Système gastrointestinal

Jusqu'à vingt échographies et dix prises de sang sous anesthésie, et pour une partie d'entre elles deux IRM après un transport vers un autre établissement : 1 515 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs tissus. Selon les cas, elles subissent une chirurgie abdominale ou lombaire pour une injection dans le foie ou la rate, une injection à travers la peau, ou la greffe chirurgicale d'un fragment de tumeur dans le foie, afin de provoquer un hépatoblastome, cancer du foie de l'enfant, chez des souris au système immunitaire intact. La première procédure, chirurgicale, porte sur des femelles gestantes, et les vecteurs viraux destinés à provoquer la tumeur sont injectés avant la naissance ou à 2, 5 et 15 jours de vie. Le porteur indique que l'emploi de souriceaux aussi jeunes peut conduire la mère à les abandonner, voire à les manger.

Objectifs

L’hépatoblastome (HB) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. La survie globale à 5 ans actuellement est de 80 pour cent. Le traitement associe de la chimiothérapie à base de Cisplatine à une résection chirurgicale de la tumeur. Mais 20 pour cent des enfants traités vont développer une résistance au Cisplatine au cours de la chimiothérapie néoadjuvante ou au cours de la récidive de la maladie. Il existe actuellement peu d’alternatives thérapeutiques, avec des données insuffisantes sur les alternatives proposées. Il est donc crucial de pouvoir tester de nouvelles associations de traitement ou de nouveaux traitements. Les modèles pré-cliniques d’hépatoblastome qui existent aujourd’hui sont réalisés sur des souris nude, souris immunodéprimées, chez qui un fragment d’HB humain, ou des suspensions cellulaires issues de culture cellulaires d’HB sont implantés en sous cutané ou en situation orthotopique, c’est-à-dire directement dans le foie. Cependant le système immunitaire a un rôle primordial dans la réponse anti-tumorale. Il est donc très important de développer des modèles syngéniques d’hépatoblastomes chez la souris immunocompétente afin de pouvoir, une fois le modèle établi, étudier l’effet de nouveaux traitements et également étudier la réponse immunitaire impliquée dans la réponse anti-tumorale. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Notre équipe s’intéresse à deux grands types de tumeurs malignes du foie : les carcinomes hépatocellulaires (CHC) principalement développés chez l’adulte et les hépatoblastomes (HB) qui se développent chez l’enfant de moins de 5 ans. L’HB est une maladie rare mais c’est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. L'incidence est de 1 à 1,5 /1000000 d'enfant de moins de 15 ans, et cette incidence est en cours d'augmentation. Il touche 20 enfants par an en France. Dans le cas des HB, bien que la majorité des patients répondent aux traitements conventionnels, environ 20 pour cent sont réfractaires et décèdent. Les modèles de xénogreffes de lignées tumorales ou de greffes orthotopiques de tumeurs dérivées de pièces opératoires de patients représentent les modèles précliniques les plus pertinents actuellement pour étudier la réponse thérapeutique. Mais ces modèles sont développés chez des souris immunodéficientes et ne permettent pas d’étudier le rôle du système immunitaire. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, et notamment les mécanismes immunitaires, et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pouvant être bénéfiques aux patients réfractaires aux traitements habituels.

