Système gastrointestinal

Toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques, 900 souris porteuses d'une mutation qui reproduit la maladie d'Alzheimer vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines subissent une chirurgie cérébrale d'une heure pour marquer les nouveaux neurones, d'autres un gavage suivi de quatre prélèvements espacés d'une heure, dont le porteur reconnaît que la douleur dure quelques jours jusqu'à cicatrisation. L'objet est de comparer l'effet d'un accès volontaire à une roue d'exercice selon qu'il commence à l'adolescence ou à l'apparition des troubles de mémoire. Les roues sont retirées la journée, et les trois tests comportementaux censés mesurer la mémoire ne sont pas nommés.

Objectifs

Le projet vise à étudier si l'exercice physique volontaire, pratiqué avant ou après le développement post-natal du cerveau, c’est à dire pendant ou après l’adolescence, déclenche des mécanismes biologiques différents et responsables d’effets bénéfiques sur le cerveau. Des données cliniques et épidémiologiques montrent que l'activité physique est une stratégie efficace pour promouvoir le vieillissement en bonne santé et ralentir le déclin de mémoire lié à certaines maladies neurologiques, comme la maladie d'Alzheimer (MA). L'exercice, tant chez les animaux que chez les humains, est une composante accessible de l’hygiène de vie. Il favorise un état anti-inflammatoire, améliore la fonction antioxydante et stimule la plasticité du cerveau. De plus, des facteurs sanguins sécrétés après l'exercice contribuent à son action neuroprotectrice : une étude a montré que le transfert de sang d'une souris active à une souris sédentaire imite les effets de l'exercice au niveau du cerveau, soulignant son effet systémique. Le microbiote intestinal, modifié par l'exercice, pourrait également jouer un rôle crucial dans la promotion de la santé. Comprendre quand et comment l'exercice retarde l'apparition de la MA est crucial pour développer des stratégies thérapeutiques efficaces. Nous faisons l’hypothèse que la période de la vie durant laquelle l'activité physique est pratiquée a une influence sur les bénéfices engendrés pour prévenir ou ralentir le déclin de mémoire. Des données de la littérature suggèrent que comparé à l'exercice à l'âge adulte, l'exercice à l'adolescence affecte différemment les processus de mémoire et la plasticité du cerveau chez les rats adultes. Ainsi, nous examinerons d’abord si une activité physique volontaire à l'adolescence ou au début de l'âge adulte entraîne un effet optimal sur le ralentissement du déclin de mémoire dans le modèle murin de la MA, à l’aide de tests comportementaux. Ensuite, nous explorerons les changements biologiques (centraux et périphériques) induits par l'exercice, susceptibles d’engendrer des effets différents sur la mémoire, à l'âge adulte.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à fournir des perspectives complètes sur l’impact de l'exercice physique dans la maladie d'Alzheimer (MA) en utilisant un modèle murin. En comparant l’impact de l’activité physique initiée pendant l'adolescence ou au début des symptômes de la MA sur la mémoire, nous déterminerons la période de vie pendant laquelle l’activité sportive a un effet optimal. Les investigations moléculaires rechercheront des changements dans certains mécanismes cérébraux décisifs pour les processus de mémoire, qui sont affectés dans la MA et qui pourraient être rétablis par l’exercice physique. L’étude de marqueurs périphériques circulants permettra d’identifier des mécanismes spécifiques activés par l'exercice ayant pour effet de protéger le cerveau. L’analyse des changements du microbiote permettra d’établir des profils de présence et/ou absence de certains marqueurs (changement dans la proportion de bactéries, changement dans la perméabilité intestinale …) en fonction des différents groupes. Finalement, cette recherche vise à approfondir notre compréhension du décours et des mécanismes induits par l'exercice physique et permettant d’améliorer la résistance du cerveau malgré la MA, ce qui pourrait éclairer de futures stratégies thérapeutiques.

