Système gastrointestinal

Les souris reçoivent une injection intraveineuse de vésicules extracellulaires puis une injection sous-cutanée de cellules de cancer de la prostate, chacune de quinze secondes. 60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La mise à mort se fait par exérèse du foie sous anesthésie, pour prélever prostate et foie et chercher si ces vésicules favorisent l'installation de métastases hépatiques. Les procédures décrites tiennent en une phrase et ne mentionnent que la douleur légère et brève des deux piqûres, la croissance de la tumeur et le développement des métastases n'apparaissant nulle part parmi les atteintes attendues.

Objectifs

Le cancer de la prostate présente une évolution généralement favorable, mais une proportion significative de patients développe une forme agressive associée à l'émergence de métastases, en particulier hépatiques, connues pour leur pronostic défavorable. Des études ont suggéré que la différenciation des cellules tumorales en cellules neuroendocrines joue un rôle dans les processus métastatiques. Cependant, les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents demeurent insuffisamment caractérisés. La formation de métastases à distance de la tumeur primaire est étroitement liée à la formation de niches pré-métastatiques, régulées par des signaux émis par les cellules tumorales. Parmi les signaux impliqués dans la communication cellule-cellule, les vésicules extracellulaires (VEs) suscitent un intérêt grandissant en raison de leurs multiples rôles physiologiques et pathologiques. En effet, les VEs sont reconnues pour leur implication dans les processus métastatiques par le transfert de leur contenu (ARN, protéines…). Notre hypothèse est que les VEs dérivées des cellules neuroendocrines de la prostate jouent un rôle essentiel dans la formation de métastases hépatiques en favorisant la création de niches pré-métastatiques. Cette étude vise ainsi à mettre en évidence l’implication spécifiques des VEs dérivées des cellules neuroendocrines du cancer de la prostate dans le processus de formation de métastases hépatiques et de caractériser les mécanismes sous-jacents par lesquels ces VEs favorisent la formation de niches pré-métastatiques.

Bénéfices attendus

Si le rôle des VEs dans la formation de métastases est reconnu dans plusieurs cancers, le rôle des VEs dérivées des cellules neuroendocrines du cancer de la prostate dans la formation de métastases hépatiques n’a jamais été caractérisé à ce jour. Ce projet permettra de faire la preuve de concept de l’implication des VEs dérivées des cellules neuroendocrines du cancer de la prostate dans la formation de métastases hépatiques. Cette étude permettra par ailleurs d'identifier des biomarqueurs impliqués dans la formation de niches pré-métastatiques, qui seront utiles pour le diagnostic et la prédiction du pronostic du cancer de la prostate. Enfin, une meilleure compréhension du rôle des VEs dans la formation de métastases hépatiques contribuera à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la communication entre les cellules cancéreuses et leur environnement afin de prévenir la formation de métastases.

Procédures

Les souris auront une administration de VEs par voie intraveineuse d'une durée de 15 secondes par souris et une administration de cellules tumorales par voie sous-cutanée d'une durée de 15 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Les souris auront une administration de VEs par voie intraveineuse (douleur légère de courte durée) et une administration de cellules tumorales par voie sous-cutanée (douleur légère de courte durée).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever la prostate et le foie.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux est essentielle pour étudier le rôle des VEs dérivées des cellules neuroendocrines du cancer de la prostate dans la formation de métastases hépatiques. Nous avons recours à des animaux car il n’y a pas de méthodes alternatives. En effet, il n’existe aucun moyen de remplacer une telle étude dans laquelle la réponse physiopathologique est complexe et met en jeu plusieurs types cellulaires (cellules inflammatoires, fibroblastes, …).

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été déterminé comme celui permettant de démontrer une différence statistiquement significative de 30 % du nombre de métastases hépatiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en présence de papier kraft et de carrées de coton pour faire leur nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose. Les administrations de VEs et de cellules de cancer de la prostate se feront sur animaux sous anesthésie médicamenteuse avec un mélange buprénorphine/xylazine/kétamine. Nous effectuerons un suivi quotidien des animaux tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur grâce à une grille de score. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait sa mise à mort anticipée. Une laparotomie sera réalisée et la prostate et le foie seront ensuite prélevés. La mise à mort sera réalisée par exérèse du foie sous anesthésie médicamenteuse avec un mélange buprénorphine/xylazine/kétamine.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix en raison des similitudes physiopathologiques de la formation de métastase chez l’Homme. Le cancer de la prostate et la formation de métastases hépatiques sont des processus qui surviennent chez l’adulte, nous utiliserons donc des animaux âgés de plus de 8 semaines dans notre étude.

