Système gastrointestinal

Des souris génétiquement modifiées pour que le gène PPARa et ceux de deux autres protéines ne fonctionnent plus dans leur foie sont soumises, selon les groupes, à deux semaines de régime cétogène, à 20 heures de jeûne ou au gavage d'une molécule qui libère une grande quantité de graisses dans leur sang. 1 152 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le porteur annonce la mise à mort de toutes à la fin des procédures pour récolter leur sang et leurs organes. Le jeûne peut faire chuter leur glycémie et leur température corporelle, le régime cétogène leur faire perdre du poids, et chaque souris subit juste avant sa mise à mort une prise de sang à la veine sous-mandibulaire, sous contention. Le porteur écrit aussi qu'un individu qui atteint un critère d'arrêt sera "replacé en conditions d'hébergement standard après examen par la vétérinaire référente", sans dire ce qu'il devient ensuite.

Objectifs

Le foie est un organe majeur qui est capable de s’adapter aux différents changements nutritionnels auxquels nous sommes exposés (période de jeûne, régime enrichi ou carencé en certains nutriments, …). Par exemple, lors d’un jeûne, le foie est le lieu de production du sucre nécessaire au fonctionnement de l’organisme en période de carence en nutriments. Cette grande capacité du foie à s’adapter à différents statuts nutritionnels est principalement assurée par des protéines spécifiques. Parmi ces protéines importantes lors de périodes de jeûne figure la protéine PPARa, qui est également importante lors de la consommation d’un régime cétogène (très riche en graisses et pauvre en sucres). Dans ce projet, pour étudier les interactions entre PPARa et 2 autres protéines lors d'un afflux d'acides gras arrivant au foie, nous générerons des souris dont le gène PPARa et le gène d’autres protéines ne sont plus fonctionnels dans le foie. Les animaux seront soumis à une période de jeûne ou à un régime cétogène ou traités avec une molécule pharmacologique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les différentes protéines qui sont impliquées lors du jeûne et de la consommation d’un régime cétogène, qui sont 2 interventions nutritionnelles actuellement étudiées pour leurs effets bénéfiques dans plusieurs pathologies. Ainsi, les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.

Procédures

Des groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou un régime cétogène riche en graisses et pauvre en sucre pendant 2 semaines. Les animaux seront pesés chaque semaine. La glycémie sera mesurée chaque semaine (2 fois au total) par prélèvement d’une seule goutte de sang à la queue (petite piqûre de la veine caudale avec une lancette de 1 mm). La mesure ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. Juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire. D’autres groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou mis à jeun pendant 20h. Après les 20h de jeûne et juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire. D’autres groupes d’animaux seront traités par gavage avec une molécule pharmacologique permettant la libération d’une grande quantité de graisses dans la circulation sanguine. Le gavage prend moins de 30 secondes. Six heures après et juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire.

Impact sur les animaux

Le jeûne peut induire une baisse de la glycémie et de la température corporelle. Le régime cétogène peut induire une perte de poids et une baisse de la glycémie. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une légère douleur. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et une légère douleur. Le gavage peut entraîner un stress des animaux.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation de l’animal entier car les réponses de l’organisme engendrées par les interventions pharmacologiques nutritionnelles (jeûne et régime cétogène) étudiées sont complexes et ne peuvent pas être mimées avec fidélité en culture cellulaire. En effet, plusieurs organes de l'organisme communiquent entre eux. L’utilisation de souris transgéniques de laboratoire est appropriée car il est possible d'étudier le rôle de protéines spécifiques.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant la piqûre permettant de prélever une goutte de sang. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons les consommations alimentaire et hydrique. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

Vingt-sept jours seule en cage, vingt-sept gavages quotidiens, vingt-sept collectes de fèces, une coupure de la queue et un prélèvement de sang à la joue avant la mise à mort. 1 296 souris vont être utilisées ainsi dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement des organes. L'objectif est de tester l'effet de bactéries commensales et d'une voie immunitaire sur une colite, avec diarrhées et signes de douleurs intestinales pendant les phases inflammatoires aiguës. Le produit qui déclenche cette colite n'est jamais nommé, il apparaît sous la seule mention d'un traitement chimique et ne figure pas dans la liste des interventions.

Objectifs

Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes (constituant le microbiote) et des molécules provenant de l’alimentation. Les bactéries et les produits qu’elles sécrètent y jouent un rôle crucial pour la bonne santé de l’hôte. Ainsi un déséquilibre de la diversité de microorganismes a été montré chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) comme la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique. Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales dans des conditions physiologiques (individus sains) et pathologiques (individus malades). Des travaux suggèrent que certaines bactéries du tube digestif et produits bactériens sont responsables de la modulation de l’inflammation intestinale chez l’hôte. L’objectif de ce projet est d’explorer les mécanismes, d’identifier le rôle des bactéries et les cellules associées impliquées dans la régulation de la réponse inflammatoire intestinale dans un modèle de colite induite chimiquement chez la souris.