Procédures

Certains animaux auront un gavage oral qui dure 30 secondes. Ces mêmes animaux auront 4 prélèvements espacés de 1h chacun. Pour certains animaux, 3 tests comportementaux seront effectués au cours de 2 à 3 semaines. Ils peuvent induire du stress du fait du déplacement des souris vers de nouvelles pièces et de la mise en contact avec de nouveaux objets. Pour limiter ce stress, les souris disposeront de périodes d’habituation aux pièces et aux dispositifs expérimentaux. Pour chaque souris, le temps maximal de tests sera limité à 1h30 par jour. Deux jours de manipulation sont également prévus afin que les souris s’habituent à l’expérimentateur dans la salle des tests comportementaux. Pour certains animaux, une injection sera réalisée par jour, pendant 4 jours consécutifs. La prise en contention et l’injection sont susceptibles de causer un stress léger, ainsi qu’une douleur légère qui dure environ 2 minutes. Finalement, certains animaux seront soumis à une chirurgie permettant de marquer des nouveaux neurones. Chaque chirurgie durera 1h maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables peuvent être dus à l’activité physique qui peut induire une légère perte du poids. Aussi, la prise en contention des animaux est susceptible de causer un stress léger. Certains animaux recevront une substance par gavage oral. Cette procédure représente une nuisance légère pour l’animal en raison de l’insertion d'une sonde dans l'œsophage. Ces mêmes animaux, auront des prélèvements qui peuvent induire une douleur légère. Ces prélèvements sont répétés 4 fois, avec un intervalle de 1h entre chaque. La douleur due aux prélèvements dure quelques jours jusqu’à cicatrisation de la plaie. Ceci représente une nuisance modérée car les prélèvements sont réalisés juste après le gavage. Certains animaux seront évalués dans des tests comportementaux. Ceux-ci ne provoquent qu’un stress léger ou modéré pour les animaux. De plus, pour quelques animaux, des injections sont susceptibles de causer une légère douleur. Ceci représente une nuisance légère. D’autres souris seront soumises à une chirurgie. Des effets indésirables de cette procédure peuvent se traduire par une altération de l’état général de l’animal : isolement, indifférence par rapport au milieu extérieur, diminution du comportement exploratoire ou une perte de poids. De plus, les chirurgies peuvent induire une douleur modérée au stade post opératoire durant quelques jours. Ceci représente une nuisance modérée.

Devenir

A l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort en vue d’analyses histologiques quantitatives.

Remplacement

Le projet a pour but d’évaluer, in vivo, l’impact de la période de la vie de l’animal (à l’adolescence ou au début des symptômes mnésiques à l’âge adulte) où l’exercice physique ralenti de façon optimale le déclin de mémoire associé à la MA. Un aspect important de ce projet est donc de pouvoir mesurer les capacités mnésiques des souris après l’exercice physique. Pour cela, un modèle animal est indispensable. De plus, nous allons étudier l’impact de l’activité sportive sur la physiologie de l’animal au niveau central (cerveau) et périphérique (sang, intestin…) où un dialogue et des interactions complexes se produisent entre le cerveau et les organes, des processus qui ne sont pas modélisables à ce jour.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe (n= 15) a été déterminé sur la base de nos études antérieures chez ce modèle murin et à l’aide de la littérature correspondante. Ce nombre est réduit au minimum pour permettre d’obtenir une puissance statistique suffisante pour les analyses statistiques nécessaires aux comparaisons intergroupes (8 groupes) et intra-groupes (comparaison des prélèvements à différents moments de la vie de l’animal). Ce nombre prend également en compte l’éventualité certains animaux ne montreront pas d’exercice physique volontaire en présence de la roue et seront donc retirés de l’étude. Ce nombre prend aussi en compte l’existence d’une variabilité inter-individuelle dans les études comportementales. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les animaux seront testés dans plusieurs tests comportementaux et nous utiliserons les mêmes animaux pour les études comportementales et post-mortem.

Raffinement

Les souris sont hébergées par 4 ou par 2 dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu’une buchette pour l’enrichissement. Les roues d’exercice seront retirées pendant la période d’inactivité (la journée) pour encourager le repos des animaux. Pour limiter le stress lié au déplacement des souris vers de nouvelles pièces et à la mise en contact avec de nouveaux objets lors des tests comportementaux, les souris disposeront de périodes d’habituation aux pièces et aux dispositifs. Pour chaque souris, le temps maximal de tests sera limité à 1h30 par jour. Deux jours de manipulation sont également prévus afin que les souris s’habituent à l’expérimentateur dans la salle des tests comportementaux. Une attention particulière sera portée aux souris pendant les périodes d’exercice physique où le poids sera surveillé 1 fois par semaine et comparé au poids de référence avant le début de l’activité sportive. De plus, les animaux seront suivis quotidiennement par des personnes formées au soin. Les critères évalués sont l’aspect général de l’animal (pelage, peau, yeux, bouche), les fonctions corporelles (respiration), le comportement (posture, locomotion, réaction à la manipulation, isolement) et le poids (pesée une fois par semaine). Pendant les chirurgies, les animaux seront placés sur une couverture chauffante permettant de contrôler leur température corporelle. Un gel oculaire sera appliqué afin d’éviter le dessèchement des yeux. Les animaux seront surveillés jusqu'à leur réveil complet (déplacements spontanés dans la cage, prise d'eau et de nourriture) et 6 heures plus tard. Après l’opération, l’animal sera isolé dans une cage propre contenant du papier ; il sera maintenu au chaud en prêtant une attention particulière à son hydratation et son état sera contrôlé. Les souris recevront une injection d'anti-inflammatoire après la chirurgie et le lendemain pour éviter les éventuelles douleurs post-opératoires. La cicatrisation de la plaie sera également contrôlée dans les jours suivant la chirurgie.

