Système gastrointestinal

Jusqu'à vingt-deux semaines en cage individuelle pour mesurer la consommation de sucre de chaque animal, une chirurgie cérébrale de quarante-cinq minutes, quatre à huit semaines d'antibiotiques puis sept jours de gavage : 3 804 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse post-mortem. Elles ont chaque jour le choix entre de l'eau et une boisson sucrée, quatre ou vingt-quatre heures selon le groupe, et subissent trois prélèvements sanguins. L'objet déclaré est de comprendre l'hyperphagie boulimique en passant par le microbiote intestinal, transféré par gavage d'une souris à l'autre. Le porteur écrit que l'isolement "n'interfère pas avec le bien-être des animaux" dans ses conditions, et annonce dans le même texte des troubles de l'humeur et de la motivation chez les souris consommatrices de boisson sucrée, qu'il compte justement mettre en évidence.

Objectifs

Les troubles du comportement alimentaire se définissent par une relation dysfonctionnelle avec l’alimentation, souvent orientée vers la consommation excessive d’aliments, riches en graisses et en sucres. Ces comportements, au-delà de leur dimension psychologique et comportementale, sont associés à des conséquences sanitaires majeures telles que les maladies cardiovasculaires, l’obésité et le diabète. L’hyperphagie boulimique est le plus prévalent de ces troubles et se caractérise par des épisodes récurrents de perte de contrôle sur la prise alimentaire, mais les mécanismes biologiques sous-jacents demeurent en grande partie méconnus. Des travaux récents mettent en lumière l’importance du microbiote intestinal dans l’émergence et/ou le maintien des troubles alimentaires. Le projet souhaite caractériser les altérations comportementales, cérébrales et du microbiote induites par une consommation excessive de saccharose ; examiner l’impact d’une manipulation ciblée du microbiote sur les comportements alimentaires ; et explorer les interactions entre le microbiote et le cerveau. Ces investigations seront menées sur des souris des deux sexes, afin d’identifier d’éventuelles différences intersexuelles, déjà décrites chez l’humain.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre, au niveau préclinique, comment un régime riche en saccharose altère la physiologie animale, en tenant compte des interactions intestin-cerveau. Les résultats attendus permettront d’approfondir la compréhension des mécanismes biologiques sous-jacents à ce trouble alimentaire. En outre, à long terme, ces travaux précliniques fourniront une base scientifique pour le développement de stratégies hygiéno-diététiques innovantes et mieux adaptées à la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à une chirurgie et des injections pour l'anesthésie (1 chirurgie par animal, durée 45 min; une injection intrapéritonéale d’une durée d’environ 20 secondes). Ils seront également soumis à des traitements chroniques d’antibiotiques (sur 4 ou 8 semaines maximum) et un transfert de leur microbiote intestinal (gavage, 1/jour sur 7 jours, d’une durée d’environ 30 sec). Il y aura des prélèvements de sang à 3 reprises lors du protocole (durée environ 30 sec).

Impact sur les animaux

Consommation excessive de saccharose : les animaux ont le choix entre de l’eau et du sucre tous les jours, pendant 4h ou 24h selon le groupe expérimental. Nous devons évaluer précisément la consommation individuelle de saccharose des souris et nous avons montré que l’isolement nécessaire (au maximum 22 semaines en cage ouverte permettant un contact auditif et olfactif) n’interfère pas avec le bien-être des animaux dans nos conditions. Nous n’avons à ce jour pas mis en évidence de pathologies chroniques dans notre modèle, mais justement, nous poursuivons notre caractérisation et le suivi de différents paramètres afin de suivre l’évolution chez les souris. Nous n’avons pas identifié d’effets sur les seuils nociceptifs. De plus, des troubles de l'humeur et de la motivation sont envisageables chez les animaux consommateurs de boisson sucrée (le but de l'étude est de les mettre en évidence). Lors de l’utilisation de traitement antibiotique, une attention particulière sera portée sur les potentielles pertes de poids et diarrhées. Le gavage intra-gastrique répété (1x/J, 7j) peut conduire à un inconfort léger lié au stress de la contention au moment de l’administration. La chirurgie sur animal anesthésié (1 heure maximum/animal) peut induire de la douleur et une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux. Le prélèvement de sang lors du protocole de consommation de saccharose peut induire une douleur légère de courte durée et une inflammation. L’injection d’anesthésique avant la perfusion peut engendrer une douleur aigüe.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.