Procédures

Les animaux pourront être soumis, selon les cas, à l’un des gestes suivants : 1) une chirurgie abdominale ou lombaire pour injection dans le foie ou la rate (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (réalisé dans l'établissement utilisateur 1 (EU1), 2) injection percutanée (animal vigile, 1 fois maximum, 15sec) (EU1), ou 3) une chirurgie abdominale pour greffe d’un fragment tumoral dans le foie (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (EU1). L’ensemble des animaux seront amenés à avoir : des prélèvements de sang de faible volume (animal anesthésié, 10 fois maximum avec une intervalle d’une semaine minimum entre chaque, 1min) ; un suivi par échographie abdominale (animal anesthésié, 20 fois maximum, 15 min) (EU1) ; pour certains un transport dans un autre établissement afin d’effectuer une imagerie non invasive par IRM (animal anesthésié, 2 fois, 30 min) (réalisé dans l'établissement utilisateur 2 (EU2)). En fin de période de maintien les animaux seront anesthésiés, un dernier prélèvement sanguin (1 min) sera réalisé et ils seront immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues sont principalement celles engendrées par les procédures chirurgicales réalisées, qui peuvent engendrer une douleur au niveau de l’incision au réveil de l’animal et avoir une incidence sur l‘état général de santé de l‘animal (perte d‘appétit, baisse de l‘activité, infection de la cicatrice, détresse de l’animal dans les cas les plus grave), ainsi qu’entrainer une légère gêne dans la locomotion. Un risque anesthésique est également à prendre compte (détresse respiratoire, réveil intempestif). L’utilisation d’animaux à des âges précoces peut engendrer un abandon de la part de la mère, voir du cannibalisme dans le cas des nouveau-nés. Un stress de l’animal peut aussi être constaté lors des contentions, ainsi qu’un inconfort lors des injections. Le développement des tumeurs hépatiques est généralement asymptomatique et n’entraîne donc pas de nuisances en soit, car les animaux seront euthanasiés avant que les tumeurs entrainent une dégradation de l’état général des animaux. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance du fait du stress lié à la néophobie des rongeurs. Un risque anesthésique est également à prendre compte car l'IRM est effectuée sous anesthésie générale (détresse respiratoire, risque d'hypothermie, réveil intempestif).

Devenir

Le prélèvement des tissus d’intérêt étant nécessaire pour la réalisation de nos analyses, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin des procédures grâce à une méthode réglementaire, et dans le respect des bonnes pratiques.

Remplacement

Les modèles in vitro ne miment que partiellement la pathologie humaine car ils ne permettent pas de modéliser certains paramètres biologiques pouvant influencer le développement tumoral ou la réponse thérapeutique, tels que les interactions des cellules tumorales avec leur environnement ou encore l'hétérogénéité intra-tumorale. Il est donc essentiel de disposer de modèles in vivo reproduisant le plus fidèlement possible les caractéristiques de la pathologie humaine. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour mieux comprendre l'histoire naturelle de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Les effectifs ont été réduits au maximum et les groupes seront composés de 8 à 12 animaux. Cet effectif a été déterminé grâce à un calcul de puissance, afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en permettant d’obtenir des résultats suffisamment robustes, et les expériences pourront être réitérées jusqu’à 3 fois si nécessaire. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Afin de limiter au maximum les éventuelles variations entre les expériences, les paramètres d’hébergement et de soin des animaux seront contrôlés. Le suivi tumoral hépatique sera réalisé grâce à une méthode non invasive, l’imagerie par échographie et par IRM, ce qui diminue également le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d'animaux utilisés sur la totalité du projet s'élève à 1515.

Raffinement

Les paramètres d'hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Les cages seront enrichies avec du coton de nidification, des maisonettes en plastique ainsi que des batônnets à ronger. Les femelles gestantes seront regroupées à 2 par cages afin d’éviter leur isolement, et ne seront séparées qu’après avoir mis bas afin d’éviter la surpopulation au sein d’une même cage. Les animaux issus d’établissement fournisseur observeront une durée d’acclimatation de 7 jours minimum avant toute utilisation. Un change sera réalisé par le personnel de l’animalerie une fois par semaine (sauf indication contraire) et une surveillance quotidienne rigoureuse des animaux sera réalisée tout au long de leur vie. Des pesées seront également réalisées à intervalles réguliers et une grille de suivi est utilisée. Les procédures seront raffinées afin de limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux (personnel formé et compétent, anesthésie et analgésie adéquate suite aux procédures chirurgicales puis surveillance rapprochée des animaux avec étiquetage spécifique des cages concernées), et des points limites précis seront établis. Si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, il sera immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire afin d’éviter toute souffrance animale. La Structure chargée du Bien-Etre Animal et/ou le vétérinaire pourront être sollicités pour conseil si besoin. Les transposrts des animaux entre l'EU1 et l'EU2 est assuré par un transporteur agréé, dans des boîtes de transport appropriées, ventilées, sécurisées et suffisament spacieuses. Un apport en nourriture et en eau gélifiée sera fourni durant le transport. Le temps de transport est de moins de 20 minutes entre les 2 EU.