Choix des espèces

Dans cette étude, nous utiliserons une lignée de souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Cette lignée est l'un des modèles précliniques de MA les plus étudiés, en raison de l’évolution progressive de la pathologie, qui ressemble à ce qui est observé chez les patients atteints de MA. Les souris de cette lignée développent avec l’âge des plaques amyloïdes, comme chez le patient. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour étudier l’impact de l’exercice physique à diverses périodes de la vie, sur le déclin de mémoire lié à l’âge dans la MA. Les animaux les plus jeunes inclus dans le projet auront 28 jours (P28) (soit plusieurs jours après le sevrage) et les animaux les plus vieux auront 10 mois (adulte). Nous allons évaluer l’impact de l’exercice physique sur le déclin de mémoire lié à la MA en fonction la période de vie à laquelle l’exercice est pratiqué : pendant le développement post-natal (P28) ou au début des symptômes cognitifs (à 6 mois). Ceci explique que des animaux jeunes mais sevrés (P28) soient nécessaires.

Gavées chaque jour pendant trois jours, ou nourries pendant quatre-vingt-dix jours avec des contaminants alimentaires, 1 048 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements à la veine faciale sous anesthésie, sept prises de sang lors d'un test de tolérance au glucose et des pesées hebdomadaires, pour mesurer si perfluorés, phtalates, bisphénols et pesticides activent ensemble des récepteurs impliqués dans l'obésité. La plupart sont tuées par dislocation cervicale, une partie des femelles étant gardée pour l'entretien de la lignée et une partie des animaux surnuméraires utilisée pour l'entraînement aux gestes techniques. Le porteur écrit n'attendre "pas de nuisances particulières", sans expliquer ce qui vaut à 256 d'entre elles un niveau de souffrance modéré.

Objectifs

Les maladies métaboliques, telles que le diabète et l’obésité, sont en constante augmentation dans les pays industrialisés. L'origine de ces maladies est complexe et multifactorielle. Les causes premières d’apparition de ces troubles, lorsqu’ils ne sont pas d’origine génétique, sont liées à une alimentation riche en sucre et en gras et à un mode de vie sédentaire. L’exposition à certains produits chimiques, dits « obésogènes environnementaux » est également suspectée de jouer un rôle dans l’apparition et/ou l’évolution de ces maladies. Un certains nombre de senseurs appelés les récepteurs nucléaires jouent un rôle important dans la régulation de l'équilibre énergétique et pourraient être des médiateurs des effets de ces « obésogènes environnementaux » sur le développement de troubles métaboliques. Les contaminants étudiés sont les composés perfluorés, les phtalates, les bisphénols, les organoétains et les pesticides connus pour leur caractère obésogène et identifiés sur la base tests en laboratoire sans animaux, réalisé par un partenaire du projet. Ces composés seront administrés seuls puis en mélange par gavage oral à des souris exprimant ou non certains récepteurs nucléaires en aigu (3 jours) ou en chronique (90 jours). Des analyses sur les perturbations métaboliques induites par l’exposition à ces contaminants seront réalisées.

Bénéfices attendus

Ces données permettront d’évaluer l’impact d’expositions à des contaminants alimentaires sur l'activation des récepteurs nucléaires et sur les perturbations métaboliques qui en découlent. Les expositions aiguës permettront de mettre en évidence un éventuel effet combiné dans l'activation d'un récepteur nucléaire donné. Les expositions chroniques de 90 jours permettront de déterminer si les mêmes récepteurs sont activés de la même manière lors d'expositions à plus faibles doses sur des temps plus longs et de rechercher les différentes perturbations métaboliques qui peuvent en découler.

Procédures

Pour les 3 expositions aiguës, les souris seront exposées à des contaminants par gavage quotidien (30 secondes) pendant 3 jours. Un prélèvement à la veine faciale submandibulaire sera effectué sous anesthésie générale (30 secondes). Pour l'exposition chronique, les souris seront exposées à des contaminants par l'alimentation pendant 90 jours. Elles seront pesées chaque semaine pendant toute la durée de l'expérimentation (ce qui correspond à environ 13 pesées de 30 secondes). Sept prélèvements d'une goutte de sang seront réalisés pendant le test de tolérance au glucose, sous pommade anesthésique. Un prélèvement à la veine faciale submandibulaire sera effectué sous anesthésie générale. Ce prélèvement dure environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Nous n’attendons pas de nuisances particulières chez les animaux exposés. Les expositions seront à des doses ne présentant pas de toxicité pour les animaux. Un stress peut être généré par la manipulation et la contention des souris.

Devenir

Les animaux ayant servi à l'expérimentation sont euthanasiés par dislocation cervicale au terme de l'expérimentation. Nous conserverons une partie des femelles pour l’entretien de la lignée et une partie des animaux surnuméraires sera utilisée pour de la formation aux gestes techniques.