Remplacement

La compréhension des mécanismes de mises en place et des conséquences des troubles du comportement alimentaire nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal entier, vigile. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer les processus neuronaux mis en jeu. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines. Il nous est donc impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d'animaux pour permettre des analyses statistiques pour les analyses comportementales et moléculaires et les analyses de l'activité cérébrale. Les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Notamment, l’utilisation de tests longitudinaux permettra d’obtenir des informations concernant l’activité des circuits cérébraux lors de l’ensemble de l’exposition au saccharose. De même, les prélèvements d’organes après perfusions permettront de décrire les altérations provoquées par le régime alimentaire autant au niveau cérébral que périphérique.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris sera assurée. De plus, une pesée au minimum 2x/semaine est réalisée lors du suivi des consommations (nourriture/saccharose/eau), permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris ont toujours accès à de l’eau. Les souris seront habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Les animaux sont isolés dans des cages enrichies et en cages ouvertes ce qui permet les contacts olfactifs entre congénères et permet aux animaux de communiquer entre eux ce qui concourt à limiter l’impact du stress d’isolement. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie per et post opératoire et les souris seront placées sur des tapis chauffants, permettant de maintenir la température corporelle de l’animal durant la procédure en plus de monitorer cette donnée physiologique. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel formé, avec une attention particulière la première semaine post-chirurgicale. L’état de santé des animaux est évalué à l‘aide d’une grille de score spécifique à la procédure chirurgicale (ciblant notamment les risques d’inflammation au niveau de la zone opérée et la reprise de poids de l’animal). Des points limites spécifiques ont été définis pour l'état général, la prise alimentaire.

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires. Sur un plan évolutif, les rongeurs, appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Nous choisissons de travailler avec la souris car nous pourrons ensuite étudier le rôle de gènes précis dans les adaptations observées, en utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées Souris jeunes adultes (au moins 8 semaines en début de procédure). Le jeune adulte correspond à la période de vie de vulnérabilité accrue chez l’Homme vis-à-vis des troubles alimentaires

1 440 souris, chacune pesée chaque semaine, gavée ou injectée, saignée neuf fois à l'état vigile puis mise à jeun dix-huit heures avant un dernier prélèvement, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant vingt semaines un régime riche en graisses ou en sucres destiné à leur faire développer une maladie du foie, puis des médicaments anti-inflammatoires dont l'équipe veut mesurer l'effet sur la fibrose. Toutes sont tuées à l'issue pour analyser leur foie. Le porteur affirme qu'un modèle animal est "indispensable" pour étudier ces effets de manière intégrée et que les explorations sur animal vigile ne peuvent pas être substituées par des approches in vitro.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie représentent plusieurs syndromes qui vont de la simple stéatose du foie à la stéatose du foie inflammatoire et peuvent évoluer vers la fibrose et le cancer. L'inflammation est un facteur clef de l'évolution de ces maladies. Dans ce projet, nous souhaitons tester des médicaments ayant un effet anti-inflammatoire. Lors de cette étude, des souris ayant développées ces maladies du foie par une alimentation riche en graisse et/ou en sucres seront traitées avec des médicaments et nous caractériserons l'évolution de ces maladies afin de voir les effets positifs de ces molécules et les voies impliquées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet est la potentielle mise en évidence d'un effet anti-inflammatoire et anti-fibrosant d'une nouvelle molécule pharmacologique. Nous pourrons en plus de cette mise en évidence étudier les voies impliquées dans la protection d'un régime

Procédures

La contention, le gavage et les injections causent un stress et une douleur modérée et de courte durée pour les animaux. Les animaux auront des injections (durée 15 secondes) ou des gavages (durée 1 mn/souris) et seront pesés une fois par semaine (30 secondes/souris). Un prélèvement de sang sera effectué 9 fois et prendra 1 mn/souris. Ils seront soumis un changement de régime ainsi qu’à une mise à jeun de 18h avec un prélèvement de sang (1mn/souris). Tous les prélèvements sont effectuées sur souris vigiles.

Impact sur les animaux

La contention, le gavage et les injections sont des sources de stress modéré pour les animaux. Les animaux seront soumis à des régulations nutritionnelles avec des changements de régime pendant 20 semaines pouvant induire un stress léger par une prise de poids avec possiblement une activité réduite . La mise à jeun peut entraîner un stress modéré aux souris.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin d'analyser l'effet des molécules sur le développement de la fibrose hépatique.

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier de manière intégrée les effets de ces molécules sur l’inflammation et la fibrose. Par ailleurs, l'identification et la validation de ces cibles thérapeutiques nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo mimant le plus fidèlement la pathologie humaine ). La réalisation d'explorations fonctionnelles sur animal vigile ne peut donc pas être subsituée par des approches entièrement in vitro.