1 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie d'entre elles suivies jusqu'à 24 mois, soit toute leur vie. Tatouées aux doigts à trois semaines, elles passent tous les trois mois un test de force de préhension jusqu'à lâcher la grille, un test de mémoire spatiale de dix minutes et un suivi du transit au charbon, pour établir un score de fragilité calqué sur celui utilisé chez les personnes âgées. Vient ensuite l'infection fongique ou bactérienne, avec un risque de sepsis que le porteur reconnaît, puis un traitement quotidien pendant quinze jours à un mois et une pesée journalière sur sept jours. Le porteur retient la souris pour la complexité de la réponse immunitaire, puis ajoute des motifs d'un autre ordre, "faibles coûts", cycles de reproduction courts, croissance rapide et facilité de manipulation.

Objectifs

L’âge de la population mondiale augmente avec actuellement environ 8.5% de la population âgée de plus de 65 ans et cette proportion devrait approximativement doubler d’ici 2050. Cette augmentation massive de la population âgée s’accompagne d’une dégradation de l’état de santé et des pathologies associées au vieillissement. En particulier, le vieillissement est associé à un facteur de risque majeur d'infections. Les infections à Candida (candidoses) chez les personnes âgées constituent un problème clinique majeur et en expansion, avec une mortalité significativement plus élevée chez les personnes âgées que chez les plus jeunes. Ainsi, notre hypothèse serait que la différenciation des cellules de l’immunité innée, les cellules myéloïdes, au cours du vieillissement serait modifiée contribuant à l’installation de l’inflammation chronique liée à l’âge (inflammaging) et favorisant le développement d’infections. Ce projet va s’appuyer sur l’expertise acquise depuis de nombreuses années dans l’étude des mécanismes moléculaires et des voies de signalisation impliquant les récepteurs nucléaires dans la modulation du phénotype des cellules myéloïdes. Ce projet associera des modèles biologiques bien maîtrisés (infection par Candida, souris spécifiquement délétées au niveau de la lignée myéloïde pour divers récepteurs de reconnaissance des pathogènes ou des facteurs impliqués dans leurs recrutement et différenciation). Ainsi, ce projet nous permettra de définir de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiques de l'inflammaging et du défaut de réponse vis-à-vis des infections observé avec le vieillissement.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension de l’impact du vieillissement sur la fonction des cellules immunitaires semble essentiel pour déterminer leur importance dans l’installation de l’inflammaging (inflammation s’installant avec l’âge) et dans la modulation de la réponse anti-infectieuse chez les personnes âgées. Ces données approfondies nous permettront de définir des stratégies thérapeutiques ciblant ces cellules.

Procédures

Pour l’identification et permettre un suivi individuel, les souris seront tatouées aux doigts (tatouage permanent) à 3 semaines de vie. Uniquement pour les souris nécessitant une vérification de leur génotypage, un bout de queue sera prélevé. L'étude vise à étudier les mécanismes du vieillissement. Ainsi, différents tests seront pratiqués afin de déterminer la fragilité des animaux s'installant avec l’âge sur 24 mois maximum : test de force de préhension et de fatigue musculaire (l'animal s'agrippe à une grille et la force et le temps de prise sont évalués), test de mémoire spatiale (2 objets sont placés à proximité de l'animal et son interaction avec les objets est évalué pendant 10min 2 fois en 24h), motilité et perméabilité intestinale (le suivi d'une prise de charbon colorant les selles permet de suivre sur quelques heures l'activité du transit). Ces tests seront pratiqués une fois sur tous les animaux et tous les 3 mois pour ceux dont un suivi longitudinal sera mis en place. Ils permettront d’établir un score de fragilité comme il est pratiqué chez l’homme. Des prélèvements seront effectués 1 fois ou maximum 1x tous les 3 mois sur la durée de vie des animaux. Lors de la préhension des souris pour la pesée, l’urine ou les selles émises spontanément par la souris seront récupérées maximum avec une fréquence de 3 mois tous les 3 mois. Suite à l’étude de la fragilité, la réponse immunitaire anti-infectieuse fongique ou bactérienne des souris sera évaluée et l’effet de traitements de type nutraceutiques sera évalué. Certains animaux infectés recevront par voie orale tous les jours pendant 15 jours à 1 mois ou par injection intrapéritonéale 1x tous les 2 jours pendant 15 jours. Un suivi sera mis en place pendant maximum 7 jours avec la pesée, le prélèvement d’urine et de selles tous les jours pendant 7 jours. Du sang et différents organes seront prélevés en fin de vie.