Remplacement

Les tests en laboratoire sans animaux, réalisés par une équipe partenaire permet une sélection de seulement 16 molécules ayant montré un potentiel synergique auxquelle s'ajouteront 4 molécules de référence. Cependant, seule une approche avec des organismes vivants entiers est capable d’évaluer les conséquences de l'activation synergique de récepteurs nucléaires et les dérégulations métaboliques qui en découlent.

Réduction

Chaque étape de protocole vise à sélectionner les molécules présentant un potentiel synergique élevé pour les étapes suivantes passant de 20 molécules avec 5 doses à 8 molécules avec une seule dose. Si aucune molécule ne synergise ou n'active un récepteur donné, aucune molécule ne sera sélectionnée pour ce récepteur, réduisant ainsi le nombre de lots prévu lors des procédures suivantes.

Raffinement

La mise en place de d'abris en inox permettra aux animaux de s'isoler au besoin. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront habitués à la préhension par les zootechniciens. Un analgésique local est prévu pour les prélèvements de sang pendant le test de tolérance au glucose. Une anesthésie générale est prévue pour les prélèvements de sang précédant la mise à mort. En cas d’atteinte d’un des points limites établis, l'animal sera retiré de l'étude, anesthésié et euthanasié si les lésions observées sont jugées irréversibles . Les animaux seront hébergés sans dépasser 6 adultes par cage conformément recommandations liées au bien-être animal.

Choix des espèces

Nous utiliserons pour ce projet des souris d'une lignée particulièrement adaptée aux les études de perturbations métaboliques. Ce fond génétique nous permet d’utiliser des souris invalidées pour les récepteurs nucléaires d'interet, de manière à mieux évaluer leurs rôles dans les perturbations métaboliques induites par l’exposition aux contaminants alimentaires. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte car nous nous intéressons à l'effet des contaminants sur le métabolisme de l'individu adulte.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 60 d'entre elles et modéré pour 240. Elles sont gavées chaque jour pendant quatorze jours, et une colite leur est provoquée chimiquement sans aucun anti-inflammatoire, l'inflammation étant l'objet même de l'étude. Il s'agit de vérifier si neuf enzymes du microbiote intestinal aggravent les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, hypothèse déjà testée in vitro sur les selles de patients. Le porteur conclut que le recours aux animaux non-humains est "indispensable", une approche in vitro excluant selon lui les interactions survenant chez l'hôte.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) telles que la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH) constituent l’un des désordres les plus courants du tube digestif et représentent un véritable problème de santé publique. Leur incidence est en augmentation dans le monde entier. Ces maladies provoquent une inflammation continue du système digestif, associée à des douleurs abdominales récurrentes, fatigue, diarrhée et altèrent la qualité de vie des patients. Bien que les traitements actuels réduisent les symptômes de la maladie, aucun d’entre eux n’est curatif et tous présentent plusieurs limites liées à des problèmes d’intolérance, de perte de réponse et des effets secondaires souvent graves. D’autres voies thérapeutiques font donc l’objet de recherches. Plusieurs études ont démontré que l'activité des protéases à sérine augmente chez les patients et qu’elle participe à la dégradation de la paroi intestinale et au maintien de l'inflammation. Notre équipe a récemment démontré qu’en plus de l’hôte, le microbiote intestinal représente un véritable réservoir de protéases à sérine qui pourraient également contribuer à l’apparition de la maladie. Dans le cadre de ce projet, notre intérêt s'est porté sur le rôle des enzymes venant du microbiote intestinal dans l’initiation et la progression des MICI. L’analyse in silico du métagénome intestinal (génome du microbiote intestinal) a montré qu’il contient des gènes codant pour des protéases à serine, et que ces gènes sont sur-représentés dans le métagénome intestinal de patients souffrant de MICI. Les protéases bactériennes dont les gènes sont plus abondants chez les patients ont déjà fait l'objet d’analyse in vitro. Les résultats obtenus ont révélé que l’activité protéolytique de neuf protéases est détectable dans les fèces des patients et que ces activités augmentent significativement en cas d’inflammation digestive. Ces observations suggèrent que les protéases à sérine bactériennes auraient un effet pro-inflammatoire jusqu’à maintenant inexploré. Le but de ce projet est de valider, chez un modèle de souris le potentiel effet de neuf nouvelles protéases à sérine codées par le microbiote intestinal dans l’initiation et la progression des MICI. En fonction des résultats i) les mécanismes d’action de ces protéases dans la pathogénie seront proposés et ii) de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les protéases à serine bactérienne pourraient être adoptées pour traiter les MICI.

Bénéfices attendus

La compréhension du rôle des protéases à serine codées par le microbiote intestinal dans l’inflammation et leur mécanisme d’action pourrait permettre d’envisager à l’avenir de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’inhibition de ces protéases.