Réduction

Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux nécessaires afin de vérifier nos résultats et les valider. Un nombre minimum de souris sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

La durée des régimes utilisés et les traitements relatifs aux tests métaboliques seront réalisés selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum et lors de la mise à jeun l'accès à l'eau est conservé. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés entraînant la mise à mort anticipée si nécessaire. En effet, l’application des points limites établis pour chaque procédure de ce projet sera effectuée.

Choix des espèces

L’espèce souris a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons de souris adultes âgées de 10 à 30 semaines, car le métabolisme énergétique est régulé de manière différente chez les jeunes adultes et/ou pendant le vieillissement.

L'ablation partielle du pancréas provoque chez le rat des fistules puis une accumulation de liquide dans l'abdomen, que le porteur prévoit de ponctionner ou, à défaut, de traiter par la mise à mort de l'animal. 360 rats vont être utilisés ainsi, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une laparotomie de trente minutes, jusqu'à deux administrations quotidiennes de traitement pendant quatorze jours, des prélèvements sanguins sous anesthésie et jusqu'à trois séances d'IRM d'une heure, pour mettre au point un modèle de fistule pancréatique et y évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. Le choix du rat, le porteur le justifie par ses "facilités d'entretien, de stabulation et de manipulation" autant que par sa proximité physiologique avec l'humain.

Objectifs

Ce projet vise 1) à mettre en place un modèle de fistule pancréatique chez le rat et 2) utiliser ce modèle pour évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce modèle permettra de vérifier la faisabilité d'une thérapie novatrice pour soigner les patients atteints de fistules pancréatiques et de détecter d'éventuels effets secondaires indésirables.

Procédures

Une chirurgie viscérale avec ablation partielle du pancréas afin de mimer une opération chez l'humain (durée estimée à 30 minutes). Traitements médicamenteux administrés au maximum de 2 fois par jour pour une durée maximale de 14 jours (durée : 1 minute / administration). En cas de prélèvement sanguin, ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à un par jour et à un volume inférieur à 10 % sur 2 semaines. Une imagerie par IRM réalisé 3 fois maximum sur une durée de 14 jours (15 - 60 min par session).

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale inclut une laparotomie, l'ablation partielle du pancréas, puis la survenue de fistules pancréatiques. Une analgésie adaptée sera appliquée limitant la gêne au maximum. De l'ascite pourra être consécutif à la génération des fistules occasionnant également une gêne. Afin de limiter celle-ci nous réaliserons des ponctions ou, si cela n’est possible, nous euthanasierons les animaux. Le stress lié à la préhension et à la contention, et les administrations, induiront une gêne inférieure / équivalente à la piqure d’une aiguille.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organes / fluides corporels pour analyse.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat, car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) permettant d'évaluer les effets d’une nouvelle approche thérapeutique dans le contexte des fistules pancréatiques. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue une étape obligatoire pour évaluer l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux sera inclus au départ pour la mise en place du modèle. Trois séries de dix animaux permettront d'évaluer la robustesse de la procédure expérimentale réalisée. Par la suite, lors des essais de traitements, nous inclurons 10 animaux par groupe, en fonction des résultats attendus, afin de réaliser une analyse valable des données, notamment par approche statistique.

Raffinement

Dans ce projet, l'objectif est d'atteindre un niveau de raffinement élevé grâce à : • La mise au point de procédures rigoureuses ; • La formation du personnel ; • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux ; • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites ; • Le recours à un suivi par imagerie si possible / nécessaire ; • le suivi de l'apparition d'ascite et la ponction de celui-ci si possible ; • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire ; • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire, ainsi qu'un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés, afin de permettre une bonne récupération des animaux ; • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements, notamment en raison de leurs facilités d’entretien, de stabulation et de manipulation, ainsi que de leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Les animaux utilisés sont adultes.

Un gavage par jour pendant huit semaines, jusqu'à trois prélèvements sanguins, des antibiotiques dans l'eau de boisson et deux mois d'isolement en cage individuelle : 1 872 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes seront tuées pour qu'on analyse la répartition du microbiote dans leur intestin. L'objectif déclaré est de comprendre comment les bactéries colonisent l'intestin selon le profil du microbiote, avec l'espoir affiché de pouvoir un jour manipuler le microbiote humain. Le résumé tient en quelques lignes sur les procédures comme sur le raffinement, et ne détaille ni les points limites qu'il dit "stricts", ni le calcul qui mène à 1 872 animaux.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de comprendre le rôle du microbiote intestinal dans la colonisation des bactéries. Les souris seront utilisées comme modèle pour divers profils de microbiotes intestinaux qui seront colonisés par des bactéries. Des thérapies distinctes seront également utilisées pour étudier les dynamiques de colonisation en réponse à ces thérapies. Ce projet fournira des informations essentielles sur le rôle du microbiote intestinal dans la colonisation bactérienne et la réussite des thérapies.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront non seulement d'améliorer la compréhension fondamentale des interactions entre l'hôte et les bactéries, mais aussi d'obtenir des informations mécanistiques essentielles qui pourront être exploitées pour manipuler le microbiote intestinal humain de manière à promouvoir et à préserver la santé humaine.