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux pour le prélèvement d’urine et les tests de force, de motricité et de cognition peuvent stresser les animaux. Une attention particulière sera portée sur la manipulation des cages de manière indépendante (changement de gants, nettoyage du matériels utilisés entre chaque cage). Bien que les prélèvements de sang soient effectués de manière très espacée, ils peuvent entrainer des lésions. Ces prélèvements, prévus au niveau mandibulaire, seront alternés d’un côté et de l’autre. Lors d’injection intrapéritonéale, le point d’injection sera désinfecté et surveillé journalièrement. Les modèles d’infection peuvent entrainer un sepsis et altérer la survie des animaux. Une surveillance journalière permettra d’intervenir au plus tôt.

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de récupérer de nombreux tissus et acquérir le maximum de données biologiques.

Remplacement

Les mécanismes de la réponse immunitaire sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité qui ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Les souris âgées nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, en tenant compte des expériences déjà réalisées au laboratoire. Le modèle est bien maitrisé au laboratoire. Chaque animal est observé à différents temps (étude longitudinale) et devient son propre contrôle. Les groupes d’animaux seront constitués de 6 à 10 individus pour permettre une étude statistique. Des analyses post mortem sur différents organes seront réalisées afin d'obtenir le plus d'informations possibles sur les animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement afin de s'assurer de leur bien-être (alimentation, boisson, comportement...). Plusieurs sources d’enrichissement dans la cage (tunnel, papier) permettront d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Leur poids sera évalué si une modification de comportement ou des points limites ci-dessous étaient observés, ou tous les 3 mois au cours du suivi longitudinal pour certains animaux, et tous les jours au moment de l’infection, cette mesure aidera à déceler une quelconque souffrance et/ou détresse.

Choix des espèces

Les mécanismes de la réponse immunitaire sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité et ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Des souris adultes jeunes afin d'avoir des souris avec un système immunitaire mature et souris âgées pour l’étude du vieillissement seront étudiées. Les souris âgées nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés qui nous permettront d’explorer l’implication de différentes voies de signalisation, cibles pertinentes pour des approches pharmacologiques dirigées.

Une piqûre ou une incision de la veine caudale chaque semaine pendant huit semaines, un gavage, une injection, douze heures sans nourriture, deux mois de régime gras et une biopsie de queue à six jours. 537 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 220 d'entre elles et modéré pour 317, toutes tuées pour prélèvement. Le porteur indique établir des organoïdes intestinaux à partir de ces mêmes souris pour traiter ex vivo une partie des questions, tout en concluant qu'aucun modèle de remplacement n'existe à ce jour. Les champs du résumé désignent l'objet de l'étude comme "un gène" sans jamais le nommer, et ne disent pas ce que les souris développeront réellement.

Objectifs

Il s’agira de comprendre précisément le rôle d’un gène dans le métabolisme digestif et de déterminer les conséquences de son absence pour des maladies affectant l’intestin (cancer du côlon, maladies inflammatoires chroniques de l’intestin comme la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique). Ces deux objectifs nécessitent l’utilisation de modèles murins à même de récapituler la complexité de l’intestin et d’intégrer l’interrelation fonctionnelle des organes du système digestif en contexte physiopathologique.

Bénéfices attendus

Le projet apportera d'importants bénéfices en termes de compréhension de la biologie, de développement de traitements et d'étude des maladies humaines. En effet, il permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques qui garantissent le fonctionnement du système digestif et sont dérégulés lors de maladies (ex. cancer colorectal, maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, diabète, obésité). A terme, les nouvelles connaissances générées par le projet contribueront à améliorer la santé humaine en fournissant des pistes innovantes pour la prévention, le diagnostic et la prise en charge thérapeutique des maladies du système digestif.

Procédures

- Prélèvements sanguing : piqûre veine caudale sur animaux vigiles une fois par semaine pendant 8 semaines ou par incision veine caudale sur animaux vigiles une seule fois ou trois fois avec 20 jours d’intervalle. - Injection : 1 injection unique sur animaux vigiles. - Gavage : une seule fois sur animaux vigiles avec une canule de gavage. - Diète : pas de croquettes pendant 12 h, réalisé une seule fois. - Régime riche en graisse (20 %) : réalisé pendant 2 mois, une seule fois. - Biopsie de queue : une seule fois sur animaux vigiles âgés d’environ 6 jours.

