Système gastrointestinal

Instillations dans le nez ou la trachée sous anesthésie, gavages jusqu'à six fois dans la même journée, injections dans le ventre ou dans la veine, infections bactériennes du poumon ou de l'intestin : 14 416 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées, sans possibilité d'être réutilisées ni adoptées, parce qu'elles ont été infectées par une bactérie pathogène qu'elles pourraient porter et transmettre. Le projet vise à comprendre comment les bactériophages, virus qui n'infectent que des bactéries, se comportent chez un hôte vivant, en vue d'élargir leur usage thérapeutique face à l'antibiorésistance. Le porteur annonce des groupes de six souris au maximum et trois répétitions par expérience, sans expliquer comment on arrive à 14 416 souris.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de faire avancer les connaissances sur l’utilisation thérapeutique des bactériophages. Les bactériophages sont des virus qui infectent uniquement les bactéries. Ils peuvent donc être utilisés pour tuer les bactéries résistantes aux antibiotiques. Ils présentent l’intérêt d’être très spécifiques des bactéries ciblées. D’autre part, les bactériophages font partie de la flore naturelle au même titre que les bactéries. Très abondants dans le tube digestif des animaux ils jouent un rôle important dans le maintien de la santé de l’appareil digestif. Leur utilisation (transplantation virale) pour rétablir une homéostasie intestinale est soutenue par des données cliniques préliminaires encourageantes. Ainsi, nous étudierons les interactions dynamiques entre les bactériophages et les bactéries dans deux organes cibles : les poumons et les intestins. Les connaissances qui seront acquises au cours de ce projet permettront de mieux appréhender le potentiel thérapeutique des bactériophages dans le but de permettre leur utilisation plus large en clinique.

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont la compréhension des mécanismes mis en jeu lors d’une phagothérapie. Ces mécanismes recouvrent non seulement les interactions entre les bactériophages et les bactéries mais aussi celles avec l’hôte et notamment son système immunitaire. La meilleure compréhension de l’utilisation thérapeutique des bactériophages permettra d’augmenter le nombre de patients traités dans des conditions optimales d’efficacité. Permettre à des patients d’accéder à ce type de traitement alors que les antibiotiques ne sont plus efficaces permettra de réduire le nombre d’impasses thérapeutiques et le coût des frais hospitaliers mais surtout d’améliorer les conditions de vie de ces patients.

Procédures

Les prélèvements sur animaux vigiles seront limités à un seul prélèvement sanguin (quelques secondes), ou des prélèvements fécaux (chaque animal est placé dans une boite pendant quelques minutes et jusqu’à 2 fois par jour). Les administrations par gavage (quelques secondes) seront limitées à 2 par jour.

Impact sur les animaux

Nous veillerons dans nos expériences à impacter le moins possible le bien-être des souris. Les expériences consistent essentiellement à - des injections intrapéritonéales ou intraveineuses une fois ou sur quelques jours. La piqure d'aiguille pour effectuer ces injections entraine une douleur légère de courte durée. - des gavages intragastriques jusqu’à six fois sur une journée qui nécessitent une contention brève - des installations intranasales ou intratrachéales sur animaux anesthésiés - des protocoles infectieux qui entraineront un inconfort et une douleur de sévérité modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptible de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, la plupart d’entre eux seront mis à mort pour analyser des organes vitaux.

Remplacement

L’évaluation des différents points évoqués dans le résumé du projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). Par ailleurs, s’agissant de bactériophages, l’évaluation pharmacocinétique ne peut s’appuyer sur l’existence de modèles mathématiques. De même, l’étude in vitro des communautés microbienne d’un tube digestif prenant en compte la structuration spatiale des organes n’est pas encore disponible.