Procédures

Gavage: durée 5s ; un seul gavage ou un gavage par jour pendant 8 semaines en fonction de la procédure. Prélevement du sang: durée 30s ; fréquence 3 fois max pour 8 semaines. Antibiotique: ajouté une fois à l'eau de boisson tous les trois jours pour une durée allant de 1 à 5 jours. Hébergement individuel: une fois pour 2 mois.

Impact sur les animaux

La contention cause un stress de courte durée. Prélèvement de sang et gavages causent un stress et des douleurs légères de courte durée. Certains antibiotiques peuvent causer des perturbations intestinales. L'isolement des animaux peut causer du stress.

Devenir

1872 souris seront mises à mort pour analyser la composition spatiale du microbiote intestinal.

Remplacement

Des modèles de microbiote in vitro ont été utilisés pour étudier les interactions au sein des communautés bactériennes. Cependant, certains aspects de ces interactions complexes impliquant des cellules immunitaires et non immunitaires ne peuvent être étudiés que chez l'animal.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe pour assurer la reproductibilité des expériences et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi et des points limites stricts, spécifiques au projet, seront appliqués.

Choix des espèces

Dans l'étude des interactions hôte / microbiote, la souris est un modèle de choix, notamment car cette espèce est la plus facile à manipuler génétiquement et à obtenir en conditions germ-free (animaux sans microbiote). L'ensemble du project utilisera des souris après sevrage et âgées de 4 à 20 semaines,chez lesquelles le système digestif est arrivé à maturité.

4 038 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales par voie sous-cutanée, intraveineuse, intracardiaque ou directement dans un organe après ouverture chirurgicale, puis sept à dix séances d'imagerie sous anesthésie, cinq à huit prélèvements sanguins après quatre à six heures de jeûne, et des pesées quotidiennes. Une partie est immunodéficiente, donc vulnérable aux infections, et le porteur prévoit une perte de poids pouvant dépasser 15 %. Les bénéfices annoncés pour les patients, une immunothérapie plus sûre et modulable, restent au conditionnel, quand le porteur écrit que la nature des prélèvements d'organes "ne permet pas la survie des animaux".

Objectifs

Les thérapies géniques et cellulaires représentent une avancée majeure dans le traitement de nombreuses maladies, notamment les cancers. Grâce à des technologies innovantes comme les cellules génétiquement modifiées, il devient possible de modifier certaines cellules pour qu’elles reconnaissent et éliminent des cellules malades dans l’organisme. Après des résultats prometteurs dans les cancers diffus, notamment certaines leucémies, ces approches sont désormais autorisées pour le traitement de cancers solides tels que le mélanome. Elles marquent ainsi une véritable révolution en immunothérapie. Malgré leur efficacité, ces thérapies ne sont pas sans risques. Leur action prolongée dans l’organisme et leur caractères difficilement réversible peuvent entrainer des effets secondaires graves. Le plus fréquent est une réaction immunitaire excessive, pouvant provoquer des troubles neurologiques voire dans de rares cas la formation de cancers secondaires liés aux cellules modifiées. Pour faire face à ces risques, des systèmes de sécurité sont actuellement en cours de développement. L’objectif est de pouvoir activer ou désactiver précisément ces traitements de façon ciblée dans le temps et dans le corps. Ces systèmes permettraient de mieux contrôler l’effet des thérapies géniques et cellulaires afin d’offrir des thérapies plus sûres aux patients.

