Système gastrointestinal

Une partie des 960 souris est rendue colitique par un stimulus inflammatoire, les autres restant indemnes pour la comparaison, toutes reçues à l'âge de trois semaines et en pleine croissance. Elles absorbent un métabolite de fongicide présent dans l'eau potable, seul ou en cocktail avec d'autres polluants, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit des gavages sous anesthésie locale et deux tests d'anxiété au maximum, qui consistent à placer chaque souris seule sur une structure à découvert ou surélevée, et parle d'inconfort plutôt que de douleur. Toutes sont tuées pour des prélèvements terminaux destinés à mesurer la motricité et la perméabilité intestinales.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : 1) Evaluer l’impact d’une exposition à un polluant (métabolite de fongicide) d’origine hydrique (seul ou en cocktail avec d’autres polluants) sur les fonctions digestives et comportementales dans un modèle murin 2) Savoir si la présence de ce polluant dans l’eau potable peut être un facteur de risque pour le développement de maladies chroniques.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre : 1) de savoir si une exposition in vivo à un polluant d'origine hydrique peut être un facteur de risque pour le développement de maladies chroniques inflammatoires digestives (colite). 2) de définir des doses et durée d’exposition de polluants potentiellement à risque pour la santé. 3) d’évaluer le risque potentiel d’un effet « cocktail » de l’association de plusieurs polluants connus de l’eau potable sur la santé.

Procédures

Dans ce projet, aucune procédure chirurgicale ne sera effectuée. Si les manipulations des animaux sont peu douloureuses, elles peuvent présenter un certain inconfort. Les tests comportementaux d'anxiété (2 maximum) nécessitent de placer les animaux individuellement dans un environnement modérément anxiogène (structures à découvert avec ou non plancher surélevé). Toutefois ces tests sont de très courte durée (< 10 minutes) et après chaque test, les animaux sont rapidement replacés dans leurs cages avec leurs congénères. Pour les études d'explorations digestives, une étape de gavage (1 ou 2 fois selon la procédure) nécessitant la contention de l'animal est appliquée. Cette procédure réalisée par un expert et sous anesthésie locale, ne dure pas plus de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, stress et douleur peuvent être générés par les différentes expérimentations comme le gavage et les prélèvements sanguins pour l’exploration fonctionnelles digestive in vivo ou encore les changements d’environnement dans les tests comportementaux. Ces effets seront limités autant que possible grâce à l’expertise des gestes techniques de l’expérimentateur.

Devenir

Mise à mort de toutes les souris à l’issue des procédures. Des prélèvements terminaux seront réalisés pour des expériences ex vivo de motricités et de perméabilités intestinales ainsi que pour des études transcriptomiques, protéomiques et immunohistochimiques.

Remplacement

Dans ce projet, les effets recherchés de l’exposition aux polluants portent sur plusieurs organes (cerveau, intestin, microbiote) dont les interactions complexes ne peuvent être modélisés in vitro ce qui justifie l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Sur la base d’expérimentations animales similaires et grâce à l’utilisation d’outil biostatistiques, le nombre minimum d’animaux à utiliser par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80% dans cette étude a été déterminé.

Raffinement

Le bien-être animal (temps d’acclimatation, hébergement, enrichissement, activité, comportement, alimentation, hydratation) sera pris en compte tout au long de l’expérimentation. Pour l’ensemble des procédures, des points limites sont mis en place et décrits dans chacune d’elle.

Choix des espèces

Le modèle C57 bl/6J est utilisé dans de nombreux projets au sein laboratoire. Notre unité possède ainsi une expertise reconnue pour l’étude des fonctions digestives et l’étude du comportement chez cette souche de souris et nous permet de ne pas utiliser trop d’animaux. Les animaux arriveront à l’âge de 3 semaines et seront en pleine croissance. L’utilisation de jeunes animaux permettra de mettre en évidence d’éventuels défauts de croissance / développement dus aux polluants.

