Système gastrointestinal

110 souris vont être utilisées, chacune recevant deux injections le même jour à deux heures d'intervalle, une fois par semaine, pendant cinq à huit semaines. Toutes sont tuées à quinze ou dix-huit semaines de vie pour prélever le foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le produit injecté provoque une maladie des petits vaisseaux du foie, avec accumulation de liquide dans le ventre, altération de l'état général et modification du comportement, la dernière semaine ajoutant trente minutes d'anesthésie pour une imagerie hépatique. Le porteur indique avoir utilisé des tests statistiques pour fixer l'effectif, sans donner ni le calcul ni la taille des groupes.

Objectifs

La maladie des petits vaisseaux du foie appelée MVPS est une maladie rare (2,5 cas pour 100 000 habitants) caractérisée par l'atteinte des petits vaisseaux dans le foie mais sans lésion de cirrhose (foie dur et fibreux non fonctionnel). La maladie des petits vaisseaux du foie touche des individus jeunes, en moyenne de 45 ans. Elle est souvent associée à d'autres maladies comme des maladies du sang (cancer du sang), des maladies du corps qui s'attaquent à lui-même (appelées maladies auto-immunes) ou encore des maladies génétiques. Les mécanismes à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie sont inconnus. Sa progression peut conduire au développement d'une hyperpression dans les grosses veines situées avant le foie et qui sont censées le traverser pour ramener le sang au cœur, cette hyperpression s’appelle une hypertension portale. Cette pression dans les veines abdominales peut entrainer des ruptures de ces veines avec des saignements dans le tube digestif, l’accumulation de liquide dans le ventre appelé ascite, ou encore la formation d'un caillot dans ces veines empêchant la circulation du sang. Il n'existe actuellement aucun traitement de la maladie des petits vaisseaux du foie. Comme cette maladie est encore largement incomprise, les progrès dans la recherche de traitement sont difficiles. Si l’implication des cellules formant les vaisseaux du foie est depuis longtemps suspectée puisqu’il s’agit d’une maladie des vaisseaux, l’une des nouvelles voies de recherche est l’étude d'autres cellules : les cellules de défense de l'organisme. Ces cellules, qui jouent un rôle contre les bactéries, peuvent être au repos dans le foie ou activer une réaction inflammatoire en cas de signal de danger de l’organisme. Elles ont été étudiées ces dernières années et leur nombre ainsi que leur activation semblent jouer un rôle dans le développement de nombreuses maladies dont certaines du foie comme la cirrhose. Notre hypothèse est donc que ces cellules pourraient, par leur interaction avec les cellules formant les vaisseaux du foie, être des acteurs clés dans le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie. L'objectif est donc d’étudier leur impact dans son développement et sa progression. A terme, en cas d'implication, elles pourraient devenir des cibles thérapeutiques. La première étape pour ces études est de développer la maladie des petits vaisseaux chez les souris.

Bénéfices attendus

Il existe plusieurs bénéfices à ce projet : en effet, la maladie des petits vaisseaux du foie touche des sujets jeunes et est encore largement incomprise. Améliorer sa compréhension est très important à la fois pour : 1/ prévoir quels patients risquent de développer cette maladie, quelle sévérité attendre et donc prévoir un suivi plus approprié. 2/ en cas d’implication des cellules de défenses de l'organisme dans le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, ces cellules pourraient devenir des cibles thérapeutiques ce qui permettrait d’éviter ou de ralentir le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie.