Impact sur les animaux

Les procédures sont susceptibles d’entrainer un stress, des modifications du poids (gain/perte) et la douleur chez les animaux soumis aux expérimentations, mais elles ont été réfléchies afin de réduire au maximum ces effets indésirables. Les animaux seront surveillés très régulièrement durant les procédures pour détecter le plus précocement possible la douleur chez les animaux et y remédier. En cas d’apparition de signes de souffrance au cours des protocoles (ex. perte de poids importante, pelage dégradé, prostration), les animaux seront mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.

Remplacement

Des observations faites chez les malades, ainsi que des expériences effectuées avec des cellules cultivées in vitro, suggèrent fortement que la disparition d’un gène étudié par l’équipe perturbe le fonctionnement du système digestif et conduit à des pathologies intestinales. Pour confirmer ces hypothèses et comprendre le rôle de ce gène, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal : la perturbation du métabolisme digestif, l’apparition de lésions tumorales ou d’un syndrome inflammatoire intestinal ne peuvent survenir que dans un organisme entier, pourvu de l’interconnexion fonctionnelle des différentes acteurs (ex. organes, système immunitaire, microbiote), et sur le long terme. Il n’existe pas de modèle alternatif de remplacement disponible à ce jour pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque procédure a été défini sur la base de la littérature scientifique et de façon à permettre des analyses statistiques (calculs de puissance statistique). Pour ne pas utiliser des groupes d’animaux supplémentaires, les prélèvements seront stockés et pourront être utilisés par la suite s’il est nécessaire d’examiner des paramètres complémentaires. En outre, des organoïdes intestinaux seront établis à partir des animaux pour étudier lorsque cela est possible certaines questions scientifiques ex vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions sanitaires contrôlées et permettant un bien-être optimal (ex. groupes sociaux, carrés de coton pour la fabrication des nids, bâtonnets à ronger). Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. En outre, des points limites ont été prédéfinis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les animaux seront surveillés très régulièrement durant les procédures pour détecter le plus précocement possible la douleur (ex. perte de poids, pelage dégradé, prostration, mimiques faciales) et y remédier. En cas d’apparition de signes de souffrance, les protocoles seront soit allégés (dose ou durée) si cela est possible, soit immédiatement arrêtés.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus) qui permet de générer des modèles d’étude des maladies humaines pertinents et bien caractérisés. Les lignées de souris transgéniques nécessaires à la réalisation du projet ont été décrites dans la littérature scientifique comme n’ayant aucune altération grave de leur bien-être et de leur santé. En particulier, elles ne développent pas spontanément des tumeurs ou une inflammation intestinale. Certaines de ces lignées de souris produisent des selles d’aspect graisseux et développent un surpoids en vieillissant, mais leur espérance de vie, ainsi que leur comportement, sont similaires à ceux des souris normales. Les expériences seront réalisées avec des souris adultes au moins âgées de 8 semaines.

Trois gavages intragastriques à 24 heures d'intervalle, jusqu'à trois prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, un régime gras et sucré, des antibiotiques dans l'eau de boisson et des isolements répétés pour récolter les fèces. 2 874 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 694 d'entre elles et modéré pour 1 180, après colonisation intestinale par des bactéries associées à la maladie de Crohn. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne rend compte de la complexité d'une réponse immunitaire, tout en décrivant des modèles gut-on-chip disponibles chez des laboratoires collaborateurs qu'il envisage d'utiliser plus tard. Une partie des souris sera tuée pour prélever la rate et l'intestin, d'autres seront gardées comme reproductrices, et celles dont le génotype ne sert pas au projet iront à la formation des manipulateurs ou seront tuées.