5 652 souris et 1 296 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mères subissent des injections et des gavages à l'état vigile, une césarienne sous anesthésie, une perfusion de deux heures et une traite de quinze à trente minutes, tandis qu'une partie de la descendance reçoit un produit chimique déclenchant une colite pendant deux cycles de six jours. Les régimes imposés aux mères simulent un retard de croissance intra-utérin ou un diabète gestationnel, pour observer les conséquences sur l'immunité intestinale des petits, tués à trois ou cinq semaines. Aucun modèle cellulaire in vitro ne pourrait reproduire l'intégralité de ces interactions, affirme le porteur, qui annonce par ailleurs recourir à des organoïdes intestinaux pour l'analyse fine des mécanismes.

Objectifs

La période périnatale (gestation et allaitement) est une période déterminante pour le développement de l'immunité chez le bébé. Certaines complications pendant la grossesse, comme un retard de croissance du bébé dans l'utérus ou le diabète gestationnel, augmentent le risque que l'enfant développe plus tard des maladies inflammatoires chroniques. Et nous manquons encore de données scientifiques pour comprendre précisément comment ces problèmes perturbent l’immunité du bébé et comment cela perdure dans le temps. Nous utilisons différents régimes alimentaires sur des modèles de rongeurs pour simuler ces complications de la grossesse et étudier leur impact sur le développement de l’immunité du bébé et si cela augmente le risque de maladies chroniques intestinales à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer ou d’infirmer notre hypothèse quant au problème de transfert de l’immunité de la mère à son bébé lors de complications de la grossesse. Notre projet permettra d’identifier les acteurs et les mécanismes mis en jeu, responsables du problème initial et à l’âge adulte. Il permettra de trouver le ou les nutriments manquants pour restaurer les défauts. Le projet devrait ainsi fournir des bases scientifiques pour de futurs essais cliniques afin d’améliorer la santé de la maman et de son bébé, réduisant l'impact des maladies inflammatoires chroniques chez le futur adulte en vue de l'amélioration de la santé de toute la population.

Procédures

Nos deux premiers groupes d'animaux recevront 2 à 3 injections à l'état vigile, et notre troisième groupe, à l'état vigile, recevra 4 administrations par voie orale. Chacun de ces actes sera d’une durée réduite de quelques secondes à 1 minute. Le prélèvement de lait réalisé sous anesthésie durera entre 15 et 30minutes. L'étude des flux de nutriments nécessite de réaliser une perfusion sur animal anesthésié d'une durée de 2h. Les animaux subiront un seul acte chirurgical, une césarienne, effectué sous anesthésie et analgésie, la durée de cet acte est de 10 à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Pour nos trois procédures expérimentales, les préhensions, injections ou administrations par voie orale sur les animaux vigiles devraient constituer un stress et une douleur de faible intensité et d’une durée réduite de quelques secondes à 1 minute, il s'agit d'actes expérimentaux de sévérité légère. Néanmoins, la réalisation consécutive de plusieurs actes expérimentaux incluant nos manipulations à l'état vigil, cités précédemment, avec des actes sur animaux anesthésiés et sous anti-douleur, requalifie nos procédures 1 et 2 en procédures de sévérité modérée. Notre procédure 3 constitue une procédure de sévérité modérée. En effet, l’administration du produit induisant la colite, a un impact modéré au dosage administré au vu des tests déjà effectués au sein de notre animalerie. Cet acte expérimental devrait occasionner une inflammation de grade modéré au niveau du côlon distal durant les deux cycles de 6 jours de traitement. Celle-ci peut être associée à des selles molles ou des diarrhées et une perte modérée de poids. L’arrêt de l’administration du produit (remplacé par de l’eau de boisson seule) entraîne l’arrêt progressif de ces symptômes et une récupération de l’état physiologique normal au bout de 4 jours. Pour toutes nos procédures, l’habituation à la préhension et l’administration par voie orale par des techniciens expérimentés, et l’utilisation de sondes souples, réduira les nuisances à leur niveau minimum. Les animaux auront une inflammation modérée du côlon, ou colite, qui durera 6 jours sur deux périodes espacées d'une période de 14 jours. Cette inflammation peut être associée à des selles molles ou des diarrhées et une perte modérée de poids. L’arrêt du traitement inflammatoire au bout des 6 jours entraine l’arrêt progressif de ces symptômes et un retour à la normale dès 4 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organe.