Réduction

D’une part, en amont des expériences conduites chez l’animal nous effectuons de nombreuses expériences in vitro afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. D’autre part, autant que possible, le nombre maximal de paramètres sera collecté pour chaque animal de façon à limiter le nombre total d’animaux utilisé. Un maximum de 6 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 3 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. Pour les données quantitatives, la distribution normale des variables sera vérifiée et les tests statistiques appropriés seront alors choisis. Pour les variables qualitatives d’autres tests seront effectués. Les éventuels effets confondants (sexe et cage par exemple) seront pris en compte au moment de l’analyse en utilisant des modèles linéaires à effets mixtes. L’outil de bioluminescence sera utilisé pour évaluer l’évolution de l’infection in situ, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.

Raffinement

Les animaux infectés seront observés 2 à 5 fois au cours du premier jour puis au moins une fois par 24h durant les 2 jours suivants puis ensuite une fois par période de 48h. Ils seront pesés au moins une fois par période de 48h dès le début du protocole. Une grille d’évaluation à 3 niveaux (0, 1, 2) permettra de suivre l’état de santé de chaque animal. Le score de 1 déclenchera l’ajout d’un diet gel pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Le score 2 sera attribué aux animaux ne bougeant plus et ayant une posture prostrée, ou présentant une perte de poids supérieur à 20%, ou présentant de signes de diarrhée pendant plus de 48h. Tout animal présentant un score de 2 pour l’un des critères sera mis à mort. Au cours des expériences, toute modification des procédures visant à réduire la douleur des animaux (par exemple, réhydratation sous-cutanée, chauffage des cages) sera évaluée avant d’être mise en place.

Choix des espèces

A ce stade expérimental du développement de la phagothérapie, la souris représente l’espèce la plus pertinente pour l’évaluation des paramètres pharmacocinétiques et l’innocuité du traitement. Il s’agit d’un mammifère dont le système immunitaire est bien connu et comporte de très grandes analogies avec celui de l’homme. L’utilisation d’autres animaux plus proches de l’homme (primates) ou de références en pharmacocinétique (porc Yucutan) ne peuvent représenter des animaux de première intention à ce stade de nos travaux. De même, la disponibilité d’élevages de souris gnotobiotiques est un outil de choix qui n’est pas encore disponible pour d’autres espèces. Dans tous les cas, seuls des animaux adultes seront utilisés (>= à 7 semaines) car leur système immunitaire est arrivé à maturité au contraire d’animaux plus jeunes.

Trente-deux semaines de régime hypercalorique, un bout de queue coupé sous anesthésie pour le génotypage, huit prélèvements de sang à la queue lors du test métabolique : 945 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie d'entre elles est gardée vivante pour l'élevage ou pour la seconde procédure, les autres sont tuées pour prélèvement des tissus. Le projet cherche à savoir si le dérèglement de l'horloge biologique aggrave la stéatose hépatique et le cancer du foie, en laissant les souris devenir obèses puis malades. Le porteur affirme que "la stéatose hépatique n'induit pas de nuisance" et que "le cancer du foie n'est pas douloureux", tout en décrivant l'ascite et l'encéphalopathie hépatique qui peuvent survenir, avec prostration, arrêt de l'alimentation et pelage négligé.