Procédures

- Gavage des animaux vigiles (300 souris) tous les jours pendant 14 jours (J1 à J14). Les souris seront gavées le J14 matin après une mise à jeun de 4 heures. La durée du geste est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris). - Prélèvements fécaux (2 ou 3 fèces) pour les 300 souris tous les jours pendant 14 jours (J1 à J14) . Les fèces seront émis naturellement à l’occasion de la pesée des animaux et de l’examen clinique. La durée du geste pour est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris). - Mise à jeun des 300 souris à J14 matin pendant 4 heures, Un prélèvement de sang sur les souris vigiles sera effectué à J14. La durée du geste pour la prise de sang est minimisée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris) afin de limiter au maximum le stress de l’animal. Un prélèvement de sang sera effectué à la fin de la procédure. La durée du geste est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris).

Impact sur les animaux

Comme une colite expérimentale sera induite, de la douleur est attendue. Aucun anti-inflammatoire n'est prévu, puisque l'inflammation sera l'objet de l'étude. Cependant, l’administration de DSS sera limitée à 7 jours.La souffrance et le stress liée à la manipulation sera (essentiellement lors du gavage (fausse route) et de la prise de sang (douleur), et de la pesée (léger stress).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes.

Remplacement

Préalablement aux essais sur les animaux, nos tests in vitro ont démontré que l’activité des protéases à serine codées par le microbiote intestinal augmente chez les sujets malades comparativement aux sujets sains. De plus, les analyses métagénomiques suggèrent que le déséquilibre de ces activités protéolytiques est associé à l’état de dysbiose observé chez les patients souffrant de MICI. Sur la base des tests préliminaires in vitro, nous avons sélectionné les neuf protéases les plus abondantes et les plus actives chez les patients atteints de MICI comparativement aux sujets sains. L’ensemble de ces tests préliminaires suggèrent que les protéases à sérine codées par le microbiote intestinale semblent avoir un effet pro-inflammatoire qui reste jusqu’à maintenant inexploré. Les mécanismes impliqués dans le développement des MICI mettent en jeu des interactions complexes entre l’hôte et le microbiote, qui sont impossibles à reproduire dans un modèle cellulaire ou de culture d’organe. Ainsi, utiliser uniquement une approche in vitro pour ce projet exclurait les différentes interactions pouvant survenir chez l’hôte. Le recours aux animaux est alors indispensable.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été défini en se basant sur des études précédentes publiées dans la littérature scientifique, mais aussi grâce à un test de puissance afin d’incorporer un nombre minimum d’animaux tout en gardant la possibilité d’obtenir des résultats statistiques significatifs.

Raffinement

Les souris seront hébergées par 5 dans des cages collectives. L’eau et la nourriture seront disponibles à volonté et les paramètres ambiants seront contrôlés régulièrement (température, humidité…). Un enrichissement de leur milieu sera mis en place afin de favoriser le bien-être des animaux et se matérialisera par du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter, des tunnels en carton pour se cacher et des tiges métalliques pour grimper. La durée d'administration du produit chimique qui induit l’inflammation sera courte (7 jours) afin de révéler l’effet de la protéase sur l’inflammation tout en limitant au strict nécessaire le développement des lésions. Au cours de l’étude, les souris seront examinées individuellement de façon quotidienne ce qui permettra de réagir le plus rapidement possible en cas d’inflammation trop invalidante. Un léger stress est anticipé suite à la pesée des animaux. De plus, des points limites seront définis et un examen clinique individuel quotidien sera réalisé. Cela permettrait d'intervenir de façon appropriée si un problème survenait et de décider l’euthanasie des souris atteignant les points limites définis.

Choix des espèces

Les souris sont couramment utilisées pour étudier la physiologie intestinale ainsi que ses maladies. Ce modèle est facile à gérer (petite taille, très facile à manipuler et la maladie est facile à mettre en place). La colite expérimentale provoquée par le produit chimique utilisé dans ce projet chez la souris est un modèle reconnu des maladies inflammatoires chroniques intestinales humaines. Il reproduit plusieurs caractéristiques physiopathologiques de l’inflammation intestinale développée par l'être humain. Ainsi, ce modèle sera utilisé pour étudier l’impact des enzymes produites par le microbiote intestinal dans le contexte de MICI. Au commencement de l’expérience, les souris seront de jeunes adultes (6-7 semaines), ce qui correspond à un âge où le métabolisme ainsi que le système immunitaire de cette espèce sont matures. Ceci limite leur fragilité et permet alors d’obtenir un modèle animal qui reflète au mieux la physiologie de l’être humain adulte, âge de plus grande fréquence d'apparition des maladies inflammatoires de l'intestin.