Remplacement

Notre étude implique de suivre l’évolution physiopathologique de la transmission de l’immunité de la mère à sa descendance en situation de complications de la gestation tels que le retard de croissance intra-utérin ou le diabète gestationnel, et d’analyser les conséquences sur la santé intestinale de l’adulte en devenir. L’utilisation d’animaux est indispensable dans les études évaluant l’impact au long cours des complications de la gestation qui sont initiées in utero et qui nécessitent d’étudier l’interface mère-enfant. Par ailleurs, notre projet de recherche implique des interactions multi-systèmes complexes, tels que le microbiote intestinal, l’écosystème microbien le plus riche sur terre, et la muqueuse intestinale, qui met en jeu un système immunitaire très dense. Il n’existe pas de modèle cellulaire in vitro pouvant reproduire l’intégralité de ces interactions. Néanmoins, nous envisageons d’utiliser, pour les analyses plus précises des mécanismes en jeu, des systèmes in vitro de culture cellulaire et des cultures d’organoïdes intestinaux.

Réduction

Ce projet de recherche sur cinq ans implique l'utilisation d'un total de 5652 souris et 1296 rats pour trois procédures distinctes. Le nombre d'animaux par procédure a été déterminé en tenant compte de la variabilité intra- et intergroupe inhérente à l'expérimentation in vivo, avec un minimum de trois répétitions indépendantes pour assurer la reproductibilité des résultats. Cette stratégie permettra une évaluation statistique robuste des effets des régimes alimentaires sur les réponses immunitaires placentaires et intestinales, ainsi que sur l'inflammation intestinale, en incluant des analyses statistiques guidées par des logiciels et des références bibliographiques d’aide à la décision statistique. Ces différents outils nous ont permis de déterminer le nombre optimal d’animaux par groupe pour obtenir des résultats significatifs permettant de répondre à nos hypothèses. Enfin, les schémas expérimentaux et le nombre d'animaux associés à chaque procédure ont été validés par les statisticiens de l'équipe pour garantir leur robustesse et leur efficacité dans la génération de données scientifiques fiables.

Raffinement

L’environnement des souris sera enrichi (tunnel, bâton à ronger, frisottis, dôme). Après deux semaines d'acclimitation à leur environnement les femelles seront mises en reproduction. Une observation hebdomadaire avec suivi du poids des animaux sera réalisée dès leur arrivée dans l’animalerie de façon à identifier un éventuel problème. Les quatre gavages de la procédure 3 seront effectués par un personnel animalier expérimenté et ils seront réalisés en utilisant des sondes fines et souples. Lors de l’induction de l’inflammation intestinale (colite par traitement chimique), les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel animalier compétent pour détecter d’éventuels signes de souffrance. L’évaluation de l’état des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique -pelage, posture-, activité, comportement, fréquence respiratoire). Si une douleur était constatée chez un animal durant le traitement induisant la colite, un analgésique de type central sera administré. Les points limites définis conduiront, s’ils sont observés, à la mise à mort des animaux le cas échéant.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée en nutrition, est idéale pour les études sur les régimes obésogènes, les colites expérimentales et l'âge maternel avancé. Elle offre l'avantage d'être immunologiquement bien caractérisée et d'accéder à de nombreux modèles génétiquement modifiés dans ce fond génétique. La ratte est un modèle maîtrisé au laboratoire, est adaptée à l’étude du retard de croissance intra-utérin induit par un régime pauvre en protéines. Son système immunitaire, proche de celui de l’humain, renforce le potentiel translationnel des résultats. Ce modèle permet également d’évaluer, lors de transferts de microbiote, d’éventuels obstacles interespèces liés à des spécificités microbiennes d’hôte. Ces analyses anticipent la faisabilité du transfert de microbiote humain à murin et ajustent le choix du modèle axénique. De façon à étudier l’effet de l’âge maternel sur le transfert immunitaire de la mère à la descendance, les animaux (rattes et souris) commandés auprès de l’établissement éleveur, pour la première partie du protocole, seront âgés soit de 7 semaines soit de 24 semaines. Après une phase d’acclimatation de deux semaines, les animaux seront mis en reproduction. De façon à étudier l’effet de nos différents régimes sur le transfert d’immunité de la mère à la descendance, une partie des mères gestantes et des fœtus sera mise à mort au dernier tiers de la gestation. L’autre partie des animaux sera maintenue sous leurs régimes respectifs jusqu’au sevrage. Au sevrage, les mères seront traites pour récupération du lait puis mises à mort pour l’analyse de populations immunitaires intestinales. Les petits âgés de 3 semaines seront alors mis à mort pour l’analyse des marqueurs de maturation immunitaire intestinale ou seront placés sous régime contrôle. L’évolution de leur maturation immunitaire sera étudiée et les derniers groupes de descendants seront mis à mort à 5 semaines de vie. Pour la troisième partie du projet, les souris axéniques, sans germe, âgées de 3-4 semaines seront commandées auprès de l’établissement éleveur de façon à réaliser immédiatement à leur arrivée un transfert microbien en période de sevrage. Une partie des animaux sera mise à mort à l’âge de 8 semaines avant l’induction de la colite pour regarder l’état de maturation immunitaire puis à 4 temps différents au cours de la colite pour suivre l'évolution inflammatoire et mimer la pathologie humaine.