Choix des espèces

La souris est un modèle expérimental de choix pour l'étude des pathologies humaines car c'est un petit mammifère qui se reproduit rapidement, est facile à manipuler, et dont nous avons une bonne connaissance du comportement et de la génétique. De plus, le génome de la souris est identique à plus de 95 pour cent à celui du génome humain, ce qui suggère une bonne homologie des mécanismes observés. On peut également facilement apprécier les modifications physiques et/ou comportementales traduisant une souffrance et/ou douleur, ce qui conduirait à l’euthanasie de l’animal. De nombreux outils moléculaires sont également disponibles chez ce modèle animal. La première procédure sera réalisée sur des femelles gestantes âgées de 2 à 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte et également à l’âge optimal permettant le bon déroulement de la gestation d’une part, et une bonne récupération de l’acte chirurgical d’autre part. Les vecteurs viraux seront injectés à différents âges (prénatal, 2, 5 et 15 jours de vie post natal), présentant un foie encore immature et en prolifération, afin de développer un hépatoblastome.

840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune maintenue sept, huit, seize ou vingt-quatre semaines sous un régime enrichi en graisse, en cholestérol ou en fructose destiné à lui faire développer une obésité, une résistance à l'insuline, une stéatose du foie et une athérosclérose. Les femelles gestantes sont isolées cinq jours avant la mise bas et soumises au même régime, ce qui expose aussi les fœtus. Après une mise à jeun et deux tests métaboliques, les souris sont anesthésiées puis tuées pour le prélèvement de sang et d'organes. Ce projet pilote sert à choisir la lignée et le régime des études à venir, et le porteur annonce qu'il réduira le nombre d'animaux, sans qu'aucun calcul d'effectif ne soit donné pour ces 840 souris.

Objectifs

Ce projet est une étude pilote qui a pour objectifs de : 1) Déterminer le modèle murin génétiquement modifié le plus adapté dans le cadre de projets de recherche étudiant l’impact de l’altération du métabolisme des lipides dans les maladies cardio-métaboliques associées à l’obésité : athérosclérose, troubles du rythme cardiaque, maladies du foie non alcoolique (stéatose, stéatohépatite et fibrose hépatique), résistance à l’insuline et diabète. En effet, les souris non génétiquement modifiées soumises à un régime riche en graisse ou en cholestérol ne développent pas l’ensemble du spectre des maladies observées chez l’Homme de manière spontanée. Pour cela il est nécessaire d’utiliser des souris dont le métabolisme des lipoprotéines, les transporteurs circulants de lipides, a été modifié pour se rapprocher de celui trouvé chez l’Homme. Cette étude pilote a pour but de valider quelle serait la meilleure lignée à utiliser pour permettre de répondre aux questions scientifiques du projet. 2) Déterminer le régime optimum qui permettrait d’étudier les différents aspects des maladies cardio-métaboliques associées à l’obésité pour ces modèles. Ceci permettra de valider le choix de la lignée à utiliser, mais également de faciliter les échanges de données et donc de diminuer le nombre total d’animaux requis pour les différents aspects du projet..

Bénéfices attendus

Ce projet pilote permettra de sélectionner l’association régime/ génotype la plus adaptée pour répondre à différents objectifs scientifiques. Il permettra d’harmoniser les régimes et le modèle murin et de réduire le nombre d’animaux in fine. A plus long terme, le projet d’étude qui pourra être lancé permettra d’étudier les mécanismes associés à l’émergence de l’athérosclérose liés aux troubles métaboliques. De plus, ce projet permettra également de conforter l’hypothèse d’une programmation périnatale du développement de l’athérosclérose à l’âge adulte. L’ensemble de ces données permettra d’identifier et de stratifier des populations humaines potentiellement à risque et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux impliqués dans ce projet (cohorte adulte et cohorte « développement » avec femelles gestantes et allaitantes) seront mis sous un régime riche en graisse et ou en fructose, et ou en cholestérol pour des durées variables (7, 8, 16 ou 24 semaines). La cohorte de souris adulte sera soumise à un prélèvement faible de sang sous anesthésie (moins de 10 min) avant la mise sous régime riche. Après le régime riche en graisse, les souris seront mises à jeun et rapidement évaluées sur le plan métabolique (moins de 2 h), incluant un faible prélèvement de sang afin de mesurer le sucre dans le sang suite à une administration de glucose ou d’insuline. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet.