Procédures

Les expériences dans notre étude durent 5 à 8 semaines. Tout d’abord nous déterminerons le nombre nécessaire et l’endroit (ventre de la souris ou veines de la souris) des injections du produit permettant le développement de la maladie vasculaire chez la souris. Pour cela, un premier groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, vigiles, des injections dans le ventre du produit entrainant la maladie (l'injection dure 30 secondes, il y a 2 injections le même jour dans le ventre à 2 heures d'intervalle). Ces injections seront réalisées pendant 5 semaines. La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 15 semaines de vie, une prise de sang directement dans la veine qui revient au coeur (veine cave) sera réalisée pour obtenir un volume de sang suffisant. Un second groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, sous anesthésie, une injection du produit dans les veines de la queue (5 minutes d'anesthésie environ, le temps d'injection étant d'une minute environ). 2 injections le même jour seront réalisées chaque semaine, à 2 heures d'intervalle. Ces injections seront réalisées pendant 8 semaines et les souris recevront également pendant ces 8 semaines un régime alimentaire spécial. La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 18 semaines de vie, une prise de sang dans la veine cave sera réalisée. Enfin, un dernier groupe de souris âgées de 10 semaines recevra une fois par semaine, sous anesthésie, une injection du produit dans les veines de la queue (procédure idem groupe de souris précédent). La dernière semaine des injections les souris auront une imagerie du foie sous anesthésie (environ 30 minutes d'anesthésie totale), avec injection d’un produit de contraste permettant de bien voir le foie. Ces injections seront réalisées pendant 5 semaines et les souris recevront également pendant ces 5 semaines un régime alimentaire spécial. Ces souris seront anesthésiées puis euthanasiées à 15 semaines de vie, une prise de sang dans la veine cave sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les souris qui reçoivent le produit pour développer une maladie des petits vaisseaux du foie peuvent présenter une altération de l’état général avec perte ou une prise de poids (en cas de formation de liquide dans le ventre). Pour les souris recevant les injections dans le ventre vigiles, les injections répétées de produit peuvent générer un stress ainsi que des douleurs temporaires au moment de l’injection. Le stress induit par le développement de la maladie (liquide dans le ventre, altération de l’état), les manipulations et les injections peuvent entraîner une modification du comportement de la souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés puis nous préléverons leur foie pour les analyses.

Remplacement

Les pathologies du foie sont des pathologies complexes sous l'influence de nombreux facteurs notamment environnementaux. Cette pluralité des facteurs de risque et d’interactions à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, rend particulièrement difficile l’étude chez l’humain. Grâce au modèle des souris nous nous affranchirons ainsi de nombreux facteurs environnementaux à l’origine du développement de la MVPS et pourrons étudier l’effet d’un seul facteur (par exemple la génétique).

Réduction

Pour limiter le nombre de souris, nous réaliserons certains tests pour étudier les cellules de défenses sur le sang de patients atteints de la maladie des petits vaisseaux du foie. Nous réaliserons également des études préliminaires des interactions des cellules immunitaires avec les cellules des vaisseaux du foie sur des cellules isolées en laboratoire. Pour les souris, une seule souris fournira des prélèvements de sang et de foie pour plusieurs analyses différentes ce qui permet de diminuer le nombre de souris nécessaires. Nous avons également réduit le nombre d’animaux au strict minimum afin d’être en mesure d’obtenir des résultats interprétables. Nous avons utilisé des tests statistiques pour déterminer le nombre de souris minimum que nous inclurons dans le projet pour mettre en évidence une différence entre les groupes.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : surveillance quotidienne par du personnel qualifié dans l’animalerie, hébergement dans des cages en groupe afin de limiter le stress (présent tout de même du fait des manipulations des souris), enrichissement de l’environnement avec du coton ou des batônnets en bois. Toutes les procédures pouvant faire souffrir ou occasionner plus de stress (comme les imageries) seront réalisées sous analgésie et anesthésie. L’état général de la souris sera évalué par une grille d’évaluation (étude du comportement de l’animal, mesure de son poids, état du poil...) remplie une fois par semaine, pour prendre en charge la douleur de manière anticipée. En cas d'altération de l'état général, un antalgique sera administré pendant 72h. En l'absence d'amélioration de l'état général la souris sera euthanasiée.

Choix des espèces

Le modèle de souris permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Les techniques pour modifier l’ADN, développées chez les souris et les nombreux outils actuellement adaptés à la souris en font un modèle de choix pour l’étude. Enfin la maladie des petits vaisseaux du foie étant une maladie multifactorielle, la proximité génétique de la souris par rapport à l’homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables occasionnées par d’autres espèces. Le début des procédures sur les animaux se fera à partir d’un âge de 10 semaines (ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et qui est l’âge auquel apparaît cette maladie chez l’homme) et au maximum jusqu’à 18 semaines de vie (âge de développement de la maladie par injections du produit).