Dès l'âge de 4 ou 6 semaines et jusqu'à 60 semaines, des souris, des rats et des hamsters dorés reçoivent une alimentation hypercalorique, avec ou sans boissons enrichies en fructose, en éthanol ou en composé pro-inflammatoire, pour provoquer obésité, diabète ou stéatose du foie. 4 750 rongeurs, soit 2 750 souris, 500 rats et 1 500 hamsters dorés, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés testés une à deux fois par jour, par la bouche, sous la peau, dans l'abdomen ou dans une veine sous anesthésie, subissent trois prises de sang et passent à trois reprises 40 heures seuls en cage sans enrichissement, et 24 heures sur grille en cage métabolique en fin de projet. Le porteur retient le hamster parce qu'il "consomme spontanément" l'éthanol, et invoque la hausse de la consommation d'alcool depuis la pandémie de COVID-19. En fin de projet, tous sont tués pour prélever leurs tissus et leur sang.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, le rat et le hamster, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

Pour vérifier si la graisse corporelle protège le foie des polluants, 192 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection déclenche chez elles une fonte progressive du tissu adipeux, de 50 % en un mois et de 80 % en trois mois, puis elles reçoivent les polluants par gavage hebdomadaire et subissent des tests de tolérance mensuels au glucose et à l'insuline, avec prélèvements sanguins à la queue. Le porteur affirme que ce dialogue entre organes ne peut être étudié hors d'un organisme vivant. Il ajoute que si un effet apparaît, les mécanismes seront ensuite explorés sur des modèles cellulaires déjà utilisés au laboratoire.

Objectifs

Les maladies non-alcooliques du foie (i.e. NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease) sont devenues une priorité de santé publique à cause de leur prévalence grandissante (20% de la population générale et plus 70% des personnes obèses). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite ou NASH (non-alcoholic steatohepatitis), propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. Bien que les causes/mécanismes de cette progression pathologique restent à clarifier, l’exposition aux perturbateurs endocriniens (PE) seuls ou mélange, est suspectée. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact des PE sur la santé, en particulier dans les NAFLD. Le tissu adipeux, aussi appelé graisse corporelle, est l'endroit principal où notre corps stocke les lipides, c'est-à-dire les graisses. En plus de cette fonction de réserve d'énergie, il joue un rôle important en capturant les perturbateurs endocriniens (PE), des substances chimiques pouvant perturber le fonctionnement de nos hormones, et aide ainsi à protéger les autres organes de leurs effets nocifs. Certaines études ont montré que plusieurs polluants présents dans notre environnement favoriseraient le développement de maladies du foie liées à des troubles métaboliques, comme le « foie gras ». Nous faisons l'hypothèse que le tissu adipeux pourrait agir comme un bouclier pour le foie, en le protégeant des effets de ces polluants.