Bénéfices attendus

L’immunothérapie représente une avancée majeure dans le traitement de nombreuses maladies graves, notamment certains cancers et maladies auto-immunes. Mais ce type de traitement n’est pas sans risque. En stimulant fortement les défenses du corps, il peut entrainer des réactions indésirables parfois sévères. Il devient donc essentiel de pouvoir en contrôler précisément l’intensité et la durée. Des stratégies récentes cherchent à rendre l’immunothérapie plus sûre et plus modulable. L’une d’entre elles repose sur la thérapie génique. Elle consiste à insérer un gène dans les cellules du patient à l’aide de transporteurs, appelés vecteurs souvent des virus modifiés. Ce gène agit comme un interrupteur, permettant ainsi d’activer ou de d’arrêter le traitement si des effets secondaires apparaissent. Ces systèmes offrent un véritable progrès en matière de sécurité. Avant d’être utilisés chez l’Humain, ces dispositifs doivent être testés sur des modèles biologiques complets comme la souris. Cela permet de vérifier à la fois leur efficacité et l’absence d’effets indésirables majeurs dans un organisme vivant. A terme, ce type d’approche pourrait améliorer la prise en charge de nombreux patients pour lesquels les traitements actuels restent insuffisants. C’est le cas de certains cancers très résistants, comme le cas du cancer du foie dont le taux de survie à 5 ans est d’environ 18 pour cent. En rendant ces traitements plus contrôlables, ces avancées ouvrent la voie à une immunothérapie plus personnalisée, mieux tolérée et potentiellement accessible à un plus grand nombre de patients.

Procédures

Dans ce projet de recherche, des souris sont utilisées pour évaluer l'efficacité, la distribution et la tolérance de traitements innovants dans l'organisme en conditions saines ou pathologiques. Les animaux suivent différentes étapes expérimentales. Certains reçoivent une seule injection d'un des deux produits thérapeutiques sur souris soit vigile soit anesthésiées d'une durée inférieure à 30 secondes. Pour créer des modèles tumoraux, plusieurs méthodes sont utilisées: une injection unique de cellules tumorales disséminées (sous anesthésie, 30 secondes), injection de cellules tumorales solides (1 fois, sous anesthésie, 45 secondes) ou injection directe dans un organe (1 chirurgie par souris, moins de 20 minutes, sous anesthésie générale avec une analgésie préventive et post opératoire pendant 3 jours). Les traitements expérimentaux comprennent l'injection de cellules thérapeutiques (1 fois, sous anesthésie, 30 secondes), de vecteurs viraux (1 fois, sur souris vigile, 30 secondes) et de médicaments complémentaires (1 fois par jour pendant 3 à 5 jours, sur animal vigile, 30 secondes). Le suivi de la tumeur repose sur des mesures manuelles (1 à 2 fois par semaines, 2 minutes sur animal vigile), de l'imagerie par bioluminescence (1 à 2 fois par semaine pendant 4 à 8 semaines, soit 7 à 10 fois par animal, anesthésie légère 10 minutes accompagné de l'injection d'un agent de contraste 30 secondes et de l'échographie (1 fois, 15 minutes, sous anesthésie). Les souris subissent aussi des prélèvements sanguins hebdomadaires (5 à 8 fois sur animal vigile à jeun 4 à 6heures, 30 secondes, une pesée quotidienne (contention 30 secondes) réalisée à la suite de l'implantation tumorale (de J0 à J4 soit 4 pesées) puis tous les 2 à 3 jours (soit 2 à 3 pesées par semaine) dont la fréquence est réaugmentée à un rythme quotidien si l'état général des animaux le justifie. Une observation clinique quotidienne est également maintenue tout au long du protocole. A la fin de l'étude, les animaux reçoivent une anesthésie avec une analgésie préventive (1 injection de 30 secondes, 30 minutes avant l'anesthésie) puis le prélèvement sanguin suivi de l'euthanasie est réalisé sous anesthésie en 10 minutes. Toutes les interventions sont réalisées par du personnel formé dans le respect de la réglementation avec une prise en compte du bien-être de l'animal à chaque étape.