Tester si huit aliments fermentés africains protègent contre l'inflammation intestinale suppose d'abord de provoquer cette inflammation. 200 souris reçoivent du DSS pendant sept jours pour déclencher une colite, la souffrance attendue étant déclarée légère pour la moitié d'entre elles et modérée pour l'autre. Chacune est gavée tous les jours pendant vingt-quatre jours, subit un prélèvement de fèces quotidien, une mise à jeun de quatre heures et deux prises de sang, avant d'être tuée pour prélèvement du côlon. Le porteur rappelle que l'effet de ces aliments a déjà été testé in vitro sur des protéases humaines et fécales, et conclut malgré tout que le recours aux animaux est "indispensable".

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) constituent l’un des désordres les plus courants du tube digestif et représentent un véritable problème de santé publique. Les MICI se caractérisent par une inflammation chronique du système digestif altérant la qualité de vie des patients. Malgré une incidence croissante et un impact socio-économique majeur, il n’existe actuellement aucun traitement curatif. De plus, les options thérapeutiques actuelles présentent des limites incluant intolérances, pertes de réponse, et effets secondaires souvent graves. D’où l’intérêt de la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les MICI sont des maladies complexes et multifactorielles dont la physiopathologie n’est que partiellement élucidée. Elles affectent des sujets génétiquement prédisposés chez lesquels le dialogue entre le microbiote intestinal et le système immunitaire est déséquilibré. En plus de la dysbiose du microbiote intestinal, de nombreux arguments plaident en faveur du rôle clé des protéases exprimées par l’hôte et le microbiote dans la survenue des MICI. L’augmentation de l’activité de ces enzymes induit des altérations de l’épithélium intestinal et favorise le maintien de l’inflammation. Malgré l’implication démontrée du déséquilibre du microbiote et de l’activité de ces enzymes dans l’inflammation digestive, leur potentiel en tant que cible thérapeutique est peu étudié. Or l’activité de ces protéases peut être régulée par le microbiote intestinal, lui-même étant directement modulé par l’alimentation. L’analyse des données bibliographiques montre que les aliments fermentés permettent de ré-équilibrer la composition du microbiote intestinal. D’autre part, nos études préliminaires in vitro ont montré que 8 aliments fermentés africains (Mabisi, Omashikua, Omaere, M'bannick, Pendidam, Kétoungol, Itutu, Cheka Mwaka) contiennent naturellement des antiprotéases inhibant significativement des protéases surexprimées chez les patients atteints de MICI. Cela suggère un fort potentiel des produits de lait fermenté africains pour lutter contre l’inflammation intestinale.Dans le cadre de ce projet, notre intérêt s'est porté sur le potentiel protecteur des produits fermentés africains contre l’inflammation intestinale induite chez un modèle de souris. Ce projet vise à étudier l’impact des aliments fermentés africains sur i) la composition du microbiote intestinal, ii) les activités protéolytiques et iii) par conséquent sur l’inflammation digestive

Bénéfices attendus

Les données acquises permettront de confirmer l’impact de chaque aliment fermenté sur les maladies inflammatoires de l’intestin. En fonction des résultats, de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur les aliments fermentés et ciblant les protéases, dont les activités sont augmentées lors de l’inflammation chronique de l’intestin, pourraient être adoptées pour gérer ces maladies.

Procédures

- Gavage des animaux vigiles (200 souris) tous les jours pendant 24 jours (J1 à J24). Les souris seront gavées le J14 matin après une mise à jeun de 4 heures. La durée du geste est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris). - Prélèvements fécaux (2 ou 3 fèces) pour les 200 souris, tous les jours pendant 24 jours (J1 à J24) Les fèces seront émis naturellement à l’occasion de la pesée des animaux et de l’examen clinique. La durée du geste est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris). - Mise à jeun des 200 souris une fois pendant 4 heures. Deux prélèvements de sang sur les souris vigiles sera effectué à J24. La durée du geste pour les prises de sang est évaluée à quelques minutes par souris (3 à 5 minutes/souris).

Impact sur les animaux

Comme une colite expérimentale sera induite, de la douleur est attendue. La souffrance liée à la manipulation sera essentiellement lors du gavage (fausse route) et de la prise de sang (douleurs). Notons que le prélèvement des fèces et la pesée des souris sont caractérisés par une faible nuisance associée à un léger stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes tels que le colon et étudier les effets des aliments fermentés sur l'inflammation.