Bénéfices attendus

Ce travail expérimental pourrait permettre de démontrer le potentiel protecteur du tissu adipeux contre l’exposition aux polluants. Ces résultats pourraient avoir des répercussions importantes en termes de santé publique, notamment en soulignant l’importance du tissu adipeux dans la protection contre les effets néfastes des polluants environnementaux. Une meilleure compréhension de ce mécanisme de protection pourrait ouvrir de nouvelles voies pour la prévention des maladies hépatiques liées à l'exposition aux polluants, et renforcer les politiques de santé publique visant à limiter cette exposition.

Procédures

Pour induire la délétion du tissu adipeux, nous injectons des souris transgéniques avec un agent pharamacologique donné . Cette procédure n’entraine pas d’autre inconfort que l’injection par voie intrapéritonéale. L’exposition aux polluants se fait par gavage hebdomadaire. Cette procédure n’entraine pas d’autre inconfort que celle d’un gavage. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. L'administration du glucose se fait par voie orale (gavage), celle de l'insuline par injection intra-péritonéale.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont des irritations aux points d'injection, des douleurs lors des prélèvement à la queue (prise de glycémie), et de l'inconfort lors des gavages oraux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de prélever les tissus sur lesquels les analyses moléculaires seront réalisés. Ces analyses sont l'objectif premier du projet et nous permettrons d'établir l’effet du tissu adipeux sur le développement de la NASH en situation d’exposition aux polluants.

Remplacement

Le but de notre étude est d’étudier l’effet du tissu adipeux sur les maladies métaboliques lors d’une exposition à des polluants. Ce dialogue inter-organe ne peut être utilisé hors d’un organisme vivant. Si un phénotype est observé, les mécanismes pourront être abordé ultérieurement sur des modèles cellulaires utilisés au laboratoire.

Réduction

Le projet nécessite l’utilisation d’un total de 192 animaux, ce qui, dans un souci de réduction, correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. L'utilisation d'un ouill statistique de prédiction prévoit un usage de 16 animaux par groupe pour obtenir des données robustes, notamment pour les tests métaboliques. La répartition du tissu adipeux étant différente chez les mâles et les femelles, il est indispensable de réaliser les analyses sur les deux sexes. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour évaluer la relevance de nos données.

Raffinement

Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis, ainsi qu'un tube tunnel, tous deux fabriqués en polycarbonate. De plus, nos interventions chirurgicales se dérouleront avec une couverture anesthésique et analgésique adaptée pour les gestes invasif et en conditions de stérilité. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, ce qui réduit la douleur. Nous utilisons des sondes de gavage en polypropylène, ce qui diminue la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en termes de points limites gradués et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne, y compris le week-end, permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.

Choix des espèces

Nous avons généré et étudié des souris qui présente une perte progressive du tiss adipeux. Nous connaissons bien le modèle et nous savons d'ores et déjà que suite à l’injection de tamoxifene, la masse adipeuse va progressivement réduire, de 50% en 1 mois et de 80% en 3 mois. Adulte, des souris de 8 semaines, le phénotype des animaux à cet âge a été caractérisé dans notre publication précédente et nous avons montré que, à ce stade, les animaux traités développent une perte de tissus adipeux.

Rendues sensibles par un antibiotique injecté dans l'abdomen, 300 souris de six à sept semaines sont ensuite infectées par gavage avec une souche pathogène de Clostridioides difficile. Les procédures sont classées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à la fin. Elles reçoivent trois injections vaccinales sous la peau et deux prises de sang à la mandibule, avec un recueil de selles tous les deux jours, l'infection provoquant deux à trois jours de diarrhée et une perte de poids de 5 à 15 %. Le porteur justifie la mise à mort par l'infection elle-même et par l'analyse des tissus, et présente la vérification des candidats vaccins chez l'animal comme "exigible réglementairement" avant toute phase clinique.