Vérifier si un bio-insecticide épandu en agriculture déclenche une inflammation intestinale chronique chez un mammifère conduit à faire ingérer Bacillus thuringiensis et ses toxines à 420 souris pendant douze semaines. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Chacune subit quatre prises de sang rapides, trois séries de prélèvements étalées sur deux heures, et un dernier prélèvement sous anesthésie. Aucun antidouleur ni anti-inflammatoire ne leur sera administré, le porteur indiquant que ces molécules fausseraient ses mesures, et la seule réponse prévue en cas de colite très sévère avec plus de 15 % de perte de poids reste la mise à mort.

Objectifs

Ces expérimentations ont pour objectif d’évaluer si l’ingestion à long-terme de bio-insecticides particuliers favorise le développement d’inflammation intestinale chronique et/ou de dérégulations métaboliques.

Bénéfices attendus

À cours termes, ce projet permettra de caractériser la sensibilité d’un organisme non-cible en particulier, la souris, à un produit et ses toxines contenues dans des produits utilisés en agriculture contre les insectes ravageurs. De plus, ce projet permettra également de faire avancer les connaissances sur les effets induits par la consommation chronique de produit sur la composition et les fonctions du microbiote intestinal, ainsi que l’induction de mécanismes inflammatoires.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang par prélèvement sur animaux vigiles. Au total, les animaux subiront - 4 prélèvements uniques de sang pour une durée < 1 minute - 3 prélèvements multiples de sang sur une durée de 2h, chacun de ces prélèvements multiples seront séparés d’au moins une semaine Les animaux subiront un prélèvement unique de sang sous anesthésie en fin de protocole

Impact sur les animaux

Les phénotypes attendus sont l’apparition d’inflammation intestinale chronique chez certaines souris et de légères dérégulations métaboliques chez d’autres souris. Les agents bio-insecticides étudiés, via leurs effets sur le microbiote intestinal, pourront en effet favoriser la dysbiose intestinale de manière à promouvoir une inflammation intestinale chronique et/ou certaines dérégulations métaboliques légères. Ces nuisances attendues sont de sévérité modérée.

Devenir

A l’issue de la procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort afin de collecter les organes nécessaires à des analyses approfondies dans le but de répondre aux objectifs du projet.

Remplacement

Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal (Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME), Mini BioReactor Array (MBRA)) ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment intestin/microbiote en présence de biopesticides chez les individus non-cibles tels que les mammifères, en santé et en pathologie.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 25 souris par condition et par sexe devait être utilisé afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les effets attendus concernant une ingestion chronique de produit sont en effet modestes.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, un suivi quotidien des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. De plus, toutes les cages seront enrichies en cocoon afin de favoriser le bien-être animal. En se basant sur notre utilisation passée de ce modèle, une possible légère inflammation intestinale chronique est attendue, mais n’engendrant pas de douleur sévère. Aucune molécule antidouleur ou anti-inflammatoire ne pourra être utilisée car notre projet se concentre sur l’étude de l’inflammation et l’utilisation d’analgésique impacterait les mesures réalisées. Une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place, avec la mise à mort par dislocation cervicale, seule alternative au cas où un point limite serrait atteint. La seule anesthésie réalisée sera gazeuse. En cas de perte de poids de plus de 10%, de la nourriture humidifiée sera placée dans une coupelle au sein même de la cage afin d’éviter toute malnutrition due à un accès restreint à la nourriture. L’apparition et la sévérité de la colite sera également largement surveillée, en cas de colite très sévère accompagnée d’une perte de poids de plus de 15%, les animaux seront placés en procédure terminale immédiate.