Objectifs

Les bactéries pathogènes Escherichia coli adhérentes et invasives (Adherent Invasive Escherichia coli, AIEC) ont été isolées dans l’intestin de patients atteints de la maladie de Crohn mais sont absentes chez les sujets sains. La maladie de Crohn est caractérisée par une dérégulation de la réponse immunitaire au sein de la muqueuse intestinale, notamment des réponses lymphocytaires, conduisant à l’installation d’une inflammation chronique. Ce projet vise à étudier comment les bactéries AIEC pourraient contribuer à initier et/ou à entretenir une réponse lymphocytaire T et/ou B intestinale anormale similaire à celle observé dans la maladie de Crohn. Plus précisément, les objectifs du projet sont les suivants : 1. Etablir dans notre animalerie la lignée de souris nécessaire au projet 2. Tester chez la souris plusieurs modèles de colonisation intestinale par les bactéries AIEC afin de déterminer le meilleur modèle pour l’étude. 3. Caractériser la réponse des lymphocytes B et T aux AIEC dans le modèle choisi, en comparaison avec une E. coli contrôle non-AIEC. 4. Valider les résultats obtenus avec plusieurs autres souches AIEC issues de notre collection. 5. Etudier le rôle de gènes bactériens dans l'induction de la réponse immunitaire pathologique par les bactéries AIEC. 6. Evaluer le potentiel vaccinal d’antigènes-candidats pour limiter la colonisation et la réponse immunitaire pathologique aux bactéries AIEC.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet fera progresser les connaissances sur la physiopathologie de la colonisation par les bactéries AIEC et leur position dans le déclenchement ou l’entretien de l’inflammation intestinale caractérisant la maladie de Crohn. Le rôle de gènes de virulence ou d’antigènes d’intérêt sera également étudié, ce qui permettra d’élucider les mécanismes sous-jacents. A moyen terme, ce projet inclut l’exploration du potentiel vaccinal des antigènes en question : si l’expérimentation confirme un intérêt vaccinal, cela constituerait une preuve de concept pour un projet plus ambitieux en vaccinologie qui portera ses fruits à plus long terme pour les patients. D’une manière générale, quels que soient les résultats, la compréhension des mécanismes de pathogénicité de AIEC à l’échelle moléculaire et cellulaire est indispensable pour identifier de nouvelles pistes de diagnostic et/ou thérapeutiques pour les patients.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront subir les gestes et contraintes suivants (tous les gestes seront réalisés par des personnels formés) : - consommation d'un régime riche en graisse et en sucres provoquant une prise de poids plus rapide. - contentions et gavages intragastriques (stress, éventuellement douleur légère, extrêmement rarement complications septicémiques; trois gavages par animal à 24h d'intervalle) - injection intraveineuse au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie - prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie dans le respect des volumes recommandés (jusqu'à trois prélèvements par animal, espacés d'une semaine au minimum). - injections sous-cutanée ou intramusculaire (administration d’antalgiques pour garantir le bien-être animal dans les cas décrits dans les procédures, essai vaccinal dans la procédure 7). - traitement antibiotique dans l’eau du biberon pouvant provoquer une légère inflammation intestinale associée à une légère perte de poids. - isolement bref (inférieur à une heure) dans une enceinte fermée permettant la collecte de fèces fraîches (répété jusqu'à trois fois par semaine)

Impact sur les animaux

Les gestes et contraintes nécessaires à la réalisation de ce projet peuvent occasionner chez les animaux du stress et une douleur légère (contention, gavage, isolement, injections sous-cutanées ou intramusculaires) voire une douleur modérée (inflammation liée au régime occidental, aux antibiotiques et à l'administration de bactéries; douleur consécutive aux prélèvements au sinus rétro-orbitaire).

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont transgéniques et ne peuvent donc pas être replacés. Les animaux de génotype de non-intérêt mentionnés en procédure 1 seront utilisés pour la formation des manipulateurs (procédure 7) ou euthanasiés. En effet, ces animaux étant transgéniques, il ne sera a priori pas possible de les réutiliser dans d'autres projets. Parmi les animaux de génotype d'intérêt, certains seront utilisés pour l'expérimentation pour obtenir des splénocytes nécessaires aux procédures 2 à 6. Les autres animaux seront conservés comme reproducteurs pour entretenir la lignée. Concernant les procédures 2 à 6, les animaux de génotype de non-intérêt seront soit conservés pour d'autres projets faisant l'objet de leur propre DAP, soit utilisés pour la formation des manipulateurs (procédure 7) soit euthanasiés. Les animaux de génotype d'intérêt générés dans le cadre de ce projet seront soit conservés comme reproducteurs pour une part d'entre eux, soit utilisés dans les procédures expérimentales décrites et mis à mort pour permettre les prélèvements nécessaires pour le projet.