Objectifs

Clostridioides difficile (C. diff) est la première cause de diarrhées bactériennes associées aux soins chez l’adulte dans les pays développés et en particulier en France (> 24000 cas par an, dont 14 % de formes compliquées). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l'ordre de 3%. Les ICD peuvent évoluer sur un mode épidémique avec la survenue de cas groupés d’infection voire de véritables épidémies locorégionales. Elles représentent un coût sanitaire important pour nos sociétés, en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours et des surcoûts liés à leur prise en charge spécifique. Une antibiothérapie est le plus souvent efficace pour traiter une infection liée à C. difficile, mais les rechutes sont fréquentes (environ 20% des patients). La vaccination est la meilleure approche à long terme pour réduire le nombre de ces infections. Le but de cette vaccination est de lutter contre le développement de la bactérie au niveau du tube digestif et donc de réduire les symptômes ainsi que la dissémination de la bactérie dans l’environnement. Les antigènes testés ont démontré in vitro et in silico des qualités requises pour être considéré comme un bon antigène. Il est toutefois nécessaire de réaliser des tests in vivo dans un modèle d'infection chez la souris qui permet d'étudier la réponse immunitaire induite par la vaccination. L'objectif de ce projet est d'obtenir une preuve de concept de l'efficacité in vivo de ces nouveaux antigènes. Une analyse de l’immunité des animaux sera vérifiée avant et après immunisation. L'efficacité vaccinale sera évaluée par le suivi de la présence de la bactérie pathogène dans le tube digestif (par numération de la bactérie dans les fèces des animaux), une analyse de l’inflammation intestinale et ceci sera corrélé à la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Le développement de nouvelles méthodes de prévention des infections à C. difficile permettrait d’offrir de nouvelles options thérapeutiques aux patients et limiter le risque d’infections communautaires et nosocomiales et de diminuer la dissémination de cette bactérie pathogène dans l’environnement. Le développement d'un vaccin permettrait de prévenir les infections à C. difficile ou leur récidive. Les antigènes vaccinaux utilisés dans cette étude sont des facteurs impliqués dans la colonisation par la bactérie du tube digestif et des facteurs de virulence. Si une réponse immunitaire efficace est induite lors de ces essais de vaccination, la bacterie sera limitée dans son développement et les symptomes cliniques de l'infection ne seront donc plus visibles.

Procédures

Le modèle nécessite 3 types d’actes expérimentaux à savoir les immunisations par voie sous-cutanée, l’administration par voie orale de C. difficile (un gavage unique durant la procédure, qui dure moins de 10 secondes par animal) et une injection intrapéritonéale d’antibiotique sous anesthésie locale (une seule injection durant la procédure, anesthésie locale par pommade 10 min avant l'injection qui dure moins de 10 secondes). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé tous les deux jours, sur la durée de l'essai, ce recueil dure moins d'une minute. Le prélèvement de sang sera réalisé par voie submandibulaire sur animaux vigiles mais anesthésiés localement par lidocaïne, 2 prélèvements à J-52 et J-5. Le prélèvement sera réalisé très rapidement (moins d'une minute) par une personne très expérimentée.

Impact sur les animaux

Le modèle nécessite 3 types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale de C. difficile et 3 injections par voie parentérale (sous-cutanée) pour les immunisations, 1 injection intrapéritonéale (moins de 5 secondes) d’un antibiotique et 2 prélèvements sanguins (moins de 10 secondes) par voie submandibulaire. Suite à l’infection, le modèle peut induire des diarrhées allant de 2 à 3 jours et des pertes de poids qui varient entre 5 et 15% du poids initial des animaux. Les nuisances suite aux infections peuvent être considérées comme modérées. Un arrêt de la diarrhée et un retour au poid initial est généralement observé 3 jours après l'infection. La procédure de gavage par voie orale occasionne pour les animaux une angoisse modérée, de courte durée (moins de 5 secondes) ; le prélèvement de fèces n’occasionne aucune douleur mais peut provoquer une angoisse légère (de très courte durée) dans la mesure où il nécessite de manipuler l’animal.

Devenir

Ayant été infectés par une souche pathogène de C. difficile, et en raison de l'interet de l'analyse des prélèvements des tissus, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

Plusieurs tests in vitro et in silico ont permis d'évaluer l'intérêt des candidats vaccins. L'étape de vérification de leurs qualités antigéniques in vivo est exigible réglementairement avant toute nouvelle phase de développement clinique. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique. La reconstitution des interactions entre, l’hôte, son système immunitaire et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.

Réduction

Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 300, tout en préservant la validité statistique de l'étude. Afin de pouvoir conclure à l'issue de ces expérimentations sans avoir besoin de les répéter, 12 animaux par groupe seront nécessaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée et une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites éthiquement non acceptables. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile.