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes de la cohorte « développement » seront en hébergement individuel pendant 5 jours avant la mise-bas afin de préparer leur nid et assurer une alimentation comparable de leurs souriceaux, ce qui diminuera leurs interactions sociales pendant cette période. Elles seront exposées à un régime riche en graisse plus ou moins cholestérol plus ou moins fructose, ce qui pourrait générer un inconfort pour elles et le développement des fœtus. A partir de 8 semaines, les souris de la cohorte adulte seront exposées à des régimes riches en graisse plus ou moins cholestérol et plus ou moins fructose ou saccharose pendant 8,16 ou 24 semaines afin d’induire une obésité et les désordres métaboliques associés : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, etc. Ceci pourrait induire un inconfort. De plus, les souris seront soumises à deux tests d’évaluation du métabolisme qui inclus une mise à jeun et de très petits volumes de prélèvement de sang.

Devenir

Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins, sans induire plus d’inconforts aux animaux.

Remplacement

Le dialogue inter-organes (cœur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (macrophages/hépatocytes ou adipocytes) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires ou organotypiques. Ainsi l’impact global d’un stress lipidique induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, il faut prendre en considération le concept que l’altération d’une fonction cellulaire (par exemple des macrophages) dans un environnement tissulaire spécifique peut avoir un écho profond dans des tissus/organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués.

Réduction

Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre de lignées potentiellement intéressantes pour le projet à 2 lignées qui seront testées en séquentielle, la seconde n’étant produite qu’en cas d’échec avec la 1ère. De même, le choix préalable des régimes a pu être réduit au maximum afin d’induire les altérations cardio-métaboliques souhaitées tout en évitant les biais. La sensibilité à l’émergence des maladies métaboliques présente une différence sexuelle importante. Il convient donc de caractériser finement les animaux des deux sexes ainsi que les mécanismes impliqués, en accord avec les recommandations des sociétés savantes internationales et des comités éditoriaux des journaux scientifiques .

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les animaux seront manipulés avec douceur, par du personnel formés et compétents, qui sera vigilant en cas de réaction comportementale excessive, ou de mal-être. Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. L’enrichissement des cages sera renforcé pour les femelles gestantes et allaitantes qui seront en hébergement individuel avec leurs petits, avec minimum de la frisure de papier kraft et un bâton à ronger.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet est de valider les conditions nutritionnelles qui permettent de programmer le développement d’une athérosclérose suite à une exposition périnatale. L’étude chez l’adulte permettra de d’associer le développement de maladies cardiovasculaires au régime alimentaire périnatale, mais sans éliminer l’impact du vieillissement. L’étude chez les souriceaux âgés de 10 jours quand ceux-ci sont strictement nourris au lait maternel permettra d’estimer si ce lien existe dès ce stade précoce, et ainsi de valider l’hypothèse d’une transmission maternelle. Ceci a également une importance pour la santé humaine car des hausses sensibles de la pression artérielle ont été observées chez des pré-adolescents avec un historique fœtal (retard de croissance, prématurité).

896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement prédisposées à développer des tumeurs du tube digestif, elles reçoivent à six semaines un gavage de bactéries Escherichia coli productrices de colibactine, puis deux prélèvements sanguins, et vivent avec leurs tumeurs jusqu'à la mise à mort au 65e jour. Le porteur attend une baisse d'activité, une perte de poils, une posture voûtée, une anémie visible aux pattes blanches, un amaigrissement, des diarrhées, du sang dans les selles et un prolapsus. À court terme il s'agit de savoir si un acide aminé, la sérine, conditionne l'effet pro-cancérogène de ces bactéries, les régimes appauvris en sérine administrés en prévention à des personnes à risque restant renvoyés au long terme.