Choix des espèces

L’exploration de l’interaction du système immunitaire avec le microbiote nécessite un modèle flexible qui permette de manipuler chacun de ces domaines, de tester les causalités et de mesurer les paramètres moléculaires et cellulaires. En ce sens, le modèle souris est le plus adapté, car les outils permettant de manipuler et d’analyser le système immunitaire chez la souris sont les mieux développés parmi les mammifères. De plus, les connaissances acquises chez la souris permettent un transfert chez l’homme, du moins conceptuellement, et bien souvent en l’état. Les souris utilisées seront âgées de 4-8 semaines (après sevrage) lors du démarrage des procédures. Le microbiote intestinal se met en place dès les périodes précoces de la vie, et il est nécessaire pour nous d’utiliser des animaux relativement jeunes afin d’étudier les facteurs environnementaux impactant la mise en place du microbiote. Les traitements seront de 12 semaines afin de tester l’impact de la présence des toxines de Bacillus thuringiensis et auront donc, jusqu’à 20 semaines lors du passage en procédure terminale.

Une colite est provoquée chimiquement chez 1 962 souris, qui peuvent alors perdre du poids, saigner dans les selles et par le rectum, et développer un prolapsus anal. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue. Le porteur qualifie pourtant les produits administrés de "non toxiques et non irritants" et annonce comme seule nuisance attendue une gêne de courte durée au point d'injection, avant de décrire une inflammation de l'ensemble du tractus intestinal. Les souris sont mises à mort après un prélèvement sanguin terminal, pour des analyses portant sur le rôle des fibroblastes dans les structures lymphoïdes du côlon.

Objectifs

Le côlon est un organe formé d’une monocouche de cellules dites épithéliales qui s’invaginent de façon à former des cryptes. Ces cryptes participent à l’absorption et à la digestion. Cette barrière physique (les cellules épithéliales) est constamment en contact avec des agents extérieurs : microorganismes provenant du microbiote ou du bol alimentaire par exemple. Ainsi, le côlon est protégé par de nombreuses structures lymphoïdes : ce sont des agrégats de cellules immunitaires situés entre les cryptes du côlon. Ces cellules immunitaires, principalement des lymphocytes (d’où le terme de structure lymphoïde), sont présentes pour à la fois tolérer le microbiote mais également déclencher la défense immunitaire en cas d’infection par un agent pathogène par exemple. Au niveau architectural, les structures lymphoïdes sont formées d’un réseau de cellules hautement contractiles appelées fibroblastes, entre lesquelles naviguent les cellules immunitaires. Lors d’une réaction immunitaire, les structures lymphoïdes augmentent leur volume afin de recruter plus de cellules immunitaires et augmenter la puissance et la vitesse de réponse à l’inflammation. Ce phénomène est régulé par le réseau de fibroblastes de la structure lymphoïde, qui se contracte ou se relaxe pour modifier le volume de la structure. Les fibroblastes jouent donc un rôle important dans le fonctionnement de la réponse immunitaire locale via les structures lymphoïdes. Cependant, aucune étude n’a été réalisée au niveau des structures lymphoïdes du côlon, alors que cet organe est constamment mis à l’épreuve par l’environnement extérieur (via le microbiote notamment). Dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (ou MICI), le côlon est dans un état inflammatoire important. Cette inflammation chronique du tissu peut être due à une dérégulation du système immunitaire dans le côlon. Chez les patients atteints de MICI, il existe un risque plus élevé de développer un cancer colorectal. Notre projet vise à caractériser le rôle des fibroblastes dans les structures lymphoïdes dans l’homéostasie (c'est-à-dire en conditions physiologiques, en l'absence d'inflammation), l’inflammation du côlon, et le cancer colorectal

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre à court terme d’étudier le rôle de la contractilité des fibroblastes dans la régulation des structures lymphoïdes décrites ici dans l’inflammation du côlon. Il va ainsi permettre d’améliorer les connaissances sur les interactions entre les cellules immunitaires et les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale en contexte inflammatoire chronique. A long terme, il pourrait permettre de mieux comprendre le rôle des SLT dans l’inflammation colique pré-cancéreuse et de mettre en évidence un nouveau mécanisme de cancérogenèse dans le côlon. Ceci pourrait participer à l’élaboration de nouveaux traitements des MICI ainsi que du cancer colorectal.