Tester une immunoglobuline administrée par la bouche sur des tumeurs de l'estomac suppose ici d'implanter la tumeur : 260 souris reçoivent des cellules cancéreuses injectées dans l'estomac au cours d'une chirurgie de dix à quinze minutes. Toutes seront tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite un gavage quotidien pendant dix à quinze jours, une injection dans le ventre chaque jour pendant dix jours, et des séances d'imagerie sous anesthésie répétées. Le seul bénéfice avancé tient à la commodité de la prise orale pour les patients, et le porteur juge le recours aux animaux "indispensable" tout en indiquant avoir déjà vérifié in vitro la pertinence du modèle et l'absence de toxicité du produit.

Objectifs

Le développement des nouvelles thérapies pour le traitement des cancers reste un enjeu majeur. Parmi les nouvelles molécules thérapeutiques il y a les immunoglobulines de classe A qui ont un tropisme de distribution et d’action dans toutes les muqueuses de l’organisme dont le tractus digestif. Une de ces molécules a déjà montré des résultats encourageants chez des souris porteuses d’une tumeur d’adéno-carcinome colorectale avec une diminution de la tumeur. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de cette molécule sur des souris porteuses d’une tumeur à l’estomac.

Bénéfices attendus

Développement d’un nouveau médicament dont la prise orale facilite le traitement des patients.

Procédures

Chirurgie au niveau de l’estomac sur animal anesthésié : injection de cellules cancéreuses dans l’estomac, durée 10-15 minutes, geste réalisé 1 fois. Administration par voie orale sur animal vigile : durée 30 secondes, geste réalisé une fois par jour pendant 10 ou 15 jours. Injection dans le ventre sur souris vigile : durée 10 secondes, geste réalisé une fois par jour pendant 10 jours.

Impact sur les animaux

De façon plutôt rare, une infection de la plaie peut arriver suite à la chirurgie. Sinon, les nuisances peuvent provenir de : 1) Développement de la tumeur : douleur, gêne, impact sur l’appétit, perte de poids. 2) Le gavage répété : douleur lié au geste, impact sur l’appétit, perte de poids, stress. 3) Les injections intrapéritonéales : stress lié à la contention, douleur au site d’injection. 4) Les séances d’imagerie : fatigue et stress liés aux anesthésies répétées, stress lié à la contention, hypothermie.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de récupérer des prélèvements post-mortem qui seront analysés ultérieurement.

Remplacement

Nous souhaitons tester l’efficacité d’un médicament administré par voie orale sur la croissance d’une tumeur de l’estomac. A l’heure actuelle il n’existe pas de modèles in vitro permettant de reproduire l’ensemble du tractus digestif dans un organisme aussi complexe que le corps. L’utilisation des animaux est donc indispensable. Néanmoins la pertinence du choix de notre modèle a été validé par des tests in vitro et l’absence de toxicité du produit a déjà été vérifiée.

Réduction

La 1ère étude de ce projet est une étude pilote qui permettra d’attester de l’efficacité ou non du nouveau médicament sur notre modèle. Si le résultat est négatif nous n’irons pas plus loin dans ce projet. Nous travaillerons à la fois sur des mâles et des femelles. Le suivi de la croissance tumorale et donc la visualisation de l’effet du traitement sur la taille de la tumeur se fera par imagerie non invasive permettant de faire un suivi longitudinal sur un même animal. Un test statistique sera réalisé. Le nombre d'animaux pour l'étude a été déterminé en utilisant un logiciel dédié.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant. Les actes expérimentaux seront réalisés sous anesthésie quand cela est nécessaire et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Une analgésie est mise en place au moment de la chirurgie et aussi en suivi post-opération si des signes de souffrance sont visibles. Une feuille de score est utilisée pour le suivi de l’animal et pour scorer des points limites adaptés au projet. La feuille de score permet de définir des critères d’arrêt des souffrances et propose des mesures conservatoires bien déterminées Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix en imagerie optique. De plus cette espèce permet d’obtenir des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront utilisées à partir d’un âge de 7 semaines correspondant à de jeunes adultes. A cet âge elles ont une taille raisonnable facilitant leur manipulation.