Objectifs

Ce projet a pour but de poursuivre les études sur les mécanismes d’action d’une bactérie capable de sécréter une toxine, nommée : « Escherichia coli producteurs de colibactine (CoPEC) », dans la carcinogénèse colorectale. En effet, l’infection par cette bactérie isolée de patients atteints de cancer colorectaux accélère le développement tumoral dans un modèle murin prédisposé à développer ce cancer. Les résultats préliminaires semblent démontrer le rôle essentiel d’un acide aminé (sérine) dans l’activité pro-carcinogène des souches CoPEC. Ainsi, nous proposons premièrement d’évaluer l’effet d’une alimentation déplétée en sérine sur l’effet pro-carcinogène de la souche CoPEC. Ensuite, nous souhaitons également vérifier la spécificité des besoins en sérine de cette souche, en étudiant une souche incapable d’utiliser la sérine. Pour cela, nous évaluerons l’effet de la toxine, la colonisation bactérienne, la perméabilité intestinale et le développement tumoral à un stade précoce et/ou tardif dans un modèle murin prédisposé à développer ce cancer.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats obtenus pourraient permettre de conclure sur l’implication de la sérine dans l’activité pro-carcinogène des CoPEC et de mieux comprendre les mécanismes de l’interaction bactéries/hôte/nutrition sur la carcinogénèse colique. A long terme, les résultats générés par ces recherches devraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant les personnes les plus colonisées par ces bactéries. Ce projet permettra de mettre au point des traitements curatifs afin d’empêcher la bactérie d’utiliser la sérine et ainsi diminuer le développement tumoral. Également, des alimentations déplétées en sérine pourront être administrées en prévention chez les personnes susceptibles de développer un cancer colorectal, ou en curatif chez les patients opérés afin de limiter la réimplantation des CoPEC.

Procédures

Une injection (gavage) sera réalisée à J0, soit lorsque la souris a 6 semaines. Des prélèvements sanguins seront réalisés à J9 et en pré-mortem sous anesthésie gazeuse. Les gestes techniques seront réalisés rapidement en quelques secondes.

Impact sur les animaux

L’expérimentateur contrôlera quotidiennement le comportement général de l’animal durant toute la durée de l’expérimentation (de la naissance à la mise à la mort, soit de J-36 (naissance) à J65 (mise à mort), J0 étant le jour de gavage). Une baisse d’activité, de locomotion, une perte de poil, une posture voutée, une anémie (pattes blanches) et un amaigrissement sont attendus. Au niveau digestif, l’expérimentateur pourra également observer des phases de diarrhée ou de constipation, un hyper toilettage anal ou à l’inverse un orifice souillé, du sang dans les selles et un prolapsus.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après la reproduction ou à la fin de l'expérience. A la fin de l'expérience, les animaux sont sacrifiés afin de réaliser des prélèvements tissulaires. Lors des reproductions, seul les animaux d'intérêt sont conservés.