Remplacement

L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet : en effet, il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de rendre compte de la complexité d’une réponse immunitaire, qu’elle soit mucosale ou systémique. Si la procédure 5 est réalisée et permet d’identifier des souches bactériennes n’induisant pas la même réponse immunitaire pathologique que la souche de référence AIEC, nous pourrons envisager de tester ces souches dans des modèles de gut-on-chip disponibles dans des laboratoires collaborateurs (Bioaster, Lyon) afin d’établir des corrélats de réponse et de non-réponse dans ce modèle in vitro. A terme, cela pourrait nous aider à nous affranchir du modèle in vivo pour cribler d’autres mutants par la suite, mais pour l’instant nous ne disposons pas de données suffisantes.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué en fonction de la littérature et de l’expertise du laboratoire sur les modèles proposés de sorte à favoriser des résultats fiables et statistiquement significatifs (en particulier, implantation intestinale hétérogène des AIEC justifiant le recours à des lots de 10 animaux). Un maximum de prélèvements seront réalisés sur chaque animal après la mise à mort ; toutefois, certaines analyses prévues requièrent le traitement de l’intestin entier, augmentant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. La procédure 5 ne sera réalisée que si nos travaux en cours ou ceux de nos collaborateurs identifient des gènes d’intérêt : nous prévoyons de limiter les tests aux cinq gènes les plus intéressants, mais il est possible que finalement il n’y ait pas autant de gènes testés. Les procédures 4, 5 et 6 ne seront réalisées que pour les paramètres expérimentaux donnant les résultats les plus significatifs (paramètres identifiés à l’issue de la procédure 3).

Raffinement

L’entretien des lignées transgéniques sera réalisé dans les conditions standard d’hébergement (4 à 7 souris par cage, libre accès à l’eau et à la nourriture, enrichissement par des igloos de cellulose vierge densifiée et apport de matériel de nidification). Pour l’expérimentation, les animaux seront transférés dans des cages ventilées en condition standard. Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant le début du protocole d’infection. Un enrichissement est apporté dans les cages : cachettes en polycarbonate teinté rouge préalablement lavées et stérilisées, et galets de lanières de papier compactées. Le bien-être des animaux sera régulièrement évalué par du personnel formé grâce à une grille de score tenant compte de l'apparence de l'animal, de son poids, des signes d'inflammation digestive et du comportement. La surveillance sera quotidienne et les animaux seront pesés chaque jour à partir du début de l'expérimentation. Des mesures simples telles que le dépôt de croquettes directement dans la cage ou le changement de biberon pour un biberon à tétine longue pourront être prises en cas de signes de douleur abdominale chez certaines souris. Un animal présentant un score alarmant recevra un traitement contre la douleur. Si le score atteint le point limite, les souris seront euthanasiées immédiatement (selon l’avancement de l’expérimentation, des prélèvements pourront être réalisés juste avant la mise à mort sous anesthésie et/ou en post-mortem).

Choix des espèces

Le choix du modèle souris est lié à cinq paramètres essentiels : - Existence des lignées transgénique nécessaire au projet - Modèle validé pour étudier les réponses immunitaires - Disponibilité des outils moléculaires pour cette espèce (anticorps, cytokines recombinantes…) - Importance des données bibliographiques déjà publiées sur la réponse immunitaire mucosale - Importance des données déjà acquises par notre laboratoire sur l'infection des souris par les AIEC La maladie de Crohn est une pathologie se déclarant chez le jeune adulte (pic de diagnostic entre 15 et 30 ans). En conséquence, nous utiliserons les souris à un âge équivalent. Pour les souris sous régime alimentaire conventionnel, les expérimentations débuteront sur des animaux âgés de 6 semaines (5 semaines + 1 semaine d’acclimations) et pourront se poursuivre jusqu’à l’âge de 10-11 semaines (pour les plus longs temps post-infection). Pour les souris sous régime riche en graisse et en sucre, le régime sera donné à l’âge de 4 semaines, le protocole d’infection débutera à l’âge de 10 semaines et pourra se poursuivre jusqu’à 14 semaines pour les plus longs temps post-infection.

Un souriceau écarté du nid plus d'une heure par sa mère est mis à mort, le point limite étant considéré comme atteint. 1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement de tissus, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et l'autre moitié un niveau modéré. Le parasite Cryptosporidium leur est administré par la bouche en une dizaine de secondes, sous contention, aux souriceaux dès l'âge de trois jours, et une partie des mères reçoit des antibiotiques dans l'eau de boisson pour perturber le microbiote. Le porteur retient la souris parce que le souriceau reproduit l'infection du jeune ruminant et que la souris adulte génétiquement immunodéficiente mime celle de l'humain immunodéprimé.