Objectifs

Le cancer du foie est une maladie en pleine expansion avec actuellement plus de 8500 nouveaux cas par an en France et plus de 7000 morts par an. En dehors des causes classiques provoquant une inflammation du foie comme les virus, l’inflammation sur foie surchargé en lipides (stéatose) est une maladie qui prend de plus en plus d’importance dans les pays développés. Cette maladie est due à l’association de plusieurs facteurs comme l’obésité, le diabète, ou le manque d’oxygène résultant de la maladie de l’apnée du sommeil. Lorsque l’on regarde de plus près ces facteurs, il a été montré que le dysfonctionnement de l’horloge biologique, aussi appelée horloge circadienne, est impliquée. L’horloge circadienne, permet aux organismes de régler leur activité en fonction du cycle journalier. De plus, à ce jour un seul traitement médicamenteux est approuvé pour le cancer du foie (carcinome hépatocellulaire). Cependant, ce traitement ne permet qu’une modeste amélioration de la survie et entraine souvent des effets secondaires qui altèrent la qualité de vie du patient. Il existe un besoin urgent de thérapies nouvelles, efficaces et sûres. Puisque les désordres métaboliques et l’horloge circadienne impliquent plusieurs organes, il est essentiel d'utiliser un modèle d'animal avec un carcinome hépatocellulaire qui associe tous les désordres sous-jacents observés chez le patient. Cela permet d'étudier l'efficacité des médicaments sur les tumeurs, mais aussi la tolérance du traitement. Cette étude permettra d’étudier l’influence et le rôle de l’horloge circadienne sur le développement du cancer du foie sur un foie stéatosé. Des études antérieures ont permis d’identifier des protéines qui régulent l’horloge. L’objectif de cette demande est maintenant de caractériser le rôle ces protéines dans le foie, pendant le développement de la stéatose, fibrose hépatique et les complications ultérieures, en combinant approches génétiques chez la souris, et analyses à grande échelle des gènes et protéines. Le modèle permettra aussi de déterminer les mécanismes moléculaires sous-jacents.

Bénéfices attendus

Les maladies de foie gras représentent une part importante des consultations chez le médecin et la prise en charge globale du patient représente un coût important pour le système de santé. Dans le cadre de cette étude, nous pourrons établir l’influence et le rôle de l’horloge circadienne dans l’établissement et le fonctionnement des maladies de foie gras. En conséquence, ce projet sera bénéfique à plusieurs échelles : démontrer des mécanismes de régulation importants des gènes de l'horloge, et de comprendre le mécanisme épigénétique de l’établissement de la stéatose hépatique et éventuellement le cancer du foie ; identifier un nouveau facteur de risque des maladies du foie gras, et donc les populations à risque de mauvais pronostic ; enfin de mettre en évidence la nécessité d’une prévention et surveillance plus étroite au niveau hépatique des personnes ayant un cycle journalier perturbé comme le jet-lag ou le travail de nuit

Procédures

Toutes les souris sont vigiles sauf indication contraire. Pour faire des analyses génétiques, un prélèvement unique du bout de la queue est réalisé à 17-21 jours de vie sous anesthésie (3min d’anesthésie,

Impact sur les animaux

Les prélèvements à la queue, ainsi que les injections dans le ventre lors des tests métaboliques provoquent une douleur légère et transitoire. La mise à jeun avant le test métabolique peut générer de l'incofort transitoire (période de jeun 6h). Le régime alimentaire va induire une réduction de la prise alimentaire car il est riche en graisse. Cependant des résultats antérieurs montrent que en terme d'apport calorique, des souris nourris avec ce régime là ont la même consommation calorique que des souris nourris avec un régime standard. La stéatose hépatique n’induit pas de nuisance. Nous n’attendons pas de décompensation de cirrhose. Si tel est le cas, cela se traduira par une ascite (abdomen distendu) ou des signes d’encéphalopathie hépatique qui correspond à une détérioration de la fonction du cerveau à cause de substances toxiques qui s'est accumulé dans le sang car le foie est trop atteint pour pouvoir correctement éliminer ces substances du sang (critères d’évaluation spécifiques : prostration, absence d’alimentation, pelage mal entretenue) Le cancer du foie n’est pas douloureux et des métastases ne sont pas attendues avec notre protocole d’induction des maladies métaboliques du foie. Les mâles de certaines lignées de souris peuvent montrer des signes d’agressivités.

Devenir

Une partie des animaux de la première procédure est gardé en vie pour être inclus dans la seconde procédure ou pour l’élevage. Les autres animaux sont mis à mort pour prélèvement des tissus. Tous les animaux de la deuxième procédure sont mis à mort pour prélèvements des tissus à analyser

Remplacement

Le développement du cancer du foie est un processus qui implique différents types de cellules au sein du foie et la maladie du foie stéatosé associe plusieurs facteurs, dont des perturbations métaboliques systémiques. Les lignées de cellules cancéreuses humaines du foie ne permettent pas de reproduire tous ces processus, en partie multi-organes. L’utilisation du modèle animal n’est donc pas pour l’instant remplaçable dans ce type d’étude.