Remplacement

L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il n’est pas possible d’étudier le rôle de la sérine sur les effets pro-carcinogènes des bactéries suite à une infection chronique sur des cellules en culture.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure ou cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire ont mis en évidence une forte variabilité du modèle, de la colonisation bactérienne post gavage et de son maintien au cours du temps. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance du modèle et à une formation interne du personnel à la technique de gavage, le nombre d’animaux par lot a été réduit au minimum. Le nombre de 8 souris par lot permettra donc d’analyser statistiquement les résultats de colonisation bactérienne, de perméabilité intestinale et le développement tumoral observées dans les différents lots. Toutefois, si l’analyse statistique suivant la première manipulation permet de réduire le nombre d’animaux, nous prendrons, bien entendu, ces résultats en compte pour définir l’effectif des manipulations suivantes.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être des animaux, plusieurs mesures spécifiques seront prises. Tout d’abord un suivi renforcé des animaux. L’expérimentateur contrôlera quotidiennement la présence d’eau / de nourriture et observera le comportement général de l’animal (activité, locomotion, état du poil, prostration, vocalise, sang, anémie…etc). Cela permettra de repérer d’éventuelle anomalies comportementales et de traiter rapidement tous signes de douleurs par des antalgiques fort, utilisés dans le traitement des douleurs cancéreuses. Enfin, si les douleurs ne sont pas soulagées par les antalgiques, une mise à mort anticipées de l'animale sera réalisée. L'évaluation de la douleur sera réalisée grâce à un système de scooring et le suivi des animaux sera réalisé par une personne formée en interne et désignée compétente au suivi de ce modèle murin prédisposé à développer des tumeurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de superficie adaptée, avec des cabanes pour se cachées et des enrichissements à ronger. Des croquettes seront également mis à disposition dans le fond de la cage et les tétines des biberons allongées si les douleurs empêchent l'animale de grimper sur la grille. Enfin certains animaux pourront être isolés si leur état général le nécessite.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler en modèle murin car la physiologie intestinale reste similaire à celle de l’homme. En effet, le modèle animal APC présente plusieurs avantages pour l’étude du développement tumoral : -La mutation du gène APC est retrouvée dans 80% des cancers colorectaux chez l’homme -Les souris développent spontanément des tumeurs au niveau du tube digestif -Il est représentatif des relations entre cellules tumorales et cellules de l’environnement tumoral -Il s’agit du modèle le plus proche de la physiologie humaine et le plus représentatif de l’interaction entre microbiote et tube digestif. Ainsi, ce modèle nous a déjà permis de conclure de manière satisfaisante sur les questions scientifiques dans un contexte de cancer colorectal. De plus nos animaleries sont adaptées à la prise en charge de ce type d’animaux. Le matériel utilisé est conforme aux règles du bien être animale (cages, enrichissements, température, cycle jour/nuit) et le personnel a suivi une formation adaptée à la gestion et à la prise en charge de ces animaux. L’étude sera réalisée chez les femelles adultes âgées de 6 semaines (20g au gavage). L’objectif est de réaliser l’expérience sur des animaux adultes et suffisamment jeunes puisque la durée totale de l’expérience est estimée à 65 jours post-gavage.

Colite provoquée par un produit dans l'eau de boisson, par sensibilisation de la peau suivie d'une administration rectale, ou par injections répétées pendant douze semaines : 6 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement d'organes entiers. Certaines lignées ont un système immunitaire déficient, ce qui les rend plus sensibles aux infections. La douleur liée à l'inflammation intestinale est estimée "légère à modérée au maximum", dans un texte qui décrit par ailleurs un risque de péritonite lié à la répétition des injections abdominales. Le porteur indique recourir en première intention aux organoïdes et aux systèmes d'intestin artificiel, puis conclut qu'un modèle animal est "totalement indispensable".

Objectifs

Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) sont caractérisées par une inflammation intestinale inappropriée. Elles représentent un fardeau majeur pour les populations occidentalisées. En effet, leur incidence et prévalence ont augmenté de façon spectaculaire au cours des dernières décennies. Les thérapies actuelles ne sont que partiellement efficaces et principalement basés sur des immunosuppresseurs (médicaments affaiblissant le système immunitaire). Celles-ci sont associés à des effets secondaires, notamment des infections et des cancers. Il est donc urgent de mieux comprendre leur origine et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons observé chez les patients atteint de MICI, une altération dans l’une des voies métaboliques qui est directement corrélé à l’inflammation. L'hypothèse principale du projet est de caractériser l'effet de cette enzyme dans les MICI afin de pouvoir développer l’enzyme humaine comme un candidat thérapeutique. Ces résultats ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements pour les MICI.

Bénéfices attendus

Ce projet représente un programme de recherche complet et ciblé sur le métabolisme dans le contexte de la santé et des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). En France, les MICI concernent aujourd’hui près de 300 000 personnes (données 2021). L'approche que nous proposons est complètement nouvelle et basée sur des découvertes concernant le rôle des certains métabolites dans les processus inflammatoires. Notre approche est basée sur la modulation de certaines voies métaboliques, perturbées dans les maladies inflammatoires, afin de restaurer la production normale de métabolites anti-inflammatoires tout en diminuant la production de métabolites pro-inflammatoires. Ce projet multidisciplinaire intègre plusieurs facettes de l'immunité et métabolisme. Les études décrites dans le projet devraient améliorer notre compréhension des mécanismes délétères impliqués dans les MICI tout en identifiant une nouvelle stratégie thérapeutique utilisable chez les patients.