Bénéfices attendus

Les maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) sont des maladies très invalidantes dont l’incidence est particulièrement importante dans les pays industrialisés. Les traitements utilisant des anti-inflammatoires ou des actes chirurgicaux sont peu efficaces et ont de nombreux effets secondaires importants. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients, la persistance de l’inflammation conduit souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Les MICI sont donc une préoccupation majeure de santé publique. Il apparait alors aujourd’hui essentiel de poursuivre les recherches qui pourront permettre d’identifier les mécanismes impliqués pour proposer des solutions permettant le dépistage et le traitement des MICI. De nombreux travaux étudiant les MICI témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal associée à une augmentation des réponses inflammatoires dans l’intestin. Dans ce contexte, des bactéries intestinales peuvent être directement responsables de cette inflammation ou, au contraire, peuvent être considérées comme anti-inflammatoires. Notre travail vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales et leurs rôles dans le développement de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI). Ce projet amènera une meilleure compréhension mécanistique de l’implication du microbiote dans la réponse inflammatoire intestinale et permettra ainsi de proposer de nouvelles voies permettant le traitement et la prévention de ces maladies.

Procédures

Pendant la durée totale du protocole soit 27 jours, les souris seront isolées et recevront quotidiennement un gavage oro-gastrique (quelques secondes) soit 27 gavages. Un gavage supplémentaire, précédé d’une mise à jeun de 6 heures, sera réalisé en milieu de protocole, suivi d’une petite coupure à l’extrémité de la queue (1 seconde) et massage (quelques secondes) pour effectuer un prélèvement sanguin. Nous effectuerons 27 collectes de fèces lors de l’émission naturelle (collecte quotidienne). La durée maximale de la collecte est estimée à 30 min maximum. Un prélèvement de sang à la joue sera réalisé une fois, sur animaux vigiles, en fin de procédure avant la mise à mort. Ce prélèvement dure 5 à 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress modéré de par leur placement en cage individuelle.. Les animaux seront également soumis à des gavages quotidiens engendrant un stress modéré du fait de la répétition malgré la courte durée du geste (moins de 10 secondes). Le traitement chimique pour l’installation de la colite engendre des diarrhées pendant les phases inflammatoires aigues entrainant des signes de douleurs intestinales. Les prélèvements fécaux quotidiens (émission naturelle de fèces par la souris) et pesées quotidiennes des animaux seront réalisés sur tous les animaux dans des pots de récolte ou de pesée, ce qui entraine un stress léger. La période de mise à jeun précédent le test de perméabilité intestinale engendre un stress . La coupure au niveau de la queue nécessaire aux prélèvements de sang lors du test de perméabilité intestinale induit une douleur légère de très courte durée (quelques secondes). Une déshydratation chez certains animaux peut être observée.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure pour le prélèvement de leurs organes et tissus utilisés pour des analyses nécessaires à ce projet.

Remplacement

Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler un système digestif en lien avec le microbiote, l’inflammation intestinale, et la réponse immunitaire. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries du microbiote intestinal, la composition en lien avec les données biologiques obtenues à partir du sang et des tissus intestinaux de l’hôte.

Réduction

L’effet des bactéries de ce projet ont été testées préalablement sur des systèmes cellulaires in vitro pour sélectionner les plus intéressantes d’entre elles, et réduire ainsi le nombre de bactéries à tester in vivo et le nombre d’animaux utilisés. Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés. Nous allons tester 2 bactéries en même temps ce qui permettra de diminuer le nombre de contrôles entrant dans le protocole expérimental.

Raffinement

Les souris bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour réaliser des nids et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris de faire ce nid et se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Afin de palier au stress induit par l’isolement, les cages seront en plexiglass transparent et mises côte à côte pour permettre les interactions visuelles, sonores et olfactives entre les animaux. Ces enrichissements permettent d'assouvir au mieux les comportements naturels de l'animal. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés tout d’abord deux fois par semaine pendant 10 jours, puis quotidiennement (surveillance visuelle, mesure de la perte de poids) tout au long de l'expérience. Nous définissons un point limite sur le poids, l’apparence des animaux et leur comportement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et euthanasié. Les souris dormant le jour, nous réaliserons les mises à jeun pendant la journée afin de limiter la sensation de faim.

Choix des espèces

Les animaux auront au minimum 6 semaines au début de la procédure, âge auquel le système immunitaire est mature et le microbiote intestinal stabilisé. Le modèle souris est largement étudié dans les recherches sur les maladies inflammatoires, ce qui permet l’accès à de nombreuses données physiologiques et immunologiques et des outils d’analyse des paramètres biologiques. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal dans lequel il est possible de bloquer les mécanismes auxquels nous nous intéressons pour pouvoir les étudier.

Le nerf vague est sectionné au niveau du cou, d'un seul côté, sur des souris ensuite nourries d'un régime riche en lipides pendant quatre à vingt-quatre semaines. 4 608 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour les prélèvements de tissus. Chacune subit un gavage de glucose ou une injection d'insuline ou de toxine diphtérique, cinq prélèvements de sang successifs sur deux heures, une contention en tube et un séjour seule en cage de calorimétrie, une perte de 20 % du poids déclenchant la mise à mort. Le porteur écrit que les souris récupèrent rapidement et complètement après la section du nerf, sans signe significatif de douleur ni de détresse, et que le régime gras ne devrait causer aucune douleur perceptible.