Réduction

Un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (augmentation de 20% des scores qui permettent le diagnostique des différentes maladies : stéatose, la maladie métabolique du foie et le carcinome hépatocellulaire) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux. Notre approche statistique est basée sur la comparaison de deux moyennes. 7 animaux mâles par condition expérimentale en fin d’expérience sont nécessaires. En effet les stades de la pathologie peuvent être variable d’un animal à l’autre. Compte tenu du risque de perte de matériel biologique pendant l'expérience (mort inexpliquée d'un animal avant la fin de l'expérience ou atteintes des points limites), nous prévoyons un maximum de 9 souris mâles par groupe d’analyse. Les animaux produits mais qui n'entrent pas dans le projet pour des raisons génétiques, pourront être utilisés pour la mise au point d'autres études grâce à des prélèvements d'organes post-mortem

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’étude. Les animaux seront pesés une fois par semaine pour suivre l’évolution de la maladie et détectés tous signes précoces de souffrance. L'établissement des scores pour les points limites aura lieu à ce moment là, une fois par semaine. En cas d'apparition de signe de souffrance, la fréquence des observations pourra être augmentée jusqu'à trois fois par jour. La nourriture sera renouvelée deux fois par semaines. Un anesthésiant sera utilisé au moment du prélèvement à la queue afin de prévenir et/ou réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse dans le cas où elles surviendraient. En cas d’agressivité les mâles sont séparés. En cas de blessure la plaie est désinfectée. Si elle devient trop invalidante, la souris est mise à mort.

Choix des espèces

Du fait de sa grande similitude avec l’homme en terme de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris présente un modèle expérimental privilégié pour les investigations des maladies circadiennes et métaboliques survenant chez l’homme. De plus les mécanismes impliqués sont pour la plupart identiques chez l'homme et la souris. Il est possible aujourd'hui d'étudier les conséquences directes de la perturbation fonctionnelle d'un gène ou d'une protéine chez la souris dans un contexte de fibrose ou stéatose hépatique qui reproduit très précisément les caractéristiques des lésions hépatiques humaines. Les souris seront incluses dans le protocole dès l’âge de 17-21 jours pour l’étape d’analyse génétique. L’apparition des pathologies que l’on étudie chez le patient se développent à l’âge adulte. C’est pourquoi les souris mâles seront mises au régime alimentaire dès 7 semaines, et mises à mort entre 7 et 39 semaines.

Produire des lignées de souris transgéniques, importées de banques internationales ou créées sur place par CRISPR-Cas9 : 2 185 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 450 d'entre elles et modéré pour les 735 autres. Des femelles reçoivent deux injections hormonales à 48 heures d'intervalle pour être superovulées, d'autres sont opérées sous anesthésie de trente à quarante-cinq minutes pour qu'on leur réimplante des embryons dans l'utérus, et des mâles sont vasectomisés par section des canaux qui transportent les spermatozoïdes. Le porteur attend des douleurs après l'opération abdominale et des complications de cicatrisation, infection, gonflement ou ouverture de la plaie. Les femelles superovulées sont tuées pour recueillir leurs embryons, les receveuses après gestation et allaitement faute d'appareil reproducteur intact, et les mâles vasectomisés lorsque leur capacité d'accouplement est jugée nulle, constatée après huit accouplements sans résultat.

Objectifs

Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet aujourd’hui d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste - À introduire au sein de notre animalerie des lignées de souris transgéniques déjà existantes dans des laboratoires extérieurs ou dans des banques internationales, par des techniques de reproduction assistée (ART). - En cas d’indisponibilité de ces modèles, créer de nouvelles lignées de souris transgéniques par des techniques de transgénèse notamment en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 , prix Nobel 2020

Bénéfices attendus

Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour tester les concepts permettant de développer de futures thérapies innovantes.