Procédures

Certains modèles subiront un traitement préalable pour induire le modèle transgénique à raison d’une injection intrapéritonéale quotidienne sur animal vigile (moins de 10 secondes) pendant 5 jours consécutifs. Certains modèles animaux utilisés dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Par la suite, nous mettrons en œuvre les différents modèles de colites mimant les aspects des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Les souris pourront être suivre au choix selon les groupes et questions scientifiques : i) Une colite induite par traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) par jour pendant 7 jours à 12 jours. ii) Une colite induite par sensibilisation de la peau sous anesthésie (5 minutes) suivi d’une administration rectale sous anesthésie (5 minutes) et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) ou un gavage intragastrique (moins de 10 secondes) pendant 3 jours. iii) Une colite induite une injection intrapéritonéale de cellules (moins de 10 secondes) et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) au maximum une fois par jour pendant un maximum de 12 semaines. Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraiches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état métabolique des souris, les animaux subiront un prélèvent de sang de faible volume sur animal vigile par simple contention par une personne formé avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.

Impact sur les animaux

Le projet comprend différentes techniques d’administrations (gavages, injections intra-péritonéales) pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. La répétition des injections au niveau abdominal peut entrainer un risque de péritonite (très rare). Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraiches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient induire de nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons également des prélèvements sanguins de faible volume pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus. Dans ces modèles la douleur imposée aux animaux est liée à l’inflammation intestinale qui n'entraîne pas la mort de l'animal. On peut estimer que son intensité sera légère à modérée au maximum. Pour l’un des modèles de colite, une anesthésie est nécessaire et pourrait induire dans de rare cas, une mauvaise réaction (stress thermique, difficulté respiratoire, arrêt cardio-respiratoire). De plus, certains modèles utilisés dans le projet disposent d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensible aux infections

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.

Remplacement

Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèle non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. A l’heure actuelle il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu, un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.

Réduction

Ce projet impliquera donc un maximum de 6840 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux à trois fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Néanmoins nous ne répéterons l’expérience que si les résultats vont dans le sens de l’hypothèse de travail et que la puissance statistique n’est pas encore atteinte.

Raffinement

permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. De plus, les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris non transgéniques mais également des lignées murines simples, doubles et triples transgéniques (toutes sur le même fond génétique). Justification des stades : Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 6 et 12 semaines de vie. Cet âge est couramment utilisé dans la littérature pour les modèles de colites. Justification du sexe : Nous utiliserons des mâles et femelles selon les productions en interne car nous étudierons les deux sexes qui sont relevant pour la pathologie en question.

Aucun analgésique ne sera administré, le porteur estimant qu'ils interféreraient tous avec le modèle, et les souris qui atteignent les points limites sont tuées par surdosage d'anesthésiques. 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs intestins. Elles reçoivent pendant sept jours du dextran sulfate de sodium dans leur eau de boisson, ce qui déclenche une inflammation intestinale, une douleur viscérale et une perte de poids, puis passent une minute trente dans un tube de mesure de composition corporelle la veille de leur mise à mort. L'enjeu déclaré est de vérifier si des antagonistes du récepteur minéralocorticoïde, déjà commercialisés pour d'autres indications, pourraient être repositionnés contre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.

Objectifs

5.5.1 décrire les objectifs du projet (repris automatiquement du champs 3.3.2.1) Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin affectent près de 300 000 personnes en France. Il existe des thérapies, mais de nombreux patients ne répondent pas à ces thérapies ou y deviennent résistants. Le projet a pour objectif d’évaluer l’inhibition du récepteur minéralocorticoïde sur la réponse inflammatoire dans un modèle de colite aiguë induite par un agent chimique. L’inhibition du récepteur minéralocorticoïde exerce des effets anti-inflammatoires dans des contextes extra-intestinaux. Ces effets anti-inflammatoires sont médiés par une de ces cibles : la neutrophil gelatinase-associated lipocalin, et impliquent les cellules myéloïdes.

Bénéfices attendus

Même si des progrès thérapeutiques notables ont été réalisés dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, de nombreux patients ne répondent pas ou plus aux traitements proposés. De plus, les antagonistes du récepteur minéralocorticoïde ne sont pas contre-indiqués chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. En cas de validation de notre hypothèse de travail, nous pourrions repositionner les antagonistes du récepteur minéralocorticoïde déjà disponibles sur le marché dans un nouveau champ thérapeutique. De plus, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents sur l’implication du récepteur minéralocorticoïde dans le développement de l’inflammation intestinale.