Objectifs

La stéatose hépatique non-alcoolique (NASH) est une maladie du foie caractérisée par une accumulation excessive de graisse dans les cellules hépatiques, accompagnée d'une inflammation et d'une lésion hépatique. Actuellement, il n'existe pas de traitement pharmacologique efficace et validé pour cette maladie. Cependant, des recherches antérieures ont mis en évidence le rôle clé de l'inflammation dans le développement de la NASH. Précédemment, nous avons montré que l’inflammation pathogène était un acteur important dans le développement de la NASH. Une découverte intéressante a montré une relation entre l'innervation vagale et le métabolisme hépatique. Le nerf vague, qui est une composante du système nerveux autonome, semble jouer un rôle dans la régulation du métabolisme du foie. Des études ont montré que la stimulation du nerf vague pouvait avoir des effets positifs sur la fonction hépatique. De plus, des recherches ont indiqué que la vagotomie cervicale unilatérale (section du nerf vague du côté gauche du cou) était associée à une augmentation de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Cela suggère que la modulation de l'activité vagale pourrait influencer la mobilisation des cellules immunitaires, notamment les monocytes, à partir de la moelle osseuse et de la rate. Cependant, les mécanismes précis de ces interactions restent encore mal compris. Pour mieux saisir ces interactions complexes, nous proposons une approche chirurgicale consistant à réaliser une vagotomie cervicale unilatérale chez des souris, qui seront soumises à un régime riche en lipides pour induire une NASH. L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle du nerf vague dans la mobilisation et le recrutement des cellules immunitaires dans le foie, et comment cela influence le développement de la NASH. Cette recherche pourrait fournir des informations cruciales pour mieux comprendre les liens entre le système nerveux autonome, l'inflammation et la pathogenèse de la NASH, ouvrant potentiellement de nouvelles voies pour le développement de traitements futurs.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle du nerf vague dans la mobilisation et le recrutement des cellules immunitaires dans le foie, et comment cela influence le développement de la stéatose hépatique non-alcoolique (NASH). La NASH représente la forme la plus prévalente de maladie hépatique et est étroitement liée à la progression de l’obésité. A ce jour, les patients souffrant de NASH ne disposent pas de traitements approuvés, et le nombre de patients nécessitant une transplantation hépatique est en constante augmentation. Par conséquent, une compréhension plus approfondie des mécanismes sous-jacents ouvre la voie à de nouvelles approches et stratégies thérapeutiques anti-inflammatoires dont les patients atteints de NASH pourront bénéficier.

Procédures

Les souris seront soumises à des interventions chirurgicales consistant en une section du nerf vague au niveau cervical côté gauche (vagotomie) ou des chirurgies contrôles sans section du nerf vague (Sham). Chaque souris subira une seule opération, qui durera environ 10 minutes et sera réalisée sous anesthésie et analgésie. Une période de récupération de 3 semaines suivra l’intervention. Ces procédures chirurgicales sont décrites en détail dans la littérature scientifique. Les observations indiquent que les souris récupèrent rapidement et complètement après la chirurgie, sans présenter de signes significatifs de douleur ou de détresse. Par la suite, les souris seront soumises à des régimes alimentaires, soit une diète standard, soit une diète riche en lipides induisant la stéatose hépatique non-alcoolique (NASH). Ces régimes alimentaires ne sont pas associés à une détresse particulière. Nous examinerons l’impact de ce régime à 4 moments différents : une période courte de 4 semaines, une période intermédiaire de 8 semaines, une période de 16 semaines marquée par une inflammation avancée, et enfin, une période de 24 semaines caractérisée par une fibrose avancée. Des explorations dites métaboliques seront réalisées en fin de procédure impliquant un gavage des animaux avec du sucre (glucose) ou une injection d’insuline puis des prélèvements sanguins seront effectués sur animal vigile (5 petits prélèvements successifs sur une période de 2 heures). La durée des actes techniques de prélèvements de sang est de 5 à 7 minutes par souris, et de gavage est de 2 à 5 minute par souris. En toute fin de procédure, les souris seront placées dans un tube pendant 2 minutes avec une certaine restriction de mouvement pour mesurer leur quantité de graisse. Elles seront ensuite placées seules dans des cages de dimension réglementaire permettant des mesures de leur métabolisme, leur activité et de leur consommation d’eau et de nourriture. Avant l’euthanasie, un prélèvement sous-mandibulaire de sang sera réalisé d’une durée d’environ 30 secondes puis l’animal sera euthanasié conformément aux directives éthiques. Tous les prélèvements tissulaires se feront suite à l’euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Les éventuels effets indésirables chez les animaux sont principalement liés à la chirurgie (douleur physique passagère, hypothermie éventuelle durant l’anesthésie). Les observations montrent que les souris récupèrent rapidement et complètement après la chirurgie, sans présenter de signes de douleur ou de détresse significative. Dans le cadre de ce projet, certaines souris seront soumises à un régime gras (Western-type). Ce régime alimentaire ne devrait pas causer de douleur ou de détresse perceptible chez les souris, mais plutôt entraîner une prise de poids, qui sera étroitement surveillée tout au long de l’étude. Toutefois, en cas d’infection et non cicatrisation de la plaie, l’animal sera sorti de l’étude. Pour les explorations métaboliques, certaines procédures telles que la mise à jeun des animaux pendant 4 heures, le gavage de glucose, l’injection intra-péritonéale d’insuline ou de toxine diphtérique (une seule piqure abdominale) avec contention douce de l’animal et la microcoupure de la queue pour les prélèvements sanguins peuvent entraîner des périodes de stress et d’inconfort temporaires et de courtes durées pour les animaux. De plus, l’isolement nécessaire de la souris de ses congénères en cage de mesure calorimétrie peut également provoquer un stress de l’animal.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l'euthanasie de l'ensemble des animaux.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins est nécessaire pour explorer la maladie dans un organisme complet, ce qui ne peut être fidèlement reproduit en se basant uniquement sur des cultures de cellules isolées.