Objectifs

La cryptosporidiose est une maladie parasitaire intestinale responsable de diarrhée chez l’Homme et les animaux. Le but de ce projet est de déterminer si le microbiote intestinal participe ou non à la mise en place de la réponse immunitaire protectrice par l’hôte. Cette réponse immunitaire protectrice sera étudiée en utilisant notamment des souris génétiquement modifiées pour des éléments de la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet répond tout d’abord à des questions fondammentales de la compréhension des mécanismes immunitaires protecteurs contre Cryptosporidium avec plus particulièrement dans ce projet, l’étude de l’implication du microbiote intestinal dans cette réponse immunitaire protectrice. A terme, mieux comprendre les interactions entre l’hote, le pathogène et le microbiote aidera à développer les meilleures stratégies de contrôle contre le parasite.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à une administration orale du parasite, sous contention. Chaque animal recevra une administration unique. Cette intervention durera une dizaine de secondes.

Impact sur les animaux

Les données du laboratoire obtenues dans la cadre du projet antérieur permettent de dire que, sur des souris non génétiquement modifiées (souriceaux ou adultes), il n’est pas attendu d’effets indésirables lors du traitement avec les antibiotiques. Toutefois, il se peut que la conjonction des traitements : antibiotique, infection et déficience génétique puisse altérer l’état général de l‘animal. Deux visites quotidiennes sont réalisées dans la salle expérimentale où sont hébergées les souris. Il faudra veiller à ce que les souriceaux ne soient pas mis à l’écart par la mère de façon prolongée. Si les souriceaux sont écartés du nid pendant plus d’une heure ce qui révèlerait un refus de la mère de les alimenter, le point limite sera atteint et ils seront euthanasiés. Pour les souris adultes, il faudra surveiller qu’elles ne soient pas prostrées avec le poil ébouriffé et qu’elles s’aliment. Si la souris est prostrée avec le poil ébouriffé, à l’écart et que cela perdure plus de 24h, le point limite sera atteint, elle sera euthanasiée. De plus, si les animaux se blessent ou présentent une malformation, ils sont euthanasiés.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.

Remplacement

L’étude de l’immunité protectrice dans un contexte infectieux ne peut être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de la présence du microbiote intestinal.

Réduction

Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus). Du point de vue statistique, nous utilisons des tests non paramétriques adaptés pour les petits échantillons mais 6 animaux par lots au minimum sont requis. Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Pour analyser les données, nous utiliserons des modèles statistiques mixtes qui tiennent compte à la fois des facteurs à effet fixe (exemples : infection ou déficience génétique de l’animal ou traitement antibiotique) et des facteurs à effet aléatoire (répétition des expériences). D'après nos expérimentations précédentes et dans ces conditions, ces effectifs et répétitions sont suffisants pour conclure du point de vue significatif ET biologique sur nos données. Pour les souriceaux uniquement, deux animaux supplémentaires sont ajoutés dans chaque lot car de la mortalité est parfois observée dans les portées (très jeunes animaux, indépendamment de l’infection ou d’un traitement). Nous travaillerons donc avec 8 animaux par lot pour les souriceaux et 6 animaux par lot pour les souris adultes.

Raffinement

Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis tous les jours (enrichissement social) afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance) ; souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruit) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas.

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé en tant que modèle expérimental pour étudier la cryptosporidiose. Le souriceau est représentatif de l’infection chez les jeunes ruminants. Dans les élevages, les jeunes ruminants se contaminent rapidement dès la naissance et éliminent le parasite en 3 semaines environ. Le souriceau inoculé avec le parasite entre 3 et 7 jours de vie élimine le parasite comme le jeune ruminant en 3 semaines environ. La souris adulte immunodéficiente, notamment lorsqu’elle est génétiquement modifiée pour un gène de l’immunité, est également très utilisée comme modèle mimant l’infection chez l’homme puisque l’homme immunodéficient (greffe, immunosupression, infection HIV) est également très sensible à l’infection. Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adultes) nous permettra de décortiquer très précisément les mécanismes de protection. Les souriceaux sont inoculés par le parasite lorsqu’ils auront 3 jours (modèle publié et validé scientifiquement de la cryptosporidiose des nouveau-nés). Les souris adultes entreront en expérimentation entre 7-12 semaines d’âge.

