respectent les normes éthiques les plus strictes pour minimiser la douleur, le stress et les inconforts des animaux. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé, et les techniques légères (gavage) ou modérées (injections dans les ganglions plexiformes) utilisées sont déjà maitrisées. Les animaux bénéficient également d’un enrichissement social (minimum 2 par cage) ainsi que d’un tunnel opaque et des matériaux de nidification (frisotis) pour se cacher, construire un nid, et ainsi maintenir leur bien-être psychologique tout au long des expériences. Lors des injections, les animaux seront suivis en post-opératoire quotidiennement afin de s’assurer de leur parfaite récupération, et de détecter d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance (inflammation ou inconfort au niveau du cou ou abdomen). L’évaluation des points limites et de l’état des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique, pelage, posture, activité, comportement, fréquence respiratoire). La présence de plusieurs signes notables ou d’un signe clinique sévère conduira à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Nous utilisons deux modèles de souris transgéniques, sélectionnés pour leur capacité unique à marquer de façon permanente et spécifique les populations neuronales activées par des stimuli nutritionnels. Le premier modèle, déjà établi au sein du laboratoire (hétérozygote), est actuellement en usage. Le recours au second modèle permet, quant à lui, de réduire le nombre d’animaux utilisés (homozygote). En effet, tous les petits seront homozygotes à la différence du premier modèle, utilisé en hétérozygote, où la moitié des petits n’ont pas le génotype désiré. Le projet vise à étudier le remodelage de l’axe intestin-nerfs vague-cerveau durant la période périnatale donc les animaux seront utilisés dès le premier jour de gestation (G0) jusqu’à 70 jours post-natal (P70) correspondant au début de l’âge adulte.