Réduction

Nous aurons besoin de 12 souris par groupe. Nous visons à minimiser le nombre d’animaux nécessaires tout en maintenant la robustesse des résultats. Pour assurer la solidité statistique de nos résultats, il sera nécessaire de reproduire les expériences sur deux lots de souris. Le nombre total d’animaux prévu est de 4608 souris. Lorsque cela sera possible et afin de limiter le nombre total de souris utilisées, nous essaierons de mettre en commun des souris contrôles pour l’étude de différents modèles murins (réduction jusqu’à 25 pourcents).

Raffinement

Le bien-être animal sera une priorité constante tout au long de la durée du projet, en minimisant la douleur et le stress. Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d’enrichissement (lanières de papier kraft, maisons en carton, tunnels en carton ou carrés de coton compacté). Une période d’acclimatation d’une semaine précédera les expérimentations. Une vérification visuelle quotidienne de l’état général des souris sera effectuée en ouvrant chaque cage. L’accès à l’eau et à la nourriture sera mis à disposition ad libitum. L’identification des animaux génétiquement modifié sera réalisée par le personnel qualifié et formé de l’animalerie. Tout signe d’inconfort, de détresse ou de comportement anormal (agressivité subite, inactivité, vocalisation, mutilation, isolement, diminution de l’appétit) ainsi que toute modification physique (pelage ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) sera étroitement surveillée et entraînera un isolement si nécessaire. Les critères absolus d’inconfort (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires), qui ne devraient pas être déclenchés par la procédure utilisée, mèneront à l’euthanasie immédiate de l’animal, conformément aux directives éthiques. En ce qui concerne les chirurgies, les animaux seront soumis à une anesthésie générale par injection intrapéritonéale. Une dose préventive d’antalgique sera administrée avant la chirurgie, puis renouvelée toutes les 8-12 heures pendant 48 heures. Un gel ophtalmologique sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter le dessèchement de la cornée pendant l’anesthésie. Lors de la chirurgie, réalisée sur un tapis chauffant pour maintenir la température de l’animal, une attention particulière sera portée sur sa fréquence respiratoire. Un rétablissement complet sans douleur ni détresse notable devra être observé après la chirurgie. Une grille de suivi sera mise en place avec pesée hebdomadaire des animaux. Une perte de poids de 20 pourcents dans les jours suivant la chirurgie sera considérée comme point limite et entrainera l'euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle du nerf vague dans la mobilisation et le recrutement des cellules immunitaires dans le foie, et comment cela influence le développement de la stéatose hépatique non-alcoolique (NASH) chez la souris. La souris a été sélectionnée comme modèle expérimental en raison de sa capacité à reproduire de manière précise les mécanismes impliqués dans le développement de la NASH. Plus particulièrement, elle est capable d’intégrer les réponses immunitaires observées chez les êtres humains. En outre, la souris est un modèle bien établi pour l’étude de la NASH et des effets de la vagotomie. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines à leur entrée dans la procédure expérimentale. Nos études requièrent que les animaux aient un métabolisme, un système immunitaire et vasculaire mature. Les souris entreront en procédure à 8 semaines et en ressortiront à 15, 19, 27 et 35 semaines. L’âge des animaux est suivi par rapport à leur date de naissance qui sera sur les étiquettes des cages ainsi que dans le logiciel de gestion des animaux.

Tuées au bout d'une semaine ou d'un mois pour prélever le côlon et l'intestin, 189 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des injections répétées dans l'abdomen, jusqu'à deux fois par semaine pendant quatre semaines. L'autre subit l'implantation chirurgicale d'un aimant sous la peau du dos et une injection intraveineuse de nanoparticules magnétiques, dispositif destiné à reproduire la pression qu'exerce une tumeur, puis une coloscopie sous anesthésie chaque semaine pendant un mois, avec perte de poids et diarrhée attendues à mesure que les tumeurs se développent. La souche retenue porte une mutation du gène APC que le porteur présente comme le seul moyen d'aborder la question, 80 % des tumeurs du côlon humain portant selon lui cette même mutation.

Objectifs

Le cancer est la principale cause de décès dans le monde, accumulant près de 10 millions de décès en 2020, selon les rapports publiés par l'OMS. Environ un million de ces décès ont été attribués au cancer colorectal, ce qui le place au deuxième rang mondial sur l'échelle de la mortalité par cancer. Malgré la grande variété et la combinaison de traitements, y compris la chirurgie et la chimiothérapie, 50 % des patients souffrent de métastases (les cellules cancéreuses migrent et s’installent dans une autre partie du corps) qui conduisent à la mort par la maladie. La létalité des différents types de cancers est déterminée par divers facteurs, l'un des plus pertinents étant le type de cellule promotrice de cellules tumorales (les cellules à l’origine de la production de cellules tumorales). Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont les promoteurs les plus agressifs de la progression tumorale et se caractérisent par leur résistance ou leur récidive après traitement, une tendance à métastaser et un taux de mortalité élevé. Dans le cancer de côlon, la pression mécanique liée à la croissance tumorale joue un rôle dans la production de cellules souches cancéreuses mais les mécanismes sous-jacents sont inconnus. L'objectif principal du projet est de déterminer l'origine cellulaire de CSC dans le cancer du côlon chez la souris. Les résultats attendus de notre projet sont de faire la lumière sur un nouveau mécanisme sous-jacent pour la formation de CSC et ouvrir ainsi à de nouveaux traitements inhibiteurs ciblant la formation des CSC.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet vont permettre d'élargir les connaissances sur les mécanismes d'émergence et de développement tumoral les plus agressifs pouvant mener à la formation de métastases dans le cancer du côlon chez la souris (court terme) à partir d'un axe moins exploré dans la communauté scientifique comme l'apport de la physique à la biochimie et à la biologie de l'établissement de cette maladie. Dans un second temps, ces connaissances pourraient être extrapolées au cancer du côlon chez l'homme, du fait de la forte homologie des mécanismes sous-jacents au développement de la maladie chez l’homme et la souris (long terme), et aux tumeurs d'autres organes, pour lesquels il y a des données montrant l’activation anormale de notre protéine d’intérêt dans 8 autres tumeurs solides humaines, en plus du côlon humain (long terme). Enfin, nous visons à obtenir de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement du cancer du côlon chez la souris d'abord, puis chez l'homme, afin d’aider à supprimer les effets tumorigènes provoqués par la pression mécanique exercée par le développement de tumeurs dans les tissus environnants, et ainsi à atténuer les processus induits par la tumeur primitive, parmi lesquels la formation de métastases, la furtivité au système immunitaire, la résistance aux traitements et la résurgence (long terme).