Procédures

Certaines femelles seront injectées 2 fois à 48H d’intervalle. Le geste ne dure que quelques secondes. D’autres femelles seront anesthésiées en vue d’être opérées pour une réimplantation d’embryons dans la cavité utérine (durée de l’anesthésie 30 à 45 minutes) Enfin, des mâles seront anesthésiés avant d’être opérés. L’opération consiste à couper les canaux qui transportent les spermatozoïdes (durée de l’anesthésie 30 à 45 minutes)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues après les injections sont des douleurs liées à la piqûre elle-même. Les femelles réimplantées avec les embryons ainsi que les mâles vasectomisés subissent une chirurgie. Une douleur est attendue à la suite de l’opération abdominale. Aussi la cicatrisation peut rencontrer certains problèmes : infection, gonflement, ouverture de la plaie

Devenir

Il est nécessaire de mettre à mort les femelles superovulées pour recueillir les embryons à une cellule. Les mâles vasectomisés sont utilisés pour leur capacité d’accouplement. Ils sont mis à mort lorsque cette capacité est nulle, établie après 8 accouplements sans femelle accouplée. Nous transférons des embryons chez des femelles receveuses en effectuant une incision au niveau de l’appareil reproducteur. Ces souris ne présentent donc pas d’appareil reproducteur intact pour pouvoir être réutilisées pour une deuxième expérience. Elles sont mises à mort après avoir mené à terme leur gestation et allaitement

Remplacement

En amont du projet, les chercheurs effectuent systématiquement des analyses préalables in-vitro quand cela est possible (culture de cellules, organoïdes…). Cependant, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche). Nous favoriserons l'importation de modèles transgéniques déjà répertoriés et caractérisés dans des bases de données. Cependant, si le modèle n'est pas disponible, nous créerons un modèle innovant par les approches de transgénèse ou de FIV

Réduction

Nous avons optimisé nos procédures pour générer des modèles innovants de souris génétiquement modifiées. Nous associons la technologie CRISPR/Cas9 (Prix Nobel de chimie 2020) à la technologie d’électroporation d’embryons pour le transfert de matériel génétique dans le noyau des embryons à une cellule. De nombreuses améliorations ont été apportées : • Optimisation des outils CRISPR/Cas9 grâce à des analyse in-silico • Choix des souches de femelles receveuses les plus adaptées pour recevoir ces embryons et mener à bien les gestations et les allaitements. Ces optimisations nous ont permis de diminuer d’un facteur 2 le nombre de souris donneuses et receveuses nécessaires à la création d’un modèle génétiquement modifié Nous avons également développé la technique de Fécondation In-Vitro (FIV), permettant la production de cohortes d'animaux de même âge tout en diminuant fortement le nombre d’animaux utilisé. Les approches de transgénèse et de reproduction assistée n’utilisent pas d’approche statistique.

Raffinement

L’ensemble des procédures nécessitant de la chirurgie se fait sous anesthésie générale, par ailleurs des analgésiques permettent de prendre en charge la douleur liée à ces chirurgies. Un fluide réhydratant chauffé à 37°C est systématiquement injecté en fin de chirurgie afin d’éviter des problèmes de déshydration et permettre un réveil de qualité. Les souris opérées sont placées sur un tapis chauffant et reçoivent de la nourriture riche en graisses (9.9%) ainsi que des graines de tournesol disposées au fond de la cage. Cette disposition leur permet de se nourrir sans avoir à se mettre sur leurs pattes arrière et tirer sur leurs cicatrices. Les animaux seront surveillés pendant les 2 jours suivant l’opération pour vérifier que la cicatrisation se passe bien Il est extrêmement rare d’observer des complications dans ce types d’expériences. Néanmoins, la grille de score permettra l’arrêt l’expérience en cas d’observation d’une souffrance chez l’animal

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée - superovulation efficace et embryons faciles à injecter Nous n’utilisons que des souris adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. Les femelles sont utilisées jusqu'à l'âge de 6 mois, tandis que les mâles sont utilisés jusqu'à l'âge de 12 mois.