Remplacement

Préalablement aux essais sur les animaux, l’effet des aliments fermentés a été testé in vitro aussi bien sur des protéases humaines impliquées dans l’inflammation intestinale que sur des protéases fécales issues de sujets sains et malades. Ces tests in vitro constituent un premier argument qui suggère que les produits de lait fermenté africains pourraient réguler les activités protéolytiques et en conséquence diminuer l’inflammation digestive. Comme le régime alimentaire peut moduler la composition du microbiote intestinal, lui-même étant impliqué dans la balance protéolytique et la pathogenèse des MICI, il est alors nécessaire d’étudier à la fois la réponse de l’hôte et du microbiote lors de l’exploration de l’effet des aliments. Cependant, le développement des MICI met en jeu des interactions complexes au sein de l’hôte, qui sont impossibles à reproduire dans un modèle cellulaire ou de culture d’organe. Utiliser uniquement une approche in vitro pour ce projet exclurait ainsi les différentes interactions pouvant survenir chez l’hôte. Le recours aux animaux est alors indispensable pour tester l’impact des aliments fermentés sur l’équilibre protéolytique, leur impact sur la composition du microbiote et pour valider en conséquence leur effet sur la maladie.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été défini en se basant sur des études précédentes publiées dans la littérature scientifique ainsi que sur des essais préliminaires réalisés par des collègues, mais aussi grâce à un test de puissance afin d’incorporer un nombre minimum d’animaux tout en gardant la possibilité d’obtenir des résultats statistiques significatifs. Comme il sera en pratique impossible d'étudier simultanément les 8 aliments fermentés sélectionnés, car cela représenterait un trop grand nombre de souris à la fois, nous conduirons ainsi l'étude en 2 séries permettant de tester chacune l’effet de 4 aliments fermentés différents. Le nombre d’animaux pour chaque série est alors de 10 groupes * 10 souris = 100 souris, soit au totale 2 séries * 100 = 200 souris pour l’ensemble de ce projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées par 5 dans des cages collectives. L’eau et la nourriture seront disponibles à volonté et les paramètres ambiants seront contrôlés régulièrement (température, humidité…). Un enrichissement de leur milieu sera mis en place afin de favoriser le bien-être des animaux et se matérialisera par du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter, des tunnels en carton pour se cacher et des tiges métalliques pour grimper. La durée d'administration du produit chimique qui induit l’inflammation sera courte (7 jours) afin de révéler l’effet des produits de lait fermenté sur l’inflammation tout en limitant au strict nécessaire le développement des lésions. Au cours de l’étude, les souris seront examinées individuellement de façon quotidienne ce qui permettra de réagir le plus rapidement possible en cas d’inflammation trop invalidante. Notons que des points limites seront mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Les rongeurs, en particulier la souris, sont des animaux couramment utilisés pour l’étude de la physiologie intestinale ainsi que ses maladies. Le modèle de colite induite par le produit chimique utilisé dans le projet chez la souris est l’un des modèles les plus couramment utilisés et les mieux documentés. Il reproduit un grand nombre de caractéristiques de la colite chez l'être humain (augmentation de la perméabilité de l’intestin, diarrhée et présence de sang fécal, …). Ceci explique l’utilisation de ce modèle lors des études antérieures sur ces maladies et également pour ce projet. Au commencement de l’expérience, les souris seront de jeunes adultes (6-7 semaines), ce qui correspond à un âge où le métabolisme ainsi que le système immunitaire de cette espèce sont matures. Ceci limite leur fragilité et permet alors d’obtenir un modèle animal qui reflète au mieux la physiologie de l’être humain adulte, âge de plus grande fréquence d'apparition des maladies inflammatoires de l'intestin.

1 836 souris vont être utilisées et toutes tuées, chacune pouvant recevoir jusqu'à 84 administrations de composés et subir jusqu'à douze prélèvements sanguins sur animal éveillé. Une colite leur est provoquée par du DSS, que le porteur décrit comme une substance corrosive et irritante, ou par du TNBS, une solution acide qui brise la barrière intestinale, avec ulcérations et diarrhées hémorragiques à la clé. Pour 204 d'entre elles la souffrance attendue est déclarée légère, pour 1 632 elle est modérée. La rubrique consacrée à la réduction annonce un effectif "réduit au minimum nécessaire (N=12 maximum)", sans expliquer comment ce maximum se concilie avec les 1 836 animaux du projet.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier l’effet de nouveaux agents pharmacologiques à caractère anti-inflammatoire dans un modèle de colite aiguë ou chronique induite par l’administration de DSS (Dextran Sodium Sulfate) ou par l’administration d’un produit chimique : le TNBS (2.4.6-trinitrobenzene sulfonic acid). 250000 personnes sont atteintes en France d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin. Ces maladies digestives sont des maladies dont on ne guérit pas aujourd'hui. Le DSS est une substance corrosive et irritante qui va créer des lésions au niveau de la barrière intestinale. Administré quotidiennement aux animaux, le DSS provoque une très forte inflammation intestinale accompagnée d’ulcérations et de diarrhées hémorragiques. Ce modèle d’inflammation est particulièrement utilisé pour cibler les mécanismes inflammatoires au niveau de l’intestin. Le TNBS est une solution acide qui induit une inflammation du colon très reproductible. Administré aux souris, le TNBS brise la barrière intestinale et pénètre dans la paroi de l’intestin. Il va provoquer une inflammation significative caractérisée par une perte de poids et des diarrhées hémorragiques. La pathologie induite par le TNBS mime la maladie de Crohn chez l’Homme. Cette pathologie, aux causes inconnues, ne bénéficie pas encore de traitement. Un modèle murin d’inflammation intestinale est donc un bon modèle pour avancer sur la compréhension et le traitement de cette maladie. La phase préclinique qui consiste à étudier l’action des agents pharmacologiques in vivo chez le rongeur est une étape essentielle dans le développement de médicaments à visée anti-inflammatoire.