Procédures

Dans un premier temps, les souris vigiles recevront une injection intrapéritonéale à différents temps déterminés en avance (une fois par jour pendant 4 jours ou une fois tous les deux jours pendant une semaine, ou deux fois par semaine pendant 4 semaines) (durée du geste inf à 10 sec). Ensuite, les souris seront divisées en différents groupes. Un groupe contrôle recevra seulement une injection intraveineuse (une fois au cours de l’expérience, sur animal vigile, durée du geste inf à 10 sec)). L’autre groupe suivra une chirurgie pour l’implantation d’un aimant en sous-cutané dans le dos de la souris suivi d’une injection intraveineuse avec des nanoparticules magnétiques (une fois au cours de l’expérience, chirurgie réalisée sous anesthésie pendant une durée maximale de 10 minutes). Une partie de ces souris sera suivie par colonoscopie sous anesthésie (une fois par semaine pendant 4 semaines, la durée de la procédure ne dépassera pas 20 minutes pour chaque souris). Au bout d’une semaine ou d’un mois, les animaux seront mis à mort pour prélever des échantillons du côlon et d’intestin

Impact sur les animaux

Les animaux seront injectés avec une solution de particules magnétiques encapsulés par voie intraveineuse et un petit aimant sera inséré par voie sous-cutanée dans le flanc supérieur droit pour établir la pression équivalente à celle d'une tumeur dans le côlon. La douleur provoquée dans cette partie expérimentale du projet est associée à l'injection et à l'implantation de l'aimant, mais ne devrait pas s'étendre sur le temps où la pression mécanique est établie (aucune réponse inflammatoire associée à la stabilisation des nanoparticules magnétiques n'a été trouvée). Après environ un mois, nous attendons le développement de tumeurs chez les animaux et l'inconfort qui y est associé, principalement une perte de poids et diarrhée, qui peut être observée dans les premières semaines après le développement de la tumeur. Un groupe de souris sera injecté par voie intrapéritonéale avant l'implantation de l'aimant et l’injection de particules magnétiques afin d'éliminer la population de cellules souches. Cela peut provoquer une gêne superficielle momentanée due à la piqûre qui ne devrait pas perdurer dans le temps. L’effet d’éliminer les cellules souches intestinales réduit la capacité du tissu à se régénérer et en conséquence induit une diminution de sa fonctionnalité qui peut se traduire en une perte de poids.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Les questions auxquelles on cherche à répondre dans ce projet ne peuvent être abordées expérimentalement sans l'utilisation d'animaux en raison de la complexité présentée non seulement par l'architecture et l'arrangement des organes in vivo, mais aussi par leur interrelation et leur rétroaction avec les systèmes immunitaire et circulatoire. Le modèle de souris est le plus approprié pour le développement expérimental de ce projet en raison de plusieurs aspects, notamment la caractérisation approfondie des mutations à utiliser, ainsi que la maladie et la réponse immunitaire dirigée contre elle. De même, tous ces aspects ont une forte homologie avec l'homme, la souris étant un excellent modèle pour les études précliniques des maladies humaines. Les alternatives de remplacement partielles ou complètes telles que les approches in vitro ou ex vivo comme les cultures de cellules tumorales ou les organoïdes ne peuvent pas imiter avec précision la croissance tumorale in vivo, notamment les pressions de croissance mécaniques associées qui provoquent l’activation des cellules souches cancéreuses. L'utilisation des souris transgéniques comme modèles pathologiques est actuellement le seul moyen d'aborder la problématique de ce projet fondamental. Les questions posées requièrent une complexité tissulaire qui ne peut être récapitulée qu’in vivo.

Réduction

Les résultats obtenus dans nos projets précédents nous ont permis de réduire et d’ajuster le nombre minimal de souris par condition nécessaire pour obtenir de résultats statistiquement fiables. Les analyses par colonoscopie in vivo tout au long des expériences à temps long nous permettent également de réduire le nombre total des souris utilisées.