Procédures

Les animaux seront soumis à du dextran sulfate sodium (1%) dans leur eau de boisson durant 7 jours afin d'induire une inflammation intestinale relative aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. La composition corporelle des animaux sera mesurée le jour précédant la mise à mort des animaux. Cette mesure peut occasionner un inconfort chez les animaux lors de l’introduction de la souris vigile dans un tube de mesure, mais n’entraine pas de douleur, la souris reste 1min30 dans l'appareil.

Impact sur les animaux

Le modèle de colite aiguë induite par le dextran sulfate sodium peut entrainer une douleur viscérale chez la Souris, ainsi qu’une perte de poids. La composition corporelle des animaux sera mesurée, le jour précédent la mise à mort des animaux. Cette mesure peut occasionner un inconfort chez les animaux lors de l’introduction de la souris vigile dans le tube de mesure, mais n’entraine pas de douleur.

Devenir

À l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer leurs intestins pour analyser différents paramètres et marqueurs biologiques.

Remplacement

Avant d’être testés in vivo, nous utilisons des modèles in vitro d’inflammation intestinale comme des lignées de cellules épithéliales intestinales ou de macrophages en réponse à des molécules pro-inflammatoires. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de rendre compte de la complexité physiologique de la réponse inflammatoire in vivo. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales.

Réduction

Ce projet s’efforce de réduire le nombre de souris au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante et en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience (données nutritionnelles, composition corporelle, poids des animaux, inflammation et fonction de barrière intestinale). Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études et des données de la littérature. Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, plusieurs approches combinées ont été prévues : la dose de Dextran Sodium Sulfate utilisée est évaluée à chaque lot de dextran sulfate sodium comme recommandé dans le protocole initial et nous avons fait le choix d’utiliser une dose faible de dextran sulfate sodium (1%) pour limiter au maximum la mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux. L’utilisation d’espèces d’animaux utilisés à des fins scientifiques, caractérisés par une faible variation génétique, permet de limiter la variabilité de la réponse biologique et par conséquent le nombre d’animaux. L’effectif de chaque groupe a été déterminé par une approche statistique en prenant comme critère principal le score histologique. Nous avons fait le choix de tester l’inhibition génétique du récepteur minéralocorticoïde uniquement sur les animaux colitiques et par conséquent de limiter les groupes contrôles au strict minimum. Les données obtenues chez des animaux contrôles seront réutilisées autant que possible. Par exemple, des échantillons de côlon seront préservés dans le laboratoire et indiqués dans une base de données communes à notre Unité et pourront ainsi être réutilisées au cours d’un autre protocole.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages standards (4 souris/cage), avec enrichissement. Les animaux seront maintenus dans un environnement contrôlé et stabilisé. Une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera réalisée avant le début des procédures. Les conditions de soins et les méthodes utilisées viseront à réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Une grille d’évaluation des points limites pour le bien-être animal sera utilisée. Un animal présentant un état de mal être ou de souffrance sera exclu de l'étude et mis à mort en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA. Pour limiter la douleur des animaux avec colite induite par le dextran sulfate sodium, l’usage est de ne pas utiliser d’analgésique en raison en de leur interaction potentielle avec le processus inflammatoire. Il existe un panel d’analgésiques utilisés dans l’inflammation intestinale, qui présentent tous un risque d’interférence avec notre modèle. Nous ne pourrons donc pas utiliser ces analgésiques dans nos procédures. En cas d'atteinte des points limites, les souris seront mises à mort par surdosage d'anesthésiants .

Choix des espèces

La Souris est le mammifère non-primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme. La Souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser la colite expérimentale et les modèles génétiques d’invalidation du récepteur minéralocorticoïde ne sont disponibles que chez la Souris. Cette souche n’est pas résistante à l’induction par le dextran sulfate sodium et permet ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. Nous utiliserons des souris d’environ 6 semaines. La réponse à la colite diffère en fonction de l'âge des animaux et le stade de développement choisi correspond à une phase de réponse optimale avec un risque de mortalité réduit.