Trop faibles pour atteindre la nourriture placée en hauteur dans leur cage, les souris mâles privées de myotubularine développent une faiblesse musculaire généralisée qui gêne leurs déplacements. 850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 798 d'entre elles et modéré pour 52. Elles subissent l'ablation d'un bout de queue pour génotypage, deux à six prélèvements de sang sous anesthésie, puis une perfusion intracardiaque qui les tue en moins d'une minute, pour chercher des anomalies du foie que les patients atteints de myopathie myotubulaire présentent dans 91 % des cas. Deux lignées sont utilisées, l'une privée de la protéine dans tout le corps et dont l'espérance de vie ne dépasse pas six à huit semaines, l'autre seulement dans le foie, retenue parce qu'elle vit assez longtemps pour laisser à l'atteinte hépatique le temps de se développer.

Objectifs

La myopathie myotubulaire est une maladie congénitale liée au chromosome X, affectant les garçons et caractérisée par une faiblesse musculaire généralisée et une insuffisance respiratoire. Les patients meurent prématurément dans les premières années de vie, généralement suite à un arrêt respiratoire. Cette myopathie est due à des mutations dans un gène exprimant une protéine, la myotubularine qui est présente dans l’ensemble du corps humain. Des maladies du foie et des voies biliaires ont notamment été reportées pour 91% des patients. Un modèle murin de la myopathie myotubulaire a été créé avec une absence d’expression de la protéine dans l’ensemble des tissus. De prime abord, il ne montre pas de signe apparent d’une dysfonction au niveau de la structure du foie. Cependant, des analyses plus approfondies doivent être réalisées pour détecter certaines anomalies du foie. De plus, l’espérance de vie de ces souris ne dépassant pas 6 à 8 semaines, à cause de leur insuffisance respiratoire, il est possible que la pathologie hépatique ne se soit pas suffisamment développée pour être détectable au niveau structurel. Nous disposons d’un autre modèle murin n’exprimant pas la myotubularine spécifiquement dans le foie qui nous permettra de caractériser la fonction hépatique sur une période plus longue, à différents âges, puisque l’espérance de vie de ces animaux ne sera pas affectée. Dans ce projet, nous souhaitons donc étudier les problèmes qui peuvent survenir dans le foie sur les deux modèles de souris et ce, par des analyses d’enzymes hépatiques, des analyses de la structure du foie et des analyses biologiques.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier et de caractériser des atteintes hépatiques dans un modèle existant de la myopathie myotubulaire ou dans un nouveau modèle spécifique pour mieux comprendre la pathologie hépatique observée chez les patients. Cela permettrait également d’identifier de nouveaux candidats thérapeutiques pour lesquels nous pourrions à l’avenir vérifier leur efficacité chez la souris, pour à terme apporter une solution thérapeutique adaptée aux patients.

Procédures

Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés : environ 5 min par souris, 2 à 6 fois en fonction de l’âge à l’euthanasie. Injection intrapéritonéale d’anesthésiques et injection sous-cutanée d’analgésique pour certains groupes avant perfusion intracardiaque : moins de 1min, 1 fois pour ces deux types d’injection. Perfusion intracardiaque pour fixation des tissus : moins d’une minute avant la mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un prélèvement d’un bout de queue associé au tatouage, pour identification et génotypage. Les nuisances que le modèle n’exprimant pas la myotubularine dans l’ensemble des tissus peut rencontrer sont liées à l’absence de la protéine dans les muscles squelettiques. Les mâles développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leur déplacement et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Les injections intra-péritonéales, sous-cutanées ou les prélèvements sanguins provoquent une douleur légère liée à la piqûre.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever le foie qui nous permettra de caractériser son état, sa fonction, sa structure, et des altérations biomoléculaires. Tous les animaux reproducteurs servant au maintien des lignées seront euthanasiés lorsque la reproduction ne sera plus efficace.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable pour caractériser l’atteinte hépatique observée chez les patients tels que les défauts de localisation de certaines molécules dans les différents compartiments du foie (canal biliaire par exemple), les défauts de structure de ces compartiments, ou encore les défauts de composition de la bile. Les organoïdes de foie que l’on pourrait développer ne possèdent pas à ce jour toutes les caractéristiques du foie : ils ne possèdent pas les structures anatomiques spécifiques comme les canaux biliaires, et par conséquent également il n’y a pas de flux biliaire. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour cette étude.