Impact sur les animaux

(i)Nuisance physiologique. Une mise à jeun de 4 à 6 heures peut être appliquée dans le cadre des modèles développés dans ce projet et est susceptible de provoquer une sensation de faim légère. L’induction des vecteurs ainsi que la progression tumorale dans certains modèles peut entrainer une perte de poids réelle supérieure à 15%. (ii)Nuisance comportementale. Les phases de contention (pesée, injection, prélevement sanguin, mesure du volume tumoral) peuvent générer un stress ponctuel ainsi qu'une douleur légère et transitoire généralement inférieur de 30 secondes. L'anesthésie gazeuse utilisée dans certaines procédures peuvent accentuer l'anxiété et provoquer une perte transitoire de chaleur corporelle. (iii)Nuisance liée au statut immunodéficient. Les souris immunodéficientes présentent une vulnérabilité accrue aux infections. (iv)Nuisance liée au développement tumoral. Le développement tumoral peut conduire à l'apparition de lésions cutanées au point d'injection ainsi qu'à des altérations du bien-être notamment au niveau du toilettage, la mobilité ou l'alimentation. (v)Nuisance liée aux interventions chirurgicales. L'anesthésie gazeuse prolongée utilisée dans certaines procédures peut entrainer une perte transitoire de chaleur corporelle. La suture peut occasionner une réaction inflammatoire locale transitoire au niveau de la cicatrice.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures expérimentales sont euthanasiés en fin d’étude. Cette euthanasie est scientifiquement indispensable car elle permet la réalisation de prélèvements d’organes et de tissus nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet. Plus précisément, les tumeurs sont prélevées pour des analyses histopathologiques. Le sang et la rate sont recueillis pour l’analyse phénotypique des cellules thérapeutiques administrées. Les organes sont prélevés dans leur totalité afin de permettre la validation du ciblage tissulaire spécifique des vecteurs de thérapie génique. La nature des prélèvements ne permet pas la survie des animaux. Ainsi aucun animal n’est conservé après les procédures, l’ensemble des animaux est euthanasié de manière programmée et encadrée conformément aux règles en vigueur.

Remplacement

Les thérapies géniques et cellulaires offrent des pistes très prometteuses pour soigner certaines maladies, mais elles doivent être rigoureusement contrôlées avant de pouvoir être utilisées chez l’humain. Il est notamment essentiel de vérifier si elles ciblent bien la zone souhaitée comme une tumeur ou un organe précis et de s’assurer qu’elles n’agissent pas par erreur sur d’autres parties du corps. Des premiers tests ont déjà été réalisés en laboratoire sur des cellules. Ces expérimentations ont permis d’évaluer l’expression du transgène, la viabilité cellulaire. Elles fournissent des données essentielles pour comprendre le fonctionnement initial du traitement. Cependant, ces vérifications ne peuvent pas se limiter aux expériences sur cellules. Les études réalisées chez l’animal sont indispensables pour observer la diffusion et l’action du traitement dans un organisme complet et ainsi recueillir les informations nécessaires pour juger de sa sécurité et de son efficacité avant toute application chez l’humain.

Réduction

Conformément au principe des 3R, ce projet repose sur plusieurs approches concrètes visant à réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique. Trois principaux leviers sont mobilisés pour optimiser la conception expérimentale et limiter l’impact sur les animaux. L’étude prend en compte les 2 sexes (mâles et femelles) afin d’inclure la variable sexe dans le plan expérimental, ce qui augmente la portée statistique et réduit les biais d’interprétation. Ne pas considérer cette variable peut conduire à des résultats non reproductibles ou non généralisables. Les différences de pharmacocinétique entre les mâles et les femelles peuvent également fausser des conclusions lorsqu’elles sont extrapolées d’un sexe à l’autre. Bien que cela soit contre intuitif, l’intégration des 2 sexes apporte une valeur scientifique renforcée aux données recueillies. Grâce à l’imagerie in vivo, chaque animal est utilisé de façon optimale afin d’obtenir un maximum d’informations. Les groupes expérimentaux sont conduits en parallèle, ce qui limite le recours aux groupes témoins. Chaque individu fait l’objet d’un protocole d’analyse complet permettant de rassembler un grand nombre de données tout en réduisant le nombre total d’animaux mobilisés. Ainsi 4038 animaux sont utilisés dans le cadre de ce projet.