Raffinement

L'implantation de l'aimant et l'injection de particules aimantées seront réalisées sous anesthésie et après injection d’un analgésique pour réduire la douleur post-opératoire. Pour éviter la déshydratation de la cornée un gel ophtalmique hydratant sera déposé sur les yeux. Des soins désinfectants seront administrés après mise en place sous-cutanée de l'aimant avec un contrôle de la cicatrisation de la plaie. Les souris seront pesées 2 fois par semaine et, en cas de déshydratation (maintien d'un pli cutané dorsal), une réhydratation sera réalisée d’une injection intrapéritonéale de Lactate Ringer avec présentation d’un gel alimentaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement) et les expériences seront contrôlées pour minimiser et prévenir la douleur chez les souris. Un maximum de 4 souris par cage sera autorisé en raison du risque accru de diarrhée après le traitement. Pour analyser la croissance tumorale, des analyses d'imagerie in vivo seront effectuées. Toutes les expériences d’imagerie seront réalisées sous anesthésie et seront effectuées par une équipe de 2 personnes si nécessaire et ne dureront pas plus de 20 minutes par animal. Pour toutes les techniques d'imagerie, un gel oculaire et des tapis chauffants seront utilisés pour minimiser l'inconfort et l'hypothermie. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux et sera utilisée afin d’intervenir rapidement sur la douleur et l’inconfort et arrêter l’expérimentation avant des signes de douleur.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l’utilisation d’un modèle animal anatomiquement proche de l’humain en vue d’une application clinique chez l’homme. La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en cancérogenèse. La souche de souris choisie contient une mutation génétique importante sur le gène APC connue pour jouer un rôle prépondérant dans le développement du cancer du côlon chez l'homme (80% des tumeurs du côlon humain possèdent cette mutation). Elle est donc depuis longtemps reconnue comme le modèle de choix pour le développement spontané de tumeurs intestinales. L'utilisation des souris sauvages et transgéniques comme modèles pathologiques est actuellement le seul moyen d'aborder la problématique de ce projet ayant comme but la description de l’influence des contraintes mécaniques dans les processus d’initiation et de progression tumorale avec une possible application pharmacologique thérapeutique associée chez l’homme.

Une partie des souris part vers des séances de formation à des gestes techniques une fois l'expérience finie, 210 individus au total, les autres étant tuées pour prélever leurs tissus. 504 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées au dioxyde de silicium alimentaire par leur mère dès la gestation puis pendant 130 jours, elles reçoivent des gavages trois fois par semaine, neuf prélèvements de sang à la queue, un poinçon dans l'oreille, des collectes de fèces en isolement deux fois par semaine, et pour la moitié d'entre elles une injection de toxine bactérienne dont les effets sont suivis jusqu'à six heures. Le porteur espère que ces données seront prises en compte par les instances réglementaires pour encadrer l'exposition humaine aux nanoparticules alimentaires, bénéfice renvoyé au conditionnel là où l'exposition des souris et l'injection de toxine sont, elles, programmées.

Objectifs

Les nanomatériaux (composés de particules < 100 nm) sont de plus en plus présents dans le secteur de l’agroalimentaire, notamment dans les aliments en tant qu’additifs. L’exposition à ces additifs est souvent chronique (jusqu’à 1-10 mg/kg/jour en Europe) et commence très tôt, via la consommation maternelle suivie d’un passage vers le fœtus (transplacentaire) ou dans le lait. Ce projet fait suite à des résultats qui montrent qu’une exposition à l'additif E551 provoque, une altération de la fonction de barrière intestinale (mesure de perméabilité), une mise en place de désordre métabolique et une modification du microbiote. Nous avons notamment mis en évidence une forte diminution de deux souches bactériennes chez des souris mâles exposés au E551 de la vie in utero jusqu'à l'âge adulte. Il s'agit de deux souches bactériennes probiotiques Akkermansia muciniphila et Bifidobacterium pseudolongum. L'objectif de ce projet sera d'étudier si une supplémentation avec ces deux souches probiotiques sera capable de modifier la mise en place des désordres provoqués par le E551 sur la fonction de barrière, sur le métabolisme et sur la réponse immunitaire. Pour ce projet, des souris femelles seront exposées 61 jours avant la mise bas et durant la lactation au E551 à 10mg/kg. L'additif sera incorporé dans l'aliment. La descendance continuera d’être exposée à l'additif via l'aliment et sera supplémentée ou non par voie orale avec les souches probiotiques seules ou associées pendant 130 jours.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en évidence le role d'un microbiote modifié dans la mise en place d'altération de la fonction de barrière intestinale, de désordres métaboliques et immunitaires. Ce projet apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale dans l'utilisation des additifs. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin d'émettre des préconisations dans l'exposition humaine aux nanoparticules alimentaires.

Procédures

Pour la supplémentation en probiotique les animaux recevront le solvant ou le probiotique (seul ou associé) par voie orale d'un geste rapide n'exédant pas 10 secondes à raison de 3 fois par semaine. Dans le cadre des mesures d'intolérance au glucose, de la glycémie, de l'insulinémie et de la perméabilité intestinale, les animaux recevront une administration orale de glucose ou d'un marqueur de perméabilité intestinale (geste rapide d'environ 10 secondes) et des prélèvements sanguins seront également réalisés au niveau de la queue (1 prélèvement pour la mesure de perméabilité, 8 prélèvements pour la glycémie-insulinémie), après application d'une crème anesthésiante locale (10 secondes/prélèvement). Des prélèvements de fécès seront aussi effectués deux fois par semaine tout au long de l’expérience. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages sans sciure pour permettre de récolter les fèces. Enfin, la moitié des animaux seront exposés au maximum 6 h à une toxine bactérienne délivrée par injection unique nécessitant une contention de quelques secondes des animaux.