Procédures

Dans un premier lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Au moins 24h après, un second produit sera administré aux animaux vigiles (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Enfin, les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement sanguin terminal (durée du geste 5 min). Dans un deuxième lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Ces animaux seront ensuite répartis en 3 groupes, un premier groupe reçevra un second traitement sur 8 jours en continu puis auront une période convalescence de 0 à 60 jours. Le deuxième groupe recevra le même second traitement mais sur 3 cycles de 5 à 8 jours avec 7 jours de repos entre chaque cycle puis une convalescence de 7 à 60 jours. Enfin le troisième groupe recevra un autre traitement à raison d’une fois par semaine sur 4 semaines (durée du geste inf à 10 sec). 2h avant la mise à mort, une partie de chacun des groupes, recevra un dernier traitement (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Enfin, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement sanguin terminal (durée du geste 5 min). Dans un troisième lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Les animaux auront un second traitement (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). De plus, un autre traitement sur 4 jours à 3 cycles (repos de 4 à 17 jours entre chaque cycle) sera réalisé. Les animaux seront suivis par coloscopie sous aneshtésie (durée du geste 5 min). Enfin, 2h avant la mise à mort, tous les animaux recevront un autre traitement (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Finalement, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement sanguin terminal (durée du geste 5 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues suite à l’administration de produits non toxiques et non irritants seront celles liées aux administrations elles-mêmes : gêne de courte durée au point d’injection. L’administration de nos traitements peut engendrer une déshydratation et une inflammation de l’ensemble du tractus intestinal. Les animaux utilisés lors des procédures peuvent présenter une perte de poids, des saignements dans les selles et rectaux. Ces effets pourront être observés en cours de traitement et jusqu’à 1 semaine après l’arrêt du traitement. La coloscopie peut engendrer une irritation transitoire du côlon.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Il est nécessaire de réaliser les expériences sur des animaux afin de modéliser (i) le développement des structures lymphoïdes tertiaires dans l’inflammation colique et (ii) le cancer colorectal ainsi que (iii) les interactions entre les différentes populations immunitaires, les fibroblastes et les cellules épithéliales adjacentes. Dans l’état actuel de notre projet, les expériences in vitro ne sont pas adaptées pour étudier les comportements immunitaires dans l’inflammation du côlon et le cancer colorectal (interactions cellulaires multiples et complexes). Il est difficile de reproduire la complexité du système immunitaire et de son interaction avec les cellules épithéliales à l’aide des organoïdes. Cependant, nous envisageons, dans une étape ultérieure, d’utiliser des organoïdes de côlon en co-culture avec des cellules immunitaires afin de répondre à des questionnements plus spécifiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts Plusieurs types d'analyses seront effectués sur la même souris. Les tissus extraits seront utilisés pour des expériences multiples afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. De plus, les croisements de souris seront optimisés pour produire le nombre d'animaux souhaité de génotype d’intérêt. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique. Tous les animaux seront utilisés pour des analyses post-mortem.

Raffinement

Les animaux seront suivis attentivement : mesure du poids cinq fois par semaine voire quotidienne (week-end inclus) à partir de 20% de perte de poids, surveillance du rectum (présence de prolapsus anal) et des selles (présence de diarrhées), aspect et comportement (signes de détresse), afin de détecter tout signe de souffrance. De plus, de précédentes études ont permis de déterminer les doses optimales de nos traitements afin d’optimiser les résultats obtenus tout en minimisant l’impact sur les animaux. Les gestes douloureux ou invasifs seront réalisés sous anesthésie avec recours aux analgésiques si nécessaire. Une grille de score adaptée aux procédures réalisées est mise en place pour évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas de perte de poids, du gel nutritif sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire qui peuvent être causés par la colite spontanée ou chimio-induite. En cas de déshydratation, une injection de soluté réhydratant chaud sera administrée. Le gel nutritif peut être proposé en complément de l’injection. Enfin, l’inflammation du côlon peut être suivie par une méthode non invasive grâce à la recherche de marqueur de l’inflammation dans les selles.