Raffinement

Des mesures précises et rigoureuses seront mises en œuvre pour assurer le bien-être des animaux. (i) Les points limites sont définis suivant une observation de signes cliniques dictant un arbre décisionnel. Les signes cliniques sont ceux altérant l’apparence physique, le poids et le comportement qui dictent l’intervention à tenir allant du soin à l’euthanasie. (ii) La gestion de la douleur se fait par administration d’analgésiques en cas de souffrance détectée. (iii) Le suivi rigoureux et proactif des animaux se fait par une surveillance quotidienne des animaux par un personnel qualifié, formé aux procédures, qui prend en charge conformément aux protocoles établis et à la grille de suivi garantissant une réponse rapide et adaptée. (iv) Dans un environnement enrichi, l’hébergement (de 2 à 5 individus par cage) en groupes sociaux compatibles des animaux favorise les comportements exploratoires et réduit ainsi le stress avec une période d’acclimatation de 10 jours avant les procédures. (v) L'anesthésie gazeuse utilisée pour certaines procédures provoque une perte transitoire de chaleur corporelle compensée par l'installation de l'animal sur un plateau chauffant pendant l'intervention puis par un réveil en cage thermostatée. (vi) Les souris immunodéficientes sont maintenues dans des conditions strictes d'hébergement et de manipulation afin de limiter les risques d'exposition aux agents infectieux.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier la formation tumorale grâce son taux élevé de prise de greffe et à sa petite taille qui facilite la manipulation. La disponibilité de diverses lignées immunodéficientes permet d’utiliser des greffes d'une autre espèce sans risque de rejet tandis que les lignées dépourvues de poils facilitent le suivi visuel de la croissance tumorale. De plus, le vaste éventail de modèles génétiquement modifiés et la connaissance approfondie du génome murin permettent d’étudier en détail les mécanismes moléculaires du cancer. Le cycle de vie court de la souris favorise la constitution de cohortes pour garantir une bonne puissance statistique, et l’existence de nombreux protocoles standardisés simplifie la comparaison des résultats entre études. Enfin le comportement bien documenté des souris permet d’identifier rapidement les signes de souffrance évaluable assurant ainsi une prise en charge efficace. Les souris utilisées seront des jeunes adultes sexuellement matures âgées de 8 à 12 semaines. Ce choix correspond à une période où les fonctions physiologiques, notamment immunitaires et métaboliques, sont pleinement développées, tout en restant stables et homogènes d’un individu à l’autre. A cet âge, les animaux présentent également un comportement plus stable, ce qui réduit la variabilité expérimentale et les réactions excessives liées au stress. L’utilisation de cette tranche d’âge permet donc à la fois de garantir la maturité biologique, de limiter les biais comportementaux liés à l’anxiété et de favoriser la robustesse des résultats.

Nourries pendant seize à vingt-quatre semaines avec un régime destiné à leur provoquer obésité, foie gras et inflammation hépatique, une partie des souris reçoit en plus deux injections par semaine pendant douze semaines pour induire une fibrose du foie. 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du sang, du foie, du tissu adipeux et du nerf sciatique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un gavage quotidien pendant douze à vingt-quatre semaines, des jeûnes de six heures suivis de six prélèvements sanguins en deux heures, et le porteur décrit une neuropathie allant jusqu'à la perte de la sensibilité. L'objectif est de tester un médicament déjà développé pour limiter l'accumulation d'un lipide, sans que les trois analyses neurologiques annoncées soient nommées.

Objectifs

La neuropathie diabétique est une complication fréquente du diabète qui touche environ 40 pourcents des patients. Elle provoque une perte de sensation, en particulier dans les pieds, ce qui peut entraîner des blessures et, dans les cas graves, des amputations. Actuellement, il n'existe pas de traitement permettant de restaurer la sensibilité perdue. En plus du diabète, d'autres facteurs comme l'obésité et le syndrome métabolique peuvent aussi causer des atteintes nerveuses similaires. Des recherches ont montré qu'un certain type de graisse pourrait jouer un rôle important dans ces dommages nerveux. Un médicament a été développé pour limiter l'accumulation de ces lipides. Ce projet de recherche veut tester si le traitement employé pour limiter cette graisse particulière pourrait aussi être utile contre la neuropathie diabétique en réduisant la synthèse de ces dérivés lipidiques et en protégeant les nerfs. Si cela fonctionne, cela pourrait ouvrir une nouvelle piste de traitement pour améliorer la qualité de vie des patients diabétiques.

Bénéfices attendus

La neuropathie liée au diabète peut entraîner de graves complications, comme des plaies aux pieds pouvant aller jusqu’à l’amputation. En France, environ 8 000 amputations par an sont dues à cette maladie. Ce projet de recherche s’intéresse à certains lipides et à leur rôle potentiel dans ces atteintes nerveuses. Un médicament agit justement sur la synthèse de ces mdérivés lipidiques. L’idée serait d’explorer s’il pourrait aussi aider les patients diabétiques en réduisant le risque de complications graves, comme les amputations.