Implantation d'une pompe osmotique sous la peau, jusqu'à quatorze injections et trois prélèvements de sang à la queue par animal, le tout sous anesthésie locale. 1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 80 d'entre elles et modéré pour les 1 480 autres. Certaines portent des tumeurs pulmonaires ou sous-cutanées et reçoivent une chimiothérapie qui provoque l'anorexie que le projet cherche justement à corriger par une protéine stimulant l'appétit. La description des procédures ne nomme ni la protéine testée ni les produits injectés, se contentant d'annoncer des séries de quatre à quatorze injections.

Objectifs

Certaines petites protéines ont des rôles à l'intérieur des cellules dans le métabolisme des acides gras et à l'extérieur comme inhibiteurs du récepteur GABA de type A, une protéine présente sur les cellules nerveuses qui aide à réguler l'activité du cerveau. Des recherches récentes montrent qu'une de ces protéines stimule la production de graisse et l'appétit chez les souris. On pense qu'elle pourrait agir comme un "facteur de faim", influençant ainsi la prise alimentaire. Des études en cours indiquent que cette protéine pourrait prévenir l'anorexie causée par certains traitements médicaux chez les souris. Les objectifs de ce projet sont d'étudier l'effet de cette protéine sur l'appétit et le poids des souris, son efficacité à empêcher l'anorexie due aux chimiothérapies anticancéreuses, ainsi que d'évaluer les effets de la protéine sur l’efficacité des chimiothérapies anticancéreuses.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la perte ou la forte diminution de l'appétit dans un contexte de traitements anti-cancéreux. Ces stratégies pourraient être bénéfiques pour les patients atteints de cancer et traités par chimiothérapie.

Procédures

Des souris seront soumises aux interventions suivantes : - 1 implantation de pompes osmotiques (chirurgie superficielle en moins de 10 min) - 3 prélèvements d’une goutte de sang dans la queue (quelques secondes) sous anesthésie locale - Des souris seront soumises aux interventions suivantes : - 5 injections sous anesthésie locale (quelques secondes) - 1 prélèvement d’une goutte de sang dans la queue (quelques secondes) sous anesthésie locale - 1 injection . (quelques secondes) sous anesthésie locale -Des souris seront soumises aux interventions suivantes : - 2 prélèvements d’une goutte de sang dans la queue (quelques secondes) sous anesthésie locale- 1 injection i.v. (quelques secondes) sous anesthésie locale - Entre 4 et 14 injections . (quelques secondes) sous anesthésie locale - Des souris seront soumises aux interventions suivantes : - 1 prélèvement d’une goutte de sang dans la queue (quelques secondes) sous anesthésie locale- 11 injections (quelques secondes) sous anesthésie locale- Des souris seront soumises aux interventions suivantes : - 2 prélèvements d’une goutte de sang dans la queue (quelques secondes) sous anesthésie locale- 7 injections (durée: quelques secondes) sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les traitements par injections et la procédure chirurgicale légère (pose d’une pompe osmotique sous anesthésie) provoquent des contraintes légères et transitoires. Une perte de poids induite par la chimiothérapie sera observée suite à l’induction de l’anorexie. Le prélèvement de sang entrainera un stress lié à la contention de courte durée et des lésions vasculaires légères et transitoires. Les tumeurs pulmonaires peuvent provoquer un essoufflement ou des douleurs thoraciques. Une tumeur sous-cutanée peut présenter un syndrome de nécrose. La formation de tumeurs et la chimiothérapie peuvent entraîner des symptômes systémiques tels que la fatigue, et une perte d'appétit.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, par d'autres moyens, l’appétit, l’absorption des aliments et le comportement des individus par rapport à la nutrition vu sa complexité.

Réduction

Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites précoces strictement appliqués, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes...). Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués dès l'apparition d'un signe de douleur. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe de contrainte, d'inconfort ou de problème de santé.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Les souris sont les animaux dont la génétique est la mieux connue. - De nombreux processus biologiques sont conservés entre la souris et l’homme. Cela permet aux résultats des études sur les souris d'être plus facilement extrapolés à l’homme. - Les souris peuvent être facilement génétiquement modifiées pour étudier les effets de gènes spécifiques sur le développement, la physiologie, ou la pathogenèse de maladies. Des modèles de souris transgéniques, knock-out, ou knock-in sont largement utilisés dans la recherche biomédicale. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.