Bénéfices attendus

A l'heure actuelle il n'existe aucun traitement curatif des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). En cas de rectocolite hémorragique, des 5‑aminosalicylés (5‑ASA) sont le plus souvent prescrits dans les formes débutantes et de sévérité faible à moyenne. Ces derniers ne sont pas efficaces dans la maladie de Crohn, pour laquelle les corticoïdes sont privilégiés. Mais leur utilisation doit être limitée en raison de leurs effets secondaires à moyen et long terme. En cas de maladie évolutive, les médecins instaurent rapidement un traitement immunomodulateur ou immunosuppresseur, pour stopper les crises et éviter l’apparition de nouvelles lésions. Ces médicaments permettent de réguler l’immunité des patients et réduire l’inflammation à long terme. La moitié des patients répondent bien aux biothérapies à leur démarrage. Mais le traitement finit par ne plus être efficace chez la moitié d’entre eux, le plus souvent après deux ans d’utilisation : il faut alors changer de molécule. C’est pourquoi le but de ce projet est de tester de nouvelles molécules thérapeutiques anti-inflammatoires dans ces pathologies.

Procédures

Anesthésie générale : une injection (30 secondes/souris, induction modèle TNBS). Prélèvements de sang : maximum 12 prélèvements (1 fois par semaine maximum, 30 secondes/souris) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal (30 secondes/souris). Administrations de composés : maximum 84 administrations (30 secondes/souris)

Impact sur les animaux

Le developpement de la maladie va entrainer une douleur liée à l'inflammation intestinale ainsi qu'une déshydratation liée aux diarrhées (durée des diarrhées = 1 à 3 jours). L’administration de traitement par injection répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements entraîne une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et le produit injecté va permettre, selon l’efficacité des molécules, de réduire la maladie (douleurs inflammatoires intestinales).

Devenir

Mise à mort de tous les animaux à la fin de la procédure afin de prélever des tissus biologiques permettant de réaliser des analyses pour vérifier l'efficacité des candidats médicament sur la maladie

Remplacement

Nous proposons dans ce projet de mettre en place un modèle d’inflammation du colon chez la souris afin de pouvoir tester in vivo l’efficacité de nouvelles thérapies dans le cadre d’une monothérapie ou d’une combinaison thérapeutique. Les souris sont les plus petits animaux chez qui la réponse inflammatoire peut être étudiée. Les tests précliniques permettent de caractériser les réponses immunitaires au niveau cellulaire et moléculaire qui sont les plus développés. Les méthodes substitutives à l’expérimentation animale telle que la culture cellulaire ou la modélisation informatique ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament. A l’heure actuelle, des organoïdes de différents systèmes biologiques (notamment le système respiratoire) sont en cours de développement dans le monde entier. Cependant, le microbiote est un constituant majeur de l’environnement intestinal. Il est cependant absent des organoïdes produits in vitro. Par conséquent, à ce jour aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire (N=12 maximum), dû à la variabilité individuelle observée pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations.

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être et détecter toute douleur au moment de l’expérimentation. Les souris sont hébergées dans des cages de 530cm2 au nombre de 6 maximum en portoir ventilé enrichies avec : des cylindres de coton, des frisures kraft, des cercles en carton, ainsi que des dômes et des tunnels carton. Les animaux auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et suivront un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. En prévention d’une éventuelle déshydratation liée à l’apparition des diarrhées, des croquettes humides ou du gel hydratant seront déposés dans les cages à partir de J0. Des points limites prédictifs sont mis en place ainsi qu'une prise en charge de la douleur avec l'utilisation d'un analgésique.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - Les souris seront utilisées de l’âge de 8 semaines à 18 mois. A ce stade de développement, les organes sont à maturité et cela nous permet d’étudier des animaux du stade jeune adulte au stade âgé. - Génétique est bien connue - Animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques - Modèle établi et maîtrisé dans notre laboratoire depuis plusieurs années Les animaux sont utilisés au stade adulte et âgés de 8 semaines à 18 mois afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature, et cela nous permet d’étudier des animaux du stade jeune adulte au stade âgé. Les paramètres étudiés étant l’évaluation du degré de l’inflammation après administration de DSS ou TNBS, une souris juvénile induira un biais dans l’expérimentation. Les âges seront homogènes au sein d'une même étude.