Procédures

Les animaux seront nourris avec des régimes spéciaux (régime induisant une obésité, un foie gras, une inflammation hépatique (animal vigil, en continu pendant 16 à 24 semaines ) ou un traitement injectable pour induire une fibrose hépatique (animal vigil, 2 fois par semaine pendant 12 semaines, 1 minute). Pour les animaux recevant le traitement ou un placebo, un gavage par jour sera réalisé pendant 12 à 24 semaines sur animal vigil, 1 min. Des explorations métaboliques seront réalisées pour explorer la sévérité du diabète (animal vigil, 2 fois car un pour le test de tolérance à l'insuline et un pour le test de tolérance au glucose), 6 prélèvements de sang de faible volume au total sur une période de 2h, après une mise à jeun de 6h) ainsi que des analyses neurologiques (2 tests sur animal vigil (2 et 10 min respectivement et 1 test sous anesthésie, 30min; chaque test étant espacé de 2 jours, 10 minutes). En fin de projet, un dernier prélèvement sanguin sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, 1 minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables notoires seront 1) risque de réduction de la prise alimentaire lié à la néophobie des souris au changement de régime, 2) la maladie hépatique induite par régimes spéciaux ou par injection bihebdomaire intrapéritoneale d'un traitement (douleur de courte durée lié à la piqure de l’aiguille) et ses conséquences métaboliques avec insulinorésistance provoquant un diabète (polyurie-polydipsie) et une obésité et les conséquences sur le nerf (neuropathie périphérique avec troubles de la sensibilité ou perte de la sensibilité) 3) dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie 4) le stress et la douleur légère lié à la manipulation et la contention durant les tests métaboliques (tests de tolérance à l'insuline et test de tolérance au glucose) 5) le stress et la douleur légère de courte durée liée au prélévement de sang lors des tests métaboliques et durant les tests de sensibilité et de conduction nerveuse. 6) risque de perte de poids, d’hémorragie lié au prélèvement et risque d’hypoglycémie ainsi que la mise à jeun de 6h avec sensation de faim pour les tests métaboliques. 7) irritation oesophagienne liée au gavage quotidien du médicament testé

Devenir

A la fin de la période de maintien des animaux, les souris seront euthanasiées afin de prélever les tissus d’intérêt (sang, tissus adipeux, foie et nerf sciatique) en vue d’analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de comprendre l’influence du métabolisme lipidique en cas de MASLD (maladie métabolique du foie) sur la neuropathie périphérique. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.

Réduction

Le nombre d'animaux pour notre étude est calculé pour avoir des résultats statistiquement fiables. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail. Le nombre total d’animaux sera de 960 souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. En cas d'obésité avec difficulté à se mouvoir, la nourriture sera déposée en fond de cage. Le change de la cage augmenté si necessaire pour s'adapter à la diurèse induite par le diabète et permettre aux souris de rester au sec. Les souris sous régime ou traitement fibrotique seront surveillées quotidiennement. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés (anesthésie, analgésie...) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Les points limites sont évalués par un personnel compétent.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques d’obésité et de diabète ont été validés chez la souris. De plus sa physiologie est connue et il est bien décrit qu'un régime obésogène et/ou diabétogène est capable d'induire une insulinorésistance quelques semaines après le régime. Dans les protocoles, les souris seront mises en conditions expérimentales à partir de l'âge de 6-8 semaines afin que le métabolisme des animaux soit stabilisé.

Les expérimentateurs excluent de l'étude et mettent à mort tout animal dont l'état ne s'améliore pas, selon une grille de score prévue pour chaque procédure. 2 000 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à la fin pour prélever tissus et sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de six semaines et pendant une quarantaine de semaines, elles reçoivent un régime hypercalorique et des boissons au fructose qui les rendent obèses, diabétiques et porteuses d'une stéatose hépatique, avec une à deux administrations de composés par jour, des jeûnes de six heures, une épilation sous anesthésie pour l'échocardiographie et jusqu'à trente semaines d'hébergement seule en cage. La finalité déclarée est de disposer de modèles reproductibles, utilisables ensuite pour tester des candidats thérapeutiques contre l'obésité et la stéatose.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (environ 40 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possible. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (1 fois, durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement (max 3 fois). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes (1 fois). Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique (3 fois).

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (environ 40 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère (quelques minutes) . Pour pouvoir relever la consommation alimentaire et hydrique, nous pourrons être amené à héberger les souris de façon individuelle pendant une partie ou toute la durée du projet (jusqu'à 30 semaines). Les souris seront stressées par cet hébergement, même si elles voient et entendent leur congénères. Pour palier le stress engendré, du sur-enrichissement (petits tunnels suspendus, boule de bois notamment) sera ajouté dans les cages et le personnel est formé à l'approche délicate des animaux, aux gratouilles lors des préhensions. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h. Lors des mesures de composition corporelle, l'animal peut ressentir un stress léger modéré , cela dure environ 2 minutes.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Pour les animaux immunodéficients, nous mettrons en place une zone dédiée et un process clair pour garantir leur statut sanitaire. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique pour chaque procédure est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et le mettront à mort. Les prélèvements de sang seront fait sous couverture analgésique.

Choix des espèces

Les souris sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques et des comorbidités associées. Les animaux sont utilisés à partir de 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.