Impact sur les animaux

La mise en oeuvre de nos procédures pourra générer du stress. Après la période d'acclimatation, les animaux seront identifiés par poinçon avec contention qui entrainera inconfort et stress. Par la suite le stress sera attenué par des manipulations hebdomadaires lors du suivi de poids ou d'observations. Les administrations des probiotiques par voies orale pourra générer du stress lié à la contention et à l'introduction de la sonde. Après le gavage, les animaux seront observés pour s'assurer qu'il n'y ait pas de fausse route (vocalise, mobilité réduite), le cas échéant l'animal sera euthanasié. Ensuite la réalisation des mesures d'intolérance au glucose ou de mesure de perméabilité seront génératrices d'inconfort notamment lié à l'administration orale de glucose ou de dextran et aux prélèvements de sang après anesthésie locale. Ensuite, l'injection de LPS qui s'effectue après contention de l'individu, peut engendrer un stress lié à la manipulation de l'animal et à l'injection en elle-même. La toxine peut perturber l'état général des animaux qui seront sous surveillance constante jusqu'à la fin de l'expérimentation.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, tous les mâles de la descendance ainsi que les femelles reproductrices seront euthanasiés afin de récolter les échantillons tissulaires pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique du projet. Les mâles reproducteurs et les femelles de la descendances seront réutilisés pour des actions de formations à des gestes techniques.

Remplacement

Des expérimentations utilisant des méthodes cellulaires complexes tels que des organoïdes intestinaux de souris ont préalablement été réalisé au laboratoire dans une nécessité de mettre en place une approche alternative à l’expérimentation animale. Ces expérimentations ont permis d’évaluer les effets direct d’additifs alimentaires inorganiques sur l’épithélium intestinal. Par conséquent, cette approche nous permet d'avoir une réponse très ciblée uniquement au niveau tissulaire/cellulaire et non intégrée. Dans notre étude nous souhaitons étudier l’impact d’une exposition à des additifs alimentaires dès la période de périnatalité et ces conséquences sur le microbiote intestinal ainsi que sur la barrière intestinale, le système immunitaire et le métabolisme. Les modèles alternatifs tels que les organoïdes ne peuvent pas reproduire le passage transplacentaire, les échanges maternofœtals ainsi que les interactions le long des axes microbiote-intestin-système immunitaire et intestin-foie. Ce modèle alternatif n’est pas non plus adapté pour étudier la répartition des particules inorganique dans l’organisme entier après le passage de la barrière intestinale.

Réduction

Nous avons conçu nos expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé en se basant sur des résultats antérieurs d'études similaires. Chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris. Pour les analyses des données récoltées, des tests statistiques adaptés seront réalisés.

Raffinement

Durant l'étude les animaux seront en hébergement collectif (5 ou 3 par cage selon le stade de l'expérimentation, 1 femelle par cage avec leurs petits pendant la lactation) avec un enrichissement des cages (dispositifs de nidification en papier absorbant et maisonnette) afin de réduire l'angoisse des animaux. L'angoisse sera également attenuée par des manipulations hebdomadaires lors du suivi de poids ou d'observations. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un anesthésique local sur la queue avant les prélèvements sanguins. L’identification des animaux par poinçon d’oreille permettra de réaliser un suivi individuel (observations, controles de prise de poids des animaux). Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance, il sera retiré de l'étude et des soins adaptés pratiqués. Le cas échéant une euthanasie sera pratiquée. L'exposition à la toxine bactérienne peut perturber l'état général des animaux qui seront observés en continu jusqu'à leur euthanasie.

Choix des espèces

La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote, l’intestin et le système immunitaire. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte (8 semaines) afin qu'elles soient capables de procréer et les descendants seront utilisés au sevrage jusqu'à l’âge de 5 mois. Cela permettra d’étudier le rôle de nos deux souches probiotiques sur une exposition périnatale suivie d’une exposition post-sevrage sur le développement des fonctions intestinales et métaboliques.

800 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à cinq gavages, subir dix-huit prélèvements sanguins et cinq mises à jeun, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent des mélanges d'antibiotiques pendant quelques jours à deux mois, pour que leur flore intestinale soit détruite, puis passent jusqu'à quatre tests métaboliques comportant chacun six heures de jeûne et quatre prises de sang. Le porteur écrit que ce protocole produit "a priori peu d'effets indésirables", tout en listant déshydratation, perte de poids et diarrhées. Toutes sont tuées pour que leurs cellules intestinales productrices d'hormones soient triées, au service d'une question posée en termes de santé humaine, l'obésité et les maladies inflammatoires de l'intestin.

Objectifs

Les intestins sont un organe majeur pour la santé car ils sont à l’interface entre alimentation, les bactéries intestinales et l’organisme. L’intestin permet notamment la digestion et l’absorption des aliments, tout en faisant barrière aux microbes et aux toxines. L’intestin produit également des hormones qui régulent les fonctions de différents organes, modulant ainsi par exemple le comportement alimentaire, la régulation énergétique ou les fonctions intestinales (transit intestinal, digestion…) elles-mêmes. Ces hormones sont produites par des cellules intestinales spécifiques, appelées cellules entéroendocrines (EECs). Ces cellules libèrent les hormones en réponse à des modifications de leur environnement. Des modifications des fonctions intestinales et notamment des hormones intestinales sont associées à différentes maladies telles l’obésité ou des maladies digestives. Ces maladies sont également associées à une modification des bactéries intestinales. Il a été montré que la déplétion complète du microbiote intestinal induit une modification importante des EECs et une augmentation des niveaux circulant de certaines hormones. Notre travail de recherche vise à mieux caractériser comment les bactéries de l’intestin influent sur les hormones intestinales et les cellules qui les produisent. Dans ce projet, nous modulerons le microbiote intestinal par l’action d’antibiotiques, mesurerons le niveau des hormones et analyserons précisément ces cellules grâce à l’utilisation de souris exprimant une fluorescence associée à ces cellules et permettant de les isoler. Nous chercherons notamment à identifier quelles sont les bactéries ou leurs produits responsables des modifications observées des EECs, ainsi qu’aux conséquences fonctionnelles des niveaux élevés de certaines hormones intestinales.