Réduction

Le nombre minimal d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à l’aide de calculs statistiques pour pouvoir observer des différences entre les animaux sains et mutés ou pour maintenir les lignées le long du projet. Pour la caractérisation des souris porteuses de la mutation uniquement dans le foie, trois âges d’euthanasie sont définis : 3 mois, 6 mois et 12 mois. Si dès 3 mois, l’atteinte hépatique s’est développée, nous étudierons l’évolution jusqu’à 6 mois.Les animaux à 12 mois ne seront peut-être pas utilisés si l’atteinte hépatique s’est développée à 3 et 6 mois.

Raffinement

Afin de raffiner nos études, les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies à l’aide de coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. En cours de protocole, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie rétro-orbitale ou mandibulaire, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse. Concernant les souris porteuses de la mutation dans l’ensemble des tissus, des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 3 fois par semaine, en plus de l’observation quotidienne des animaux. Un aliment hydratant et nourrissant sera de plus placé au sol dans la cage pour faciliter l’accès aux souris malades. Afin de réduire la souffrance et le stress de ces animaux, des points limites ont été établis.

Choix des espèces

Les souris porteuses de mutation dans le gène exprimant la myotubularine ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène responsable de la myopathie myotubulaire, de façon ubiquitaire ou spécifiquement dans le foie, ce qui en font les plus petits modèles animaux à caractériser pour la fonction hépatique. Les mâles n’exprimant pas la protéine dans l’ensemble des tissus ainsi que les animaux contrôles seront utilisés après sevrage, à l’âge de 3 semaines et seront euthanasiés à l’âge de 6 semaines. A ce stade, la pathologie s’est suffisamment développée pour permettre la caractérisation d’une éventuelle atteinte hépatique. Les animaux qui n’expriment pas la protéine dans le foie et les animaux contrôles, seront utilisés à partir de 2 mois et jusqu’à 3, 6 ou 12 mois pour observer une évolution des enzymes hépatiques dans le sang et laisser le temps aux souris de développer une atteinte hépatique que l’on caractérisera à partir de prélèvements post-mortem. Les animaux à 12 mois ne seront peut-être pas utilisés dans l’étude si l’atteinte hépatique s’est développée à 3 et 6 mois.

Les souris de ce projet sont génétiquement modifiées et élevées sur place, chaque première portée subissant une biopsie de la queue dans ses deux premières semaines de vie. 604 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Trois gavages espacés de cinq jours, une injection intrarectale sous anesthésie et des injections dans l'abdomen déclenchent une inflammation intestinale susceptible de provoquer perte de poids, baisse d'activité, douleur et diarrhée sanglante, pour tester le rôle protecteur d'une protéine dans la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse. Les souriceaux qui n'ont pas le génotype recherché sont tués après le génotypage, les autres servent à la reproduction et aux expériences avant d'être tués pour prélever l'intestin.