Choix des espèces

La souris de laboratoire est largement utilisée car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage qui permet l’obtention rapide de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. De plus, les bases de données d'expression de la souris, les lignées de souris et les protocoles déjà établis permettraient d'étendre facilement ce projet à l'avenir en utilisant des modèles déjà existants, ou de comparer les résultats du projet à différents ensembles de données provenant d'autres projets. Par ailleurs, la souris est très proche de l'Homme au niveau génétique mais aussi métabolique et immunitaire, c'est donc un excellent modèle d'étude des maladies chroniques du tractus intestinal et du cancer colorectal. De plus, cela nous permet d’étudier le rôle des fibroblastes dans les structures lymphoïdes dans l’inflammation colique et le cancer colorectal. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire mature.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime enrichi en cholestérol et en acide biliaire pour provoquer des calculs biliaires, elles reçoivent les composés testés une à deux fois par jour, par la bouche, sous la peau, dans l'abdomen ou dans la veine sous anesthésie, subissent huit prises de sang, parfois après quatre heures de jeûne, et passent 20 heures isolées sur grille en cage à métabolisme après 4, 8, 12 et 16 semaines de traitement. Le porteur reconnaît que la répétition des traitements "génère un stress chronique", pour des études qui doivent "valider ou non" des candidats contre les calculs et leurs complications au foie et à l'intestin. Une partie des souris porte une mutation, Mdr2 ko +/-, qui les prive d'un transporteur de phospholipides, et il dit la choisir pour "exacerber l'effet du régime lithogénique" et étudier des stades "plus avancés et plus sévères de la maladie".

Objectifs

La formation de calculs biliaires peut entrainer des dysfonctions biliaires, hépatiques et intestinales importantes, notamment une cholestase menant à une cholangite sclérosante et une inflammation sévère du foie qui peut elle-même entrainer un hépatocarcinome ou autrement appelé cancer du foie. Le but de ce projet est de modéliser ces dysfonctions en provoquant la formation de calculs biliaires et ainsi pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de valider ou non des traitements limitants le développement de calculs biliaires et donc l’apparition des complications hépatiques et intestinales associées.

Procédures

Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile. 8 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 4h maximum avant le prélèvement. Après 4, 8, 12 et 16 semaines de traitement, nous mesurerons divers paramètres urinaires et fécaux (récolte pendant 20h par l’intermédiaire de cages à métabolisme).

Impact sur les animaux

1) La mise sous régime lithogénique, enrichi en cholestérol et en acide biliaire, va accentuer la formation de calculs biliaires, notamment chez les souris Mdr2 ko +/-. 2)Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3) Les mises à jeun (4h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress. 4)Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 20h.

Devenir

Tous les animaux (1800 souris) seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno-marquages et expression de gènes, paramètres métaboliques...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développés pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions associées à la formation de calculs biliaires notamment au niveau du foie et de l’intestin ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. Une analyse statistique permettra d'utiliser le nombre minimal d'animaux tout en assurant la robustesse des résultats.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux. L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une rougeur ou plaies cutanées, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront.

Choix des espèces

La souris wild-type développe des calculs biliaires sous régime lithogénique entrainant des complications hépatiques et intestinales de façon modérée. La souris Mdr2 ko +/- (FVB.129P2-Abcb4tm1Bor/J heterozygous) est une souris génétiquement modifiée. Elle est dépourvue de transporteurs de phospholipides, ce qui engendre une accumulation de phospholipides dans le foie et une accumulation d’acides biliaires dans la circulation sanguine et dans la bile. En utilisant ce modèle génétiquement modifié et prône à développer des calculs biliaires, cela nous permet d’exacerber l’effet du régime lithogénique et donc d’étudier des stades plus avancés et plus sévères de la maladie. Les animaux sont mis sous régime à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à l’âge de maturité sexuelle.