Bénéfices attendus

Le rôle de l’intestin et en particulier des hormones intestinales pour la santé de l’homme apparait comme étant très important, en particulier dans l’obésité ou les maladies inflammatoires de l’intestin, qui touchent plus de 650 millions d’individus à travers le monde. Un lien entre microbes et les cellules produisant les hormones intestinales a déjà été établi. Cette étude nous permettra d’identifier plus précisément comment certains produits microbiens ou certaines bactéries modulent les fonctions des EECs et quelles sont les conséquences sur la physiologie de l’hôte. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant de trier cette population cellulaire rare, et mesurerons les niveaux d’hormones après différentes stimulations. Cela nous permettra d’identifier comment ces cellules sont régulées dans différents contextes microbiens et d’en déduire les produits microbiens qui régulent ces cellules. Compte tenu des fonctions importantes de ces hormones pour la santé, ce projet permettra de proposer de nouvelles voies modulant leurs niveaux et ainsi agir sur les fonctions quelles régulent, notamment dans le cas de maladies où ces fonctions sont altérées.

Procédures

Les 800 animaux recevront des mélanges d’antibiotiques dans leur eau de boisson pendant quelques jours à deux mois. Toutes les expérimentations seront réalisées sur animaux vigiles. Les animaux seront pesés deux fois par semaine, et leur consommation alimentaire mesurée en parallèle. Au maximum quatre tests métaboliques seront réalisés sur tous les animaux. Chaque test comporte une phase de jeûne (6h), quatre prélèvements sanguins au maximum, et un gavage ou une injection d’un stimulus d’intérêt Certains animaux recevront une injection préalable à l’administration du stimulus. La durée d’un test métabolique n’excède pas deux heures entre la première prise de sang et la dernière et chaque prélèvement de sang en lui-même n’excède pas trente secondes. Un gavage supplémentaire au moment de la mise à mort (entre 10 minutes et une heure avant l’euthanasie) sera également réalisé sur des animaux mis à jeun pendant 2 à 6 heures pour la mesure du transit intestinal. Des prélèvements de sang seront réalisés lors de la mise à mort, avant le gavage et au moment de la mise à mort. Lors des mesures de transit, certains animaux recevront également une injection préalable pour étudier le rôle des hormones. Au total, les 800 animaux pourront recevoir jusqu’à 5 gavages, être prélevés pour leur sang 18 fois et mis à jeun 5 fois, en recevant les traitements antibiotiques pendant un maximum de deux mois.

Impact sur les animaux

Ce protocole produit a priori peu d’effets indésirables sur les animaux : la consommation des antibiotiques dans l’eau de boisson a déjà été pratiquée à de nombreuses reprises sans impact sur la santé et le comportement des animaux. Les effets indésirables des antibiotiques peuvent être une déshydratation, une perte de poids ou l’apparition de diarrhées. Les injections, gavages et prélèvement de sang peuvent induire une légère douleur et un stress du fait de la contention. Les jeûnes peuvent conduire à une perte de poids réduite, rattrapée les jours suivants. Les stimuli administrés n’ont pas d’effet indésirable connu chez les animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récolter leurs tissus pour l’isolement des cellules produisant les hormones intestinales par tri cellulaire. Les fonctions des cellules pourront alors être analysées par différentes techniques

Remplacement

L’utilisation de souris pour cette expérimentation est nécessaire par l’impossibilité d’étudier in vitro ou de modéliser l’interaction entre les bactéries et l’intestin du fait de l’absence de modèles pour cultiver un microbiote complexe en contact direct avec un épithélium intestinal dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’étudier l’ensemble des EECs.

Réduction

Dans ce projet, nous utiliserons des groupes de 8 animaux de même sexe. Ce nombre a été évalué comme suffisant par l’analyse statistique des variations de chaque variable au sein d’un groupe lors de projets précédents La rareté des cellules entéroendocrines nécessitant l’utilisation de tissus entiers pour chaque application. Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles car l’effet sexe est inconnu. Des analyses statistiques permettront d’étudier l’effet sexe sur la déplétion du microbiote.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, d'un abri en propylène rouge, et d’un support suspendu et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et seront hébergés à plusieurs par cage pour éviter l'isolement. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Une grille de décision (points limites) est établie.Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux. Les animaux seront habitués à être manipulés avant et pendant toute la durée de l’expérimentation afin de diminuer leur stress lors de la contention et les prélèvements.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont issues d’une lignée génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente dans toutes les cellules entéroendocrines. Cette lignée est un modèle particulièrement utile pour l’étude des cellules entéroendocrines, permettant de les trier ou de les distinguer facilement lors de l’analyse des tissus. L’étude portant sur les cellules entéroendocrines matures, des souris adultes (8 à 12 semaines au démarrage du protocole) seront utilisées. Les hormones intestinales et le système digestif de la souris étant très proche de celui de l’Humain, l’utilisation du modèle souris apporte des connaissances généralisables pour la santé humaine.