Objectifs

Les maladies chroniques intestinales, telles que la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, ont un effet dévastateur sur la qualité de vie des patients. L’origine de ces maladies reste inconnue, et de ce fait les traitements manquent de précision et d’efficacité. Une série d’observations suggère que ces maladies sont liées à une inflammation chronique intestinale induite par l'hypersensibilité du côlon à l’alimentation et au microbiote intestinal. Une réponse inflammatoire dérégulée et un dysfonctionnement du système immunitaire sont considérés comme les deux causes les plus suspectes associées à ces maladies. Dans ce travail, nous utiliserons un modèle de souris pour explorer davantage le lien potentiel entre la réponse inflammatoire/immune dérégulée et le développement des maladies chroniques intestinales. Dans ce contexte, l'objectif du projet est de déterminer in vivo le rôle protecteur d’une protéine en réponse à différents stress environnementaux ainsi que d’évaluer son potentiel thérapeutique dans le contrôle de l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

La maladie de Crohn et la colite ulcéreuse sont des maladies inflammatoires chroniques susceptibles d'évoluer vers la fibrose et le cancer colorectal. Le bénéfice de ce projet est d’évaluer une potentielle cible thérapeutique dans le contrôle de l’inflammation, afin d’optimiser l'efficacité du traitement des maladies inflammatoire intestinale. Ce projet vise également à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de la réponse inflammatoire intestinale.

Procédures

1) La première portée de chaque couple de souris pour le maintien de lignée dans les 2 premières semaines de vie seront soumises à une biopsie de queue en quelque secondes. 2) Toutes les souris seront soumises à 3 gavages oraux durant moins d’une minute, 1 gavage tous les 5 jours. 3) Certain souris rêverons une anesthésiées administrée en injection intrapéritonéale et recevront par voie intra-rectale un produit chimique. 4) Certain souris seront pesées chaque jour en quelques secondes pendant 3 jours minimum et 2 semaines maximum. 5) Certain souris recevront 3 fois une injection intrapéritonéale et seront pesées 1-3 fois en quelques secondes.

Impact sur les animaux

Le génotypage des souris se fera par une biopsie caudale qui peut provoquer une légère douleur. Le gavage et l’injection intrapéritonéale peuvent induire un stress et une douleur légère. Les modèles d’inflammation intestinale sont susceptibles d’induire une inflammation intestinale, ce qui peut provoquer une perte de poids, une baisse d'activité, de la douleur et de la diarrhée avec saignement. L’injection intra rectale peut conduire à une douleur légère et du stress.

Devenir

Les animaux ayant pas le bon génotype seront mis à mort après le génotypage. Des animaux avec le bon génotype sont gardés en vie pour la reproduction et les procédures expérimentales. L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour récupérer les tissus d'intérêt, notamment l’intestin.

Remplacement

L’emploi du modèle animal est indispensable afin d’étudier une réponse inflammatoire en milieu physiologique où les cellules du tube digestif sont confrontées aux aliments dégradés, aux bactéries participant à la digestion et en présence d’un système immunitaire. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement physiologique auquel est soumis une réponse d’inflammation in vivo.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec le nombre minimum d’animaux nécessaire à l’obtention d’un résultat significatif déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 au maximum en cage ventilée pour le maintien en communauté, en accord avec leurs besoins sociaux, et disposeront d’eau et nourriture ad libitum. Le génotypage et la biopsie seront réalisées durant les 2 première semaines de vie des souris. Afin de réduire le traumatisme lié au gavage oral, les manipulateurs seront bien formés et des sondes de gavage souples à bout arrondi seront utilisées. Afin de réduire le traumatisme lié aux injections rectales, une anesthésie sera utilisée. La taille d’aiguille de l’injection sera adaptée à la taille de l’animal. Une surveillance sera effectuée 1 à 2 fois par jour par les membres de ce projet ou par les zootechniciens afin de détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance de l’animal. Pour limiter au maximum la douleur et la souffrance associée au sepsis sévère et notamment lors de la fin de vie, une grille d’évaluation du bien-être animal est mise en place.

Choix des espèces

La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins fait de la souris un modèle de référence pour étudier la réponse inflammatoire/immune et le développement des maladies chroniques intestinales comme la colite ulcérative ou la maladie de Chohn. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 à 13 semaines après la naissance), où elles possèdent un système immunitaire mature.